Overekspresi Gen Scrose Transporter (SUT) pada Tanaman Tebu (Saccharum

officinarum) untuk peningkatan kandungan sukrosa

01.34 Diposkan oleh aliya seed
Label: penelitian
BAB 1. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Produksi gula nasional Indonesia mengalami kemerosotan sangat tajam dalam
tiga dasawarsa terakhir. Kemerosotan akibat penurunan rendemen gula ini
menjadikan Indonesia yang pernah menjadi produsen gula sekaligus eksportir
gula, berubah menjadi importir gula terbesar. Upaya menyelematkan kandungan
gula atau sukrosa dalam batang tebu memerlukan penanganan seoptimal
mungkin. Namun usaha meningkatkan mutu tanaman tebu dengan cara
konvensional (persilangan antar tanaman) memerlukan waktu yang lama.
Perkembangan bioteknologi memberikan alternatif lain dalam usaha
peningkatan mutu tanaman yaitu dengan transformasi gen. Keberhasilan
teknologi ini sangat mendorong kemajuan rekayasa genetik dalam memodifikasi
materi genetik utamanya dalam memasukkan gen-gen penyandi sifat-sifat
unggul dalam suatu organisme.
Penerapan teknik ini telah menghasilkan tanaman kedelai transgenik yang
toleran terhadap herbisida (Marveldani et al., 2007). Transformasi gen
menggunakan Agrobacterium tumefaciens berhasil dilakukan pada kalus tebu
(Fitranty et al., 2003) dan pada eksplan padi yang dikaluskan (Toki et al., 2006)
namun dilaporkan pada saat pengkulturan, kalus atau eksplan transforman yang
diperoleh dapat mengalami perubahan gen seiring dengan proses regenerasinya.
Perubahan gen ini disebut variasi somaklonal. Kandungan sukrosa pada
tanaman tebu telah berhasil dilakukan dengan memasukkan gen Sucrose
Phosphate Synthase (SPS) yang dilakukan Miswar et al. (2007). Selain SPS
yang mampu mengkatalisis pembentukan sukrosa, dapat juga memasukkan gen

Sucrose Transporter (SUT). Metode yang ditempuh adalah overekspresi gen.

Dalam tanaman tebu telah diidentifikasi bahwa enzim SPS merupakan enzim
kunci untuk sintesis sukrosa dan SUT adalah protein yang bertindak sebagai
translokator sukrosa dari organ pembuat (source) sukrosa ke organ penyimpan
(sink) sukrosa.
Dengan meningkatkan aktivitas sintesis sukrosa dan translokasi sukrosa dengan
overekspresi gen SPS dan SUT diharapkan dapat diciptakan varietas tebu baru
dengan produksi gula tinggi. Saat ini tebu transgenik overekspresi SPS telah
didapat dan kedepan akan ditambahkan / overekspresi gen SUT (Sugiharto,
2010).
Di sini Sucrose Transporter (SUT) merupakan protein yang menentukan
transport sukrosa dari daun sebagai tempat asimilasi sukrosa ke tempat jaringan
yang memerlukan atau ke tempat organ penyimpanan (sink). Transformasi SUT
dilakukan dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 dan
LBA4404 yang mengandung vektor pCAMBIA dan promotor CaMV35S.
Metode ini diharapkan mampu meningkatkan kandungan sukrosa sehingga
memperoleh tanaman tebu yang memiliki sifat unggul.
Rumusan Masalah
Seberapa besar pengaruh overekspresi gen Sucrose Transporter (SUT) pada
tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) sehingga mampu meningkatkan
kandungan sukrosa?
Jenis eksplan apakah yang paling tepat dan efesien untuk bahan tranformasi?
Tujuan
Adapun tujuan dari penelitian ini sebagai berikut:
Untuk meningkatkan kandungan sukrosa pada tebu.
Untuk mencari jenis eksplan yang tepat dan efesien untuk bahan transformasi.

