- 1321 -
PENJELASAN
BAKUPEMBANDINGFARMAKOPEINDONESIA<11>
Baku Pembanding Farmakope Indonesia untuk
selanjutnya ditulis Baku Pembanding FI atau BPFI
dibuat dan diedarkan di bawah wewenang Badan
Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, yang
masing-masing lotnya telah lolos dari seleksi dan
kesesuaian. Karakteristik kritis tiap lot dari spesimen
dipilih untuk pembuatan pembanding ditetapkan atas
dasar hasil pengujian dari 3 (tiga) atau lebih
laboratorium secara independen.
BPFI adalah senyawa yang telah dikarakterisasi, seperti
obat tertentu (senyawa obat, produk biologik, eksipien,
cemaran, hasil urai, pereaksi dan juga termasuk baku
pembanding untuk verifikasi kinerja). Jika disahkan
untuk digunakan sebagai baku pembanding pada
pengujian kualitatif atau kuantitatif (sebagai bagian dari
monografi) pada Farmakope Indonesia, BPFI bersifat
resmi dan memiliki legalitas hukum di Indonesia.
Pemastian kesesuaian untuk pemakaian pada aplikasi
lainnya ditentukan oleh pengguna. BPFI adalah baku
pembanding primer dalam wilayah hukum Republik
Indonesia, jika memungkinkan dikalibrasi atau
dibandingkan terhadap baku pembanding internasional
seperti disediakan oleh World Health Organization.
BPFI tidak digunakan untuk tujuan terapi. BPFI
disediakan untuk tujuan metrologi legal dan dapat
membantu memastikan perbandingan hasil dan
ketertelusuran terhadap Satuan Internasional (SI), baik
disertifikasi atau tidak.
JENIS BAKU PEMBANDING
Baku Pembanding untuk artikel Farmakope Indonesia
Baku Pembanding untuk artikel resmi dalam Farmakope
Indonesia tersedia sebagai bahan murni atau campuran
bahan kimia seperti bahan obat atau eksipien tertentu.
Penggunaan bahan-bahan ini ditentukan dalam masing-
masing monografi dan umumnya digunakan dalam
penetapan kadar dan/atau uji identifikasi. Penggunaan
BPFI diluar ketentuan dalam monografi adalah
tanggungjawab pengguna. Nilai karakteristik atau nilai
perhitungan BPFI dinyatakan pada sertifikat baku
pembanding.
Baku Pembanding Cemaran
Baku Pembanding untuk cemaran dapat berupa:
Cemaran organik yang terbentuk baik pada saat
proses produksi maupun selama penyimpanan bahan
dan dapat termasuk bahan awal, bahan antara,
produk sampingan, pereaksi, katalisator, dan/atau
hasil urai.
Cemaran anorganik yang umumnya dihasilkan dari
proses sintesis; termasuk antara lain pereaksi,
katalisator, logam berat, dan garam anorganik.
Sisa pelarut yang dapat berupa larutan organik atau
anorganik yang digunakan selama proses sintesis.
Baku Pembanding Cemaran dapat berupa bahan tunggal
yang dimurnikan atau campuran lebih dari satu cemaran.
Cara lain untuk mengendalikan cemaran adalah dengan
menyatakan kandungan cemaran pada bahan resmi
dalam sertifikat; menggunakan waktu retensi relatif
kromatografi dan faktor respons atau menyatakan nilai
teoritis seperti serapan jenis UV pada panjang
gelombang tertentu. Nama senyawa baku pembanding
ditulis dalam nama umum dinyatakan dalam etiket dan
sertifikat baku pembanding.
Bahan Pembanding Bersertifikat
Bahan Pembanding Farmakope Indonesia Bersertifikat
adalah Baku Pembanding yang memiliki sertifikat nilai
karakteristik dengan ketidakpastian terkait dan
ketertelusuran metrologi, yang sesuai dengan
International Organization for Standardization (ISO)
Guide 30-35. Penggunaan yang benar dari Bahan
Pembanding Farmakope Indonesia Bersertifikat ini
menunjang ketertelusuran hasil terhadap satuan Standar
Internasional dan komparasi prosedur.
Baku Pembanding Farmakope Indonesia untuk
Produk Biologik
Farmakope Indonesia menyediakan Baku Pembanding
untuk produk biologi dan bahan tambahannya. Seperti
tertera pada Unit Potensi (Produk Biologi) dalam
Ketentuan dan Persyaratan Umum, BPFI untuk produk
biologi dapat berbeda dalam satuan, definisi, atau
standar lain yang diakui secara internasional. Baku
Pembanding Farmakope Indonesia dipersyaratkan dalam
pengujian dan penetapan kadar pada Farmakope
Indonesia.
Baku Uji Verifikasi Kinerja Farmakope Indonesia
Bahan ini digunakan untuk menganalisis atau untuk
membantu penyesuaian operasi instrumen untuk
memastikan bahwa hasil yang diperoleh akurat dan atau
presisi, atau memberikan hasil yang bisa diterima.
Penggunaan Baku Pembanding ini secara umum
dijelaskan dalam bab uji umum dan informasi terkait.
PENGGUNAAN BAKU PEMBANDING
FARMAKOPE INDONESIA
Penggunaan resmi Baku Pembanding Farmakope
Indonesia ditetapkan dalam monografi dan Ketentuan
Umum Farmakope Indonesia, yaitu:
Penggunaan kuantitatif pada penetapan kadar dari
zat aktif dan sediaan, uji batas, atau blangko dan
kontrol.
Penggunaan kualitatif (seperti uji identifikasi, uji
kesesuaian sistem, atau penanda puncak
kromatografi).
Penggunaan metode khusus (seperti baku verifikasi
kinerja, baku titik leleh, dan penghitung partikel).
