Laporan Praktikum Kimia Analisis Instrumen 3 (PERCOBAAN 3 ANALISA PIGMEN TUMBUHAN DENGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI KERTAS DAN SPEKTROSKOPI

UV-VIS)
PERCOBAAN 3 ANALISA PIGMEN TUMBUHAN DENGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI KERTAS DAN SPEKTROSKOPI UV-VIS TUJUAN PERCOBAAN Memisahkan zat warna dari ekstrak tumbuhan menggunakan kromatografi kertas. Menentukan panjang gelombang maksimum yang diserap tiap zat warna yang diperoleh. Menyarankan jenis dan struktur molekul klorofil dari data spektrum UV-Vis yang diberikan instrumentasi spektroskopi UV-Vis.

A.

B. PRINSIP PERCOBAAN Memisahkan zat warna dari ekstrak tumbuhan menggunakan kromatografi kertas berdasarkan gaya kapilaritas sehingga diperoleh kromatogram. Kemudian kromatogram yang diperoleh dipisahkan dan dilarutkan dengan pelarut etanol untuk di uji jenis dan struktur molekul klorofil dengan menggunakan spektroskofi UV-Vis berdasarkan penyerapan energi radiasi elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan energi tertentu, sehingga elektron-elektron dalam larutan sampel mengalami transisi elektronik dan kemudian elektron tersebut kembali ke keadaan dasar dengan panjang gelombang tertentu C. DASAR TEORI 1. Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel 1.1. Tabel 1.1 Klasifikasi kromatografi

Kriteria Fasa mobil Mekanisme Fasa stationer 2. Kromatografi Kertas

Nama Kromatografi cair, kromatografi gas Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi Kromatografi pertukaran ion kromatografi gel Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas

Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan sederhana suatu campuran senyawa dapat

dilakukan dengan kromatografi kertas, prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti kolom. Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air. Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O yang teradsorpsi dalam selulosa kertas. Fasa gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa untuk bergerak disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan dengan cara membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time retention (tR) atau volume retention (VR). Nilai Rf dapat ditentukan dengan cara: Rf = jarak yang ditempuh noda jarak yang ditempuh pelarut Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga besaran ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama. Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah. Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan larutan yang berisi sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1cm dari tepi kertas. Setelah penetesan larutan pada kertas, maka bagian bawah kertas dicelupkan dalam larutan pengambang (developing solution). Larutan ini umumnya terdiri atas campuran beberapa pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air. Sistem ini akan terserap oleh kertas dan sebagai akibat dari gaya kapiler akan merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini dapat diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan, sistem secara keseluruhannya disimpan dalam tempat tertutup, ruang didalamnya telah jenuh dengan uap sistem pelarut ini. Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan (Shofyan, 2010).

Gambar 1.1 Contoh hasil kromatografi kertas 3. Spektroskopi UV-Vis Spektroskopi UV-Vis adalah salah satu teknik analisis spektroskopik yang menggunakan radiasi elektromagnetik UV dekat (190-380 nm) dan sinar tampak 380-780 nm dengan menggunakan instrumen spektrofotometer. Dari spektrum absorpsi dapat diketahui panjang gelombang dengan absorbans maksimum dari suatu unsur atau senyawa. Pada prinsipnya spektroskopi UV-Vis menggunakan cahaya sebagai tenaga yang mempengaruhi substansi senyawa kimia sehingga menimbulkan cahaya. Panjang gelombang lazim disajikan dalam satuan nm di mana 1 m = 10-9 nm. Pada table berikut ini ditampilkan klasifikasi sinar tampak beserta warna komplementernya (bila dicampurkan jadi tidak berwarna). Table 1.2 Klasifikasi sinar tampak dengan warna komplementernya Panjang gelombang (nm) Warna Warna komplementer 400-435 435-480 480-490 Violet/ungu/lembayung Biru Biru kehijauan Hijau kekuningan Kuning Jingga