Manfaat
Keberhasilan overekspresi dan transformasi gen Sucrose Transporter (SUT)
pada tebu dalam penelitian ini dapat meningkatkan kandungan sukrosa pada
tanaman tebu budidaya.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
Aktifitas Sucrose Transporter (SUT)
Sukrosa transporter memiliki peran sentral, karena mengatur alokasi
sukrosa baik intra maupun di tingkat tanaman secara keseluruhan.
Menurut Slameto (2010) dalam disertasinya yang berjudul Kloning dan
Karakterisasi Ekspresi Gen Famili Sucrose Transporter (SUT) pada Tanaman
Tebu (Saccharum officinarum L.) bahwa SUT merupakan protein yang
menentukan transport sukrosa dari daun sebagai tempat asimilasi sukrosa ke
tempat jaringan yang memerlukan atau ke tempat organ penyimpanan (sink).
Banyak tanaman yang mengandung Sucrose Transporter (SUTs) atau juga
dikenal sebagai pembawa sukrosa yaitu Sucrose Carriers (SUCs), yang mungkin
memiliki fungsi yang berbeda dalam floem loading dan unloading atau
translokator sukrosa ke tempat organ penyimpanan (sink).
Menurut Eckardt (2003) peneliti terdahulu telah mentransfer SUT2 ke membran
plasma SE dalam tomat (LeSUT2), pisang (PmSUC3) dan Arabidopsis
(AtSUC3), kentang (StSUT2), dan jagung (ZmSUT1).
Meyer et al. (2000) memberikan lebih rinci karakterisasi Arabidopsis protein,
yang mereka sebut AtSUC3. Barker et al. (2000) dalam hipotesisnya
menyatakan bahwa LeSUT2 dan AtSUT2/SUC3 berfungsi sebagai sensor
sukrosa dalam sieve element, berdasarkan perbandingan tanaman sukrosa
transporter dengan famili yang berkarakter sensor glukosa dalam ragi.
Bakteri Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium merupakan bakteri tanah anggota famili Rhizobiaceae,

gram negatif berbentuk batang (Smith, E. F dan Townsend, 1907), tidak
memiliki endospora dan tubuhnya dikelilingi oleh sedikit flagella (Old dan
Primose, 2003). Bakteri ini dapat menyebabkan penyakit pada tanaman
dengan mentransfer DNA ke genom tanaman yang secara alami hanya
menginfeksi tanaman dikotil (De Ia Riva et al., 1998). Namun, telah
ditemukan dari beberapa penelitian terdahulu bahwa Agrobacterium
efesien untuk transformasi gen pada tanaman monokotil, angiospermae
maupun gymnospermae (Toki et al., 2006).
A. tumefaciens memiliki kemampuan untuk menstransfer partikular DNA (TDNA) yang merupakan bagian dari plasmid Ti (tumor-inducing plasmid) ke
dalam inti sel tanaman yang diinfeksi (Binns and Thomashaw, 1988).
Kemampuan menstransfer DNA tersebut disebabkan A. tumefaciens memiliki
komponen genetik penting yang terlibat dalam proses transformasi gen antara
lain: kromosom gen virulen (chv), gen virulen (vir), dan T-DNA yang terdapat
dalam plasmid Ti (Rahmawati, 2006). Kromosom gen virulen pada kromosom
Agrobacterium dan berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman. Gen
vir terdapat dalam plasmid Ti yang mempunyai ukuran 200-800 kbp. Plasmid Ti
ini mengandung beberapa lokus gen vir antara lain Vir A, Vir C, Vir D, Vir F,
Vir G, dan Vir H yang dapat menginduksi terbentuknya tumor. Gen-gen tersebut
berperan dalam menginduksi transfer dan integrasi T-DNA. Gen vir yang
dimiliki A. tumefaciens ini peka terhadap senyawa feolik beserta senyawa
lainnya seperti glukosa dan galaktosa yang dikeluarkan tumbuhan dikotil ketika
terjadi luka pada permukaan bagian luar tumbuhan (Pardal, 2002).
Adanya transfer dan integrasi T-DNA ke dalam sel tumbuhan menyebabkan
terbentuknya penyakit tumor (crawn gall) dan senyawa-senyawa opine.
Senyawa opine yang dihasilkan dari kondensasi antara asam amino dan gula
dikumpulkan dan dikeluarkan oleh sel-sel tumor, lalu dikonsumsi oleh A.
tumefaciens sebagai sumber karbon dan nitrogen (De la Riva et al., 1998).