 - 1322 -
PENGEMASAN
Jumlah bahan untuk masing-masing wadah Baku
Pembanding Farmakope Indonesia tergantung dari
penggunaan yang sesuai dan secara umum cukup untuk
beberapa kali pengulangan. Beberapa baku (khususnya
bahan dengan persyaratan penanganan khusus atau
bahan yang tersedia hanya dalam jumlah sedikit)
tersedia dalam wadah satuan tunggal. Wadah satuan
tunggal tersebut umumnya diliofilisasi, dan
kandungannya diberi etiket dalam massa dan satuan
aktivitas per wadah pada sertifikat pengujian. Jika diberi
etiket demikian, kandungan wadah tersebut harus
direkonstitusi seluruhnya tanpa penimbangan. Petunjuk
rekonstitusi diberikan pada sertifikat pengujian atau
dalam monografi baku tersebut.
SERTIFIKAT PENGUJIAN
Sertifikat pengujian berisi seluruh informasi yang
diperlukan untuk penyimpanan dan pemakaian Baku
Pembanding Farmakope Indonesia yang benar sesuai
monografi. Informasi termasuk petunjuk penggunaan,
peringatan keamanan, informasi persyaratan untuk
senyawa terkendali, dan nilai karakteristik atau nilai
perhitungan baku dengan pemakaian kuantitatif. Kecuali
dinyatakan lain dalam prosedur pada monografi atau
Ketentuan Umum, Baku Pembanding Farmakope
Indonesia harus digunakan sesuai dengan petunjuk pada
sertifikat pengujian Baku Pembanding.
Walaupun Baku Pembanding Farmakope Indonesia
mengalami pengujian ulang untuk menentukan
kesesuaian lanjutan penggunaan, Baku Pembanding
Farmakope Indonesia tidak mencantumkan waktu
kedaluwarsa pada etiket.
PENANDAAN
Tulisan pada etiket berisi informasi nama baku
pembanding, nomor kontrol, massa, nama dan alamat
produsen.
PEMAKAIAN
Banyak pengujian dan penetapan kadar di Farmakope
berdasarkan perbandingan antara zat uji dengan Baku
Pembanding Farmakope Indonesia. Pada pengujian
tersebut, pengukuran dilakukan terhadap sediaan zat uji
dan baku. Jika ditentukan bahwa larutan baku atau
preparasi baku disiapkan untuk pengujian kuantitatif
dengan pengenceran secara bertahap atau cara lain, maka
baku pembanding harus ditimbang saksama seperti
tertera pada Timbangan dan Anak timbangan <41> dan
Peralatan Volumetrik <21>. Perhitungan juga harus
mencantumkan kemungkinan kesalahan dari
penimbangan massa dalam jumlah sedikit seperti tertera
pada Penyesuaian Larutan dalam Ketentuan Umum.
Baku Pembanding wadah satuan tunggal seperti tersebut
di atas adalah pengecualian.
Petunjuk penggunaan Baku Pembanding Farmakope
Indonesia meliputi sebagai berikut:
Gunakan langsung Tanpa perlakuan khusus atau
koreksi untuk penguapan.
Keringkan sebelum digunakan Gunakan segera
setelah pengeringan pada kondisi yang ditentukan.
Pengeringan tidak boleh dilakukan pada wadah
aslinya. Sebagian bahan harus dipindahkan ke dalam
wadah pengering.
Tetapkan kadar air secara titrimetri pada saat akan
digunakan Lakukan koreksi kadar air atau susut
pengeringan yang ditetapkan pada sebagian bahan.
Penetapan kadar air secara titrimetri dilakukan
dengan cara Metode I seperti tertera pada Penetapan
Kadar Air <1031>. Penetapan kadar air dapat juga
dilakukan dengan metode instrumen atau
mikroanalitik. Jika menggunakan sejumlah tertentu
(lebih kurang 50 mg Baku Pembanding), titrasi
dengan pereaksi yang diencerkan empat kali. Jika
dipersyaratkan penetapan susut pengeringan dari
Baku Pembanding Farmakope Indonesia, maka
gunakan prosedur sesuai yang tertera pada sertifikat
pengujian. Jumlah contoh yang lebih kecil dari
persyaratan yang tertera pada Susut Pengeringan
<1121> dapat digunakan untuk Baku Pembanding
Farmakope Indonesia jika pengguna dapat
memperoleh hasil yang akurat.
Jika pada sertifikat pengujian dipersyaratkan
pengeringan atau koreksi terhadap penguapan, harus
dilakukan pada saat akan digunakan. Perlakuan lebih
lanjut harus dikendalikan oleh prosedur operasional
pengguna dan Cara Berlaboratorium yang Baik.
PENYIMPANAN
Baku Pembanding Farmakope Indonesia harus disimpan
dalam wadah yang ditetapkan oleh Farmakope Indonesia
(misalnya vial yang kedap udara atau vial yang dikemas
dalam kantong tertutup kedap udara). Jika ditentukan
penyimpanan khusus, maka harus mengikuti petunjuk
pada sertifikat pengujian. Vial yang belum dibuka harus
disimpan sesuai dengan petunjuk pada sertifikat
pengujian. Pengguna harus memastikan bahwa isi dari
vial yang sudah dibuka masih sesuai untuk digunakan
dan memenuhi nilai yang tertera, dan informasi
ketidakpastian masih dalam rentang yang dapat diterima.
PERALATAN VOLUMETRIK <21>
Sebagian besar peralatan volumetrik yang digunakan
dalam Farmakope Indonesia Edisi V adalah peralatan
yang dikalibrasi pada suhu 20, walaupun pada umurnya
saat penggunaan alat tersebut di laboratorium suhu lebih
mendekati 25, yaitu suhu yang umum digunakan untuk
pengujian dan penetapan kadar menurut Farmakope.