490-500 500-560 560-580 580-610

Hijau kebiruan Hijau Hijau kekuningan Jingga

Merah Ungu kebiruan Ungu Biru kehijauan

610-680 Merah Hijau kebiruan 680-800 Ungu kemerah-merahan Hijau (Sitorus, 2009). Ada dua aspek yang dapat di ukur dengan alat spektroskopi UV-Vis yaitu aspek kualitatif dan kuantitatif spektroskopi UV-Vis: 1. Aspek Kualitatif Secara kualitatif, spektroskopi UV-Vis dapat menentukan panjang gelombang maksimal, intensitas, efek pH dan pelarut. 2. Aspek Kuantitatif Dalam aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap Jika suatu molekul bergerak dari suatu tingkat energy tinggi ke tingkat energy rendah maka beberapa energy akan dilepaskan. Energy ini dapat hilang sebagai radiasi yang dapat dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika satu molekul dikenai suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga molekul energi tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan (absorbsi) energi oleh molekul. Supaya terjadi absorbsi, perbedaan energi antara dua tingkat energi harus setara dengan energi foton yang diserap (Sastrohamidjojo, 1991). Ada tiga macam proses penyerapan energy ultraviolet dan sinar tampak, yaitu: a. Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan b. Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks c. Penyerapan oleh perpindahan muatan Pengukuran absorbansi atau transmitansi dalam spektroskopi ultraviolet dan daerah sinar tampak digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif spesies kimia. Absorbansi ini berlangsung dalam dua tahap, pertama, yaitu transisi atau eksitasi electron M+hv=M*. tahap kedua adalah relaksasi M* menjadi spesies baru dengan reaksi fotokimia. Absorbsi dalam daerah ultraviolet dan daerah tampak menyebabkan eksitasi electron ikatan. Puncak absorpsi (maks) dapat dihubungkan dengan jenis-jenis ikatan yang ada dalam spesies. Spektroskopi absorbsi berguna untuk mengkarakterisasi gugus fungsi dalam suatu molekul dan untuk analisa kuantitatif. Spesies yang mengabsorbsi dapat melakukan transisi yang meliputi: Electron (e), pi (), sigma (), non bonding (n) Jenis transisi ini terjadi pada molekul-molekul organik dan sebagian kecil anion anorganik. Molekul tersebut mengabsorpsi radiasi elektromagnetik karena adanya electron valensi, yang akan tereksitasi ke tingkat energy yang lebih tinggi. Absorbsi terjadi dalam daerah UV vakum (< 185 nm) sedangkan kromofor dengan energy eksitasi yang rendah mempunyai daerah absorbsi di atas 180 nm. Electron dari molekul organic yang mengabsorbsi meliputi electron yang digunakan pada ikatan antar atom-atom dan elektron nonbonding atau elektron tidak berpasangan yang pada umumnya terlokalisasi. Transisi

elektronik pada tingkat-tingkat energy terjadi dengan mengabsorbsi radiasi sehingga menyebabkan transisi ------ *, n------ , n-----, dan ----- *. Absorbsi yang melibatkan electron-elektron orbital d dan f Unsur-unsur blok d mengabsorbsi pada daerah UV dan daerah sinar tampak. Terjadinya transisi logam golongan f disebabkan karena electron-elektron pada orbital f. Transfer muatan electron Komponen yang diabsorpsi harus terdiri dari elektron donor dan elektron akseptor sehingga transfer elektron dapat terjadi dan menghasilkan absorbsi radiasi (Krisnandi, 2002) . Persyaratan yang harus dipenuhi untuk absorbsi sinar tampak adalah larutan harus berwarna. Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk cairan berwarna (Widyaningsih dan Faiqoh, 2009). 4. Instrumentasi Spektroskopi UV-Vis Bagian-bagian dari alat spektroskopi UV-Vis adalah: sumber cahaya Sumber energy cahaya yang biasa untuk daerah tampak dari spectrum itu maupun daerah ultraviolet dekat dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat ranbut terbuat dari wolfram. Pada kondisi operasi biasa, keluaran lampu wolfram ini memadai dari sekitar 235 atau 350 nm ke sekitar 3 m. energy yang dipancarkan olah kawat yang dipanaskan itu beraneka ragam menurut panjang gelombangnya. Monokromator Ini adalah piranti optis untuk memencilkan suatu berkas radiasi dari sumber berkesinambungan, berkas mana mempunyai kemurnian spectral yang tinggi dengan panjang gelombang yang diinginkan. Radiasi dari sumber difokuskan ke celah masuk, kemudian disejajarkan oleh sebuah lensa atau cermin sehingga suatu berkas sejajar jatuh ke unsure pendispersi, yang berupa prisma atau suatu kisi difraksi.. Kuvet Merupakan wadah sampel. Kuvet yang baik untuk spektroskopi UV-Vis yang terbuat dari kuarsa, yang dapat melewatkan radiasi daerah ultraviolet ( < 350 nm). Kuvet yang baik tegak lurus terhadap arah sinar untuk meminimalkan pengaruh pantulan radiasi. kuvet harus memenuhi syarat-syarat diantaranya adalah tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya, permukaannya secara optis harus benar-benar sejajar, harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan-bahan kimia, tidak boleh rapuh dan mempunyai bentuk yang sederhana. Pada pengukuran di daerah UV, dipakai kuvet kuarsa, sedangkan kuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Sedangkan pengukuran di daerah sinar tampak (visible), dapat digunakan semua jenis kuvet (Krisnandi, 2002). Detector Detector berfungsi untuk menangkap sinar yang merupakan sinar terusan dari larutan sampel. Di dalam amplifier sinar tersebut diubah menjadi signal listrik. Prinsipnya mengubah energy foton diluar yang jatuh mengenai sampel dan mengubah energy tersebut menjadi besaran yang dapat diukur (Anonim, 2011). 5. Ekstraksi Pigmen Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu bahan dari campurannya, biasanya dengan menggunakan pelarut. Ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai cara. Ekstraksi menggunakan pelarut didasarkan pada kelarutan komponen terhadap komponen lain dalam campuran. Pelarut polar akan melarutkan solut yang polar dan pelarut non polar akan melarutkan solut yang non polar atau disebut dengan like dissolve like. Tehnik ekstraksi lainnya misalnya menggunakan air untuk mengambil pigmen alami dari tumbuhan, seperti: daun, dan lain-lain.

