1.

Penentuan Kadar Air (AOAC, 1990) Sample 2 g Botol timbang (yang telah diketahui beratnya) Keringkan dalam Oven Suhu 105 C, 3 jam Dinginkan dalam eksikator Timbang Panaskan lagi dalam Oven 105 C Dinginkan dalam eksikator Timbang (Demikian seterusnya sampai dicapai berat konstan, selisih penimbangan berturut-turut kurang dari 0,2mg)

Kadar Air = (Pengurangan brt / brt sample) x 100 %

=============================================== ===========Umar Santoso

2.

Penentuan Kadar Total Lipida Cara Soxhlet (AOAC, 1990)

Sample 2 g (kering dan telah dihaluskan) Tempatkan dalam kertas saring, gulung, masukkan dalam Thimble Pasang rangkaian alat Soxhklet Pasang tabung ekstraksi pada alat distilasi Soxhlet dengan pelarut PE secukupnya (Alirkan air kondensor) Distilasi selama sekitar 4 jam Pindahkan PE yang telah mengandung lemak ke dalam botol timbang bersih dan telah diketahui beratnya. Uapkan dengan water-bath sampai agak pekat Teruskan penguapan dalam oven 100 C Dinginkan dalam eksikator, Timbang. Demikian seterusnya sampai dicapai berat konstan Berat Residu = berat lemak
=============================================== ===========Umar Santoso

3. Penentuan lemak susu dengan cara Babcock

Timbang 18 g susu segar dalam botol Babcock 17,5mL H2SO4 95% (BJ : 1,82-1,83) Campur baik-baik, Goyang-goyangkankan botol sampai gumpalan-gumpalan campur Pasang botol Babcock dalam Centrifuge Sentrifugasi selama 5 mnt Tambahkan air panas (+ 60C ) sampai labu dalam botol tersisi penuh Lanjutkan sentrifugasi 2 mnt Tambahkan air panas lagi sampai lemak cair terletak dalam leher botol (kolom) berskala. Sentrifugasi 1 mnt lagi Masukkan botol dalam air penghangat ( 60 C) selama 3 mnt atau lebih Ambil, dan ukurlah kolom lemak dari ujung bawah sampai meniskus atas Berat lemak ----------------- X 100 % Berat sample

Kadar lemak =

=============================================== ===========Umar Santoso

4. Metode Folch (1957). Sample 5 g (mis. ikan segar) GILING 50mL Campuran Kloroform : Metanol (2/1) Aduk/ homogenkan dlm waring blender atau Aduk dengan magnetic stirrer Diamkan beberapa waktu Saring melalui kertas saring bebas lemak Tampung dengan Erlenmeyer (diketahui beratnya) Filtrat dicuci dengan aquadest Gojog, dan diamkan sampai terjadi pemisahan. Pisahkan dengan Corong Pemisah Ambil bagian bawah Uapkan pelarutnya Lemak Kadar lemak = Berat lemak/ Berat Sample X 100%
(Lemak ini siap untuk sample analisis berikutnya)
=============================================== ===========Umar Santoso

5. Penentuan angka asam (Acid Value)

Sample minyak 5 - 20 g 50mL alkohol 95% netral Erlenmeyer Tutup dengan Pendingin Balik (REFLUX) Panaskan sampai mendidih, gojog kuat-kuat Dinginkan suhu kamar Tambahkan indikator PP Titrasi dengan 0,1 N KOH standard (Akhir titrasi tercapai bila terbentuk warna merah muda yang tak hilang selama 30 detik) Catat larutan 0,1 N KOH yang dibutuhkan

Angka asam : mg KOH yang dibutuhkan untuk menetralkan asam lemak bebas dalam 1 g minyak

mL KOH X N KOH X 56,1 Angka asam = -----------------------------------Berat sampel (g)

