BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

LAPORAN PRAKTIKUM INSTRUMENTASI PERLENGKAPAN DAN PERALATAN TEKNIS LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

KELOMPOK NAMA DOSEN

: 3 (TIGA) : DAWAM SUPRAYOGI : Dr. rer.nat. ARI INDRIANTO, S.U

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2013

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

Tujuan Praktikum Mahasiswa dapat menjelaskan dan menggambarkan skema umum laboratorium kultur jaringan, prinsip, fungsi ruang serta peralatan yang ada di dalamnya.

Pendahuluan Bioteknologi merupakan salah satu cara untuk membuat dan memodifikasi produk biologis dengan memanfaatkan teknik-teknik tertentu sehingga

menghasilkan produk yang lebih berkualitas dibandingkan produk alaminya. Dewasa ini perkembangan bioteknologi semakin pesat. Kebutuhan manusia akan tanaman yang berkualitas baik, serta adanya beberapa tanaman yang sulit untuk diperbanyak dengan cara alami membuat kebutuhan akan teknik bioteknologi menjadi semakin meningkat. Salah satu teknik yang digunakan adalah kultur jaringan tanaman. Menurut Suryowinoto (1991) dalam Hendaryono dan Wijayani (1994), kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel cultuus atau gewebe kultur. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Maka, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya. Kultur jaringan akan lebih besar persentase keberhasilannya bila menggunakan jaringan meristem. Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu jaringan yang terdiri dari sel-sel yang selalu membelah, dindingnya tipis, belum mempunyai penebalan dari zat pektin, plasmanya penuh dan vakuolanya kecilkecil. Kebanyakan orang menggunakan jaringan ini untuk tissue culture. Sebab, jaringan meristem keadaannya selalu membelah, sehingga diperkirakan mempunyai zat hormon yang mengatur pembelahan. Kultur jaringan tanaman merupakan teknik yang telah ada selama lebih dari 30 tahun. Teknik ini dilakukan dengan membudidayakan sel, jaringan, atau organ tanaman pada medium bernutrisi yang diformulasikan khusus. Dalam kondisi 1

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

yang tepat, tanaman dapat diregenerasi dari satu sel. Terdapat beberapa jenis kultur jaringan tergantung pada bagian tanaman (eksplan) yang digunakan (Anonim, 2010). Penerapannya teknik kultur jaringan membutuhkan tempat kerja, peralatan, dan rangkaian kerja yang aseptis. Proses pelaksanaannya meliputi tahap persiapan alat dan medium; inokulasi dan inisiasi kultur; pemeliharaan (inkubasi), dan aklimatisasi. Sebagian besar pelaksanaan kultur jaringan dilakukan dalam laboratorium. Menurut Indrianto (2013) laboratorium yang baik untuk melakukan kultur jaringan harus memiliki kriteria aman, bersih, memiliki organisasi dan penataan ruang yang sesuai. Ruangan laboratorium harus rutin dibersihkan dengan antiseptik. Penataan ruangan yang sesuai juga diperlukan untuk memudahkan proses pengerjaan, karena setiap tahapan pengerjaan sebaiknya dilaksanakan pada ruang terpisah. Dalam melaksanakan proses inokulasi dan inisiasi kultur serta inkubasi, ruangan yang digunakan harus benar-benar aseptis. Lokasi laboratorium sebaiknya tidak berdekatan dengan lingkungan yang dapat menimbulkan polusi. Laboratorium kultur jaringan di buat tertutup tanpa ventilasi dan jendela kaca yang digunakan harus tertutup permanen lalu dipasang exhauster untuk menyedot debu yang ada di dalam ruangan. Untuk menjaga suhu tetap konstan 25-28oC maka perlu dipasang AC. Selain itu, ketersediaan listrik, air yang cukup, dan gas juga harus dimiliki (Indrianto, 2013).