tumefaciens yang diinfeksikan ke tanaman melepaskan T-DNA yang akan

merangsang tanaman untuk mensintesis protein opine. Berbagai macam opine
yang dihasilkan oleh tanaman, di antarnya octopine, nopaline, succinamopine,
atau LL-succinamopine (Datta and Datta, 2002). Berdasarkan jenis senyawa
yang disintesis gen-gen opine, A. tumefaciens dikelompokkan menjadi beberapa
strain salah satunya GV3101 dengan tipe kromosom C58 dan jenis opine yang
dihasilkan adalah nopaline (Konz and Schell, 1986).
Penelitian tentang A. tumefaciens menjadi berkembang, sehingga pada tahun
1970 para peneliti berhasil mengidentifikasi plasmid dari beberapa strain A.
tumefaciens dan pada tahun 1977 para peneliti berhasil mentransfer T-DNA ke
dalam genom tanaman, tetapi masih perlu penyempurnaan untuk mendapatkan
keberhasilan transformasi yang lebih baik (Datta and Datta, 2002).
Perkembangan ini membuktikan bahwa plasmid Ti telah berhasil digunakan
sebagai vektor untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman (Gelvin,
2003).
Transformasi Gen Menggunakan A. tumefaciens pada Tanaman Tebu
Transformasi gen menggunakan A. tumefaciens banyak digunakan pada kalus,
baik untuk infeksi maupun seleksi sel transformannya (Toki et al., 2006).
Eksplan transformasi berupa potongan-potongan gulungan daun muda
kemudian diinokulasi pada media kalus. Keuntungan menggunakan gulungan
daun muda adalah mudah mendapatkan eksplan dalam jumlah banyak
dibanding tunas apikal. Satu pucuk atau satu gulungan daun muda rata-rata
dipotong menjadi 9 eksplan. Kelemahan eksplan dari gulungan daun muda
adalah harus melalui fase kalus untuk menjadi tunas. Beberapa peneliti
melaporkan bahwa propagasi tebu melalui fase kalus menyebabkan tingkat
kematian tunasnya tinggi sehingga sulit diaklimatisasi. Okviandari (2004)
melaporkan bahwa planlet transforman yang berasal dari kalus tebu varietas
R579 gagal ditumbuhkan menjadi tunas tebu transgenik, karena mengalami

kegagalan regenerasi menjadi tunas hijau. Regenerasi eksplan transformasi pada

tebu yang melalui fase kalus menghasilkan tunas albino pada varietas PS864
dan PSTG87, dan hijau muda pada varietas R579, sehingga efiisiensi
transformasi rendah (Setyati, 2005).
Penggunaan A. tumefaciens dalam transformasi tanaman lebih menguntungkan
dibandingkan dengan metode lain (Arencibia et al.,1998). Keunggulan
penggunaan transformasi melalui A. tumefaciens mempunyai transformasi yang
tinggi, dapat terintegrasi gen asing ke dalam gen inang. Manickavasagam et al.
(2004) menyebutkan bahwa keunggulan dari transformasi menggunakan A.
tumefaciens adalah teknis yang mudah, meminimal pembentukan kembali
genom tanaman transforman, dan mempunyai jumlah copy number yang
rendah.
Fitranty et al., (2003) telah berhasil melakukan teransformasi gen P5CS
menggunakan Agrobacterium pada kalus tebu. Enrequez-Oberegon et al. (1998)
dan Elliot et al. (1998) telah juga berhasil melakukan transformasi gen
menggunakan A. tumefaciens pada kalus tebu. Walaupun demikian progeni
(keturunan) yang dihasilkan masih mengalami beberapa kendala. Salah satunya
disebabkan adanya perubahan genom (variasi somaklonal) saat regenerasi
eksplan selama dikultur secara in vito. Adanya variasi somaklonal ini disinyalir
terjadi akibat terlalu lamanya masa prekultur (perkalusan) eksplan. Untuk
mengatasi hal tersebut dibutuhkan periode prekultur jaringan yang tepat untuk
meminimalisir terjadinya variasi somaklonal.
Miswar et al. (2007) telah berhasil melakukan transformasi menggunakan A.
tumefaciens strain GV3101 binary vector dengan plasmid pKYS yang telah
disisipkan gen penyandi enzim Sucrose Phosphat Synthase (SPS) di bawah
kontrol promotor CaMV35S. Begitu juga Slameto dalam disertasinya yang
berjudul Kloning dan Karakterisasi Ekspresi Gen Famili Sucrose Transporter
(SUT) pada Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.), yang telah memperoleh
cDNA SUT1 dan cDNA SUT2 dengan ukuran penuh (full length).

