PEWARNAAN

BAKTERI
 BAKTERI
 Tak berwarna bila diperiksa langsung,
kurang jelas
 Tembus cahaya

Dengan Pewarnaan sel-sel terwarnai/berwarna

dan tidak tembus cahaya,
sehingga sangat jelas &
kontras
Tujuan Pewarnaan
 Mempermudah melihat morfologi sel
bakteri
 Untuk melihat bagian-bagian struktural
sel bakteri
 Membantu mengidentifikasi bakteri
 Memperjelas ukuran dan bentuk sel
bakteri
Merupakan gZaraatm
Wyanagrtneradiri dari ion positif
Jika :
(+) dan ion negatif (-), salah satu
• Warna pada ion (+) ; zat warna
ion berwarna.
basa
• Warna pada ion (-) ; zat warma
asam
Mekanisme Pewarnaan
 Sel bakteri banyak mengandung asam
nukleat bermuatan (-) sebagai gugus posfat
 Jika diwarnai muatan (-) pada asam nukleat
bereaksi
dengan ion (+) zat warna basa
Zat warna asam ditolak oleh muatan (-) bakteri : tak
mewarnai sel, tapi yang terwarnai adalah latar
belakangnya.

Langkah-langkah utama pewarnaan :

 Pembuatan apusan pada kaca objek (penempatan olesan
pada kaca objek)
 Fiksasi olesan
 Aplikasi pewarna tunggal atau serangkaian larutan
pewarna/reagen.
Faktor – faktor penentu keberhasilan
dalam pewarnaan bakteri
 Fiksasi
 Peluntur warna
 Substrat
 Intensifikasi pewarnaan
 Zat warna penutup

Fiksasi
Cara yang paling umum dengan cara fisik (pemanasan)
Fungsinya :
 Melekatkan sel pada kaca objek
 Mencegah terjadinya otolisis sel, yaitu proses larutnya sel
yang disebabkan oleh enzim yang ada di dalamnya
 Membunuh bakteri dsb.
Peluntur warna
Tujuan untuk mendapat kontras yang baik pada bayangan
mikroskop, menghilangkan warna sel yang telah diwarnai

Pada umumnya, sel yang mudah diwarnai : cepat pula dilunturkan

sedangkan sel yang sukar diwarnai : sulit dilunturkan

Dari segi ketahanan sel terhadap senyawa kimia ada yang : tahan
asam, tahan alkohol, tahan air dsb.
Ketahanan tersebut digunakan untuk membedakan kel. Mikroba

Substrat
Yang berhubungan dengan kandungan utama sel
Berdasarkan kand. Sel : sifat sel. Misal basofilik

Intensifikasi Pewarnaan
Untuk mempercepat pewarnaan bakteri
Misal dengan penambahan mordan : zat warna akan terikat lebih
kuat pada jaringan
-Me kan zat warna
-Me kan temperatur pewarnaan (60-900 C)

Mordan :
Zat kimia yang bukan bahan cat, tetapi menyebabkan sel bakteri
dapat dicat lebih intensif atau menyebakan cat terikat lebih kuat
pada jaringan sel.

Zat Warna Penutup

(pada pewarnaan bertingkat)
Diberikan pada akhir pewarnaan
Untuk memberikan warna kontras pada sel mikroba yang tidak
menyerap warna awal. Misal methylen blue, safranin dsb.

Macam –macam pewarnaan

Berdasarkan jenisnya : pewarnaan positif dan pewarnaan negatif
Berdasarkan cara pelaksanaannya : pewanaan sederhana,
pewarnaan bertingkat/ majemuk/diferensial
 jenis Cara contoh
pewarnaan
positif Tunggal (sederhana) Methylen blue

Kompleks (diferensial) P.Gram

P. Tahan asam

P. Struktur sel (khusus) spora, granula,

flagella

Negatif kapsul
Pewarnaan sederhana
Pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam pewarna
Contoh zat warna : kristal violet, safranin, methylen blue (zat
warna basa)
Mekanisme :
Zat warna basa bereaksi dengan komponen sel yang bersifat asam
(asam nukleat, prot, dsb) ; sel terwarna dengan merata.

Pewarnaan sederhana, hanya memungkinkan pengamatan

morfologi sel : batang, coccus, dsb
Cara : apusan yang telah difiksasi genangi pewarna
keringkan.