Deskripsi Laboratorium Laboratorium Bioteknologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada merupakan sebuah tempat yang digunakan untuk melakukan berbagai akitivitas yang berkaitan dengan percobaan maupun kegiatan-kegiatan penelitian. Dalam menjalankan fungsinya, laboratorium ini didukung dengan perangkat peralatan, bahan-bahan, mekanisme serta tata cara penggunaan alat, dan organisasi pengelolaannya. Laboratorium ini dipimpin oleh Bapak Dr.rer.nat. Ari Indrianto, 2

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

S.U., dan dibantu oleh dua staff dosen lainnya yaitu Ibu Dra. Endang Semiarti, M.S., M.Sc., D.Sc. dan Bapak Eko Agus Suyono, S.Si., M.App.Sc., serta asisten dan 2 orang laboran. Ruangan yang terdapat di dalam laboratorium ini meliputi ruang praktikum, ruang penyimpanan alat, ruang bahan, ruang penaburan, ruang inkubasi, ruang sterilisasi medium, ruang penyimpanan medium, ruang preparasi medium, ruang dosen, ruang asisten dan ruang komputer, serta ruang administrasi. Pengenalan alat-alat laboratorium dan tata cara penggunaannya yang benar, akan
Ruang Dosen 1 Ruang Dosen 2 Ruang Dosen 3
Mushola

memudahkan proses penelitian sehingga akan

Ruang Administrasi

Tempat penyimpanan alat peneliti

Meja Praktikum dan Penelitian

menghasilkan
Meja Praktikum dan Penelitian
Ruang Alat

tanaman yang baik.

kultur

Meja Praktikum dan Penelitian

Ruang Asisten

Meja Praktikum dan Penelitian

Ruang Penaburan

Ruang Preparasi Medium

Ruang Penyimpanan Medium

Ruang Sterilisasi Medium

Ruang Inkubasi

Gambar 1. Denah Laboratorium Bioteknologi Fakultas Biologi

Metode Pelaksanaan A. Waktu dan Tempat Waktu dan tempat pelaksanaan praktikum yaitu : Hari/tanggal Pukul Tempat : Rabu, 27 November 2013 : 08.00 sampai selesai : Laboratorium Bioteknologi Universitas Gadjah Mada

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

B. Alat Pada praktikum kali ini dijelaskan cara penggunaan alat-alat yang digunakan pada proses kultur jaringan. Antara lain: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Alat gelas Autoklaf Centrifuge Enkas Magnetic stirrer dengan atau tanpa pemanas Inkubator Incubator Shaker Kompor Gas Laminar Air Flow

10. Lemari Pendingin 11. Microwave 12. Mikroskop 13. PCR Machine 14. pH Meter 15. Timbangan Analitik

Instrumentasi Alat Pada praktikum instrumentasi ini, dijelaskan beberapa alat yang biasa digunakan dalam praktikum maupun penelitian kultur jaringan. Setiap alat memiliki fungsi dan spesifikasi masing-masing, sehingga dalam penggunaannya menyesuaikan dengan kebutuhan peneliti. Selanjutnya akan dijelaskan beberapa alat yang terdapat dalam laboratorium bioteknologi.

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

1. Alat Gelas Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, tabung reaksi, corong kaca, pengaduk kaca, petridish dan dissecting set seperti skalpel dan pinset haras diletakkan di dalam tempat tersendiri. Penggunaan alat-alat gelas disesuaikan dengan kebutuhan, namun harus disterilisasi terlebih dahulu agar tidak terjadi kontaminasi pada eksplan atau medium.

2. Autoklaf Pada laboratorium kultur jaringan terdapat tiga tipe autoclave yakni autoklaf tipe lama, programmable, dan portable. Autoklaf merupakan alat yang

digunakan untuk sterilisasi dengan uap panas bertekanan. Metode sterilisasi ini dilakukan dengan suhu 121oC dan tekanan 15psi selama 15-20 menit. Alat yang dapat di sterilisasi menggunakan autoklaf adalah alat kaca dan logam yang tahan panas. Selain untuk sterilisasi alat, autoklaf juga digunakan untuk sterilisasi medium.

