MAKALAH KAPITA SELEKTA

INTRAVENA IMMUNOGLOBULIN UNTUK TERAPI ALZHEIMER

Anggota:

M. HILMI FATHURRAHMAN (260110090024) OKKY SRI PURWANTI RUTH W.Y. VALENTINE JOSI MEIKA MUTMAINAH (260110090025) (260110090027) (260110090028)

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 20013

DAFTAR ISTILAH

AA Ab Abs APP APP/PS1 A BBB CFS DMEM IVIG LDH

antibodi anti- -amyloid endogen

protein prekursor amiloid atau presenilin. amyloid precursor protein dan presenilin 1

Blood Brain Barrier

Dulbeccos modified eagle medium Nama dagang dari Gammagard Liquid lactate dehidrogenase; LDH assay digunakan untuk mengukur integritas membran sebagai fungsi banyaknya LDH sitoplasmik yang dilepas ke medium.

NFT Sapp

Neuro Fibrilarry Tangle fragmen larut dari APP (Panel A) ke ekstraselular.

BAB I LATAR BELAKANG Alzheimer merupakan penyakit penurunan memori dan kognitif lain yang menyebabkan kematian 3 hingga 9 tahun setelah diagnosis pada lebih dari 35 juta orang di dunia dan 5,5 juta orang di United States. Proses patologi penyakit Alzheimer belum sepenuhnya dimengerti, sebagian dikarenakan penyakitnya baru muncul setelah bertahun-tahun (Bateman et al., 2012). Akumulasi protein misfolded pada otak yang menua menyebabkan kerusakan oksidatif dan inflamasi, yang akhirnya menyebabkan kegagalan energi dan disfungsi sinaps (Querfurth and LaFerla, 2010). Lebih dari satu dekade dari pertama diterimanya penggunaan asetilkolin esterase inhibitor pada pasien Alzheimer, masih belum ada pengobatan atau kombinasi terapi yang dapat secara efektif menghentikan atau membalikkan penyakit neurodegeneratif. Biaya untuk mengobati penyakit Alzheimer pada tahun 2010 mencapai lebih dari $172 milyar di United States, yang diprediksi akan meningkat hingga 1 triliun dolar pada tahun 2050 kecuali jika dikembangan pengobatan untuk penyakit tersebut (Bateman et al., 2012). Akhir-akhir ini hipotesis target terapi amyloid mendapatkan banyak kritikan, termasuk penggunaan gamma secretase inhibitor untuk mengurangi pembentukan beta amyloid, agen untuk mencegah aggregasi oligomer amyloid, dan imunoterapi untuk meningkatkan klirens amyloid dan plak. Hanya ada 5

pengobatan yang disetujui oleh FDA untuk mengobati Alzheimer, termasuk 4 AChEIs dan antagonis 1- N-methyl-daspartate (NMDA) (Ling and Min, 2010). BAB II ISI

Alzheimer adalah bentuk umum dari dementia progresif, terhitung sebanyak 50% hingga 56% kasus pada autopsi dan klinik paling umum terjadi pada lansia. Alzheimer merupakan penyakit neurodegeneratif dengan karakteristik atropi otak, kehilangan neuron dan fungsi sinaptik, plak amyloid, pembentukan Neuro Fibrilarry Tangle (NFT). Pada hipotesis amyloid, terjadinya

hiperfosforilasi Tau menyebabkan deposisi peptida -amyloid dan NFT sehingga mengakibatkan agregasi -amyloid, mengakibatkan neurotoksik (Ling and Min, 2010). Penyakit Alzheimer dikombinasikan dengan penyakit intraserebral vaskular menyebabkan 13% hingga 17% kasus. Faktor resiko utama dari penyakit Alzheimer adalah umur. Insiden penyakit ini meningkat dua kali lipat setiap 5 tahun pada umur setelah 65 tahun, dengan diagnosis 1275 kasus baru setiap tahun pada 100.000 orang dengan umur lebih dari 65 tahun (Querfurth and LaFerla, 2010). Salah satu terapi target amyloid menggunakan imunoterapi adalah Intravenous Immunoglobulin. Telah diketahui bahwa antibodi anti-amyloid endogen sedikit meningkat pada CFS bersama dengan perusakan Blood Brain Barrier (BBB) yang mengarahkan mikroglia dan memodulasi fagositosis amyloid yang keuanya mengurangi bahaya amyloid. Plak amyloid berisi IgG dan glia fagositik pada pasien Alzheimer . Pada pembuluh vena yang sama, pemberian
4

immunoglobulin intravena, immunoterapi pasif, mungkin efektif. Dalam

uji

klinik dengan sampel kecil, IVIG menunjukkan penurunan CSF A, untuk meningkatkan fungsi kognitif dan menstabilkan fungsi kognitif pada pasien Alzheimer selama pemberian IVIG (Ling an Min, 2010). Immunoglobulin yang dimurnikan diperoleh dari plasma manusia sehat untuk terapi gangguan immunodefisiensi primer dengan kerusakan imunitas humoral. IVIG mengandung auto-antibodi alami, termasuk antobodi-antibodi yang melawan peptida -amyloid yang terakumulasi di otak pasien Alzheimer. Antibodi -amyloid yang terdapat di IVIG mengikat plak -amyloid sehingga menurunkan A-induced toxicity. Antibodi IgG yang tidak mengikat A melindungi otak dari brain injuries akut. IVIG mengandung antibodi A sehingga dapat memblok fibrilisasi A dan mencegah A-mediated neurotoxicity in vitro. IVIG mampu menghancurkan A fibril sintetik dan mengaktifkan uptake A sintetik oleh mikroglia (Magga et al., 2010). Pada penelitian ini, didemonstrasikan bagaimana IVIG dapat mencegah toksisitas A pada hippocampal neuron dan efek IVIG dalam memediasi neuroproteksi dengan meningkatkan microglia (Magga et al., 2010).