Ketidaksesuain ini tidak berarti, apabila suhu ruang tetap.
Penggunaan Untuk memperoleh derajat ketelitian
yang diinginkan dalam penetapan kadar menurut
 - 1323 -
Farmakope, termasuk diantaranya pengukuran secara Buret
volumetri dan pernyataan bahwa suatu pengukuran harus
diukur secara seksama, alat harus dipilih dan Volume yang 10
dinyatakan (ml) 25 50
digunakan dengan hati-hati. Ukuran buret harus (tipe mikro)
sedemikian hingga volume titran tidak kurang dari 30% Batas kesalahan
0,02 0,10 0,10
volume nominal. Bila volume titran yang diukur kurang (ml)
dari 10 ml, umumnya diperlukan buret 10 ml atau Batas
0,02 0,03 0,05
mikroburet. kesalahan (%)
Rancangan alat volumetrik merupakan faktor penting
dalam menjamin kesaksamaan. Misalnya panjang skala
dari gelas ukur harus tidak kurang dari 5 kali diameter TERMOMETER <31>
dalam; ujung buret dan pipet harus membatasi laju aliran
agar tidak lebih dari 500 l per detik. Alat pembacaan suhu yang sesuai untuk uji
Farmakope, memenuhi spesifikasi yang tertelusur
Standar kesaksamaan Toleransi kapasitas untuk labu terhadap standar nasional. Alat pembacaan suhu dapat
tentukur, pipet volume dan buret harus sesuai dengan berupa tipe cairan dalam kaca atau suatu jenis indikator
yang tertera pada tabel. suhu digital atau analognya, seperti alat resistensi suhu,
Toleransi kapasitas untuk pengukuran pipet ukur termister, atau termokopel.
sampai dengan kapasitas 10 ml agak lebih besar dari Suatu indikator suhu digital atau analognya terdiri dari
pipet volume dengan ukuran yang setara yaitu berturut- probe suhu yang merupakan tempat sensor. Probe
turut 10 l, 20 l dan 30 l untuk ukuran 2 ml, 5 ml dan suhu dihubungkan dengan suatu alat ukur yang mampu
10 ml. menerjemahkan sinyal dalam ohm atau milivolt menjadi
Pipet volume dan pipet ukur yang dikalibrasi sebagai pembacaan suhu. Bagian probe suhu dari indikator
pemindah (td), harus dialirkan dalam posisi tegak lurus suhu digital atau analognya yang direndam dalam media
dan disentuhkan pada dinding labu penampung untuk yang suhunya diukur harus dibuat dari bahan yang inert.
mengeluarkan sisa pada ujung pipet. Pembacaan volume Standardisasi indikator suhu digital dan analognya
pada buret harus dapat diperkirakan hingga mendekati dilakukan pada suhu standar yang tertelusur terhadap
0,01 ml untuk buret 25 ml dan 50 ml dan hingga standar nasional, dengan frekuensi pengujian yang
mendekati 0,005 ml untuk buret 5 ml dan 10 ml. Pipet ditetapkan. Dalam pemilihan alat pembacaan suhu, perlu
yang dikalibrasi secara khusus (tc) umunya digunakan dipertimbangkan dengan hati-hati kondisi penggunaan.
untuk pengukuran cairan kental seperti sirup, dalam hal Termometer cair dalam kaca dapat distandardisasi
demikian labu tentukur dapat dipakai sebagai pengganti dengan pencelupan total, pencelupan sebagian atau
pipet tersebut, untuk itu pipet atau labu tentukur harus pencelupan keseluruhan. Sepanjang dapat dilaksanakan,
dibilas sampai bersih dan bilasan ditambahkan pada setiap termometer harus digunakan sesuai dengan
bagian cair yang diukur. kondisi pencelupan seperti pada saat distandardisasi.
Standardisasi termometer dilakukan pada frekuensi
Labu tentukur pengujian yang ditetapkan dengan suhu standar yang
tertelusur terhadap standar nasional. Mengacu pada
Volume standar E1 yang terkini. Standardisasi termometer cair
yang dalam kaca untuk pencelupan total, meliputi pencelupan
10 25 50 100 250 500 1000
dinyatakan
(ml)
termometer sampai bagian atas kolom cairan dengan sisa
Batas batang termometer dan bagian atas dari ruang ekspansi
kesalahan 0,02 0,03 0,05 0,08 0,12 0,15 0,30 dibiarkan pada suhu ruang. Standardisasi untuk
(ml) pencelupan sebagian, meliputi pencelupan termometer
Batas hingga batas garis celup yang ditandai dengan goresan
kesalahan 0,20 0,12 0,10 0,08 0,05 0,04 0,03 pada bagian depan termometer dan menyisakan batang
(%) termometer yang dibiarkan pada suhu ruang.
Standardisasi untuk pencelupan keseluruhan, meliputi
Pipet volume pencelupan seluruh termometer, tidak ada bagian batang
termometer yang dibiarkan berhubungan dengan suhu
Volume ruang. Untuk penggunaan pada kondisi pencelupan lain,
yang diperlukan koreksi terhadap batang yang tidak tercelup
1 2 5 10 25 50 100
dinyatakan hingga diperoleh pembacaan suhu yang benar.
(ml)
Pada pemilihan termometer, penting untuk
Batas
kesalahan 0,006
0,0
0,01 0,02 0,03 0,05 0,08
dipertimbangkan dengan hati-hati, mengenai kondisi
06 pada saat digunakan. Tabel yang disertakan pada bagian
(ml)
Batas ini menunjukkan spesifikasi sejumlah termometer yang
0,3 sesuai untuk uji Farmakope, termasuk angka-angka batas
kesalahan 0,60 0,20 0,20 0,12 0,10 0,08
0
(%)
 - 1324 -
atas dan batas bawah rentang suhu yang tercantum harus dilakukan dengan menggunakan alat timbangan
dalam Tabel. yang ketidakpastian pengukurannya (kesalahan acak
ditambah dengan kesalahan sistematik) tidak lebih dari
Spesifikasi Termometer 0,1% pembacaan. Misalnya, ditimbang sejumlah 50 mg,
maka kesalahan mutlak tidak lebih dari 50 g.
