KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI

Dosen Pengampu : Patimah, S.Si.,

M. Farm., APT
Daftar Isi

01 Definisi dan Prinsip KCKT

Kronstruksi Dasar Alat

02 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

03 Jenis – jenis KCKT

04 Derivatisasi pada KCKT

 Kromatografi cair kinerja tinggi adalah teknik kromatografi
cair dimana larutan dipompa melalui kolom pada tekanan
hingga atau kadang-kadang melebihi 4000 psi.

DEFINISI DAN
PRINSIP Prinsip dari kromatografi cair kinerja tinggi adalah
pemisahan senyawa terdiri dari dua atau lebih,
berdasarkan adsorpsi dan partisi antara fase diam dan
fase bergerak, fase diam berubah kolom dan fase
bergerak campuran bahan organik.
KONSTRUKSI
DASAR ALAT
KCKT

Tempat Fase Gerak Pompa Injektor

Kolom Detektor Recorder

 Wadah fase gerak merupakan wadah untuk
Tempat Fase menampung fase gerak yang digunakan selama
proses pemisahan dengan KCKT. Wadah ini harus
bersih dan lembam (inert) atau tidak bereaksi
Gerak dengan komponen fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak anatar 1 sampai 2
liter.
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase
gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan
komponen lain terumata di pompa dan detektor,
sehingga akan mengacaukan analisis. Maka dari itu
sangat dianjurkan untuk membuat fase gerak
menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan
kemurnian yang sangat tinggi.

Sumber : Buku Analisis Obat

secara Spektroskopi dan
Kromatografihal 419
 POMPA Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah
pompa yang mempunyai syarat bagaimana syarat
wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap
fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya
pompa dengan mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
pompa dengan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
aliran fase gerak
tekanan konstan alir 3 ml/menit.
yang konstan
Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan

Sumber : Buku Analisis Buku

Analisis Obat secara
Spektroskopi dan Kromatografi
hal 427
 teknik penyuntikan teknik aliran berhenti
dengan alat suntik

INJEKTOR Dapat digunakan suatu

aliran kolom dihentikan
dan setelah tekanan pada
septum apabila tekanan
tempat penyuntikan turun
pada bagian atas kolom
hingga nol, tempat
kurang dari 70 atmosfer
penyuntikan dibuka dan
(lebih kurang 1000 psi).
analit disuntikan dengan
Pada tekanan yang lebih
memakai alat suntik.
tinggi dapat digunakan
Kemudian tempat
suatu katup penyuntik
penyuntikan ditutup dan
untuk memasukkan zat
pompa dijalankan kembali.
uji.
Tekanan tinggi dengan
cepat tercapai kembali dan
zone penyebaran kecil
dalam proses ini.

Sumber :Farmakope Indonesia

Edisi IV Hal 1010
 KOLOM
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan
utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

1 Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80 %

atau lebih kecil dibandin dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100
μl/menit)
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat
2
membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena

3 solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini
sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel kliniks

Meskipun demikian, dalam praktiknya kolom mikrobor ini

tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat
Sumber : Buku Analisis Obat secara untuk analisis rutin.
Spektroskopi dan Kromatografi hal 428 – 429
 Detektor
Idealnya, suatu detector harus mempunyai
karakteristik sebagai berikut:

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat

1 reproduksibel

Mempunyai sensitifitas yang tinggi yakni mampu

2
mendekteksi solute pada kadar yang kecil

3 Stabil dalam pengoperasian

4 Mempunyai sel volume yang kecil sehingga

mampu meminimalkan pelebaran pita

Signal yang dihasikan berbanding lurus dengan

5
konsentrasi solute pada kisaran yang luas

6 Tidak peka terhadap perubahan suhu dan

Sumber : Buku Analisis Obat secara kecepatan alir fase gerak
Spektroskopi dan Kromatografi hal 435
REKORDER
Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang
dihasilkan oleh detector lalu memplotkannya
sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat
dievaluasi oleh seorang analis.
 Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi.
FASE GERAK
DAN FASE
Fase diam pada KCKT kebanyakan berupa silika yang
DIAM
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi,
atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
 Kriteria Fase Gerak

