PRAKTIKUM III

Hari, Tanggal : Rabu, 14 Desember 2016

Judul : Pembuatan Preparat Sumsum Tulang
Dasar Teori :

Terdapat dua macam preparat sumsum tulang yaitu Preparat tebar

(spread) dan Preparat tekan (squash).
Preparat spread yaitu preparat yang dibuat dengan cara meletakkan
hasil aspirasi berupa fragmen sumsum tulang diatas kaca obyek dan
kemudian digeser menggunakan kaca penebar (spreader) zona
pembacaan Trail. Pembuatannya mirip dengan pembuatan sediaan apus
darah tepi (SADT) atau blood film, tetapi disini menggunakan bahan
utama fragmen sumsum tulang.
Sedangkan preparat squash yaitu preparat yang dibuat dengan cara
meletakkan fragmen sumsum tulang hasil aspirasi diatas kaca obyek,
kemudian dengan kaca obyek yang lain ditekan sambil menggeser
sehingga tampak gambaran inti ditengah (core) dan daerah pinggir dari
fragmen sumsum tulang zona baca core.
Alat dan Bahan :
1. 6 buah kaca objek
2. Pipet tetes
3. Sampel sumsum tulang
4. Methanol ( untuk fiksasi )
5. Tissue

Cara Kerja :

1. Teteskan sampel sumsum tulang di atas objek gelas untuk mencari

fragmen sumsum tulang
2. Untuk membuat preparat Spread, fragmen sumsum tulang diambil
dengan menggunakan pipet tetes kemudian diletakkan di atas objek
gelas yang lain kemudian digeser menggunakan kaca penebar
(spreader). Seperti pembuatan sediaan apus darah tepi.
3. Untuk membuat preparat Squash, fragmen sumsum tulang diambil
kemudian diletakkan diatas kaca objek kemudian ditekan sambil
menggeser hingga ujung kaca objek.
4. Tunggu sampai keringkan, kemudian preparat siap untuk di warnai.
5. Tetapi jika preparat akan disimpan, tidak langsung diwarnai maka
diharuskan untuk difiksasi terlebih dahulu.

Hasil Praktikum :

Preparat Spread Preparat Squash

Kesimpulan :

1. Preparat spread digunakan untuk menilai sellularitas, hitung jenis sel

darah, hitung megakariosit, identifikasi sel, dan estimasi trombosit
menilai adanya sel asing atau ganas dan menghitung M: E Ratio
2. Preparat squash digunakan untuk estimasi sellularitas dan estimasi
jenis sel.

PRAKTIKUM IV
Hari, Tanggal : Rabu, 21 Desember 2016
Judul : Pengecetan dan Pemeriksaan Identifikasi Preparat Sumsum
Tulang
1. Pengecatan Giemsa
Tujuan : Untuk melihat morfologi dan jenis sel darah, menilai
selularitas.
Prinsip :
Pada pengecatan Giemsa dilakukan pengelompokan yang bersifat
asam yang akan mengikat zat warna dasar azure methylen blue seperti
asam nukleat, protein dari inti sel dan sitoplasma primitif. Dan
pengelompokan yang bersifat basa dari molekul Hb yang akan mengikat
zat warna yang bersifat asam dan terwarnai oleh eosin. Granula dari
netrofil tercat secara lemah dengan komplek azure. Granula eosinofil
mengandung derivate spermin termasuk kelompok alkalis yang akan
terwarnai kuat oleh komponen asam. Sedangkan granula basofil
mengandung heparin yang bersifat asam sehingga akan mengikat
komponen basa dari zat warna.

Alat dan Bahan :

Preparat Sumsum tulang (spread dan squash)

Bak pewarnaan
Methanol
Reagen Buffer A (KH2 PO4 .9,1 gr/ L)
Reagen Buffer B (Na2HPO4 . 2H2O 11,9 gr /L)
Giemsa Pekat
Mikroskop
Oil Imercy

Cara Kerja :

1. Pembuatan Larutan Kerja

Siapkan campuran Buffer A + B,( 1 : 1) campuran ini tahan 3 hari.
Tambahkan ke dalam Buffer, Giemsa pekat dengan perbandingan,
Giemsa pekat 1 bagian : 7 bagian Buffer. Campuran hanya tahan 1
hari.
2. Pengecetan
Preparat yang sudah kering difiksasi dengan methanol 5 10
menit.
Genangi dengan larutan kerja selama 20 30 menit.
Sisa cat dibuang, cuci dengan air mengalir hingga betul-betul
bersih.
 Keringkan di udara, lalu mounting dengan EZ mount dan ditutup
deck glass.
Setelah kering periksa di bawah mikroskop dengan perbesaran
objektif 100x.