Seri Rentang Suhu Pembagian Pencelupan Ketidakpastiaan pengukuran memenuhi syarat jika pada
No (C) Skala (C) (mm) penimbangan ulang tidak kurang dari 10 kali, tiga kali
nilai simpangan baku dibagi dengan jumlah yang
Termometer untuk Pemakaian Umum termasuk ditimbang tidak lebih dari 0,001. Kecuali dinyatakan
Penetapan Jarak Lebur lain, untuk uji batas secara titrimetri, penimbangan harus
memungkinkan diperolehnya angka signifikan dari
1C -20 sampai 150 1 76 bobot analit setara dengan angka signifikan dari kadar
2C -5 sampai 300 1 76 titran.
3C -5 sampai 400 1 76 Penggolongan kelas berikut ini dibuat berdasarkan
peningkatan toleransi:
Termometer untuk Penetapan Jarak Didih atau Anak timbangan kelas 1 adalah anak timbangan yang
Jarak Destilasi atau Penetapan Suhu digunakan untuk kalibrasi pada timbangan berkapasitas
rendah dengan kepekaan tinggi. Tersedia dengan satuan
37C -2 sampai 52 0,2 100 yang bervariasi dari 1 mg sampai 500 mg. Toleransi
38C 24 sampai 78 0,2 100 untuk setiap satuan dalam kelas ini adalah 5 g.
39C 48 sampai 102 0,2 100 Dianjurkan untuk mengkalibrasi timbangan yang
40C 72 sampai 152 0,2 100 menggunakan metode optik atau elektrik untuk
41C 98 sampai 152 0,2 100 penimbangan dengan saksama sejumlah zat di bawah 20
102C 123 sampai 177 0,2 100 mg.
103C 148 sampai 202 0,2 100 Anak timbangan kelas 1 adalah anak timbangan
104C 173 sampai 227 0,2 100 dengan ketelitian tinggi yang digunakan untuk kalibrasi.
105C 198 sampai 252 0,2 100 Dapat digunakan untuk menimbang saksama sejumlah
106C 223 sampai 277 0,2 100 zat di bawah 20 mg (untuk anak timbangan 10 g atau
107C 248 sampai 302 0,2 100 kurang, persyaratan kelas 1 memenuhi kelas M seperti
tertera pada Tabel).
Termometer untuk Penetapan Jarak Beku atau Anak timbangan kelas 2 adalah anak timbangan yang
Penetapan Suhu digunakan sebagai baku kerja untuk kalibrasi, terpasang
pada timbangan analitik dan anak timbangan
89C -20 sampai 10 0,1 76 laboratorium untuk analisis rutin (Persyaratan kelas 2
90C 0 sampai 30 0,1 76 memenuhi kelas S seperti tertera pada Tabel).
91C 20 sampai 50 0,1 76 Anak timbangan kelas 3 dan 4 adalah anak timbangan
92C 40 sampai 70 0,1 76 yang digunakan pada timbangan laboratorium dengan
93C 60 sampai 90 0,1 76 ketelitian sedang (Persyaratan kelas 3 memenuhi kelas
94C 80 sampai 110 0,1 76 S-1; persyaratan kelas 4 memenuhi kelas P seperti tertera
95C 100 sampai 130 0,1 76 pada Tabel).
96C 120 sampai 150 0,1 76 Kelas anak timbangan dipilih sehingga toleransi bobot
yang digunakan tidak lebih dari 0,1% dari jumlah yang
ditimbang. Umumnya kelas 2 dapat digunakan untuk
TIMBANGAN DAN ANAK TIMBANGAN <41> jumlah lebih besar dari 20 mg, kelas 3 untuk jumlah
lebih besar dari 50 mg dan kelas 4 untuk jumlah lebih
Pada pengujian dan penetapan kadar menurut besar dari 100 mg.
Farmakope diperlukan penggunaan timbangan yang Timbangan harus dikalibrasi secara berkala, sebaiknya
beragam dalam kapasitas, kepekaan dan reprodusibilitas. terhadap anak timbangan baku mutlak.
Kecuali dinyatakan lain, jika zat dinyatakan timbang
saksama untuk penetapan kadar, maka penimbangan
 - 1325 -
Toleransi untuk anak timbangan baru dalam set

Kelas M Kelas S Kelas S-1 Kelas P

Satuan Masing-masing Kelompok Masing-masing Kelompok Masing-masing Kelompok
(g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
100 500 250 1000 2000
50 250 120 600 1200
30 150 74 154 450 900
20 100 74 154 350 700
10 50 74 154 250 500

5 34 65 54 105 180 360

3 34 65 54 105 150 300
2 34 65 54 105 130 260
1 34 65 54 105 100 200
(mg)
500 5,4 10,5 25 55 80 160
300 5,4 10,5 25 55 70 140
200 5,4 10,5 25 55 60 120
100 5,4 10,5 25 55 50 100

50 5,4 10,5 14 34 42 85
30 5,4 10,5 14 34 38 75
20 5,4 10,5 14 34 35 70
10 5,4 10,5 14 34 30 60

5 5,4 10,5 14 34 28 55
3 5,4 10,5 14 34 26 52
2 5,4 10,5 14 34 25 50
1 5,4 10,5 14 34 25 50
Catatan Tidak lebih dari sepertiga anak timbangan kelas S-1 mempunyai kesalahan lebih dari setengah toleransi yang
tertera pada tabel

UJI BATAS MIKROBA<51> Prosedur Umum

A. UJI ENUMERASI MIKROBA Pengujian dilakukan pada kondisi aseptik sebagai

Pendahuluan
Bab ini menjelaskan tentang pengujian kuantitatif
untuk bakteri mesofil dan kapang yang dapat tumbuh
pada kondisi aerob.