Ekstraksi pigmen adalah proses pemisahan pigmen dari suatu bahan campurannya dalam jaringan tumbuhan menggunakan suatu pelarut (Simon, 2008). 6. Pigmen dalam Bayam Bayam merupakan salah satu tanaman yang daunnya banyak mengandung klorofil dan karotenoid. Klorofil merupakan zat warna hijau pada daun. Klorofil adalah pigmen hijau yang ditemukan dalam banyak tanaman. Klorofil berasal dari bahasa Yunani, yaitu chloros "hijau" dan phyllon "daun". Klorofil a dan b adalah pigmen tumbuhan yang dibutuhkan dalam reaksi fotosintesis, diproduksi di kloroplast pada jaringan fotosintesis yang ada di daun. Klorofil a berwarna hijau biru memiliki panjang gelombang maksimum pada 430 nm dan 669 nm, sedangkan klorofil b berwarna hijau kuning memiliki panjang gelombang maksimum pada 453 nm dan 652 nm. Klorofil a menunjukkan Rf 0,4 dan klorofil b menunjukkan Rf 0,38 (Wiwing, 2005) Gambar 1.2. klorofil a dan klorofil b Beta karotenoid adalah salah satu pigmen warna yang terdapat di dalam daun bayam. Karotenoid biasanya menunjukkan warna kuning, jingga dan merah jingga. Karena warnanya berkisar antar jingga sampai merah, maka beta karotenoid mempunyai panjang gelombang maksimum berkisar 430-480 nm (Schwartz dan Elbe, 1996) dan Rf 0,625. Gambar 1.3. beta karotenoid D. METODOLOGI PERCOBAAN 1) Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah: Mortal Alu Pisau Beaker glass 600 ml Chamber Tabung reaksi Pipet tetes Gelas ukur Botol vial Pinset Penggaris Staples kuvet spektroskopi UV-Vis cary 50 Bahan yang digunakan adalah: kertas saring air akuades koin pensil etanol aseton daun bayam segar uang logam

 plastik wrap 2) Skema Kerja 1) Preparasi Sampel Kertas saring Di gunting berukuran 7 x 10 cm Kertas saring berukuran 7 x 10 cm Dibuat garis batas bawah 1,5 cm dari tepi bawah dan garis batas atas 1 cm dari tepi atas kertas Kertas kromatografi