Hasil Pemeriksaan :

Preparat Spread
Hyperseluler
Tampak hampir tidak
terdapat sel lemak
karena tertutupi oleh sel
hemopoietik
Peningkatan aktivitas
hemopoietik

Preparat Squash
Pembesaran 10x pada zona
baca Core.
Tampak fragmen.
Megakariosit
Bentuk : oval, kadang-kadang
bulat
Warna : merah jambu
Bentuk inti : multilobuler tidak
teratur
Tipe kromatin : padat

Kesimpulan :
Pada preparat sumsum tulang dengan pengecatan giemsa di
dapatkan gambaran hypersellularitas sel hemopoietik lebih dominan dan
banyak dari pada lemak terlihat sedikit.

Sedangkan untuk preparat squash pada pembesaran 10x pada zona

baca Core tampak terlihat jelas fragmen fragmen sumsum tulang dan
juga terdapat Megakariosit yang selanjutnya akan bermaturasi menjadi sel
Metamegakaryosit.

2. Pengecatan SBB (Sudan Black B)

Tujuan : untuk melihat seri granulosit

Prinsip :

Sudan Black B dalam ethanol akan mencat phospholipid yang

terdapat dalam lekosit (granulosit) berwarna coklat kehitaman.

Alat dan Bahan :

Preparat sumsum tulang (spread)

Bak pewarnaan
Cawan Petri
Staining jar
Larutan A (Phenol12 gr, Ethanol 70% 25 ml
Larutan B (Na2HPO4 . 2H2O0,225 gr, Aquadest 75 ml)
Larutan C (Sudan Black B0,45 gr, Ethanol 70 % 150 ml)
 Formalin
Aquades
Alkohol 70%
Safranin 1%
Mikroskop
Oil Imercy

Cara Kerja :

1. Pembuatan Larutan Kerja

Campurkan larutan A + B (1 : 1)
Tambahkan larutan C, 3 bagian
Campuran ini harus netral atau sedikit alkalis
2. Pengecatan
Preparat yang sudah kering difiksasi dengan uap formalin dalam
staning jar selama 5 10 menit.
Cuci dengan aquadest, keringkan.
Rendam preparat dengan larutan kerja dalam petri tertutup selama
30 menit.
Buang sisa cat, rendam dengan alcohol 70% selama 2 menit sambil
digoyang goyang.
Cuci dengan air mengalir, lakukan counter stain dengan safranin 1%
selama 10-30 detik
Cuci dengan air mengalir, keringkan (jangan di mounting).
Periksa dibawah mikroskop dengan perbesaran objektif 100x

Hasil Pemeriksaan :

Pengecatan SBB Negatif (-)

karena tidak ditemukan sel
yang berwarna coklat
Kesimpulan :

Pada preparat sumsum tulang dengan pengecatan Sudan Black B

(SBB) disimpulkan SBB (-) dikarenakan tidak ditemukananya sel yang
positif (berwarna cokelat kehitaman) dan predominan dari seri sel non
granula. SBB (+ ) terjadi pada kasus keganasan seri granulosit.

3. Pengecatan Fe

Tujuan : Untuk mengetahui adanya kandungan besi dalam fragmen

sumsum tulang

Prinsip :

Ion Ferri dalam hemosiderin mengubah Ferrocyanida yang berwarna

kuning dan mudah larut dalam larutan asam menjadi suatu endapan
(presipitat) Ferri Ferrocyanida yang berwarna biru (Reaksi Perl).