=============================================== ===========Umar Santoso

6. Angka Penyabunan (Angka saponifikasi)

Sample Minyak 1,5 5 g 50mL lart. KOH (dibuat dari 40g KOH dlm 1 L etanol) Erlenmeyer 250mL Tutup dengan Pendingin Balik Didihkan hati-hati selama 30 mnt Dinginkan Tambahkan indikator PP Titrasi kelebihan KOH dengan lart. 0,5N HCl standard Lakukan Titrasi Blanko (tanpa sample)

Angka Penyab. : Banyaknya mg KOH yang dibutuhkan untuk menyabunkan 1 g lemak atau minyak

(Titrasi Blanko Titrasi Sample) x N HCl x BM KOH Angka Penyab. = -------------------------------------------------------------------

Berat sample (g)

=============================================== ===========Umar Santoso

7. Angka Iodine

Sample minyak 0,1 0,5 g 10mL CHCL3 (atau CCl4) 25mL reagen IBr (atau ICl) Erlenmeyer Biarkan di tempat gelap 30 mnt, kadang digojog. 10mL lart. KI 15% 50-100mL aquadest yg telah didihkan Segera TITRASI dengan lart. Na-thiosulfat 0,1N sampai lart. berwarna kuning pucat, tambahkan 2 mL lart pati. TITRASI lanjutkan sampai warna biru hilang Catat kebutuhan lart. Na-thiosulfat. Lakukan titrasi Blanko, yaitu 25mL reagen IBr ditambah 10mL KI 15% diencerkan dengan 100mL aquadest yg telah dididihkan, kemudian dititrasi dengan lart. Na-thiosulfat 0,1N Angka Iodine : Banyaknya (g) iodine yang dapat ber-reaksi dengan 100 g lemak atau minyak.
BM Iodine = 126, 9

(T. Blanko T. Sample) Angka Iodine = ------------------------------ x N Na-thio x 12,691 Lemak (g)
=============================================== ===========Umar Santoso

8. Penentuan angka peroksida (Peroxide Value)

Minyak 5,00 + 0,005g (dlm. Erlenmeyer bertutup) 30mL campuran Asam Asetat : Kloroform (3/2) Goyangkan sampai bahan larut semua 0,5mL lart. KI jenuh Diamkan 1 mnt dengan kadang digojog 30mL Aquadest TITRASI dengan 0,1N Na-thiosulfat standard sampai warna kuning hampir hilang. 0,5mL lart. Pati 1% Lanjutkan titrasi sampai warna biru hilang Catat kebutuhan Na-thiosulfat Lakukan Titrasi Blanko! Angka peroksida : milli-equivalen peroksida per 1 kg lemak

(T. Sampel T. Blanko) x N Na-thio x 1000 Angka peroksida = ------------------------------------------------------Berat sample (g)

=============================================== ===========Umar Santoso

9. Angka TBA (Metode Tarladgis et al. (1960)

Bahan (makanan berlemak) 3 g 50mL Aquadest Giling dengan Waring Blender 2mnt Pindahkan ke labu distilasi, cuci dengan 48,5mL aquadest Atur sampai pH 1,5 dengan penambahan 4N HCl Batu didih dan antifoam agent Pasang, dan lakukan distilasi sedemikian rupa shg diperoleh distilat 50mL selama 10 mnt. Aduk distilat, ambil 5 mL masukkan dalam Erlenmeyer 50mL bertutup. 5mL Reagen TBA (0,02M TBA dlm 90% As.asetat glas.) Campur baik-baik Panaskan dalam Penangas Air mendidih 35mnt. Baca Absorbansi 528nm Buat kurva standard dengan TEP atau TMP sebagai standard.