Neuroinflammatory Sitokin Signaling dan Penyakit Alzheimer Neuroinflammation, dinyatakan sebagai frank aktivasi mikroglial dengan ekspresi berlebihan dari sitokin memiliki hubungan dengan perkembangan penyakit Alzheimer dan cedera otak traumatis, infeksi sistemik, penuaan normal, dan beberapa gangguan neurologis. Neuroinflammation berkontribusi

menyebabkan penyakit Alzheimer pada orang dengan sindrom Down (karena kelebihan gen merupakan karakteristik dari sindrom) dan pada orang dengan mutasi genetik yang mempengaruhi protein prekursor amiloid (APP) atau presenilin. Vom Berg et al. menyelidiki peran sitokin proinflamasi dalam patogenesis penyakit. Hasilnya menunjukkan bahwa redaman ekspresi dan sinyal dari sitokin interleukin-12 dan interleukin-23 pada model tikus dikaitkan dengan penurunan aktivasi mikroglial, di tingkat larut -amyloid (AA), dan dalam beban plak AA keseluruhan . Temuan ini konsisten dengan studi sebelumnya yang mengaitkan aktivasi mikroglial dengan kelebihan ekspresi interleukin-1 (yang mengatur interleukin-12-interleukin-23 signaling3) dan ekspresi APP (yang ketika dibelah menghasilkan AA), perkembangan plak AA, dan aktivasi mikroglia pada otak pasien dengan penyakit Alzheimer. Vom Berg et al. juga mengamati bahwa pengiriman

intracerebroventricular dari antibodi terhadap subunit-p40 umum untuk kedua interleukin-12 dan interleukin-23 - membalikkan penurunan kognitif yang

berkaitan dengan usia pada tikus dan bahwa pembalikan ini disertai dengan penurunan tingkat AA larut. Pengamatan ini menunjukkan bahwa penindasan sinyal oleh interleukin-12, interleukin-23, atau sitokin inflamasi lainnya dapat mencegah atau menunda timbulnya penyakit Alzheimer dan, untuk pasien yang sudah menjalani penurunan kognitif penyakit Alzheimer, dapat menghentikan penurunan tersebut. Inflamasi dan penyakit Alzheimer. Tekanan saraf yang memicu ekspresi -protein prekursor amiloid (APP) oleh neuron berhubungan dengan peningkatan risiko penyakit Alzheimer, sehingga melepaskan fragmen larut dari APP (Sapp) (Panel A) ke ekstraselular. Pada gilirannya, Sapp mengaktifkan mikroglia dan menginduksi sintesis dan pelepasan sitokin proinflamasi interleukin-1. Tindakan ini memunculkan peningkatan lebih lanjut dalam ekspresi APP neuronal dan menginduksi ekspresi interleukin-23 dan interleukin-12, dua sitokin proinflamasi lainnya yang berbagi subunit p40 umum. Ekspresi interleukin ini menyebabkan interleukin-23R-12R1 mengikat reseptor bersama mereka akan dikaitkan dengan peningkatan konsentrasi AA larut, ketinggian kepadatan plak AA, dan penurunan kognitif pada model tikus penyakit Alzheimer. Eksperimental penekanan SiRNA subunit p40 menghalangi pengikatan interleukin-23 dan interleukin-12 pada reseptor mikroglial, interleukin-23R12R1, yang mengakibatkan penurunan kadar AA larut dan plak AA sedikit. Paling relevan sebagai strategi terapi mungkin untuk penyakit Alzheimer pada manusia adalah temuan bahwa pengobatan tikus dengan antibodi penetralisir p40

(ustekinumab) dibalik perubahan perilaku buruk yang terkait dengan penurunan kognitif pada tikus Indikasi untuk penggunaan Immune Globulin intravena dalam kondisi autoimun dan inflamasi Saat ini, immune globulin digunakan dalam pengobatan dari berbagai macam penyakit, lebih dari 75% immune globulin intravenous di Amerika

Serikat diberikan kepada pasien dengan kondisi autoimun atau inflamasi. Beberapa tahun lalu, demielinasi polineuropati kronis inflamasi ditambahkan ke daftar indikasi, dan penggunaan immune globulin intravenous juga sekarang diterima untuk pasien yang menjalani transplantasi ginjal ketika penerima memiliki antibodi tinggi titer atau bila darah donor adalah ABO-kompatibel. Baru-baru ini, FDA menyetujui penggunaan immune globulin untuk mengobati pasien dengan multifokal motorik neuropati. Di Amerika Serikat, immune globulin intravenous telah sering digunakan untuk indikasi off-label. Sejumlah besar penyakit telah menunjukkan berpotensi tanggapan bermanfaat untuk kekebalan intravena globulin dan bagi banyak dari penyakit ini, misalnya, immune globulin intravenous telah digunakan untuk mengobati autisme dan kelelahan kronis sindrom, namun efektivitasnya dalam kondisi ini adalah tidak berdasar. Sebagai alternatif untuk terapi lain, secara keseluruhan penggunaan immune globulin intravenous terus berkembang sebagai wawasan baru diperoleh ke dalam mendasari karakteristik patofisiologi tertentu penyakit dan kebutuhan untuk immunomodulation.