2 lembar daun bayam Dikeringkan dengan lap/kertas tissue Daun bayam kering Ditempatkan pada garis pensil sehingga tertutup hingga lebar kertas Daun bayam di atas garis pensil Ditempatkan penggaris di atas daun bayam mengikuti garis pensil Ditekankan dan digoreskan sepanjang garis pensil dengan logam Diulangi hingga garis hijau terlihat jelas Warna hijau daun menempel dan terbentuk pada kertas saring Dibiarkan kering Garis hijau mengering

2) Pemisahan Pigmen Kertas saring Digulung berbentuk silinder dengan cara distaples

 Diposisikan garis/pita hijau diluar Kertas saring berbentuk silinder Dimasukkan ke dalam beaker glass berisi 20 ml etanol Diusahakan pelarut tidak menyentuh garis hijau Ditutup beaker glass dengan plastic wrap Dibiarkan pelarut mengelusi sampel di kertas saring selama 5 menit Kertas saring di dalam beaker glass

Pelarut bergerak naik dan pita-pita warna memisah Dibuka tutup plastik beaker glass Pelarut hampir mencapai garis batas atas Dikeluarkan kertas saring dari beaker glass Kertas saring basah Dibiarkan mengering di ruangan gelap Kertas saring kering

3) Ekstraksi Pigmen Kertas saring kering Diluruskan dengan melepas staplesnya Kertas saring lurus Diukur jarak setiap pita warna dari garis batas bawah Dihitung harga Rf setiap pita warna Dicatat warna pita Warna pita dan Harga Rf setiap warna pita Digunting setiap warna pita Dipisahkan hati-hati Potongan masing-masing pita Dimasukkan ke tabung reaksi yang berbeda

Tabung reaksi berisi potongan pita Diberi label dengan menuliskan harga Rf pita Ditambah 5 ml etanol Tabung reaksi berisi potongan pita dan etanol Ditutup dengan plastic wrap Dibiarkan semua zat warna larut dalam etanol Zat warna larut dalam etanol

4) Pengukuran Panjang Gelombang Dimasukan blanko (etanol ) hingga 2/3 tinggi kuvet Diambil kuvet blanko dan pegang bagian buramnya Dibersihkan kaca transparan kuvet dengan tisu Dimasukan dalam alat instrumentasi spektroskopi UV-Vis Kuvet blanko Dibersihkan dari debu & pengotor lainya Kuvet blanko bersih
Layar computer menunjukan angka zero kuvet blanko dalam spektroskopi UV-VIS Di pilih program zero pada layar komputer

Dikeluarkan kuvet dari alat instrumentasi Di masukan kuvet sampel 1 dalam alat spektroskopi UV-VIS Kuvet sampel dalam alat instrument Di pilih program START pada layar komputer Kurva panjang gelombang sampel 1, panjang gelombang dan absorbansi sampel 1 Di pilih finish Di keluarkan kuvet sampel Diganti dengan sampel berikutnya Di pilih program START pada layar komputer

 Dilakukan proses pengoperasian Di lakukan proses pengoperasian

Kurva panjang gelombang gelombang sampel berikutnya, panjang gelombang dan absorbansi berikutnya dicetak Hasil scanning

5) Analisa Panjang Gelombang Maksimum Zat Warna Panjang gelombang maksimum tiap zat warna Ditandai Dicatat nilainya Panjang gelombang maksimum tiap zat warna Dibandingkan dengan data literatur Ditentukan klorofil a, klorofil b, karotenoid berdasarkan panjang gelombang maksimum Panjang gelombang maksimum Klorofil a, klorofil b, karotenoid

E. HASIL PENGAMATAN Pemisahan pigmen No Perlakuan Pengamatan 1 Kertas saring kromatografi di gulung dengan posisi garis hijau bayam di luar + dimasukkan dalam beaker glass berisi 20 Garis hijau bayam naik ke ml etanol atas mengikuti elusi pelarut Terbentuk noda kuning (bawah), hijau (tengah), kuning muda kehijauan (atas) 2 Di hitung Rf masing-masing noda Noda kuning = 0,4 Noda hijau = 0,8 Noda kuning muda kehijauan = 0,93 3 Masing-masing noda dipotong Ekstraksi pigmen No Perlakuan 1 Potongan noda Rf 0,4 dimasukkan ke dalam tabung reaksi + 5 ml etanol