=============================================== ===========Umar Santoso

1. Titik Leleh Persiapan : Sample minyak dilewatkan dulu melalui kertas saring Masukkan ujung pipa kapiler dari kaca (min. 3 buah) ke dalam sample sampai terisi sekitar 10mm. Tutup ujung kapiler, dengan memanaskan pada api Bunsen Tempatkan kapiler dalam Beaker glass dengan posisi berdiri Masukkan ke dalam refrigerator, 4-10 C, semalam Ambil kapiler, masing-masing lekatkan pada Termometer dengan karet gelang, bagian bawah kapiler sejajar dengan ujung bawah termometer Masukkan kepiler bersama termometer ke dalam Beaker glass berisi setengah penuh aquadest. Ujung bawah termometer masuk dalam air kira-kira 3 cm Panaskan di atas pemanas listrik dengan pengadukan konstan (kenaikan suhu air skt. 0,5C per menit) Pemanasan dilanjutkan sampai betul lemak dalam kapiler meleleh (jernih) (Lemak kelihatan keruh sebelum betul-betul meleleh). Catat suhu meleleh tsb.
=============================================== ===========Umar Santoso

Metode Kjeldahl
0.7 2.2 g Sample (dlm Labu Kjeldahl) 0.7g HgO (atau 0.65g logam Hg) 15g K2SO4 (atau Na2SO4 anhyd.) 25mL H2SO4 pekat DESTRUKSI (didihkan) pelan-pelan, tambahkan sedikit parafin Setelah jernih, didihkan lagi + 30 mnt. Dinginkan
+ 200ml aquadest dingin

Butiran Zn 25mL lart. Na2S2O3 8% (atau lart. K2S 4%) + 15g NaOH Pasang rangkaian distilasi Erlenmeyer penampung (15ml HCl 0.02N , + 6 tetes MR/BCG) DISTILASI (ujung kondenser terendam dlm lart. HCl) Akhiri jika vol. distilat mencapai > 150ml (Cuci ujung kondenser) TITRASI lart. HCl dlm. Erlenmeyer dengan NaOH st.

Lakukan penentuan Blanko !

=============================================== ===========Umar Santoso

PERHITUNGAN
meq NH3 yang terdistilasi sama dengan selisih meq asam mula-mula dan meq setelah distilasi, yang dititrasi dengan NaOH standard. Jadi , meq NH3 = (ml asam x N asam) (ml NaOH x N NaOH) Karena meq N dalam protein sama dengan meq NH3, gram N adalah dikalikan dengan 0.014007. g N = meq N x 0.014007 Karena itu: (ml HCl x N HCl) (ml NaOH x N NaOH) x 1.4 % N = ---------------------------------------------------------g Sample

Protein = %N x Faktor konversi

CATATAN:

*Larutan K2S atau Na-tiosulfat dapat dicampur dulu dengan lart. NaOH sebelum ditambahkan ke labu.
=============================================== ===========Umar Santoso

MIKRO-KJELDAHL (Direct Titration)

Sample LABU Kjeldahl <---- 2 g K2SO4 ; 40 mg HgO (hati-hati) <---- 2 mL H2SO4 pekat <---- Batu didih Didihkan (destruksi) Jika lart. sudah jernih Tambahkan aquadest, didihkan lagi + 1.5jam Dinginkan, kemudian Pindah ke Labu distilasi, bilas dengan aquadest <----- 8-10mL NaOH-Na2S2O3 Distilasi Tampung distilat dalam ERLENMEYER berisi: <----- 5mL H3BO3 jenuh <----- 4 tetes indikator ( 0.2%MR + 0.2%MB) (Akhiri distilasi jika Distilat sudah tidak basik) Distilat dititrasi dengan 0.02N HCl standard

%N =

(Titrasi S Titrasi Bl) N HCl 14.007 100 ---------------------------------------------------mg Sample

=============================================== ===========Umar Santoso

Protein = %N x FK

PROSEDUR Kjeltec
-------------------------------------------------

Sample (0.1 0.6 g) Tambahkan H2SO4 pkt 3mL Katalisator: Campuran (K2SO4+CuSO4+Se)

Destruksi sp. jernih (+ 2 jam ) Pindah ke Tabung Distilasi (bilas 4 x) Siapkan lart.NaOH-Thio (di bawah) (Siapkan lart. H3BO3 4% yg ditambahkan lart. MR-BCG) Pasang Tabung Distilasi, tempatkan Erlenmeyer penampung berisi 5mL H3BO3 4% (pipa terendam) ON-kan alat, Setting NaOH : 0.2 mL x 10mL Time : 3 mnt Setelah selesai 3 mnt, ambil Erlenmeyer Siap untuk TITRASI dengan 0.02N HCl standard.