Salah satu bidang yang tumbuh bunga adalah potensi penggunaan immune globulin intravenous pada pasien dengan penyakit Alzheimer. Imunoterapi pasif dengan penggunaan amiloid anti-beta (AA) antibodi dicoba (misalnya, antibodi monoklonal seperti sebagai bapineuzumab), namun pendekatan ini telah membatasi sukses. Baru-baru ini, immune globulin intravenous, yang

mengandung antibodi alami, ditunjukkan mengandung antibodi terhadap peptida AA, dan dalam kedua in vitro kultur sel saraf-dan dalam model tikus in vivo, kekebalan tubuh manusia intravena globulin memiliki menguntungkan effects. intravena immune globulin dipromosikan pengakuan dan penghapusan deposito AA native dibentuk oleh mikroglia. Sebuah 18-bulan, open-label, ikutan terbaru studi dari 24 pasien dengan penyakit Alzheimer penyakit menerima immune globulin intravenous menunjukkan pengurangan pembesaran ventrikel pada magnet resonance imaging dan peningkatan kognisi scores. studi terkontrol yang lebih besar diperlukan untuk mengatasi kemanjuran intravena kekebalan globulin dalam Alzheimer penyakit.

BAB III METODE 3.1 Persiapan awal 3.1.1 Persiapan Hewan Tikus yang digunakan adalah tikus peternak transgenik amyloid precursor protein dan presenilin 1 (APP/PS1), yang berasal dari National Laboratory Animal Center, Universy of Eastern Finland. Tikus diciptakan dengan co-injeksi chimeric mouse / manusia APP695 tanpa mutasi K595N/M596L Swedia dan PS1-dE9 (penghapusan ekson 9) vektor yang dikendalikan oleh prion elemen protein promotor tikus independen tikus transgenik ganda, APP/PS1, dikawin silangkan dengan C57BL6 / J selama 10-12 generasi. 3.1.2 Persiapan IVIG (Nama dagang : Gammagard Liquid) IVIG disiapkan dari plasma manusia sehat oleh Baxter Innovation GmbH (Vienna). IVIG kontrol disiapkan tanpa antibodi terhadap A. Konsentrasi Antibodi A sekitar 2 % dari IgG yang ada dalam IVIG dengan molaritas IVIG 150000 Da. 3.2 Fibrilisasi A A 1-42 dilarutkan dalam larutan stok 1 mg/ml dalam air steril.

Terjadi oligomerisasi dan fibrilisasi spontan lalu diinkubasi dalam suhu 37 C selama 24 jam. Keadaan oligomerisasi A dianalisis dengan

immunoblotting untuk A manusia setelah adanya cross-linking sample

10

dengan glutaraldehid. Keadaan fibrilisasi A dikonfirmasi menggunakan mikroskop electron. Efek IVIG terhadap fibrilisasi A dipelajari dengan inkubasi 10mcM A 1-42 terlarut dalam 5,10 dan 30 mcM IVIG atau 30 mcM irrelevant human recombinant IgG sebagai kontrol pada suhu 37 C selama 24 jam. Konsentrasi fibrillar A dikuantifikasi dengan pewarnaan Thioflavin-T. Sampel ditambahkan 2 mcM Thioflavin-T dalam 50 mM glisin pH 9.2. Floresensi diukur pada panjang gelombang 435 dan 485 nm. Potongan cryostat otak tikus APP/PS1 umur 19 bulan diinkubasi dalam medium ex vivo 20 mCm IVIG selama 7 hari . Konsentrasi A 1-42 diukur dengan ELISA A 1-42. 3.3 A neurotoxicity pada sel kultur neuron hippocampal A 1-42 (American Peptide) dilarutkan dalam larutan stok 1 mg/ml dalam air steril. Hippocampal neuron diberi perlakuan dengan A 1-42 fresh tadi dan IVIG selama 24 jam. Medium dikumpulkan dan dianalisis lactate dehidrogenase (LDH). LDH assay digunakan untuk mengukur integritas membran sebagai fungsi banyaknya LDH sitoplasmik yang dilepas ke medium. Hippocampal neuron dibeli 4% folmaldehid dan diwarnai dengan bisbenzimide Hoechst 3342 untuk mendeteksi apoptosis/nekrosis sel. Sel hidup diamati dibawah mikroskop fluorscent berdasar adanya kromatin yang padat. Disiapkan sel kultur neuron hippocampal dari otak tikus E18 C57BL. Hippocampi lalu disuspensikan dalam medium Dulbeccos modified eagle medium (DMEM), 10% FBS dengan penicillin-streptomisin dan di-plated

11

dalam poly-DL-ornithine-precoated (0.5 mcg/mcl) dan dibiakan dalam kelembaban 37 C 5 % CO2. Hari berikutnya, medium diganti menjadi medium neurobasal bebas serum dengan nutrisi 2% B27, 500 mcM glutamin, 25 mcM glutamat dan penisilin-streptomisin. Pada hari ke 2-4 sel diberi 10 mcM sitosin arabinoside untuk mencegah proliferasi sel lain. Sepertiga medium selalu diganti 3-4 hari untuk pemeliharaan. Setelah 11 hari in vitro, hippocampal neuron bisa digunakan untuk penelitian. 3.4 Degradasi A otak oleh sel mikroglia primer Kortek dan otak tengah dibelah dan selaput otak dikeluarkan. Jaringan tadi diresuspensi dalam DMEM,10% FBS, 100 U/ml Penicilin-streptomisin dan 2 mM L-glutamate lalu ditempatkan dalam plate. Mikroglia dipanen setelah 12 DIV dengan menggetarkan flasks pada 120 rpm selama 10-15 menit 37 C. Untuk penelitian ex vivo, mikroglia diresuspensi dalam medium bebas serum X Vivo 15 dengan strepto-penicilin dan 2 mM L-Glutamat. Dilakukan ex vivo degradasi assay, lalu dilihat interaksi IVIG dengan deposit A dengan inkubasi bagian otak dengan IVIG selama 1.5 jam 37 C dan dicuci lalu dikuantifikasi. 3.5 Degradasi A otak oleh sel astrosit primer Hippocampi dan selaput diisolasi kemudian jaringan ditambahkan tripsin lalu disentrifugasi percoll. Kemudian di resuspensi dengan DMEM/F12, 10% FBS, 100 U/mL penisilin-strepto dan suplemen G5, dibiakan dalam suhu 37 C 5 % CO2. Sel glial dihilangkan dengan menggetarkan biakan pada 200 rpm selama 2 jam 37 C.