Keberhasilan transformasi melalui A. tumefaciens dipengaruhi oleh strain, jenis

promoter, dan jenis eksplan (Utomo, 2004). Komori et al. (2007) berpendapat
bahwa 30% dari 180 publikasi terbaru, menginformasikan penggunaan
pCAMBIA sebagai vektor transformasi. Sedangkan untuk DNA promoter
menggunakan CaMV35S, karena jumlah dan tipe promoter yang mampu
mengendalikan ekspresi transgen yang tinggi pada tanaman tebu masih sedikit.
Promoter konstitutif yang mampu mengendalikan ekspresi transgen sampai 10
kali tingkat ekspresi yang dicapai promoter CaMV35S pada tanaman monokotil
adalah actin promoter padi dan Ubi-1 promoter jagung (Rooke et al., 2000).
Gen GUS
Gen GUS merupakan gen penanda yang mengkode sintesis enzim Glucoronidase. Gen GUS banyak digunakan sebagai reporter gene (gen
penanda) dalam transformasi pada tanaman. Salah satu sifat gen reporter yang
dikehendaki oleh para peneliti adalah ekspresinya cepat dan mudah dideteksi.
Ekspresi gen Gus dapat dideteksi dengan substrat fluorogenic dan chromogenic.
X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-glucoronidase) adalah substrat
chromogenic yang sangat efisien untuk lokalisasi histokimia aktivitas glucoronidase dalam jaringan dan sel, memberikan presipitat biru (spot biru)
pada tempat terdapatnya aktivitas enzima tersebut (Ogras and Gozukirmizi,
1999).
Konstruksi gen GUS mengadung sekuen gen nptII yang menyandi
terbentuknya enzim neomicyne phosphotransferase, sehingga selain
sebagai gen penanda, konstruksi gen GUS juga berfungsi sebagai
penyeleksi (Liu et al., 2003). Aktifitas nptII akan menyebabkan eksplan tebu
tahan terhadap antibiotik yang tergolong aminoglikosida seperti genecin dan
kanamisin yang terdapat di dalam media seleksi. Eksplan yang berhasil
ditransformasi konstruksi gen GUS ini akan menunjukkan ketahanan terhadap
antibiotik tersebut ketika ditanam di dalam media seleksi (Manickavasagam,

2004).

Kerangka Fikir Penelitian

Gambar 2.5.1 Diagram Alur Kegiatan Penelitian

2.6 Hipotesis
Dengan overekspresi gen Sucrose Transporter (SUT) diharapkan mampu
meningkatkan kandungan sukrosa pada tebu sehingga menghasilkan produksi
gula yang berkualitas tinggi.
BAB 3. METODOLOGI
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Politeknik Negeri Jember
sejak bulan April-September 2010.
Alat dan Bahan
Alat
Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: erlenmayer,
beaker glass, petridish, tabung reaksi, micropipet, pH meter, stirer, gelas ukur,
microwave, sentrifuge, Polymerase Chain Reaction (PCR), alat kultur (scalpel,
ose, gunting, pinset, bunsen,) laminar air flow, autoclave, shaker inkubator, dan
desikator.
Bahan
Eksplan transformasi adalah kalus dan pangkal tunas tebu in vitro hasil dari fase
kalus. Tanaman tebu berasal dari varietas PS158. Gen Sucrose Transporter
(SUT) di bawah kontrol promoter Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S yang
dikonstruksi pada vektor pCAMBIA dengan promotor CaMV35S. Strain A.
tumefaciens yang digunakan adalah GV3101 dan LBA4404. Media kultur yang
digunakan adalah media MS dengan beberapa kondisinya.
Tabel 3.1 Jenis media beserta komposisinya yang digunakan selama penelitian
berlangsung.
Media Komposisi Keperluan
MS0 MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar) Media dasar