Pengujian ini dirancang untuk menentukan suatu
bahan atau sediaan memenuhi spesifikasi mutu secara
mikrobiologi yang telah ditetapkan, termasuk jumlah
sampel yang akan digunakan dan interpretasi hasil uji.
Metode ini tidak dapat diaplikasikan untuk produk
yang mengandung mikroba viabel sebagai bahan aktif.
Prosedur mikrobiologi lain termasuk metode
otomatisasi dapat digunakan setelah dibuktikan
kesetaraannya dengan metode farmakope.
tindakan pencegahan untuk menghindari kontaminasi
mikroba dari luar produk, tetapi tidak mempengaruhi
mikroba yang diuji.
Jika produk mempunyai aktifitas antimikroba sebelum
diuji lakukan netralisasi menggunakan inaktivator yang
telah dibuktikan tidak toksik terhadap mikroba yang diuji.
Metode Penghitungan
Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan
Membran atau salah satu Metode Angka Lempeng yang
sesuai. Metode lain adalah Angka Paling Mungkin
(APM) yang umum digunakan untuk produk dengan
tingkat kontaminasi rendah.
Pemilihan metode pengujian berdasarkan beberapa
faktor antara lain jenis produk yang diuji, persyaratan
yang ditentukan dan ukuran sampel yang memadai untuk
memperkirakan kesesuaian secara spesifik. Kesesuaian
metode yang dipilih harus ditetapkan
 - 1326 -
Metode Penghitungan
Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan
Membran atau salah satu Metode Angka Lempeng yang
sesuai. Metode lain adalah Angka Paling Mungkin (APM)
yang umum digunakan untuk produk dengan tingkat
kontaminasi rendah.
Pemilihan metode pengujian berdasarkan beberapa
faktor antara lain jenis produk yang diuji, persyaratan
yang ditentukan dan ukuran sampel yang memadai untuk
memperkirakan kesesuaian secara spesifik. Kesesuaian
metode yang dipilih harus ditetapkan.
UJI FERTILITAS, KESESUAIAN METODE
PENGHITUNGAN DAN KONTROL NEGATIF
Ketentuan Umum
disimpan pada 2 8. Setelah dipilih untuk menyiapkan
suspensi segar sel vegetatif A.brasiliensis atau
B.subtilis, siapkan suspensi spora yang stabil dan
gunakan untuk inokulum dalam pengujian dengan
volume yang sesuai. Suspensi spora yang stabil
dipelihara pada 2 8 untuk jangka waktu yang
tervalidasi.
Kontrol Negatif
Untuk membuktikan kesesuaian kondisi pengujian,
kontrol negatif dilakukan menggunakan pengencer yang
sesuai seperti pada penyiapan larutan uji. Tidak boleh
terjadi pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif dilakukan
pada saat pengujian seperti tertera pada Pengujian
Sediaan. Kegagalan kontrol negatif memerlukan
investigasi.

Kemampuan metode untuk mendeteksi mikroba pada Fertilitas Media

produk harus ditetapkan.
Jika terjadi perubahan kinerja pengujian pada produk
yang mempengaruhi hasil uji, maka harus dilakukan
verifikasi terhadap kesesuaian metode.
Penyiapan Galur Mikroba Uji
Gunakan suspensi mikroba uji terstandar yang stabil.
Galur mikroba uji dipelihara dengan Teknik Biakan Lot
Benih tidak lebih dari 5 pasase dari master lot benih
asli. Biakkan tiap galur bakteri dan kapang uji secara
terpisah seperti tertera pada Tabel 1.
Untuk membuat suspensi mikroba uji gunakan Dapar
Natrium Klorida-Pepton pH 7,0 atau Dapar fosfat pH
7,2; untuk memisahkan spora Aspergillus brasiliensis
tambahkan polisorbat 80 P 0,05% pada dapar. Gunakan
dapar dalam waktu 2 jam atau dalam 24 jam jika
Uji setiap bets media jadi dan setiap bets media yang
dibuat dari media kering atau dari bahan yang tertera
pada formula.
Inokulasi sejumlah kecil mikroba (tidak lebih dari
100 koloni per plate) ke dalam Soybean-Casein Digest
Broth, Soybean-Casein Digest Agar dan Sabouraud
Dextrose Agar seperti tertera pada Tabel 1. Inkubasi
sesuai dengan kondisi yang tertera pada Tabel 1.
Untuk media padat, pertumbuhan yang diperoleh
tidak boleh berbeda dua kali dari nilai hitung inokulum
standar. Pertumbuhan mikroba dan hasil uji fertilitas
pada inokulum yang dibuat segar harus sebanding
dengan bets sebelumnya. Media cair dapat digunakan
jika pertumbuhan mikroba uji terlihat jelas dan
sebanding dengan inokulum yang telah sesuai dengan
hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.

Tabel 1.
