TUGAS 6

UJI KLT DENGAN BERBAGAI ELUEN

(Menggunakan Sampel Kolesterol)
6.1.

Tujuan
Mahasiswa mampu menjelaskan tentang kaitan antara polaritas eluen dengan harga Rf.

6.2.

Tinjauan Pustaka

6.2.1 Kolesterol (FI III Hal.697)

Kolesterol P C27H46O, BM 386,67

Pemberian

: Lembaran atau butiran ; putih atau agak kuning ; hampir tidak berbau.

Kelarutan

Oleh pengaruh udara menjadi kuning atau cokelat pucat.

: praktis tidak larut dalam air, larut dalam kloroform P , dalam eter P,
dalam dioksan P, dalam etil asetat P, dalam heksana P dan dalam
minyak nabati, agak sukar larut dalam etanol mutlak P; sukar larut dan

perlahan-lahan dalam etanol (95%)P.

Identifikasi :
A. Pada larutan 10 mg dalam 1 ml kloroform P tambahkan 1 ml asam sulfat P ;
lapisan kloroform berwarna merah darah dan asam sulfat berfluoresensi hijau.
B. Larutkan lebih kurang 5 mg dalam 2 ml kloroform P, tambahkan 1 ml anhidrida
asetat P, kemudian 1 tetes asam sulfat P, terjadi warna merah muda dan segera
berubah menjadi merah kemudian biru dan akhirnya hijau terang.
Jarak lebur antara 147 dan 150
Rotasi jenis antara -34 dan -38, penetapan dilakukan menggunakan 200 mg dalam 10
ml dioksan P.
Susut pengeringan, tidak lebih dari 0,1%, pengeringan dilakukan pada suhu 60 selama
4 jam.

Sisa pemijaran tidak lebih dari 0,1%.

Kelarutan

: dalam etanol larutkan 500 mg dalam 50 ml etanol (95%) P hangat

dalam labu bersumbat atau dalam gelas ukur, biarkan selama 2 jam ;
tidak terbentuk endapan atau kekeruhan. larut dalam aseton, benzenea,
kloroform, etanol, eter, heksana, metanol.

Kolesterol adalah metabolit yang mengandung lemak sterol yang ditemukan pada
membran sel dan disirkulasikan dalam plasma darah. Merupakan sejenis lipid yang
merupakan molekul lemak atau yang menyerupai, kolestrrol ini ialah jenis khusus lipid
yang disebut steroid. Steroid adalah lipid yang memilki struktur kimia khusus. Steroid
ini terdiri dari 4 cincin atom karbon.
6.2.2 Larutan Eluen
Kloroform
Kloroform adalah nama umum untuk triklorometana (CHCl3). Kloroform dikenal
karena sering digunakan sebagai bahan pembius, akan tetapi penggunaanya sudah
dilarang karena telah terbukti dapat merusak liver dan ginjal.Kloroform kebanyakan
digunakan sebagai pelarut nonpolar di laboratorium. Wujudnya pada suhu ruang
berupa cairan bening, mudah menguap, dan berbau khas.
Kloroform (FI III halaman 151)

Kloroform CHCl3

BM

: 119,38

Kloroform adalah triklorometana mengandung etanol 1,0% v/v sampai 2,0%

sebagai zat penstabil. Pemerian : cairan, mudah menguap, tidak berwarna , bau khas ,
rasa manis dan membakar. Kelarutan : Larut dalam lebih kurang 200 bagian air , mudah
larut dalam etanol mutlak P, dalam eter P, dalam sebagian besar pelarut organik, dalam
minyak atsiri dan dalam minyak lemak.
Identifikasi :

A. Tidak dapat terbakar : uapnya dalam nyala bunsen memberikan nyala berwarna
hijau dan menghasilkan uap berbau khas.
B. Hangatkan 1 tetes dengan 1 tetes anilina P dan 1 ml larutan natrium hidroksida P
8% b/v terjadi fenilkarbilamin yang berbau khas dan beracun.
Penyimpanan : dalam wadah tertutup baik tersumbat kaca , terlindung dari cahaya.
Khasiat
: sebagai anastetikum umum, pengawet dan zat tambahan.
Etil Asetat
Etil Asetat (HPE ,6th ed p : 253)
Ethyl acetate C4H8O2 BM : 88,1
Struktur :