MS1
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 3 mgl-1 2,4-D, 100 ml-1 air kelapa) Induksi
kalus
MS2
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,2 ppm BAP, 0,1 ppm IAA) Induksi tunas
MS3
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,2 ppm BAP, 0,1 ppm kinetin). Multiplikasi
tunas
MS4
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,1 ppmBA, 0,2 ppm kinetin, 100 ppm
acetosyringone) Ko-kulivasi
MS5
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,1 ppm BA,
0,2 ppm kinetin, 500 ppm cefotaxime )
MS + (30 gl-1 sukrosa, 7 gl-1 agar, 0,1 ppm BA, Eliminasi
tumefaciens
MS6
0,2 ppm kinetin, 500 ppm cefotaxime, 25 ppm higromisin )
Seleksi ketahanan antibotika vektor pCAMBIA
YEP
Yeast Extract dan Peptone cair yang berisi antibiotika 50 mgl-1 kanamisin dan
100 mgl-1 rifamfisin Mengkulturkan
A. tumefaciens
Rancangan Penelitian
Rancangan yang digunakan dalam penelitian Tugas Akhir (TA) ini adalah
metode uji t karena untuk membandingkan dua macam perlakuan. Adapun dua

macam perlakuan tersebut adalah jenis eksplan yang digunakan untuk bahan
transformasi yakni A = kalus dan B = tunas. Dengan menggunakan metode uji t
dapat membandingkan dan memperoleh jenis eksplan yang tepat dan efesien
untuk bahan tranformasi.
Hipotesis : H0 : = B atau _ B = d
H1 : B atau _ B 0
Kriteria uji :
t_( hitung)= d/s_d atau t= (|-B|)/S_((-B))
Pelaksanaan Penelitian
Membuat media
Membuatan media inisiasi tebu dengan medium MS1 dan media untuk
menumbuhkan tunas MS2, masing-masing bervolume 1 liter.
Persiapan Eksplan Transformasi
Eksplan tanaman tebu (Saccharum officinarum L.) varietas PS158 dari
gulungan daun termuda yang berumur 2-2,5 bulan dari bibit kemudian
disterilkan dengan alkhohol 96 % setelah itu dibakar sampai tiga kali.
Selanjutnya pucuk tebu yang telah dibakar dikupas sampai didapatkan spindle
leaf yang mendekati titik tumbuh. Satu pucuk dapat dipotong-potong menjadi 9
eksplan dan setiap botol ditanam 2 eksplan.
Eksplan ditanam media MS1 dalam kondisi gelap dengan suhu 260C. Proses
penyimpanan dilakukan selama 4 minggu hingga memperoleh kalus dengan
ciri-ciri nodular, kompak dan menunjukkan warna kekuningan dan digunakan
sebagai eksplan untuk transformasi.
Sebagian kalus disubkulturkan ke dalam media MS2 untuk menghasilkan tunas
dan ditanam pada kondisi gelap selama 4 minggu. Bagian basal (pangkal) tunas
tanaman ini (0,5 cm) dipisahkan dan digunakan sebagai eksplan untuk
transformasi.