Penyiapan dan Penggunaan Mikroba Uji
Kesesuaian Metode Penghitungan
Fertilitas
dalam Sediaan
Penghitungan Penghitungan Angka Lempeng
Penyiapan Angka Kapang
Mikroba Uji Total Mikroba Total Kapang Total Mikroba
Galur Uji dan Khamir
Aerob dan Khamir Aerob
Staphylococcus Soybean-Casein Soybean-Casein Soybean-Casein
aureus ATCC Digest Agar atau Digest Agar atau Digest
6538, NCIMB Soybean- Casein Soybean- Casein Agar/APMSoybean
9518, CIP 4.83, Digest Broth, Digest Broth -Casein Digest
atau NBRC 30-35, 100 koloni, Broth
13276 18-24 jam 30-35, 100 koloni,
3 hari 30-35,
3 hari
Pseudomonas Soybean-Casein Soybean-Casein Soybean-Casein
aeruginosa Digest Agar atau Digest Agar atau Digest Agar/APM
ATCC 9027, Soybean- Casein Soybean- Casein Soybean-Casein
NCIMB 8626, Digest Broth, Digest Broth, Digest Broth,
CIP 82.118 atau 30-35, 100 koloni 100 koloni,
NBRC 13275 18-24 jam 30-35, 30-35,
3 hari 3 hari
 - 1327 -
Bacillus subtilis Soybean-Casein Soybean-Casein Soybean-Casein
ATCC 6633, Digest Agar atau Digest Agar atau Digest Agar/APM
NCIMB 8054, Soybean- Casein Soybean- Casein Soybean-Casein
CIP 52.62 atau Digest Broth , Digest Broth Digest Broth
NBRC 3134 30-35, 100 koloni, 100 koloni,
18-24 jam 30-35, 30-35,
3 hari 3 hari
Candida albicans Sabouraud Soybean-Casein Sabouraud Soybean-Casein Sabouraud
ATCC 10231, Dextrose Agar Digest Agar Dextrose Agar Digest Agar Dextrose Agar
NCPF 3179, IP atau Sabouraud 100 koloni, 100 koloni, 100 koloni, 100 koloni,
48.72 atau NBRC Dextrose Broth, 30-35, 20-25, 30-35, 20-25,
1594 20-25, 5 hari 5 hari 5 hari 5 hari
2-3 hari APM: tidak ada
Aspergillus Sabouraud Soybean-Casein Sabouraud Soybean-Casein Sabouraud
brasiliensis Dextrose Agar Digest Agar, Dextrose Agar, Digest Agar, Dextrose Agar,
ATCC 16404, atau Potato- 100 koloni, 100 koloni, 100 koloni, 100 koloni,
IMI 149007, IP Dextrose Agar 30-35C 20-25, 30-35C, 20-25,
1431.83 atau 20-25, 5 hari 5 hari 5 hari 5 hari
NBRC 9455 5-7 hari, atau APM: tidak ada
hingga diperoleh
sporulasi yang
baik

Kesesuaian Metode Penghitungan Mikroba
dalam Sediaan
PENYIAPAN SAMPEL
Metode penyiapan sampel disesuaikan dengan sifat
fisik sediaan yang diuji. Jika dengan prosedur yang
diuraikan di bawah ini tidak ada yang memuaskan maka
harus dikembangkan prosedur lain yang sesuai.
Sediaan Larut Air Larutkan atau encerkan sediaan
yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan
Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan
Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth
bila perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu encerkan
dengan pelarut yang sama.
Sediaan Bukan Lemak yang Tidak Larut dalam
Air Suspensikan atau encerkan sediaan yang akan diuji
(biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar Natrium
Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar Fosfat pH
7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth. Dapat
ditambahkan surfaktan seperti Polisorbat 80 1 g per L
untuk membantu mensuspensikan bahan yang sulit
dibasahi, jika perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu
encerkan dengan pelarut yang sama.
Sediaan Berlemak Larutkan atau encerkan sediaan
yang akan diuji dalam isopropil miristat steril yang
disterilkan dengan cara penyaringan atau campurkan
sediaan yang akan diuji dengan sesedikit mungkin
surfaktan Polisorbat 80 steril atau surfaktan non-
inhibitor lain steril, jika perlu hangatkan dalam tangas
air pada suhu tidak lebih dari 40 atau pada kasus
tertentu tidak lebih dari 45. Aduk perlahan-lahan dan
jika perlu pertahankan suhu dalam tangas air.
Tambahkan secukupnya pengencer yang telah
dihangatkan hingga diperoleh pengenceran 1 dalam 10.
Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan suhu
dengan waktu sesingkat mungkin untuk pembentukan
emulsi. Lakukan pengenceran bertingkat dengan
pengencer yang sesuai mengandung surfaktan Polisorbat
80 P dengan kadar sesuai atau surfaktan non-inhibitor
lain steril.
Cairan atau Padatan dalam bentuk Aerosol
Pindahkan seluruh isi sediaan dengan cara aseptic dalam
penyaring membrane atau wadah steril yang
sesuai untuk pengambilan sampel. Gunakan seluruh isi
atau sejumlah tertentu sediaan dari tiap wadah yang
diuji.
Transdermal Patches Lepaskan lapisan, letakkan
bagian berperekat menghadap ke atas pada lempeng
kaca steril atau baki plastik. Agar tidak saling menempel
tutup permukaan berperekat dengan bahan berpori steril
yang sesuai (misal kasa steril), kemudian pindahkan
lembaran transdermal dalam wadah berisi pengencer
yang mengandung polisorbat 80 P atau lesitin dengan
volume yang sesuai. Kocok kuat selama tidak kurang
dari 30 menit.
INOKULASI DAN PENGENCERAN
Tambahkan suspensi mikroba uji pada sampel dan
suspensi kontrol (pengencer tanpa sampel) seperti tertera
di atas, untuk mendapatkan inokulum dengan jumlah
tidak lebih dari 100 koloni. Volume suspensi inokulum
tidak lebih dari 1% dari volume sediaan yang
diencerkan.
Untuk menunjukkan perolehan kembali mikroba uji
yang dapat diterima dari sediaan, faktor pengenceran
terendah dari sampel yang disiapkan harus digunakan
untuk pengujian. Jika hal tersebut tidak memungkinkan
karena adanya aktifitas antimikroba atau kelarutan
 - 1328 -
sediaan yang rendah, perlu dikembangkan protokol uji
yang sesuai. Jika sifat penghambatan pertumbuhan dari
sampel tidak dapat dihindari, maka jumlah total suspensi
mikroba uji mungkin harus ditambah setelah proses
netralisasi dengan pengenceran atau penyaringan.