12

3.6

Penetrasi IVIG ke otak dan hippcampal Tikus kontrol diberi 1 g/Kg 10% IVIG setara dengan 10 ml/Kg saline. Injeksi diberikan 2 kali seminggu selama 1-3 minggu dan juga untuk long term injection diberi 1 kali seminggu. IVIG diinjeksikan ke hippocampi 200 mcG dalam 2 mcL, otak kemudian digunakan untuk immunochemistry.

3.7

Immunochemistry Tikus dianestesi dengan 105 mg/Kg pentobarbiturat dan 425 mg/Kg cholar hidrat dan diperfusi heparinized saline. Otak diambil dan difiksasi dengan paraformaldehid dalam 0.1 M PB selama 4 jam lalu 30% sukrosa dalam 0.1 M PB sepanjang malam dan disimpan di suhu -70 C sampai akan di proses. Bagian koronal otak dipotong dengan microtma freezing-sliding setebal 35 mcM pada level dorsal hippocampus. Bagian yang dilabeli IgG diberi perlakuan 0.1% H202 dalam metanol dan diinkubasi semalaman dengan kelinci anti-human HRP labelled Ab pH 7.6. Immunoreactivity divisualisasi dengan H2O2 dan 0.25% nickel enhanced diaminobenzidine.

13

BAB IV HASIL

IVIG protektif terhadap A pada kultur neuron hippocampal primer. IVIG menghambat fibrilasi A1-42 sintetik tetapi tidak melarutkan A otak yang terbentuk secara ex vivo.

IVIG melindungi neuron hippocampal terhadap toksisitas AB1-42. Dilarutkan 5 M AB1-42 (Ab oligomer) diinkubasi selama 0 atau 48 jam, cross-linked untuk mempertahankan struktur peptida dan dianalisis dengan western blotting dengan anti-Ab antibodi (6E10). Kemudian dilarutkan AB1-42 terdiri dari monomer, dimer, berbagai bentuk oligomer dan agregat dengan molekul yang lebih besar berat (Mw). Setelah 48 jam inkubasi, bentuk Mw rendah

14

AB1-42 berkurang sementara agregat Mw tinggi yang terdeteksi (A). Mw AB1-42 monomer 4,5 kDa. Setelah 48 jam inkubasi, sitotoksisitas itu ditentukan dengan cacat integritas membran sel dan adanya kromatin kental dalam inti. AB1-42 adalah sangat sitotoksik (B, C) di konsentrasi mikromolar (n = 3, p <0,001). IVIG mengurangi AB1-42-induced neurotoksisitas oleh ketentuan pelepasan LDH sitoplasma (B, n = 3, p <0,05) dan jumlah sel apoptosis / nekrotik (C, n = 3, p <0,001). Pengaruh IVIG pada Ab fibrillization dipelajari dengan menginkubasi larutan 10 M AB1-42 rekombinan IgG manusia (ctrl IgG) selama 24 jam dan mengukur fluorometrically Ab dengan Thioflavin-T pewarnaan. IVIG mengurangi AB1-42 fibrillization (D, p <0,001, n = 3) tapi ini tidak tergantung konsentrasi dan juga terjadi pada adanya IgG tidak relevan (D, p <0,001, n = 3). Untuk mempelajari pengaruh IVIG pada solubilisasi native terbentuk otak Ab deposito, cryostat-potong bagian otak hippocampus tidak tetap dibuat dari usia APP/PS1 tikus diinkubasi dengan 20 pM IVIG selama 7 hari. IVIG tidak melarutkan preformed deposito Ab, pelepasan Ab ke dalam medium tidak meningkat (E, p> 0,05, n = 6), sedangkan Ab immunoreactive daerah di bagian otak tidak menurun (F, p> 0,05, n = 6), sebagaimana ditentukan dengan ELISA dan immunostaining.

15

IVIG meningkatkan klirens A dimediasi-mikroglia ex vivo dengan mekanisme yang terkait dengan A Abs dan dehradasi lisosomal. Klirens A IVIG-enhanced spesifik untuk mikroglia karena IVIG tidak mempengaruhi klirens A oleh astrosit. IVIG mempromosikan mikroglia-dimediasi Ab bentuk native. Dalam sebuah uji ex vivo, bagian otak sel mikroglial tikus neonatal diinkubasi di atas APP/PS1. Setelah masa inkubasi 24 jam, beban Ab dihitung oleh Ab immunostaining. Mikroglia mengurangi beban Ab ex vivo (A, C, n = 6-8, p <0,05) yang diukur dari seluruh daerah hippocampus. IVIG lanjut dipromosikan mikrogliadimediasi izin Ab (A, C, n = 6-8, p <0,05). Pengurangan Ab diamati sebagai Ab bebas di bagian otak pada situs mikroglia sel tubuh, divisualisasikan dengan DAPI, sebagaimana dicontohkan untuk subiculum (D). Ketika uji ex vivo dilakukan untuk tikus dewasa astrosit, peneliti mengamati penurunan yang signifikan dari Ab beban (B, n = 6-8, p <0,01), diukur dari daerah hippocampus keseluruhan, tetapi tidak ada promosi clearance Ab dengan sampai 20 pM IVIG (B, n = 6-8). Skala bar 200 m (C) dan 50 m (D). IVIG mempromosikan miroglia-dimediasi difus Deposito Ab. Dalam hippocampus mikroglia-dimediasi pengurangan beban Ab adalah yang paling jelas dalam subiculum ini yang ditampilkan baik padat (panah) dan menyebar (panah) Ab deposisi (B). Kami mengamati mikroglia utama untuk mengurangi beban Ab dari subiculum (A, n = 15, p <0,05). IVIG lanjut mempromosikan izin