Cara menggunakan

1. Dibuka tutup autoklaf dengan hati-hati 2. Dipastikan jumlah akuades di dalam autoklaf cukup 3. Dimasukkan peralatan dan bahan ke dalam keranjang autoklaf. Jika bahan yang akan disterilisasi berupa botol tertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

4. Ditutup autoklaf dengan rapat lalu dikunci agar tidak ada uap yng keluar dari bibir autoklaf 5. Dinyalakan autoklaf dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC 6. Ditunggu sampai alarm tanda selesai berbunyi,dan suhu turun hingga sekitar 60oC 7. Dibuka dan dikeluarkan isi autoklaf dengan hati-hati

3. Centrifuge Centrifuge digunakan untuk memisahkan larutan

berdasarkan berat molekulnya. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan memberikan gaya sentrifugal pada larutan yang di masukkan ke dalamnya sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar sedangkan substansi yang ringan akan berada di atas. Centrifuge terdiri dari sebuah rotor dengan lubang-lubang untuk meletakkan

wadah/tabung yang berisi cairan dan sebuah motor yang dapat memutar rotor pada kecepatan yang dikehendaki. Cara menggunakannya: Diletakkan tabung yang berisi cairan yang dengan volume sama antara tabung satu dengan yang lainnya pada tempat yang berseberangan Ditutup penutup centrifuge sampai terkunci Dipilih kecepatan yang diinginkan pada tombol kecepatan Dipilih waktu pemutaran yang diinginkan pada tombol waktu dan centrifuge akan langsung berputar. Dibuka penutup centrifuge setelah prosesnya selesai Diambil tabung dari centrifuge dan dipisahkan sesuai kebutuhan.

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

4. Enkas Enkas merupakan versi sederhana dari laminar air flow. Enkas biasanya terbuat dari kaca, dan diletakkan di tempat yang tertutup (lebih baik di ruangan steril). Kondisi di dalam enkas dibuat steril dengan menggunakan tablet formalin yang

dibiarkan terus berada di dalam enkas dan dapat juga dilengkapi dengan lampu UV. Untuk membersihkan enkas, disemprotkan alkohol 90% lalu di usap dengan lap yang bersih untuk meratakannya. Prinsip kerja enkas yaitu setiap alat dan bahan yang masuk ke dalamnya harus steril. Oleh karena itu, sebelum dimasukkan peralatan dan tangan harus disemprot dengan alkohol 70% terlebih dahulu (Sandra, 2004).

5. Hot plate Magnetic Stirrer Magnetic stirrer digunakan untuk menghasilkan gerakan berputar dalam larutan. Tujuannya adalah untuk memastikan bahwa semua reagen tercampur. Sebuah sistem magnetic stirrer menggunakan magnet yang diputar oleh motor listrik . Kecepatan magnet ini berputar dapat disesuaikan dengan tombol putar. Sebuah magnet kecil yang dilapisi dengan bahan nonreaktif seperti teflon atau kaca ditempatkan dalam labu (Pavia, et al., 2011). Magnet dalam labu berputar karena dipengaruhi medan magnet pada alas magnetic stirrer. Umumnya magnetic stirrer dilengkapi dengan hot plate sehingga memungkinkan untuk memanaskan larutan sambil diaduk secara bersamaan. Agar magnetic stirrer menjadi lebih efektif, labu yang berisi larutan harus ditempatkan ditengah hot plate. Alat ini biasanya disandingkan dengan pH meter yang dilengkapi dengan termometer.

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

Cara menggunakan

Disiapkan hot plate magnitic stirrer Disiapkan bahan nutrisi yang akan dicampur/diramu sesuai dengan kebutuhan Diasukkan nutrisi kedalam erlenmeyer Diletakkan Erlenmeyer dan kapsul pengaduk di atas hot plate magnetic stirrer Diyalakan dengan menekan tombol on Diputar tombol pengatur kecepatan putaran kapsul pengaduk pada Erlenmeyer dan pengatur suhu Dibiarkan ramuan tersebut bercampur sampai homogen dan mendidih dengan pH yang sesuai Diatur panel pengatur kecepatan putar kearah kiri sehingga kapsul magnetic berhenti Dimatikan alat dengan menekan tombol off Diangkat Erlenmeyer dengan menggunakan lap dan keluarkan kapsul magnetic Dibersihkan alat, sehingga dalam keadaan siap pakai.