NETRALISASI/PENGHILANGAN
AKTIFITAS ANTIMIKROBA
Jika tidak dapat ditemukan metode netralisasi yang
sesuai, dapat diartikan bahwa kegagalan isolasi mikroba
yang diinokulasikan disebabkan oleh aktivitas
antimikroba dari sediaan. Hal ini menunjukkan bahwa
sediaan tidak terkontaminasi mikroba uji. Ulangi
pengujian dengan pengenceran yang lebih tinggi yang
sesuai dengan pertumbuhan mikroba uji dan kriteria
penerimaan khusus.

Jumlah perolehan kembali mikroba uji dari sampel PEROLEHAN KEMBALI MIKROBA UJI
yang disuspensikan seperti tertera pada Inokulasi dan DALAM SEDIAAN
Pengenceran, diinkubasi mengikuti prosedur yang
tertera pada Perolehan kembali mikroba uji dalam Untuk tiap mikroba yang terdaftar, lakukan uji
sediaan, dibandingkan dengan jumlah mikroba uji yang terpisah. Hanya mikroba yang ditambahkan yang
diperoleh kembali dari suspensi kontrol. dihitung.
Jika pertumbuhan terhambat (dengan faktor reduksi Penyaringan Membran Gunakan penyaring
lebih besar dari 2), maka lakukan perubahan prosedur membran dengan porositas tidak lebih dari 0,45 m.
untuk penghitungan khusus untuk meyakinkan validitas Jenis bahan penyaring dipilih sedemikian rupa sehingga
hasil. Beberapa contoh perubahan prosedur yaitu dengan : kemampuan menahan bakteri tidak dipengaruhi oleh
(1) Penambahan jumlah volume pengencer atau kandungan sampel uji. Gunakan satu jenis membran
media biakan; penyaring untuk tiap mikroba uji.
(2) Penambahan larutan penetral khusus atau umum Pindahkan sejumlah suspensi sampel yang disiapkan
pada pengencer; seperti tertera pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan
(3) Penyaringan membran; atau Pengenceran serta Netralisasi/ Penghilangan Aktifitas
(4) Kombinasi perubahan di atas. Antimikroba (minimal mengandung 1 g sediaan, atau
kurang jika diperkirakan jumlah koloni besar) saring
Zat Penetral Zat penetral digunakan untuk segera dan bilas penyaring membran dengan sejumlah
menetralkan aktifitas senyawa antimikroba. (seperti tertentu volume pengencer.
tertera pada Tabel 2). Zat tersebut dapat ditambahkan Untuk menentukan angka lempeng total mikroba
pada pengencer atau media yang sesuai sebelum aerob (ALT), pindahkan penyaring membran ke
disterilkan. Jika digunakan metode tersebut, efikasi dan permukaan lempeng media Soybean-Casein Digest Agar
hilangnya toksisitas terhadap mikroba harus dibuktikan (SCDA). Untuk menentukan Angka Kapang Khamir
dengan melakukan penambahan zat penetral pada (AKK), pindahkan membran ke permukaan lempeng
blangko tanpa sediaan. media Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi cawan seperti
tertera pada Tabel 1. Lakukan pengamatan dan
Tabel 2 penghitungan.
Zat Penetral Umum / Metode untuk Metode Angka Lempeng Total Metode angka
Zat Penghambat lempeng total dilakukan setidaknya duplo untuk tiap
media, dan hasil merupakan rata-rata hitung jumlah
Zat Penetral koloni.
Zat Penghambat
Potensial/Metode Metode Tuang Gunakan cawan Petri berdiameter 9
Glutaraldehid, raksa Natrium hidrogen sulfit cm, inokulasikan 1 ml suspensi sampel seperti tertera
(Natrium bisulfit) pada Preparasi Penyiapan Sampel, Inokulasi dan
Fenolik, alkohol, Pengenceran serta Netralisasi/Penghilangan Aktifitas
Pengenceran Antimikroba ke dalam tiap cawan dan kemudian
aldehid, sorbat
Senyawa amonium tambahkan 15 - 20 ml Soybean-Casein Digest Agar atau
kuartener, Sabouraud Dextrose Agar pada suhu tidak lebih dari 45.
parahidroksibenzoat Lesitin Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar, sesuaikan
(paraben), bis- jumlah media. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji
biguanida yang tercantum pada Tabel 1.
Senyawa amonium Inkubasi cawan seperti tertera pada Tabel 1. Hitung
kuartener, iodin, Polisorbat jumlah koloni rata-rata dari tiap cawan media dan
paraben jumlah koloni inokulum awal.