Dalam sediaan farmasi, etil asetat terutama digunakan sebagai pelarut, meskipun juga
telah digunakan sebagai perasa dalam makanan. Sebagai pelarut, termasuk dalam
topikal dan gel, dan dimakan tinta cetak yang digunakan untuk tablet. Etil asetat juga
telah terbukti meningkatkan kelarutan klortalidon dan memodifikasi bentuk kristal
polimorfik untuk memperoleh piroksikam pivalat, asam mefenamat, dan flukonazol.
Etil asetat adalah, tidak berwarna, cairan yang mudah menguap dengan aroma
buah, harum, dan bau sedikit acetous, dan memiliki rasa yang menyenangkan bila
diencerkan. Etil asetat mudah terbakar.
Kelarutan

: 1 bagian larut dalam 10 bagian air pada 25C ; etil asetat lebih larut
dalam air pada suhu yang lebih rendah dari pada suhu yang lebih
tinggi. Larut dengan aseton , kloroform , diklorometana , etanol ( 95
%) , dan eter , dan dengan sebagian besar cairan organik lainnya.

Etil asetat harus disimpan dalam wadah kedap udara , dilindungi dari cahaya dan
pada suhu yang tidak melebihi 30C . Etil asetat perlahan-lahan terurai oleh air dan
menjadi asam. Etil asetat digunakan dalam makanan , dan farmasi oral dan formulasi
topikal . Ethyl acetate umumnya dianggap srelatif tidak beracun dan bahan nonirritant
bila digunakan sebagai eksipien . Namun , etil asetat mungkin dapat mengiritasi selaput
lendir dan konsentrasi tinggi dapat menyebabkan depresi sistem saraf pusat . Potensi

gejala paparan yang lama termasuk iritasi dari mata , hidung , dan tenggorokan ,
pembiusan, dan dermatitis.
Metanol

Metanol yang dikenal sebagai metil alkohol, wood alcohol atau spiritus, adalah
senyawa kimia dengan rumus kimia CH3OH. Ia merupakan bentuk alkohol paling
sederhana. Pada "keadaan atmosfer" ia berbentuk cairan yang ringan, mudah menguap,
tidak berwarna, mudah terbakar, dan beracun dengan bau yang khas (berbau lebih
ringan daripada etanol). metanol digunakan sebagai bahan pendingin anti beku, pelarut,
bahan bakar dan sebagai bahan additif bagi etanol industri.
Metanol diproduksi secara alami oleh metabolisme anaerobik oleh bakteri. Hasil
proses tersebut adalah uap metanol (dalam jumlah kecil) di udara. Setelah beberapa
hari, uap metanol tersebut akan teroksidasi oleh oksigen dengan bantuan sinar matahari
menjadi karbon dioksida dan air.
n-Heksan

Heksana (n-heksana) adalah sebuah senyawa hidrokarbon alkana dengan rumus kimia
C6H14 (isomer utama n-heksana memiliki rumus CH3(CH2)4CH3). Awalan heksmerujuk pada enam karbon atom yang terdapat pada heksana dan akhiran ana berasal
dari alkana, uang merujuk pada ikatan tunggal yang menghubungkan atom-atom karbon
tersebut. Seluruh isomer heksana amat tidak reaktif, dan sering digunakan sebagai
pelarutorganik yang inert. Heksana juga umum terdapat pada bensin dan lem sepatu,
kulit dan tekstil. Dalam keadaan standar senyawa ini merupakan cairan tak berwarna
yang tidak larut dalam air.
6.2.3 Identifikasi Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan za terlarut oleh suatu

proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari 2 fase atau lebih ,
salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di
dalam zat-zat tersebut menujukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan
dalam absorpsi, partisi , kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan
ion.
Teknik kromatografi umumnya membutuhkan zat terlarut terdistribusi diantara 2
fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase grak membawa zat terlarut melalui media,
hingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang tereluasi lebih awal atau lebih akhir.
Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut
berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam bertindak sebagai zat penjerap
seperti halnya penjerap alumina yang diaktikan , silika gel dan resin penukar ion atau
dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase
gerak. (FI IV halaman 1002)
Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan
campuran yang berbeda polaritas sehingga didapatkan perbandingan tertentu.
Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh.
Faktor retensi adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak
yang ditempuh oleh eluen. Nilai Rf sangat karakteristik untuk senyawa tertentu pada
eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan
senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai
kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya, hal tersebut dikrenakan fasa diam
bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga
menghasilkan nilai Rf yang rendah. Jika Rf nya terlalu tinggi yang harus dilakukan
adalah mengurangi kepolaran urin, dan sebaliknya.

(Sholeh, 2009)
Nilai Rf didefinisikan sebagi perbandingan jarak yang ditempuh oleh senyawa
pada permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut sebagai fase
gerak. Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya
senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel
yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila
senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat
kromatografi lapis tipis ( Handayani, 2008).
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal
tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam
sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang

rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar.
Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan
nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu
tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya
(Ewing Galen Wood, 1985).
Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu (Underwood, 1999):
1. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang
sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan
harga Rf.
2. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
3. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari
atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen
pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih
lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien
partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi
mempengaruhi harga Rf.
4. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan
serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi
kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.
5. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volumevolume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu
mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap
harga Rf mereka.
Kemampuan suatu analit terikat pada permukaan silika gel dengan adanya pelarut
tertentu dapat dilihat sebagai pengabungan 2 interaksi yang saling berkompetisi.
Pertama, gugus polar dalam pelarut dapat berkompetisi dengan analit untuk terikat pada
permukaan silika gel. Dengan demikian, jika pelarut yang sangat polar digunakan,
pelarut akan berinteraksi kuat dengan permukaan silika gel dan hanya menyisakan
sedikit tempat bagi analit untuk terikat pada silika gel. Akibatnya, analit akan bergerak
cepat melewati fasa diam dan keluar dari kolom tanpa pemisahan. Dengan cara yang
sama, gugus polar pada pelarut dapat berinteraksi kuat dengan gugus polar dalam analit
dan mencegah interaksi analit pada permukaan silika gel. Pengaruh ini juga

menyebabkan analit dengan cepat meninggalkan fasa diam. Kepolaran suatu pelarut
yang dapat digunakan untuk kromatografi dapat dievaluasi dengan memperhatikan
tetapan dielektrik () dan momen dipol () pelarut. Semakin besar kedua tetapan
tersebut, semakin polar pelarut tesebut. Sebagai tambahan, kemampuan berikatan
hidrogen pelarut dengan fasa diam harus dipertimbangkan (Tim Penyusun, 2010).

6.3.

Alat dan Bahan

Alat
Beaker Gelas

Bahan
Kolesterol

Gelas Ukur

Kloroform

Batang pengaduk

Etil Asetat

Cawan penguap

N-heksana

Chamber

metanol

Plat KLT

anisaldehida asam sulfat

Pipet
Pipet mikro

6.4.

Prosedur Kerja
1. Larutkan sedikit kolesterol kedalam kloroform.
2. Totolkan pada 4 plat KLT( kiesel gel 254)
3. Siapkan 4 macam eluen (fase gerak) yaitu :
n-heksan-etil asetat (1:1)
n-heksan-etil asetat (4:1)
kloroform-metanol (4:1)
kloroform:etil asetat (4:1)
4. Elusi 4 plat KLT tersebut dengan eluen yang dibuat
5. Semprot dengan penampak noda anisaldehida asam sulfat
6. Panaskan 1000C sampai timbul noda berwarna merah/ungu
7. Hitung harga Rf pada masing-masing plat KLT
8. Diskusikan, mengapa harga Rf pada masing-masing plat berbeda.