Alat dan Bahan :

Preparat sumsum tulang (spread)

Staining jar
Waterbath
HCl 1 N
K Ferrocyanida 4 %
Methanol
HCL 20 %
Safranin 1%

Note :

Pastikan alat-alat terbebas dari cemaran Fe dengan membilas terlebih

dahulu dengan HCl 20 %.
Pengecatan Fe sebaiknya di dampingi dengan control

Cara Kerja :

Preparat yang sudah kering difiksasi dengan methanol 5 10

menit
Tuangkan bagian HCl 1 N ke dalam staining jar dan masukan ke
dalam water bath 560 C selama 10 menit
Tambahkan bagian K Ferrocyanida 4 % ke dalam staining jar
Masukan preparat yang sudah difiksasi hingga terendam semua
Biarkan selama 10 - 20 menit dalam water bath 560 C
Bilas dengan air mengalir - 1 menit
Lakukan counter stain dengan safranin 1 % 10 30 detik
 Cuci dengan air mengalir dan keringkan
Periksa di bawah mikroskop dengan perbesaran objektif 10-100x

Hasil Pengamatan :

Terdapat partikel sedikit atau

hampir tidak ditemukan.

Kesimpulan :

Pada preparat sumsum tulang dengan pengecatan Fe tidak

ditemukan kandungan Fe fragmen negatif (0). Kurangnya kandungan besi
pada sel darah biasa terjadi pada kasus anemia defisiensi besi.

4. Pengecatan Lephene

Tujuan : untuk melihat bentuk seri eritrosit

Prinsip :

Lepehne akan memberikan warna hijau terang pada sitoplasma

eritrosit karena adanya reaksi benzidine dan perhidrol.

Alat dan Bahan :

Preparat sumsum tulang (spread)

Bak Pewarnaan
Reagent Lepehne (larutan benzidine 0,6% dalam ethanol 96%
sebanyak 2 ml, 0,5 ml perhidrol 30% dalam 4,5 ml ethanol 70%)
Methanol
 Giemsa (larutan kerja)
Mikroskop
Oil Imercy

Cara Kerja :

Preparat yang sudah kering difiksasi dengan methanol selama 5

10 menit.
Rendam dengan reagen lepehne selama 10 menit.
Cuci dan keringkan
Rendam dengan cat Giemsa (lar. kerja) 15 20 menit
Cuci dan keringkan
Periksa di bawah mikroskop dengan perbesaran objektif 100%

Hasil Pemeriksaan :

1. Eritrosit tua sebagai control

2. Bukan seri eritrosit
1
2

Kesimpulan :

Pada sampel sumsum tulang yang di cat dengan Lepehne didapatkan

Lephene negatif (-) karena ditemukan seri eritropoietik namun sedikit atau
hamper tidak ada. Lephene (+) biasanya pada Eritroleukemia (M6).

5. Pengecatan PAS

Tujuan : untuk melihat seri limposit

Prinsip :
 Pengecatan PAS berguna untuk mengenali sel sel jajaran Limposit
yang mengandung Glicogen. Reaksi yang terjadi adalah Oksidasi Glicogen
oleh asam Periodat (Periodic Acid) menjadi Aldehida, dan bereaksi dengan
reagent Schiff yang menyusun warna merah.

Alat dan Bahan :

Preparat sumsum tulang (spread)

Bak pewarnaan
Cawan Petri
Kristal Formalin
Larutan Periodic Acid
Larutan Schiff
Larutan Hematoxylin
Metanol

Cara Kerja :

Preparat di fiksasi dengan uap formalin atau metanol5-10 menit.

Rendam dengan Periodic Acid selama 20-30 menit
Buang cat, cuci dengan air mengalir selama 5-10 menit, bilas
dengan aquadest.
Rendam dengan larutan Schiff selama 20-30 menit
Buang cat, cuci dengan air mengalir sampai betul betul bersih
selama 5-10 menit.
Rendam dengan Hematoxylin selama 10-15 menit
Buang cat, cuci dengan air mengalir selama 5-10 menit.
Keringkan. Periksa di bawah mikroskop dengan perbesaran
objektif 100x

Hasil Pemeriksaan :
Interpensi :
PAS ( + ) apabila sitoplasma
sel limfopoietik berwarna
merah.

Hasil :
PAS ( - ) / negatif
Tidak terlihat granulasi
merah tua kasar pada
sitoplasma Limfoblas.

Kesimpulan :

Pada preparat sumsum tulang dengan pengecatan PAS ditemukan

hasil PAS (-) / Negatif bukan dari seri limfosit.