16

mikroglia-dimediasi Ab (A, n = 15, p <0,05). Diffuse Ab deposito (panah) itu sangat berkurang dan hampir menghilang ketika diinkubasi pada mikroglia dan IVIG 20 mM (B). Ab bebas, hadir di bagian otak diinkubasi dengan mikroglia atau mikroglia dan IVIG, ditunjukkan dengan tanda bintang (*). IVIG melakukan tidak mempengaruhi proliferasi sel atau kelangsungan hidup yang diukur dengan aktivitas metabolik seluler (C). Skala bar 50 m.

Promosi clearance mikroglia-dimediasi Ab tergantung pada antibodi Ab di IVIG. Berkurangnya antibodi Ab dari IVIG signifikan membahayakan IVIGdipromosikan mikroglia-dimediasi izin Ab (A, n = 5-6, p <0,05) dicitrakan dalam subiculum (B).

17

Preincubation bagian otak dengan 20 mM IVIG diikuti dengan mencuci keluar dari setiap terikat IVIG sebelum penambahan eksogen mikroglia primer dilestarikan mikroglia-dimediasi izin Ab (A, B, n = 5-6, p <0,001) yang tidak secara signifikan berbeda dari inkubasi ex vivo di hadapan IVIG seluruh assay (n = 5-6, p> 0,05). Garis putus-putus merupakan daerah immunoreactive Ab secara utuh bagian otak hippocampus diinkubasi tanpa mikroglia. Signifikansi statistik clearance Ab dibandingkan dengan bagian otak utuh diinkubasi tanpa mikroglia adalah ditampilkan sebagai tanda bintang di bawah garis putus-putus, yang menunjukkan masing-masing nilai-p. Skala bar 100 m.

Mekanisme selular klirens A memiliki relevasi yang potensial in vivo karena setelah pemberian perifer IVIG berpenetrasi ke otak tikus mencapai

18

konsentrasi maksimal dalam hippocampus dan secara selektif berikatan dengan deposit A dalam ko-lokasisasi dengan mikroglia. IVIG sebagian dapat mengembalikan microgliamediated Izin Ab dihentikan oleh Baf. Di hadapan Baf, 20 M IVIG pengobatan mengakibatkan izin rendah dan sebagian besar dari difus Ab deposito hanya (A, B, n = 3-4, p <0,05). Dense (panah) dan menyebar (Panah) deposito Ab ditunjukkan dalam subiculum tersebut. Skala bar 50 um.

IgG immunoreactivity manusia terdeteksi di otak setelah pemberian perifer IVIG. Untuk mempelajari apakah bisa IVIG menembus BBB untuk mencapai otak parenkim, APP/PS1 tikus disuntik ip dengan IVIG 1 g / kg atau garam dimulai pada usia 4 bulan. Itu IVIG diidentifikasi dari cryostat-potong bagian otak tikus dengan IgG anti-manusia. IVIG menembus BBB terbukti dengan intensif IgG manusia pewarnaan di hipokampus tikus (A) dengan gradien anteriorposterior jelas dengan immunoreactivity tertinggi pada akhir septum dari hippocampus berdekatan dengan koroid pleksus. Juga, immunoreactivity kuat

19

diamati melapisi ventrikel (A). Intensitas IgG manusia immunoreactivity meningkat dengan durasi pengobatan IVIG dari 1 sampai 14 minggu IVIG admininistration (C). Tikus Saline-perlakuan tanpa immunoreactivity khusus untuk IgG anti-manusia (B). Dalam hippocampus, deposito Ab muncul sebagai pola stippled dari agregat materi yang dibahas dengan immunoreactivity untuk IgG manusia (panah hitam) (D). Setelah suntikan intrahippocampal tunggal IVIG IgG immunoreactivity tersebar homogen di seluruh hippocampus (E), sedangkan kuat IgG immunoreactivity diamati sebagai stippled pola (E). Skala bar 200 m (A, B, E) dan 50 m (D).

IVIG berinteraksi dengan Ab otak tikus di APP/PS1 setelah pemberian perifer. Rangkap tiga pelabelan immunofluorescence deposito Ab, IgG manusia dan mikroglia dilakukan setelah perifer i.p. administrasi IVIG. Deposito Ab-immunoreactive (A) dan IgG manusia (B) diamati untuk bersama-pelokalan di parenkim otak, seperti yang diungkapkan oleh confocal mikroskop laser scanning dicitrakan di korteks entorhinal lateralis (D). Human