6.5.

Skema Kerja

Kloroform : Metanol
(4 : 1)
n-Heksana : EA
(4 : 1)

Larutkan sedikikt kolesterol

ke dalam Kloroform

Totolkan pada 4
Plat KLT

Siapkan 4
macam eluen

n-Heksana : EA
(1 : 1)

Kloroform : EA
o

Panaskan 100 C
(hingga timbul noda
merah ungu/ungu)

Semprot dengan
penampak noda
anisaldehid
asam sulfat

Hitung harga
Rf

6.6.

Hasil Praktikum
Konstanta dielektrik pelarut (eluen)

Eluasi 4 Plat
KLT

(4 : 1)

Metanol

: 33,0

Etil asetat

: 6,0

Kloroform

: 4,8

n-Heksana

: 2,0

Perhitungan konstanta dielektrik :

1. n-Heksan : Etil Asetat (1 :1) =

( 2 x 1 ) +(6 x 1)
2

=4

2. n-Heksan : Etil Asetat (4 :1) =

( 2 x 4 ) +(6 x 1)
5

= 2,8

3. Kloroform : Metanol (4 :1) =

( 4,8 x 4 ) +(33 x 1)
5

4. Kloroform : Etil Asetat (4 :1) =

= 10,44

( 4,8 x 4 ) +(6 x 1)
5

Kromatografi Lapis Tipis

Sebelum dieluasi ( UV 254 nm)

= 5,04

Setelah dieluasi dan diberi penampak noda anisaldehid asam sulfat

Nilai Rf :
1. n-Heksan : Etil Asetat (1 :1) =

6,5
8

= 0,8125

2. n-Heksan : Etil Asetat (4 :1) =

2,2
8

= 0,2750

3. Kloroform : Metanol (4 :1) =

7,8
8

= 0,9750

4. Kloroform : Etil Asetat (4 :1) =

4,7
8

= 0,5875

6.7.

Pembahasan
Dalam percobaan ini digunakan beberapa macam perbandingan kombinsai eluen
antara n-Heksan, Etil Asetat, Kloroform dan metanol. Hal
ini1,2,3
dikarenakan
dapat
Plat
&4 setelahagar
di eluasi
dan di beri
penampak noda dilihat di dan di hitung nilai Rfny
diketahui kepolaran yang tepat untuk pemisahan senyawa
fitokimia yang diinginkan.

Salah satu faktor yang harus diperhatikan dalam mencampur fase gerak adalah hanya
pelarut yang memepunyai kepolaran yang sama yang dapat dicampur.
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu.
Penggunaan eluen yang berbeda-beda bertujuan untuk membandingkan polaritas eluen
dari harga Rf yang didapatkan. Rf merupakan faktor yang digunakan untuk mengetahui
perpindahan senyawa yang asli dengan jarak pelarut yang sesungguhnya. Nilai Rf selalu
bergantung pada penampak noda yang dihasilkan dan selalu berbentuk perbandingan.
Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang
rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fase diam bersifat polar.
Senyawa yang lebih besar polar akan tertahan kuat pada fase diam, sehingga
menghasilkan nilai Rf yang rendah. Nilai Rf pada KLT yang bagus berkisar antara 0,2
sampai dengan 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi
kepolaran eluen dan sebaliknya.
Pada identifikasi noda atau penampak noda, jika noda sudah berwarna dapat
langsung diidentifikasi dan ditentukan harga Rf. Faktor yang mempengaruhi gerak dan
harga Rf, yaitu :
Sifat dari penyerap dan derajat aktivitas
Stuktur kimia dari senyawa dipisahkan
Kerapan dari satu pasang penyerap
Pelarut (derajat kemurnian) fase gerak.
Telah disebutkan bahwa polaritas sampel dan laju pergerakan berbanding terbalik.
Semakin tinggi polaritasnya maka makin lambat pula pergerakannya. Sedangkan bila
dilihat dari pengaruh eluen yang digunakan semakin tinggi polaritas eluen maka nilai Rfnya juga semakin tinggi. Bila polaritas eluen rendah maka nilai Rf-nya juga semakin
rendah.