(T. Sampel T. Blanko) x N HCl x 14.008 % N = ----------------------------------------------------------- x 100% g Sample x 1000

Campuran (250g K2SO4+ 5 CuSO4+ 0,7g Se)

=============================================== ===========Umar Santoso

REAKSI YANG TERJADI:

(40g NaOH + 5g Thio) per 100mL

1.

Protein + H2SO4 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 NH3

(Destruksi) (Distilasi) (Penangk.NH3)

NH3 +HCl st berleb. NH4Cl+HCl sisa

HCl sisa + NaOHst NaCl + H2O (Titrasi) (Perlu dua lart. standard, yaitu HCl st. dan NaOH st.) Protein + H2SO4 (NH4)2SO4 (Distruksi) (NH4)2SO4 NH3 ( Distilasi) (Penangk. NH3)

2.

NH3 + H3BO3 berleb. NH4H2BO3

NH4H2BO3 + HCl st. NH4Cl + H3BO3 (Titrasi) (Hanya perlu satu lart. standard , yaitu HCl st) ---ooo---

=============================================== ===========Umar Santoso

SHOCTEC Sample : 1 3 g PE : 70 mL

Perendaman : 15 mnt Extraksi : 30mnt Pengeluaran PE : 15 mnt.

ANALISA PROTEIN - METODE LOWRY

(Lowry et al., 1951. J. Biol Chem. 193 : 265) Prinsip:
Reaksi antara protein dengan reagen fenol dan Cu pada kondisi alkalis. Pembentukan warna karena oksidasi asam amino bergugus aromatik oleh suatu reagen heteropolifosfat (Phosphotungstate Phosphomolibadate) yang dikatalisis Cu.

Reaksi:
1. Pembentukan kompleks protein-tembaga.

=============================================== ===========Umar Santoso

2.

Reduksi reagen PhosphomolybadatePhosphotungstate (Folin-Ciocalteau Phenol Reagent) oleh gugus Tyrosine dan Tryptophan.

Reagensia: 1) 2% Na2CO3 dilarutkan dalam 0.1N NaOH. 2) 2.7% NaK-Tartrate 3) 1% CuSO4 dalam air 4) 1 N Folin-Ciocalteau Phenol Reagent, harus diencerkan 1 : 1 dengan aquadest dari reagensia aslinya 2N; siapkan baru tiap hari. Kisaran deteksi 20 ~ 200g

PROSEDUR METODE LOWRY

1) Buat kurva standard menggunakan BSA. Siapkan larutan BSA: 20, 40, 60, 80, 100, dan 120 g/mL. 2) Masing-masing 0.5mL masukkan dlm tab. reaksi. 3) Siapkan campuran 2% Na2CO3; 2.7% NaK-tartrate, dan 1% CuSO4 (CuSO4 ditambahkan terakhir). 4) Tambahkan masing-masing 5mL, di-vorteks.
=============================================== ===========Umar Santoso

5) Inkubasikan 10 mnt. tepat. 6) Tambahkan 0.5mL reagensia phenol, di-vorteks. 7) Inkubasikan 30 mnt. tepat (suhu kamar) 8) Baca Absorbansinya pada 700nm. 9) Plot-kan hubungan konsentrasi BSA VS absorbansi. 10) Baca absorbansi larutan Sample. 11) Ektrapolasikan atau hitung konsentrasi protein dalam Sample. SENYAWA-SENYAWA PENGGANGGU Sukrosa Ammonium sulfat Urea Tris buffer Senyawa-senyawa sulfhidril

=============================================== ===========Umar Santoso

PROSEDUR METODE LOWRY

Untuk kurva standard : Siapkan larutan BSA: 20, 40, 60, 80, 100, dan 120 g/mL. Sample 0.5mL 5mL Reagen Lowry Vortek Inkubasi 10 mnt. tepat 0.5mL reagensia Phenol FC Vortek Inkubasi 30 mnt. tepat (suhu kmr.) Baca Absorb. 700nm. Reagen Lowry : Campuran 2% Na2CO3, 2.7% NaK-tartrate, dan 1% CuSO4 (CuSO4 ditambahkan terakhir).