6. Inkubator Inkubator ini digunakan untuk menyimpan peralatan dan medium yang telah di sterilisasi. Penyimpanan ini dilakukan agar kondisi medium dan peralatan tetap terjaga.

Cara penggunaan : Dihubungkan kabel inkubator ke sumber listrik kemudian diputar tombol dari posisi mati [O] ke posisi hidup [l]

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

Ditekan tombol (oC) lalu diatur suhu sesuai dengan yang diinginkan. Ditekan tombol (+) untuk menaikkan suhu, sebaliknya ditekan tombol () untuk menurunkan suhu. Apabila suhu sudah sesuai sesuai dengan yang diinginkan, tombol (oC) ditekan sekali lagi

Dibuka pintu inkubator dengan menggeser gagang pintu (handler) kekanan (atas) lalu ditarik ke luar, kemudian dibuka pintu kaca bagian dalam. Dimasukkan dan disusun peralatan dan bahan yang akan diinkubasikan pada rak. Ditutup rapat pintu kaca bagian dalam dengan cara ujung pinggir pintu bagian tengah ditekan hingga berbunyi klik. Diakhiri pengoperasian inkubator dengan diputar tombol on [l] kekiri hingga posisi off [O]. Dilepaskan kabel inkubator dari sumber listrik.

7. Incubator Shaker Incubator shaker berfungsi untuk menggojok suatu campuran bahan medium dan yang

memerlukan

temperatur

kecepatan

mengaduk yang konstan.

Cara menggunakan: Diletakkan alat di tempat yang sudah ditentukan Disambungkan incubator shaker dengan catu daya dan dinyalakan Disiapkan tabung larutan Dimasukkan ke dalam incubator dan letakkan tabung tersebut diatas plate Diatur suhu, waktu, dan kecepatan putaran yang diinginkan 9

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

Diletakkan tabung sesuai tempat yang tersedia, dan tidak beracak Dimatikan incubator shaker jika telah selesai digunakan

8. Kompor Gas Dalam proses pembuatan medium kultur, setelah bahan-bahan penyusun medium diukur sesuai dengan jumlahnya maka bahan tersebut dimasak. Salah satu alat untuk memasaknya dapat

menggunakan kompor gas. Kompor gas sudah sangat umum digunakan sehari-hari, sehingga dalam penggunaannya di laboratorium tidak akan menimbulkan kesulitan yang berarti.

9. Laminar Air Flow Laminar air flow (LAF) adalah sebuah lemari yang dilengkapi dengan blower dan lampu UV, berfungsi untuk menanam eksplan ke dalam botol dalam kondisi steril atau melakukan subkultur. Prinsip kerja alat ini dengan mengalirkan udara dari blower yang bergerak lurus kedalam lemari tempat melakukan kultur. Udara dari blower melalui High Efficiency Particular Air (HEPA) filter dengan ukuran porositas 0,22 0,24m. Bakteri dan jamur akan tertahan oleh saringan ini sehingga udara yang masuk kedalam LAF sudah steril dan membuat ruangan menjadi steril. Blower harus terus dinyalakan selama LAF digunakan. LAF juga dilengkapi dengan lampu UV yang selalu dinyalakan apabila tidak sedang digunakan. Saat sedang digunakan maka lampu UV harus dimatikan karena bila tidak dimatikan dapat membahayakan kesehatan terutama merusak retina mata dan kulit. 10

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

10. Lemari Pendingin Dalam pembuatan medium kultur sering kali konsentrasi bahan yang diperlukan sangat kecil, hal ini akan menyulitkan dalam akurasi pengukuran bahan. Oleh karena itu, biasanya dibuat larutan stok yang memiliki konsentrasi yang lebih tinggi dari kebutuhan. Hal ini dilakukan agar ketika dibutuhkan larutan stok dapat diencerkan sesuai kebutuhan dan pengukuran saat membuat larutan tidak terlalu sulit. Untuk menjaga kondisi larutan stok tetap baik, maka diperlukanlah lemari pendingin sebagai tempat penyimpanan larutan. Dengan disimpan di dalam lemari pendingin, kondisi larutan dapat terjaga dalam waktu yang lama.