20

IgG terdeteksi terutama dalam Ab plak, tetapi juga dalam pembuluh darah (B). Manusia IgG yang terikat deposito Ab adalah dikelilingi oleh Iba-1 mikroglia positif (C, D). Penggabungan immunosignals di (D) menunjukkan bahwa deposito Ab menjadi sasaran kedua oleh IgG manusia dan direkrut mikroglia. Penghilangan primer antibodi mengakibatkan tidak adanya diharapkan

immunolabelling. IVIG telah diusulkan sebagai terapi potensial untuk AD dan baru-baru ini telah terbukti dapat mengurangi patologi AD dalam studi 18 bulan dilakukan dengan 8 pasien dengan AD ringan . Namun, mekanisme yang tepat bagaimana Pengobatan IVIG dapat meningkatkan AD patologi jelas. Penelitian kami menunjukkan bahwa - di samping neuroproteksi terhadap toksisitas Ab - IVIG meningkatkan mikroglia-dimediasi tetapi tidak astrosit-dimediasi Ab izin. Imunoglobulin secara umum tampaknya mengurangi Ab toksisitas, dan ini efek yang menguntungkan secara signifikanditingkatkan oleh Ab spesifik Abs. Kami menunjukkan bahwa perifer administered IVIG menembus ke otak tikus transgenik meniru AD manusia patologi dan selektif mengikat deposito Ab di parenkim otak. Deposito Ab co-lokal dengan IVIG juga erat dikelilingi dengan Iba-1 mikroglia positif, menunjukkan relevansi penting in vivo. Akumulasi Ab dalam otak AD pasien mencerminkan ketidakseimbangan antara pengendapan Ab dan pembersihannya dari parenkim otak, menyebabkan peristiwa patologis termasuk neurotoksisitas dan peradangan. Peneliti melakukan studi neurotoksisitas dengan baru dilarutkan AB1-42, model Ab toksisitas dalam

21

Kehadiran Ab oligomer dan fibril, seperti yang kita dan orang lain telah dijelaskan sebelumnya . IVIG atau dimurnikan Ab Abs IVIG telah terbukti dapat menghambat neurotoksisitas diinduksi oleh Ab oligomer dalam neuron kortikal tikus dan sel sekunder N2A . Penelitian menunjukkan IVIG mengurangi AB1-42 diinduksi neurotoksisitas dalam sel tikus primer neuron dibiakkan dari hippocampus, otak daerah biasanya mempengaruhi di AD. Britschgi et al. melaporkan bahwa IgG dimurnikan dari AD individu pasien atau kontrol non-gila sehat mengurangi Ab neurotoksisitas dengan cara yang sama. Deposito Ab dikurangi pada model tikus transgenik AD melalui beberapa mekanisme: (i) penghambatan Ab fibrillization oleh Ab mengikat Ab , (ii) dimediasi sel glial clearance Ab, termasuk mikroglia-mediated fagositosis dari opsonized deposito Ab , dan (iii) perifer tenggelam rute di mana Ab Abs dalam plasma ekstrak Ab melalui kesetimbangan ke penghabisan Ab melintasi BBB . Perlu dicatat di sini, bahwa asal berbeda IVIG persiapan dapat menjelaskan mengikat spesies Ab ke berbagai tingkat menyebabkan kemungkinan sumber variasi antara studi yang berbeda. Abs dimurnikan dari IVIG telah terbukti secara in vitro menghambat fibrillization sebagai serta untuk membubarkan fibril preformed dari AB25-35, AB1-40 dan AB1-42 . Selain itu, IVIG sendiri tanpa langkah pemurnian lebih lanjut ditunjukkan untuk membubarkan preformed AB140 fibril [39]. Kami telah banyak menggunakan AB1-42 oligomerisasi dan Model fibrillization di kami sebelumnya Ab neurotoksisitas studi . Memanfaatkan model ini, kami mengamati IVIG untuk sederhana mengurangi sintetis AB1-42 fibrillization seperti yang dideteksi dengan

22

Thioflavin-T noda. Temuan ini ini sejalan dengan penelitian sebelumnya dengan IVIG di AB1-42 fibrillization . Namun, kami menemukan ini bukan karena setiap komponen tertentu hadir dalam IVIG karena juga terjadi atas permohonan dari manusia rekombinan relevan kontrol Ab, menyarankan mekanisme independen Ab Abs dan mungkin sebagian karakteristik untuk fragmen Ab pada umumnya. Selain itu, kami mengamati tidak ada efek IVIG pada solubilisasi native terbentuk Ab manusia deposito dari APP/PS1 bagian otak tikus. Selain mendeteksi ada solubilisasi Ab ke media, kita mengamati tidak ada efek IVIG pada Ab beban diukur dari APP/PS1 bagian otak tikus baik. Karena IVIG tidak efek tambahan pada AB1-42 fibrillization bila dibandingkan untuk relevan IgG, kami sarankan IVIG memiliki efek langsung pada sel saraf untuk mengurangi AB1-42 keracunan, atau tidak langsung perlindungan melalui netralisasi AB1-42. IVIG sebelumnya telah ditunjukkan untuk meningkatkan penyerapan eksogen tersedia urat saraf Ab di BV-2 sel, model garis sel sekunder untuk mikroglia. Alih-alih menentukan Ab serapan, penelitian fagositosis Ab oleh mikroglia tikus primer mantan vivo assay, dimana ijin native disimpan otak Ab dipelajari. Clearance Ab oleh primer mikroglia telah terbukti terjadi terutama setelah opsonisasi deposito Ab membutuhkan dekorasi mereka dengan Abs untuk pengakuan konsekuen oleh mikroglia . Kami menemukan mikroglia utama untuk mengurangi Ab beban tanpa langkah opsonisasi sebelumnya diperlukan. Selain itu, kami menemukan IVIG untuk lebih meningkatkan timbunan Ab dalam tergantung dosis cara. Selain itu, perawatan pra-otak bagian dengan IVIG dan mencuci-out dari terikat IVIG sebelum penerapan mikroglia sudah cukup