Pengamatan Warna noda pada potongan kertas memudar dan menghilang Potongan noda Rf 0,8 dimasukkan ke dalam Warna noda pada tabung reaksi + 5 ml etanol potongan kertas memudar dan menghilang Potongan noda Rf 0,93 dimasukkan ke dalam Warna noda pada tabung reaksi + 5 ml etanol potongan kertas memudar dan menghilang

Pengukuran panjang gelombang No Rf noda Panjang gelombang 1 Rf 0,4 276,0 220,0 208,1 2 Rf 0,8 665,0 416,0 208,1

Absorbansi 0,326 1,411 1,400 0,100 0,143 1,169

Rf 0,93

207,0

0,828

F. PERHITUNGAN Rf kuning muda kehijauan = Rf hijau muda = Rf kuning =

G. PEMBAHASAN Sebelum melakukan kromatografi kertas, sebaiknya dilakukan terlebih dahulu preparasi sampel dengan menyiapkan kertas saring, chamber dan daun bayam. Dalam penyiapan kertas saring untuk kromatografi, kertas saring harus dibuat garis atas dan garis bawah dengan ukuran 7 x 10 cm untuk mempermudah menghitung jarak noda yang terelusi sehingga Rf noda dapat dihitung dan komponen senyawa dari noda bayam dapat di analisis. Garis-garis ini harus dibuat dengan menggunakan pensil, tidak boleh menggunakan pulpen/alat tulis lain yang menggunakan tinta karena apabila menggunakan tinta maka tinta dari alat tulis akan ikut terelusi pada saat kromatografi berlangsung sehingga dapat mempengaruhi proses kromatografi. Sedangkan apabila menggunakan pensil, karbon dari pensil tidak akan ikut terelusi karena karbon bersifat inert sehingga tidak mempengaruhi proses kromatografi. Kemudian daun bayam hijau harus dikeringkan terlebih dahulu dengan lap/tissue untuk menghindari adanya kotoran yang kemungkinan masih menempel pada daun yang nantinya dapat mengganggu proses elusi. Karena kotoran-kotoran tersebut mungkin dapat membentuk noda tersendiri pada kertas kromatografi. Untuk menempatkan noda daun bayam hijau pada kertas saring, cukup dengan meletakkan daun bayam tersebut di atas garis batas bawah kemudian digoreskan dengan menggunakan uang logam agar warna hijau daun bayam menempel pada garis batas bawah kertas. Cara ini cukup sederhana sehingga tidak perlu lagi dilakukan maserasi terhadap daun bayam. Kromatografi kertas dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan pigmen warna pada daun bayam. Kromatografi kertas dapat digunakan untuk memisahkan pigmen warna, karena kertas whatman yang digunakan sebagai fase diam mengandung serat selulosa yang dapat menyerap pigmen-pigmen warnadari campuran dalam daun bayam dengan gaya kapilaritas. Pigmen-pigmen warna akan berpindah tempat sepanjang kertas dengan kecepatan yang berbeda sesuai dengan tingkat kepolaran senyawa/pigmen dan pelarut yang digunakan, untuk membentuk sederet noda-noda yang terpisah. Kertas kromatografi tersebut digulung dengan posisi garis hijau di luar agar pengamat dapat melihat proses elusi dengan mudah. Untuk melakukan elusi, pemilihan pelarut harus diperhatikan agar proses elusi berjalan dengan baik dan sebagian besar senyawa dapat terelusi. Pada percobaan kromatografi kali ini, digunakan pelarut etanol karena pelarut etanol dapat mengelusi senyawa yang polar maupun yang tidak polar. Kemampuan ini dikarenakan etanol memiliki struktur C2H5OH yang terdiri dari rantai hidrokarbon C2H5- yang menyebabkan etanol dapat menarik senyawa nonpolar sedangkan adanya gugus -OH yang bersifat polar dapat menarik senyawa polar. Dengan kemampuan ini diharapkan etanol dapat mengelusi semua senyawa yang ada di dalam daun bayam. Namun, sebelum kertas saring dimasukkan ke dalam gelas beaker yang berisi etanol, sebaiknya gelas beaker berisi etanol itu dijenuhkan terlebih dahulu. Penjenuhan ini bertujuan untuk menyeimbangkan tekanan atmosfer di dalam dan di luar chamber agar noda berjalan lurus (tidak berkelok-kelok). Tekanan atmosfer di luar dan di dalam chamber dikatakan seimbang apabila perembesan pelarut ke kertas saring sudah mencapai ke luar chamber.