Kultur Agrobacterium tumefaciens

Gen SUT (Sucrose Transporter) yang telah dikonstruksi pada vektor pCAMBIA
(Center for the Application of Molecular Biologi to International Agriculture
(CAMBIA), Canberra, Australia, ditransformasikan ke dalam sel A.tumefaciens
strain GV3101 dan LBA4404 melalui heat shock pada 420C selama 90 detik.
Koloni tunggal Agrobacterium yang positif mengandung gen SUT diinokulasi
ke dalam larutan starter yakni 3 ml media Yeast Extract dan Pentone (YEP) cair
yang berisi antibiotika 50 mgl-1 kanamisin dan 100 mgl-1 rifamfisin, kemudian
diinkubasi pada suhu 280C di dalam shaker selama 48 jam. Selanjutnya bibit A.
tumefaciens diambil 1 ml dari larutan starter ditambahkan ke dalam media YEP
cair 50 ml yang mengandung antibiotika 60 mgl-1 kanamisin dan 100 mgl-1
rifamfisin. Setelah itu diinkubasi dalam shaker inkubator selama + 8 jam. Sel
disentrifuge pada 5.000 rpm, 40C selama 10 menit. Pellet A. tumefaciens yang
terbentuk disuspensikan ke dalam media YEP cair dengan pengaturan OD600
(Optical Density) 0,6 -1,0 nm.
Transformasi Gen SUT menggunakan Agrobacterium- Mediated Transformation
pada kalus dan tunas
Eksplan yang dipakai untuk transformasi adalah kalus dan pangkal tunas tebu in
vitro. Jumlah kalus yang diinfeksi adalah 20 kalus, dengan masing-masing kalus
memiliki massa kurang-lebih 0,2 gram kemudian dikumpulkan dan diberi
perlakuan pengeringan di atas kertas saring steril di dalam laminar air fow
selama 30 menit. Setelah itu ditempatkan dalam Erlemeyer yang berisi 50 ml
media MS cair dan disonifkasi selama 5 menit. Infeksi Agrobacterium
dilakukan dengan cara merendam kalus dalam suspensi Agrobacterium (OD600
akhir disetarakan 0,6) yang mengandung acetosyringone (100 mgl-1), yang
selanjutnya diinkubasi pada suhu 28 C selama 30 menit. Sebelum ko-kultivasi,
material yang telah terinfeksi dicuci satu kali dengan air steril kemudian
dikeringkan dalam laminar air flow. Ko-kultivasi dilakukan dengan

memindahkan kalus yang diinfeksi pada media MS1 ditambah 100 mgl-1
aceosyringone pada kondisi gelap dengan suhu 28 C selama 3 hari.
Pangkal tunas tanaman in vitro berdiameter 3 mm dan tinggi 5 mm yang
diisolasi dari tunas tebu in vitro yang tingginya lebih dari 1,5 cm disimpan di
dalam media MS cair di dalam LAFC. Jumlah eksplan yang diinfeksi adalah 50
eksplan, 25 eksplan untuk uji GUS dan 25 eksplan untuk kokultivasi. Kemudian
ditiriskan di atas tissue steril sambil melakukan penusukan sebanyak 4-5 kali
menggunakan jarum suntik steril yang berdiameter 1 mm. Tanaman yang telah
dilukai direndam dalam MS cair 50 ml yang mengandung A. tumefaciens
dengan kerapatan sel bakteri (OD(600) infeksi) = 1.0, dan acetosyringone (100
mgl-1). Setelah itu diprekultur di dalam media MS yang diletakkan dalam
shaker dengan kecepatan putaran 150 rpm pada suhu 28 C selama 30 menit.
Eksplan terinfeksi dikeringkan menggunakan kertas filter steril dan diinokulasi
pada media MS padat yang mengandung acetosyringone. Ko-kultivasi
dilakukan selama 3 hari di dalam gelap dengan suhu 28 C.
Seleksi Transforman pada medium antibiotik
Tahapan selanjutnya adalah seleksi transforman yaitu untuk mengetahui
keberhasilan transformasi dan ketahanan antibiotika dari transforman. Eksplan
putatif terinfeksi dicuci tiga kali dengan 500 mgl-1 cefotaxime dan kemudian
dikeringkan di atas kertas filter steril dalam laminar air fow.
Untuk kalus yang terinfeksi disubkultur pada media MS4 untuk mengeliminasi
A. tumefaciens dan diinkubasi pada kondisi gelap selama satu minggu.
Kemudian kultur ditransfer pada media seleksi MS5, serta diinkubasi pada
kondisi yang sama selama 14 hari. Proses seleksi dilakukan sebanyak 5 siklus.
Tunas yang diperoleh dari kalus tunggal ditetapkan sebagai satu klon putative
transforman.
Tunas yang terinfeksi dan telah diko-kultivasi disubkultur ke dalam media MS5
pada itensitas cahaya sekitar 2000 lux selama 16 jam per hari dengan suhu