23

untuk meningkatkan clearance deposito Ab. Hal ini menunjukkan bahwa interaksi IVIG dengan deposito Ab mungkin cukup untuk mempromosikan izin Ab oleh mikroglia. Selain itu, izin mikroglia-dimediasi Ab secara signifikan berkurang di hadapan habis IVIG dibandingkan untuk IVIG, menunjukkan bahwa Ab Abs hadir dalam IVIG berpartisipasi clearance Ab. Kemampuan IVIG untuk menginduksi promosi clearance Ab tampaknya khusus untuk mikroglia utama, karena kami tidak menemukan peningkatan lebih lanjut Ab clearance oleh astrosit primer. Pengurangan menyebar deposito Ab terjadi pada situs sel tubuh mikroglial, di mana rongga di lapisan manusia Ab terlihat terbentuk. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa mikroglia mengungkapkan protease seperti MMPs yang bisa menurunkan Ab ekstrasel dan bahwa IVIG menginduksi ekspresi MMP-9 di mikroglia. Ketika ex vivo bagian otak diinkubasi di hadapan mikroglia-AC dan mikroglia ditambah IVIG-AC media, kami mengamati tidak ada pengurangan yang signifikan otak Ab beban (data tidak ditampilkan), menunjukkan bahwa protease ekstraseluler yang disekresikan oleh mikroglia tidak microgliamediated Izin Ab. Mikroglia terbukti menginternalisasi Ab dan mengirimkannya ke lisosom di mana sebagian besar non-selektif degradasi protein berlangsung. Baf, penghambat V-ATPase, mengganggu pemeliharaan intralysosomal pH rendah [49]. Kami mengamati bahwa deposito Ab tetap sebagian besar utuh dalam bagian dengan Baf, menunjukkan bahwa intralysosomal pH dan inaktivasi diantisipasi lisosomal protease oleh Baf mempengaruhi kemampuan untuk mikroglia jelas Ab. Namun,

24

bahkan di hadapan Baf, IVIG pengobatan mengakibatkan mikroglia-dimediasi izin sebagian besar dari deposito menyebar Ab, menunjukkan bahwa IVIG dapat mempotensiasi mikroglia-dimediasi izin Ab oleh menangkal defisit lisosomal pada mikroglia. Selain itu, mikroglia dilemahkan memiliki lisosom asam lemah, dan pengasaman lisosomal selama aktivasi mikroglia diperlukan untuk degradasi Ab oleh mikroglia . Dengan demikian hasil penelitian menunjukkan bahwa pembukaan Ab terjadi dengan degradasi lisosomal dan meningkatkan aktivitas lisosomal mikroglia, berpotensi oleh IVIG, dapat meningkatkan Ab izin. Baru-baru ini, reseptor untuk aktivitas anti-inflamasi IVIG diidentifikasi. Sialylated IgG Fc fragmen di IVIG yang ditunjukkan untuk mengikat DAFTARR1, reseptor pada splenocytes tikus, sehingga sekresi larut antiinflamasi mediator yang mengatur aktivitas makrofag . Namun, karena model kami didasarkan pada terisolasi mikroglia dari CNS, ini tidak mungkin mekanisme untuk kegiatan IVIG. Umumnya, IVIG telah diusulkan untuk mengatur FcgR mengaktifkan dan penghambatan pada makrofag untuk memodulasi inflamasi . Karena Efek FcgRdimediasi lebih suka menekan inflamasi jalur, termasuk fagositosis, hal ini tidak kemungkinan mekanisme menjelaskan IVIG-disempurnakan fagositosis di mikroglia. Di hadapan IVIG, BV-2 mikroglia tampilan bercabang morfologi dengan tinggi ekspresi aktivasi penanda CD45, menunjukkan bahwa IVIG menginduksi pola aktivasi tertentu pada mikroglia . Selain itu, telah ditunjukkan bahwa intrakranial Ab Ab administrasi mengarah ke clearance biphasic dari

25

Deposito Ab ; pertama penghapusan cepat menyebar Ab deposito, dan yang kedua penghapusan deposito Ab kompak terkait dengan aktivasi transien mikroglia. Kami menemukan IVIG meningkatkan mikroglia-dimediasi dari difus Ab sebagian besar tergantung pada Ab Abs. Imunoglobulin tidak dirubah menunjukkan kecenderungan rendah untuk menembus BBB, tetapi dalam kondisi tertentu seperti tahap spesifik penyakit dan penuaan, imunoglobulin memiliki akses lebih mudah ke otak . Abs Alam mengakui oligomer Ab majelis telah ditemukan berada di serebrospinal manusia fluida, tetapi pada 30-230 kali konsentrasi yang lebih rendah daripada dalam plasma tetapi repertoar IgG Abs adalah sama di kedua kompartemen . IgG telah ditunjukkan untuk mengikat deposito Ab di otak pada pasien AD sementara IgG indeks pelabelan plak tinggi disertai dengan mengurangi beban plak menunjukkan bahwa auto-Abs melawan Ab dapat membantu untuk mengontrol beban Ab . Apakah pemberian IVIG, sebagai terapi, bisa lebih meningkatkan pelabelan plak pada pasien dengan tinggi IgG plak indeks pelabelan atau mengkompensasi penurunan plak pelabelan dalam penderita dengan rendah IgG label plak Indeks untuk lebih meningkatkan pengakuan dan fagositosis deposito Ab masih harus diklarifikasi. Seperti yang disampaikan di sini, kami mempelajari penetrasi diberikan perifer eksogen IVIG ke otak dan mengikat Ab deposito. Dengan menyuntikkan IgG manusia ke dalam tikus, kami memiliki kesempatan untuk memvisualisasikan distribusi IVIG di otak tikus. Peneliti menemukan bahwa perifer diberikan IVIG mencapai parenkim otak dengan cukup konsentrasi untuk dideteksi, tetapi yang juga signifikan perbedaan regional ada. Konsentrasi

26

tertinggi IgG manusia ditemukan di hippocampus septum dengan gradien menurun jelas menjelang akhir sementara dari struktur otak. Bersama dengan immunoreactivity IgG melapisi ventrikel, temuan ini menunjukkan bahwa rute akses utama ke IVIG otak tikus adalah melalui pleksus koroid.