Maka dari itu untuk melihat kejenuhan chamber, kertas saring harus mencapai luar chamber sehingga dapat menghubungkan antara luar dan dalam chamber. Hal penting yang perlu diperhatikan dalam memasukkan kertas saring dalam beaker glassadalah pelarut harus berada di bawah garis batas bawah, agar pelarut tidak mencapai garis hijau. Pelarut tidak boleh mencapai garis hijau untuk menghindari senyawa yang terdapat pada garis hijau melarut dalam pelarut. Pada saat elusi berlangsung,beaker glass harus dalam keadaan tertutup supaya kejenuhan beaker glass tidak terganggu sehingga tidak berdampak pada proses elusi, yang dapat berakibat pada pembelokan noda dan akhirnya perhitungan Rf masing-masing noda menjadi kurang tepat. Elusi dapat terjadi karena pengaruh dari dorongan pelarut pengembang (etanol) dan gaya kapilaritas. Kertas kromatografi dikeringkan untuk menguapkan pelarut etanol dan harus dikeringkan di tempat yang terlindung cahaya untuk menghindari rusaknya senyawa pada kromatogram karena kemungkinan senyawa pada kromatogram mudah teroksidasi jika terpapar cahaya. Berdasarkan hasil pengamatan, terlihat adanya noda-noda yang berwarna kuning, hijau, dan kuning muda kehijauan dari hasil proses elusi. Warna-warna noda ini menunjukkan senyawa tertentu karena senyawa-senyawa tertentu memiliki warna yang tertentu pula. Noda yang berwarna kuning kemungkinan adalah senyawa karotenoid, warna hijau kemungkinan senyawa klorofil a dan warna kuning muda kehijauan kemungkinan klorofil b. Dugaan ini berdasarkan literatur bahwa karotenoid berwarna kuning-merah, klorofil a berwarna hijau kebiruan, dan klorofil b kuning kehijauan. Namun noda-noda ini belum pasti senyawa karotenoid, klorofil a dan klorofil b, karena banyak senyawa yang memiliki warna yang sama. Untuk mengetahui dengan pasti jenis noda-noda ini merupakan senyawa karotenoid, klorofil a dan klorofil b maka harus dihitung harga Rf nya karena harga Rf merupakan identitas dari suatu senyawa. Berdasarkan hasil perhitungan, harga Rf dari noda berwarna kuning (kemungkinan senyawa karotenoid), hijau (kemungkinan senyawa klorofil a), dan kuning muda kehijauan (kemungkinan senyawa klorofil b) masing-masing sebesar 0,4; 0,8; 0,93. Dari harga Rf ini menunjukkan noda-noda tersebut bukan senyawa karotenoid, klorofil a, dan klorofil b karena berdasarkan literatur harga Rf klorofil a, klorofil b dan karotenoid masingmasing sebesar 0,4; 0,38;0,625 (Wiwing, 2005). Namun peneliti boleh saja mengatakan nodanoda tersebut merupakan senyawa yang dimaksud mengingat warna-warna dari noda dan karena seringkali nilai Rf berbeda dari satu kertas ke kertas lainnya (Basset, 1994). Kemungkinan harga Rf dari literatur menggunakan kertas yang berbeda dengan kertas yang digunakan saat peneliti praktikum sehingga nilai Rf yang diperoleh juga berbeda. Maka dari itu, harus dilakukan pengujian panjang gelombang pada masing-masing noda untuk memastikan senyawa tersebut merupakan klorofil a, klorofil b dan karotenoid dengan menggunakan spektroskopi UV-Vis. Sebelum dilakukan pengujian, senyawa-senyawa pada noda yang masih menempel pada kertas kromatografi harus dilarutkan dalam pelarut etanol agar dapat dilakukan pengujian, karena analisis spektroskopi harus menggunakan sampel dalam bentuk cairan. Kromatogram memiliki senyawa-senyawa yang berbeda dilihat dari warna nodanya. Maka masing-masing noda harus dipotong untuk memisahkan senyawa-senyawa itu. Masingmasing potongan noda dilarutkan kembali ke dalam 5 ml etanol. Etanol digunakan karena dengan alasan yang sama, yaitu agar dapat melarutkan senyawa yang polar maupun nonpolar. Dan pelarut etanol juga memenuhi syarat sebagai pelarut untuk analisis spektroskopi karena etanol tidak berwarna. Karena apabila digunakan pelarut yang memiliki warna, pelarut tersebut akan ikut mengabsorbsi pada daerah pengukuran sehingga mempengaruhi panjang gelombang maksimum senyawa pada noda. Melarutnya senyawa pada potongan-potongan