01 02 03 04 05

Viskositas Transparasi terhadap Indeks bias

UV Toksisitas
inert
Perbedaan indeks
Pelarut dengan viskositas Jika detektor UV yang bias antara pelarut Fase gerak harus Seorang analis harus
rendah menghasilkan digunakan, maka fase dengan sampel harus tidak bereaksi sama menghindari
tekanan yang lebih rendah gerak harus transparan besar jika bekerja sekali dengan penggunaan produk
dibandingkan pelarut secara sempurna pada dengan batas-batas campuran sampel. yang toksik semaksimal
dengan viskositas tinggi panjang gelombang deteksi tertentu. mungkin.
pada suatu kecepatan alir yang digunakan.
tertentu. D
D
D
 Lanjutan

Kemurnian
06
Tidak adanya senyawa yang mengganggu pada
bentuk deteksi yang digunakan, tidak adanya
senyawa yang mmengganggu elusi gradien, tidak
adanya residu non-volatil dalam kasus pemisahan
preparatif.

Titik didih
07
Titik didih fase gerak yang rendah diperlukan jika
eluat akan dilakukan pemrosesan lebih lanjut
supaya memudahkan dalam penguapannya.

Sumber : Buku Analisis Obat secara

Spektroskopi dan Kromatografi hal 420 – 422c
 Fase Diam

Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa

silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer
stiren dan divinil benzen.

Sumber : Buku Analisis Obat secara

Spektroskopi dan Kromatografi hal 429
 Jenis-jenis KCKT, yaitu sebagai berikut

JENIS-JENIS Kromatografi Kromatografi Penukar

Adsoprsi Ion
KCKT
Kromatografi Partisi

Kromatorafi Kromatografi Ekslusi

Pasangan Ion Ukuran
Sumber : Buku Analisis Obat
secara Spektroskopi dan
Kromatografi hal 439
 Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
KROMATOGRAFI menggunakan fase normal dengan menggunakan
fase diam silica gel dan alumina. . Fase gerak yang
ADSORPSI digunakan untuk fase diam silica atau alumina
berupa pelarut non polaryang ditambah dengan
pelarut polar untuk meningkatkan kemampuan
elusinya sehingga tiddak timbul pengekoran puncak.

Jenis KCKT ini kurang luas penggunaannya.

Serangkaian senyawa homolog tidak dapat
dipisahkan dengan kromatografi adsorpsi ini karena
pada bagian solute yang non polar tidak dapat
berinteraksi dengan permukaan adsorben yang
polar.

Sumber : Buku Analisis Obat

secara Spektroskopi dan
Kromatografi hal 440
KROMATOGRAFI Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silica
PARTISI yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat.
Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silica
adalah hidrokarbon-hidrokarbon non polar. Sebagai
fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril
dengan air atau dengan larutan buffer.

Sumber : Buku Analisis Obat

secara Spektroskopi dan
Kromatografi hal 440
KROMATOGRAFI KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang
PENUKAR ION dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase
gerak. penukar ion yang sering digunakan adalah
polistiren resin. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya.

Sumber : Buku Analisis Obat

secara Spektroskopi dan
Kromatografi hal 441
 KROMATOFRAGI PASANGAN ION
Keuntungan kromatografi paangan ion untuk
pemisahan senyawa – senyawa ionik sebagai
berikut:

Sistem fase terbalik dapat digunakan untuk

1 pemisahan

Campuran asam, basa , netral dan juga molekul –

2 molekul amfoterik dapat dipisahkan

3 Kromatografi psangan ion juga merupakan

pilihan yang baik jika nilai pKa analit serupa

4 Selektifitas dapat dipengaruhi oleh pemilihan

pasangan ion yang bermuatan berlawanan

Sumber : Buku Analisis Obat secara

Spektroskopi dan Kromatografi hal 442
KROMATOGRAFI
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi
EKSKLUSI
permiasi gel dan dapat digunakan untuk
UKURAN memisahkan atau menganalisis senyawa dengan
berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silica atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus
(lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam..

Sumber : Buku Analisis Obat s

ecara Spektroskopi dan Kroma
tografi hal 448
 Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara analit
dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika kimia
analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada KCKT
adalah untuk :

DERIVATISASI 1. Meningkatkan deteksi

PADA KCKT 2. Mengubah struktur molekul atau polaritas analit
sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang
lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang
lebih baik
4. Menstabilkan analit yang sensitif