Pewarnaan differensial
Proses pewarnaan untuk menampilkan perbedaan
diantara sel-sel
bakteri
Biasanya digunakan lebih dari satu macam zat warna atau reagen
pewarnan biasanya
Pewarnaan Gram :
•salah satu teknik pewarnaan diferensial yang : -paling penting
-paling banyak
digunakan
Dikembangkan oleh Christian Gram (1884)
Dua macam bakteri : gram positif (ungu), gram negatif
(merah)
No Larutan & urutan Reaksi & penampakan bakteri
penggunaannya
Gram (+) Gram (-)

1 Kristal violet Sel berwarna ungu Ungu

2 Lar. iodium Terbentuk kompleks KV-1, Kompleks KV-1,
sel tetap ungu ungu.
3 alkohol Dinding sel mengalami Lemak terekstraksi
dehidrasi, pori2 menciut, dari dinding sel,
daya rembes dinding sel & pori2
membran menurun, KV-I mengembang, KV-
tak dpt keluar dari sel, sel I keluar : sel tak
tetap ungu. berwarna
4 safranin Sel tak terpengaruh, tetap Sel menyerap zat
ungu warna ir, merah
FAKTOR-FAKTOR YANG DAPAT
MENIMBULKAN KERAGAMAN DALAM
REAKSI GRAM ADALAH :
 Pelaksanaan fiksasi
 Kerapatan sel pada olesan
 Konsentrasi dan Umur reagen
 Sifat, konsentrasi, dan jumlah
pemucat
 Sejarah biakan
Pewarnaan tahan asam
 Khusus untuk Mycobacterium : M. tuberculosa, M. leprae

Karena banyak mengandung asam mikolat & lemak

 Meningkatkan kandungan lemak : tak permeabel terhadap zat-
zat warna yang umum
 Tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa

Bila dipaksakan, misal dengan menggunakan mordan,

pemanasan maka sekali ia menyerap zat warna akan tetap
dipegang teguh, tak akan dilepaskan lagi, walaupun digunakan
zat peluntur yang kuat seperti lakohol-asam
Disebut bakteri tahan asam (BTA)
Cara : (P. Ziehl-Nielsen)
• Buat Apusan
• Warnai Dengan Karbol Fuksin 5 Menit Sambil Dipanasi
Dengan Api Kecil
• Zat Warna Dibuang, Lalu Tetesi Asam-alkohol 1-2 Detik
• Cuci Dengan Air Kran
• Tambahkan Larutan Methylen Blue 1 Menit
• Cuci, Keringkan

Hasil :
BTA merah
Bukan biru.
BTA
Pewarnaan Spora
• Spesies2 Bacilus & Clostridium : menghasilkan endospora
yang sangat resisten.
• Karena struktur dinding spora yang keras dan tebal. : sukar
diwarnai harus dengan pemanasan.
• Sekali terwarnai sukar dihilangkan.
• Ada beberapa metode : Klein, Schaeffer & fulkon.

Pewarnaan Kapsul
Kapsul : merupakan lapisan lendir yang menyelubungi sel,
sebagai
cadangan makanan, untuk perlindungan.
Tanpa pewarnaan, K sukar dilihat dibawah mikroskop, sebab : K. tak
berawarna, K. indeks biasnya rendah.
K. Bersifat non ionik : tidak diwarnai dengan P. biasa tetapi dengan
P. negatif.
Cara (M. Burry) :
 Sediakan 2 kaca objek bersih
 Teteskan 1 tetes tinta cina pada salah satu kaca objek.
 Suspensikan 1 ose bakteri pada tetesan tinta cina tadi
sampai homogen, jangan melebar.
 Lebarkan suspensi tersebut dengan menggosokan
pada
kaca objek kedua (spt pembuatan hapusan darah)
 Keringkan & fiksasi
 Tambahkan boraks methylen blue 2 % diatas sediaan tadi
& diamkan selama 1-2 menit
• Cuci dan keringkan di udara
• Periksa di bawah mikroskop
 Pewarnaan negatif
Spesimen dicampur dengan tinta
india & disebarkan menjadi lapisan
tipis.
Menelaah morfologi : prosedur dan
reagen pewarnaan sangat lemah
pengaruhnya terhadap
mikroorganisme.