noda dapat dilihat dari melunturnya warna noda pada potongan-potongan tersebut. Apabila semua senyawa sudah melarut, maka larutan tersebut dimasukkan ke dalam botol vial dan diberi label harga Rf nya masing-masing supaya masing-masing senyawa tidak tertukar harga Rf nya saat dilakukan analisis. Sebelum dilakukan pengujian,pengoperasian alat spektroskopi UV-Vis, dipilih panjang gelombang 200-800 nm karena panjang gelombang sinar UV berkisar dari 200-350 nm dan panjang gelombang sinar tampak berkisar dari 350-800 nm, dengan penggunaan panjang gelombang 200-800 nm maka diharapkan panjang gelombang maksimum sampel dapat teramati. Pada pemasangan kuvet pada alat instrumentasi, kuvet ini harus dipasang tegak lurus terhadap arah sinar, tujuannya untuk meminimalkan pengaruh pantulan radiasi. Dalam penggunaan kuvet juga harus diperhatikan, yaitu kuvet ini harus dipegang pada bagian buram supaya tidak ada noda yang berasal dari jari menempel pada bagian bening kuvet tersebut, tujuannya supaya dapat mentransmisikan semua cahaya yang melewati kuvet.Pelarut etanol yang digunakan tersebut dijadikan sebagai blanko dengan tujuan untuk mengkalibrasi alat instrumentasi spektroskopi UV-Vis agar dapat meminimalisir kesalahan pada pemakaian instrumentasi spektroskopi UV-Vis sehingga diperoleh besar absorbansi dan panjang gelombang maksimum sampel dengan teliti. Setelah alat spektroskopi UV-Vis dikalibrasi, larutan sampel dimasukkan ke dalam alat instrument spektroskopi UV-Vis untuk mengukur absorbansi sampel sehingga diketahui panjang gelombang maksimum masing-masing senyawa pada noda. Setelah sampel dimasukkan ke dalam kuvet, cahaya monokromatik yang melewati sampel akan diserap sehingga menyebabkan elektron pada sampelmengalami transisi dari tingkat energi dasar ke tingkat energy yang lebih tinggi. Kemudian, elektron tersebut mengalami perpindahan kembali dari tingkat energy yang lebih tinggi ke tingkat energi yang lebih rendah (mengalami relaksasi) dengan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu. Cahaya yang dipancarkan ini akan diteruskan ke detektor untuk diubah menjadi signal listrik. Dan sinyal listrik akan diterima oleh amplifier. Amplifier ini berfungsi untuk memperkuat hasil pembacaan detector dalam hal panjang gelombang. Selanjutnya panjang gelombang tersebut dilanjutkan ke rekorder untuk mengubah ke dalam bentuk sinyal-sinyal listrik dalam bentuk spektrum. Jadi fungsi rekorder disini yaitu mengubah panjang gelombang hasil deteksi dari detector yang diperkuat oleh amplifier menjadi sinyal-sinyal listrik dalam bentuk spectrum. Sinyal-sinyal listrik dalam bentuk spectrum ini dilanjutkan ke tahap berikutnya yaitu dibawa ke monitor sehingga dapat dibaca dan dapat di print. Pada golongan karotenoid, klorofil a dan klorofil b, transisi yang relevan terjadi dengan transisi ___*, di mana salah satu elektron ikatan dari terkonjugasi tereksitasi dari orbital _ ke orbital antibondingnya _*. Pada senyawa karotenoid, klorofil a dan klorofil b, elektron _ terdelokalisasi sangat besar mengingat sangat panjangnya sistem konjugasi ikatan ganda yang dimiliki. Hal ini mengakibatkan proses eksitasi terjadi dengan energi yang relatif rendah, yang umumnya senyawa karotenoid, klorofil a dan klorofil b menjadi berwarna karena energi eksitasinya yang rendah (Britton et al, 1995). Berdasarkan hasil spektroskopi UV-Vis, diperoleh absorbansi maksimum dari noda kuning dengan Rf 0,4 adalah 1,411; absorbansi maksimum dari noda hijau dengan Rf 0,8 adalah 1,169; dan absorbansi maksimum dari noda kuning muda kehijauan dengan Rf 0,93 adalah 0,829, sehingga panjang gelombang maksimum masing-masing noda adalah 220 nm, 208,1 nm, dan 207,0 nm. Dari panjang maksimum yang diperoleh, maka noda-noda tersebut bukan klorofil a, klorofil b dan karotenoid karena berdasarkan literatur panjang gelombang maksimum klorofil a adalah 430 nm dan 669 nm, panjang gelombang klorofil b adalah 453 nm dan 652 nm, sedangkan panjang gelombang maksimum karotenoid adalah 430-480 nm. Perbedaan panjang