270C. Proses seleksi dilakukan sebanyak lima siklus, tiap siklus 14 hari. Setelah
melalui 5 siklus, tunas yang tumbuh disubkultur ke media MS0 selama 4
minggu untuk mendukung pertumbuhan selanjutnya.
Analisis Polymerase Chain Reaction (PCR)
Analisis PCR dilakukan dengan DNA genom yang telah diisolasi menggunakan
TaKaRa Ex Taq polymerase (Takara Bio Inc) dan satu set primer yang didesain
dari sekuen DNA CaMV, nptII (the neomycin phosphotransferase gene) atau
gus. Kondisi reaksi PCR yang digunakan untuk denaturasi, annealing, dan
extention berturut-turut adalah pada 98C selama 10 detik, 55C selama 30
detik, 72C selama 1 menit dengan 30 siklus. DNA yang teramplifikasi
kemudian dianalisis dengan elektroforesis pada 1% gel agarosa dan difoto.
Uji Gen GUS
Uji gen GUS dilakukan terhadap eksplan tebu yang sudah dikokultivasi di
dalam ruang gelap selama 3 hari sesuai dengan prosedur histochemical yang
disebutkan oleh Jefferson et al. (1987) dengan beberapa modifikasi. Sample
dicuci satu kali dengan larutan buffer 0,1 M potassium phosphate, pH 7,0.
Sample diinkubasi dalam larutan buffer yang berisi 2% metanol, 0,3% Triton X100, 0,5 mM potassium ferricyanide, 0,5 mM potassium ferrocyanide dan 0,5
mg ml1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucoronide pada suhu 37C,
diletakkan di dalam shaker dengan kecepatan putaran 85 rpm selama 48 jam.
Sampel dicuci dengan etanol 70%. Pengamatan spot atau bercak berwarna biru
karena adanya ekspresi gen GUS dilakukan menggunakan mikroskop.

DAFTAR PUSTAKA

Arencibia, A.D., E.R Carmona., P Tellez., M. Chan., S.M. Yu., L.E. Trujillo. and
P. Oramas. 1998. An Efficient Protocol for Sugarcane (Saccharum spp.L.)
Transformation-mediated by Agrobacterium tumefaciens. Trans. Res. 7: 213222.
Binns A.N. and Thomashow, M.F. 1988. Cell Biology of Aagrobacterium
Infection and Transformation of Plants. Annual Review of Microbiolog. 42:
575-606.
Datta K. and S.K. Datta. 2002. Plant Transformation. In Moleculac Biology: A
Partical Approach. Gilmartin, P., and C. Bowler. 2002 (Eds.) Oxpord University
Press. Volume One-Chapter 2: 13-32.
De la Riva G.A., J. Gonzalez-Cabrera, R. Vazquez-Padron, and C. Ayra-Pardo,.

1998. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. EJB

Electronic Journal of Biotechnology 1 (3): 118-133.
Eckardt, Nancy. 2003. The Function of SUT2/SUC3 Sucrose Transporters: The
Debate Continues. The Plant Cell Jurnal, Vol. 14: 1259-1261.
Elliot, A.R., Cambell, J. A., Brettel, R. I.S., and Cristopher, P.L 1998.
Agrobacterium-mediated Transformation of Sugarcane Using GFP as a
Screenble Marker. Aust J. Plant Physiol. 25:739-743.
Enriquez-Obregon, G.A., Vazquez-Padron, R.I. Pieto-Samsonov, D.L., Della
Riva G.A., Selman-Housein, G. 1998. Herbicide-resistant Sugarcane
(Saccharum officinarum L.) Plants by Agrobacterium-mediated Transformation.
Planta. 206: 20-27.
Fitranti, N., Nurilmala, F., Santoso, J., dan Minarsih, H. 2003. Efektivitas
Agrobacterium Mentransfer Gen P5CS ke dalam Kalus Tebu Klon PS 851.
Menara Perkebunan 71(1): 16-27.
Gelvin S.B. 2000. Agrobacterium and Plant Genes Involved in T-DNA Transfer
and Integration. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Moll. Biol. 51: 233-256.
Komori, Imayama, Kato, Ishida, Ueki, and Komari. 2007. Current Status Of
Binari Vectors and Superbinari Vectors. Plant Physiology. 145: 1155-1160.
Koncz Cs., and Schell J. 1986. The Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the
Tissue-specific Expression of Chimeric Genes Carried by a Novel Type of
Agrobacterium Binary Vector. Mol Gen Genet. 204: 383-396.