Polaritas pada umumnya berpacu pada konstanta dielektrik untuk mengetahui

kekuatan relatifnya. Berdasarkan konstanta dielektriknya, urutan eluen dari yang nonpolar sampai ke polar yaitu : n-Heksana (2,0), Kloroform (4,8), Etil Asetat (6,0) dan
metanol (33,0). Konstanta dielektrik yang tinggi mengindikasi pelarut polar dan
konstatnta dielektrik yang rendah menunjukan pelarut polar. Oleh karena itu, kami
menghitung jumlah konstata dielektrik dari eluen yan digunakan.
Jenis eluen :
1. n-Heksan : Etil Asetat (1 :1) dihasilkan konstanta dielektrik sebesar 4
2. n-Heksan : Etil Asetat (4 :1) dihasilkan konstanta dielektrik sebesar 2,8
3. Kloroform : metanol (4:1) dihasilkan konstanta dielektrik sebesar 10,44
4. Kloroform : Etil Asetat (4:1) dihasilkan konstanta dielektrik sebesar 5,04
Sehingga eluen yang paling polar adalah eluen no.3 yaitu Kloroform : metanol
(4:1) dan eluen yang paling non-polar adalah n-Heksan : Etil Asetat (4 :1). Hasil tersebut
sesuai denga literatur dimana Rf yang besar mempunyai hasil kepolaran yang rendah.
Tempat dengan nilai Rf yang tertinggi adalah yang paling non-polar (Serma and Bernard,
2003). Hal tersebut sesuai denga praktikum kami yaitu eluen dengan polaritas tinggi
mempunyai Rf tinggi yaitu 0,9750 pada eluen Kloroform : metanol (4:1) dan polaritas
terendah mempunyai Rf terendah yaitu 0,2750 pada eluen n-Heksan : Etil Asetat (4 :1).
Kemampuan suatu analit terikat pada permuakaan silica gel dengan adanya
pelarut tertentu dapat dilihat sebagai penggabungan 2 interaksi yang saling
berkompetensi. Pertama, gugus polar dalam pelarut dapat berkompetensi dengan analit
untuk terikat pada permukaan silica gel yang bersifat polar. Dengan demikian jika pelarut
yang digunakan sangat polar, pelarut akan berinteraksi kuat dengan permukaan silica gel
yang hanya menyisahkan sedikit tempat bagi analit dalam hal ini kolesterol yang bersifat
non-polar untuk terikat pada silca gel . akibatnya analit yang akan bergerak cepat
melewati fase diam dan keluar dari kolom tanpa pemisahan.

6.8.

Kesimpulan
Dari pembahasan diatas dapat ditarik kesimpulan bahwa:
Nilai Rf yang tertinggi adalah yang paling polar dan nilai Rf yang terendah
adalah yang plaing non-polar.
Nilai Rf tertinggi dan paling polar adalah kloroform : metanol (4 : 1 ) yakni
0,9750
Nilai Rf terendah dan paling non-polar adalah n-Heksan : Etil Asetat (4 :1).yakni
0,2750

DAFTAR PUSTAKA
Edge, S., Kibbe, A.H., and Shur, J., 2009, , Handbook of Pharmaceutical Excipient, 6 th
Edition, 364-369, Pharmaceutical Press, London.
Ewing, Galen Wood. 1985. Instrumental of Chemical Analysis Fifth edition. McGraw-Hill.
Singapore.
Farmakope Indonesia 1979, Edisi III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia
Farmakope Indonesia 1995, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Handayani, 2008. Sintesis Senyawa Flavonoid--Glikosida secara Reaksi Transglikosilasi
Enzimatik dan Aktivitasnya sebagai Antioksidan. Vol. 9, No. 1, Januari 2008, hal. 1-4
Underwood, AL dan JR. Day R.A. 1988. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Keempat. Jakarta:
Erlangga