11.

Microwave Microwave digunakan untuk memanaskan bahan atau larutan yang akan digunakan untuk

membuat medium.

12. Mikroskop Mikroskop secara umum digunakan untuk membantu mengamati benda yang ukurannya mikroskopis maupun mengamati bagian-bagian DNA (dengan pewarnaan). Mikroskop juga terdapat di laboratorium bioteknologi. Di sini terdapat beberapa jenis mikroskop optik yang digunakan sesuai dengan kebutuhannya. Mikroskop digunakan untuk membantu dalam proses inokulasi.

11

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

13. PCR Machine Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA (Handoyo dan Rudiretna, 2000).

14. pH meter dan Termometer Dalam pembuatan medium kultur harus jaringan, tepat. kondisi itu

keasaman

Untuk

diperlukan pH meter untuk mengukur keasaman larutan medium. Termometer di sini digunakan untuk mengukur suhu pada saat proses pembuatan medium. Alat ini menampilkan hasil pengukurannya pada layar secara digital, sehingga memudahkan pengguna untuk membacanya. Setiap selesai digunakan, ujung elektroda pada pH meter harus selalu dicelupkan dalam larutan KCl untuk menjaga stabilitasnya. Apabila pH meter sering digunakan untuk mengukur pH yang rentangnya terlalu jauh, maka pH meter perlu sering dikalibrasi.

12

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

15. Timbangan Analitik Dalam pembuatan medium kultur jaringan, ada kalanya diperlukan bahan dengan jumlah yang sangat sedikit. Untuk mengukur bahan tersebut diperlukan timbangan analitik. Timbangan analitik memiliki ketelitian 4 angka di belakang koma, dengan kapasitas maksimal 210gr. Sebelum

melakukan penimbangan, tancapkan stop kontak ke arus listrik, lalu tekan tombol on. Selanjutnya letakkan alas berupa kertas dan tekan tombol 0/T. Tombol ini digunakan sehingga untuk penunjuk mengkalibrasi berat tetap

timbangan,

menunjukkan angka nol. Selanjutnya, letakkan bahan yang akan di timbang dan baca skalanya. Setelah selesai menimbang, matikan timbangan dengann menekan tombol off lalu cabut stop kontak dari arus listrik.

Simpulan 1. Secara umum proses pelaksanaan kultur jaringan tumbuhan meliputi tahap persiapan alat dan medium; inokulasi dan inisiasi kultur; pemeliharaan (inkubasi), dan aklimatisasi. Setiap tahapan dilakukan dengan kondisi aseptis dan dalam ruangan yang berbeda-beda. 2. Setiap alat yang digunakan dalam proses kultur memiliki karakteristik tersendiri. Sehingga penting untuk mengetahui cara penggunaan alat-alat tersebut.

13

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

No. Dokumen Berlaku Sejak Revisi Halaman

FO-UGM-BI-07-13

Daftar Rujukan Anonim, 2010. Diakses tanggal 1 Desember 2013. Agricultural Biotechnology. http://www.isaaa.org/resources/publications/agricultural_biotechnology/do wnload/agricultural_biotechnology.pdf

Handoyo, D., dan Rudiretna, A., 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(1): 17-29.

Hendaryono, D.P.S., Wijayani, A., 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius.

Indrianto, A., 2013. Perlengkapan dan Peralatan Teknis Laboratorium Kultur Jaringan. Tidak dipublikasikan.

Sandra, E., 2004. Kultur Jaringan Anggrek Skala Rumah Tangga. Jakarta: Agromedia Pustaka

Pavia D. L., Lampman G. M., Kriz G. S., Engel R. G., 2011. A Small Scale Approach to Organic Laboratory Techniques, 3rd edition. Belmont, California: Thompson Brooks/Cole.

14