Liu D., S.V. Oard, J.H. Oard. 2003. High Transgene Expression Levels In
Sugarcane (Sacchanarum Officinarum L.) Driven by The Rice Ubiquitin
Promoter RUBQ2. Palnt Science. 165: 743-750.
Marveldani., M. Barnawi. K. Setiawan., dan S.D. Utomo. 2007. Pengembangan
Kedelai Transgenik yang Tahan Herbisida Amonium-glufosinat dengan
Agrobacterium tumefaciens. Jurnal Akta Agrosia Vol. 10 No 1 hlm 49-55.
Manickavasagam, M., Ganapathi, A., Anbazhagan, V.R., Sudhakar, B., Selvaraj,
N., Vasudevan, A., dan Kasthurirengan, S. 2004. Agrobacterium-mediated
Genetic Transformation and Development of Herbicide-resistant Sugarcane
(Saccharum species hybrids) Using Axillary Buds. Plant Cell Rep. 23: 134-143.
Miswar, Sugiharto, B., Soedarsono, J., dan Moeljapawiro, S. 2007.
Transformasi Gen Sucrose Phosphate Synthase (SoSPS1) Menggunakan
Agrobacterium tumefaciens untuk Meningkatkan Sintesis Sukrosa pada
Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) Berk. Penel. Hayti. 12: 137-143.
Ogras T.T., and Gozukirmizi N. 1999. Expression And Inheritance of GUS Gene
in Transgenic Tobacco Plants. Tr. J. of Botany. 23: 297-302.
Okviandari. 2004. Transformasi Gen Sucrose Phosphate Synthase pada
Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) dengan Bantuan Agrobacterium
tumefaciens. Tesis. Program Pasca Sarjana. Universitas Jember. Jember,
Indonesia. pp. 43.
Old, R.W., dan Primose, S.B. 2003. Prinsip-prisip Manipulasi Gen (Pengantar
Rekayasa Genetika). Ed. IV. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

Pardal J.S. 2002. Perkembangan Penelitian dan Transformasi.

Rahmawati, S. 2006. Status Perkembngan dan Perbaikan Sifat Genetik Padi
Menggunakan Transformasi Agrobacterium. Jurnal AgroBiogen 2(1): 36-44.
Rooke L., Byrne D., and Salgueiro S. 2000. Marker Gene Expression Driven By
The Maize Ubiquitin Promoter In Transgenic Wheat. Ann.appl. Biol. 136: 167172.
Setyati S. 2005. Optimasi Transformasi Gen Sucrose Phosphate Synthase pada
Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.) dengan Bantuan Agrobacterium
tumefaciens. Tesis. Program Pasca Sarjana. Universitas Jember. Jember,
Indonesia. pp. 39.
Smith, E.F., dan Townsend, C.O. 1907. A. Plant-Tumor of Bacterial Origin.
Science 25: 671-3.
Toki, Hara, Ono, Onodera, Tagiri, Oka, dan Tanaka. 2006. Early Infection of
Scutellum Tissues with Agrobacterium allows High-speed Transformation of
Rice. The Plant Jurnal 47: 969-976.
Utomo, S.D. 2004. Pengaruh Strain Agrobacterium Terhadap Efisiensi
Transformasi Genetik Jagung Genotipe Hibrida Hill. Ilmu Pertanian 11 (2): 110.
Sastrosupadi, Adji. 2000. Rancangan Percobaan Praktis. Kanisius: Yogyakarta.
Sudjana. 2002. Metoda Statistika. Tarsito: Bandung.