=============================================== ===========Umar Santoso

ANALISA PROTEIN - METODE LOWRY

(Lowry et al., 1951. J. Biol Chem. 193 : 265) Prinsip:
Reaksi antara protein dengan reagen fenol dan Cu pada kondisi alkalis. Pembentukan warna biru karena oksidasi asam amino bergugus aromatik oleh suatu reagen heteropolifosfat (Phosphotungstate Phosphomolibadate) yang dikatalisis Cu.

=============================================== ===========Umar Santoso

REAKSI KIMIA YANG TERJADI PADA Metode Kjeldahl

Reaksi pada waktu Destruksi
Cat.

n C NH2 + mH2SO4 Heat

Protein

CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

CARA I Metode Konvensional (TITRASI BALIK)

Perlu 2 macam larutan std. yaitu HCl std. dan NaOH std. (Titrasi Balik) H2SO4

aCbHcN
Cat. OH-

a CO2 + b H2O + cNH4HSO4

cNH4HSO4 cNH3 + (c + d) HCl

c NH3

+ cSO42c NH4Cl + d HCl

dHCl + d NaOH

d H2O + d NaCl

mmol N (c) = mmol reacted HCl =

mmol HCl taken x (c + d) - mmol NaOH (d)

mmol aCbHcN = mmol N x 1/ c
=============================================== ===========Umar Santoso

KONVENSIONAL:
Perlu 2 lart std, yaitu asam untuk mengumpulkan NH3 , dan basa untuk titrasi balik (Back Titration).

CARA II. TITRASI LANGSUNG

Hanya perlu 1 lart. std., yaitu asam std., untuk Direct Titration. NH3 ditangkap dengan lart. H3BO3, shg dalam distilasi terbentuk ammonium borate. NH3 + H3BO3

NH4+ + H2BO3-

Asam borate adalah sangat lemah untuk dititrasi, tetapi borate-nya, yang ekivalen dengan jumlah NH3, adalah suatu basa Bronsted (Penerima Proton) yang kuat, yang dapat dititrasi dengan asam standard dengan indikator MR. Asam borat adalah lemah shg tidak mengganggu. Ammonium borate : (NH4H2BO3) (NH4H2BO3) + HCl ------> NH4Cl + H3BO3

=============================================== ===========Umar Santoso

Metode Lowry : 1. Membuat kurva standar menggunakan BSA (Bovine Serum Albumin) Konsentrasi VS Absorbansi 2. Menera Absorbansi sample. 3. Plot-kan Absorbansi sample ke Konsentrasi-nya. Atau : gunakan Persm. Regresi linier:

Y = AX + B
Spektrofotometer

Absorbansi 700nm

Konsentrasi
=============================================== ===========Umar Santoso

Analisis Komposisi asam-asam amino

- Menggunakan metode TLC - Menggunakan HPLC - Amino acid Analyzer Preparasi: Sample protein harus dihidrolisis dulu dengan HCL 6N. 6N HCl Protein ------------------- asam-asam amino Asam-asam amino dianalisa dengan TLC CARA: 1. Siapkan Plate 2. Berikan garis bagian bawah 3. Tutulkan sample-sample dengan pipet kecil atau kapiler atau syringe, sambil ditiup. 4. setelah kering, kembangkan dalam tanki pengembang yang telah diberi solven. 5. Keringkan dalam oven 100 C. 6. Ukur jarak antara garis dasar dengan tengahtengah noda (mis. a cm). 7. Ukur jarak garis dasar dengan garis atas (garis solven) (mis. b cm) 8. Hitung Rf Rf = a/b
=============================================== ===========Umar Santoso

TLC (Thin Layer Chromatography)

=============================================== ===========Umar Santoso