27

BAB V KESIMPULAN

IVIG meningkatkan pengenalan dan pembersihan deposit A yang terbentuk di manusia oleh mikroglia. A Abs alami dalam IVIG berinteraksi dengan dan meningkatkan fagositosis depisot A , menghasilkan peningkatan klirens A dimediasi-mikroglia. Hasil ini memiliki relevansi terapeutik in vivo, pemberian perifer IVIG berpenetrasi melalui BBB dan secara spesifik berikatan dengan deposit A alam parenkim otak. Hal ini memdukung IVIG sebagai terapi yang potensial untuk mengimbangi kekurangan A Abs dalam yang dapat menyebabkan toksisitas A-terinduksi.

28

DAFTAR PUSTAKA

Bateman, Randall J., Chengjie Xiong., Tammie L.S. Benzinger, Anne M. Fagan, et al. 2012. Clinical and Biomarker Changes in Dominantly Inherited Alzheimers Disease. N Engl J Med 367:795-804. Fan, Ling Yun and Chiu Ming Jang. 2010. Pharmacological Treatment for Alzheimers Disease :Current Approaches and Future Strategies. Acta Neurologica Taiwanica.19 : 4 Hanisch UK, van Rossum D, Xie Y, Gast K, Misselwitz R, Auriola S, Koistinaho J, Kettenmann H, Moller T: The microglia-activating potential of thrombin: the protease is not involved in the induction of proinflammatory cytokines and chemokines. J Biol Chem 2004, 279:51880-7. Hartig W, Reichenbach A, Voigt C, Boltze J, Bulavina L, Schuhmann MU, Seeger J, Schusser GF, Freytag C, Grosche J: Triple fluorescence labelling of neuronal, glial and vascular markers revealing pathological alterations in various animal models. J Chem Neuroanat 2009, 37:128-38. Hartung HP, Mouthon L, Ahmed R, Jordan S, Laupland KB, Jolles S. Clinical applications of intravenous immunoglobulins (IVIg) beyond immunodeficiencies and neurology. Clin Exp Immunol 2009;158:Suppl 1:23-33. Hughes RA, Donofrio P, Bril V, et al. Intravenous immune globulin (10% caprylate-chromatography purified) for the treatment of chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy (ICE study): a randomised placebo-controlled trial. Lancet Neurol 2008;7:136-44. [Erratum, Lancet Neurol 2008;7:771.] Jankowsky JL, Fadale DJ, Anderson J, Xu GM, Gonzales V, Jenkins NA, Copeland NG, Lee MK, Younkin LH, Wagner SL, Younkin SG, Borchelt DR: Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue

29

betaamyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Hum Mol Genet 2004, 13:159-70. Jordan SC, Peng A, Vo AA. Therapeutic strategies in management of the highly HLA-sensitized and ABO-incompatible transplant recipients. Contrib Nephrol 2009;162:13-26. Kanninen K, Malm TM, Jyrkkanen HK, Goldsteins G, Keksa-Goldsteine V, Tanila H, Yamamoto M, Yla-Herttuala S, Levonen AL, Koistinaho J: Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 protects against beta amyloid. Mol Cell Neurosci 2008, 39:302-13. Koistinaho M, Lin S, Wu X, Esterman M, Koger D, Hanson J, Higgs R, Liu F, Malkani S, Bales KR, Paul SM: Apolipoprotein E promotes astrocyte colocalization and degradation of deposited amyloid-beta peptides. Nat Med 2004, 10:719-26. LeVine H III: Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimers disease betaamyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution. Protein Sci 1993, 2:404-10. Magga J, Puli L, Pihlaja R, et al. Human intravenous immunoglobulin provides protection against A toxicity by multiple mechanisms in a mouse model of Alzheimers disease. J Neuroinflammation 2010;7:90-105. Magga, Johanna., Puli ,Lakshman.,Rea,Pihlaja., Katja,Kanninen., Suvi,Neulamaa., Malm , Tarja., Wolfgang,Hrtig., Jens,Grosche., Gundars, Goldsteins., Heikki,Tanila., Jari Koistinaho., and Koistinaho,Milla . 2010. Human intravenous immunoglobulin provides protection against Ab toxicity by multiple mechanisms in amousemodel of Alzheimers disease. Journal of Neuroinflammation . 7:90 Malm TM, Magga J, Kuh GF, Vatanen T, Koistinaho M, Koistinaho J: Minocycline reduces engraftment and activation of bone marrowderived cells but sustains their phagocytic activity in a mouse model of Alzheimers disease. Glia 2008, 56:1767-79. Newburger JW, Takahashi M, Burns JC, et al. The treatment of Kawasaki syndrome with intravenous gamma globulin. N Engl J Med 1986;315:341-7. ONuallain B, Hrncic R, Wall JS, Weiss DT, Solomon A: Diagnostic and therapeutic potential of amyloid-reactive IgG antibodies contained in human sera. J Immunol 2006, 176:7071-8.

30

Orange JS, Hossney EM, Weiler CR, et al. Use of intravenous immunoglobulin in human disease: a review of evidence by members of the Primary Immunodeficiency Committee of the American Academy of Allergy, Asthma and Immunology. J Allergy Clin Immunol 2006;117:Suppl: S525S553. [Erratum, J Allergy Clin Immunol 2006;117:1483.] Prins C, Gelfand EW, French LE. Intravenous immunoglobulin: properties, mode of action and practical use in dermatology. Acta Derm Venereol 2007;87: 206-18. Relkin N, Moore D, Tsakanikas D, Brewer J. Intravenous immunoglobulin treatment decreases rates of ventricular enlargement and cognitive decline in Alzheimers disease. Neurology 2010;75:380. abstract.

31