gelombang maksimum yang diperoleh dari percobaan dengan literatur kemungkinan dikarenakan pada saat pengujian dengan spektroskopi UV-Vis, larutan sampel tidak mencapai 2/3 kuvet karena sampel sudah menguap. Sehingga cahaya monokromatis alat spektroskopi UV-Vis hanya mengenai sedikit larutan sampel dan larutan sampel hanya menyerap sedikit cahaya monokromatis yang menyebabkan panjang gelombang maksimumnya lebih kecil dari panjang gelombang maksimum literatur. Oleh karena kesalahan-kesalahan yang dapat terjadi saat praktikum, maka noda dari daun bayam dapat dikatakan mengandung senyawa klorofil a, klorofil b dan karotenoid. Dan dari literatur dikatakan bahwa bayam mengandung beta karotenoid, maka golongan karotenoid pada bayam yang berwarna kuning tersebut adalah beta karotenoid. Berdasarkan data-data spektrum yang ditunjukkan oleh instrumentasi spektroskopi UV-Vis maka struktur dari klorofil a, klorofil b, dan beta karotenoid adalah sebagai berikut: Beta karotenoid

H. KESIMPULAN Kesimpulan dari percobaan ini adalah: 1. Panjang gelombang maksimum noda berwarna kuning adalah 220 nm, panjang gelombang maksimum noda berwarna hijau adalah 208,1 nm, panjang gelombang maksimum noda berwarna kuning muda kehijaun adalah 207,0 nm 2. Harga Rf noda berwarna kuning, hijau, dan kuning muda kehijauan masing-masing sebesar 0,4;0,8 dan 0,93 3. Daun bayam mengandung beta karotenoid, klorofil a dan klorofil b.

I. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2011. Spektofotometri. Online.http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_ analisis/spektrofotometri/ (diakses 6 Mei 2011) Basset, J, et al. 1994. Buku Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Penerbit buku kedokteran EGC. Jakarta. Britton, G, Jensen, S.L., and Pfander, H., 1995,Carotenoids Volume IA: Isolation and Analysis, Birkhauser Verlag, Berlin p. 211. Krisnandi IH. 2002. Pengantar Analisis Instrumental. Bogor: Sekolah Menengah Analisis Kimia Bogor. Sastroamidjojo H. 1991. Spektroskopi. Yogyakarta: Liberty. Scwartz, S.J. dan J.H.V. Elbe. 1996. Colorants. Di dalam Food Chemistry. Third Edition. O.R. Fennema (ed). Marcel Dekker Inc. New York. Shofyan. 2010. Kromatografi Kertas. Online.http://forum.um.ac.id/index.php?topic=23762.0 (Diakses 5 Juni 2011) Sitorus M. 2009.Spektroskopi Eludasi Struktur Molekul Organik.Yogyakarta:Graha Ilmu. Widyaningsih E dan Faiqoh CE. 2009. Spektroskopi UV-Vis. Online.File:///H:/TUGAS% 20 SPEKTRO/UV/spektroskopi-uv-vis.html(diakses 6 Mei 2011) Wiwing M. Isolasi Dan Identifikasi Zat Warna Daun Suji (Pleomele Angustifolia, N.E. Brown) Secara Kromatografi Lapis Tipis Dan Spektrofotometri UvVis. Online.http://rac.uii.ac.id/harvester/index.php/record/view/58202(Diakses 5 Juni 2011)