Raksa Tioglikolat Metode Sebar Untuk lempeng media gunakan cawan
Raksa, halogen, Petri diameter 9 cm, diisi 15-10 ml Soybean-Casein
Tiosulfat Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu
aldehid
EDTA(edetat) Ion Mg atau Ca lebih kurang 45 pada tiap cawan Petri, dan biarkan
memadat. Jika digunakan cawan Petri yang lebih besar,
sesuaikan jumlah media. Keringkan permukaan lempeng
media dalam lemari laminar-airflow atau dalam
 - 1329 -
inkubator. Lakukan duplo untuk tiap mikroba uji yang 2 0 0 9,2 1,5-3,5
tertera pada Tabel 1. Inokulasikan 0,1 ml suspensi 2 0 1 14 4-35
sampel yang disiapkan seperti pada Penyiapan Sampel, 2 0 2 20 5-38
Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/ 2 1 0 15 4-38
Penghilangan Aktifitas Antimikroba dengan 2 1 1 20 5-38
menyebarkan pada permukaan lempeng media. Inkubasi 2 1 2 27 9-94
dan hitung jumlah koloni seperti telah dijelaskan pada 2 2 0 21 5-40
Metode Tuang. 2 2 1 28 9-94
Metode Angka Paling Mungkin (APM) Presisi 2 2 2 35 9-94
maupun akurasi Metode APM kurang dibandingkan
2 3 0 29 9-94
dengan Metode Penyaringan Membran atau Metode Angka
2 3 1 36 9-94
Lempeng Total. Hasilnya tidak dapat diandalkan terutama
3 0 0 23 5-94
untuk penghitungan khamir. Metode APM dapat
3 0 1 38 9-104
digunakan untuk menghitung ALT jika tidak ada metode
lain yang sesuai dan jika telah ditetapkan sebagai metode 3 0 2 64 16-181
pilihan. 3 1 0 43 9-181
Siapkan minimal tiga seri pengenceran (10-1, 10-2, 10- 3 1 1 75 17-199
3
) suspensi sediaan dengan cara seperti tertera pada 3 1 2 120 30-360
Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran serta 3 1 3 160 30-380
Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba. Dari 3 2 0 93 18-360
tiap tingkat pengenceran suspensi sediaan inokulasikan 3 2 1 150 30-380
masing-masing 1 ml ke dalam tiga seri tabung berisi 9 3 2 0 93 18-360
10 ml media Soybean-Casein Digest Broth. Jika perlu 3 2 2 210 30-400
tambahkan surfaktan seperti polisorbat 80 P atau 3 2 3 290 90-990
inaktivator zat antimikroba ke dalam media. Jika dibuat 3 3 0 240 40-990
tiga tingkat pengenceran, maka diperoleh 9 tabung 3 3 1 460 90-1980
terinokulasi. Inkubasi semua tabung yang telah 3 3 2 1100 200-4000
diinokulasi pada suhu 30 - 35 selama tidak lebih dari 3 3 3 3 >1100
hari. Jika terdapat kesulitan dalam membaca hasil, atau
ketidakyakinan terhadap sifat dari sediaan yang diuji, HASIL DAN INTERPRETASI
lakukan sub-kultur pada media yang sama atau Soybean
Casein Digestic Agar selama satu sampai 2 hari pada Jika ada kesesuaian antara Metode Penyaringan
suhu yang sama, gunakan hasil ini. Dengan Membran atau Metode Angka Lempeng, hitung jumlah
menggunakan Tabel 3 dapat ditentukan angka paling rata-rata mikroba uji dengan nilai penerimaan tidak lebih
mungkin (APM) per g atau ml sediaan uji. dari faktor 2 suspensi kontrol tanpa sediaan seperti
tertera pada Inokulasi dan Pengenceran.
Tabel 3 Nilai Angka Paling Mungkin Mikroba Jika ada kesesuaian dengan Metode APM nilai
inokulum yang dihitung harus dalam batas kepercayaan
Kombinasi Jumlah APM Batas 95% dari nilai suspensi kontrol.
Tabung Pada Tiap Seri per g atau per Kepercayaa Jika kriteria tersebut di atas tidak dapat dipenuhi
yang Menunjukkan mL sediaan n 95% untuk satu atau lebih mikroba yang diuji dengan metode
Pertumbuhan tersebut di atas, maka metode dan kondisi uji harus
Jumlah g atau mL mendekati kriteria yang digunakan untuk menguji
sediaan per tabung sediaan.
0,1 0,01 0,001
0 0 0 <3 0-9,4 PENGUJIAN SEDIAAN
0 0 1 3 0,1-9,5
0 1 0 3 0,1-10 Jumlah Sediaan yang Digunakan untuk Pengujian
0 1 1 6,1 1,2-17
0 2 0 6,2 1,2-17 Jika tidak dinyatakan lain gunakan 10 g atau 10 ml
0 3 0 9,4 3,5-35 sediaan uji yang diambil dengan cara seperti di atas.
1 0 0 3,6 0,2-17 Untuk sediaan cairan atau padatan dalam aerosol
1 0 1 7,2 1,2-17 gunakan 10 wadah sampel, demikian juga untuk sampel
1 0 2 11 4-35 transdermal patches.
1 1 0 7,4 1,3-20 Jumlah yang diuji dapat dikurangi untuk sediaan
1 1 1 11 4-35 dengan bahan aktif yang dibuat dalam tiap unit dosis
(contoh tablet, kapsul, injeksi) kurang dari atau sama
1 2 0 11 4-35
dengan 1 mg, atau jumlah per g atau ml (untuk
1 2 1 15 5-38
penyiapan sampel tidak dalam unit dosis) kurang dari
1 3 0 16 5-38
 - 1330 -
1 mg. Dalam hal ini jumlah sampel yang diuji tidak
kurang dari 10 unit dosis atau 10 g atau 10 ml sediaan.
Untuk bahan aktif dengan jumlah sampel terbatas
atau ukuran bets sangat kecil (misalnya kurang dari 1000
ml atau 1000 g) jumlah sampel yang diuji harus 1% dari
bets kecuali jumlah yang lebih kecil ditentukan atau
dinyatakan dan disetujui.
Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets kurang
dari 200 unit (misal sampel untuk uji klinis), ukuran
sampel dapat dikurangi menjadi dua unit atau satu unit
jika kurang dari 100 unit.
Ambil sampel secara acak dari ruahan sediaan atau
dari wadah yang tersedia pada saat pengerjaan. Untuk
mendapatkan jumlah yang diperlukan, campurkan
sejumlah isi wadah hingga mencapai jumlah sampel
yang cukup.
Pemeriksaan Sediaan
PENYARINGAN MEMBRAN
Gunakan alat penyaring yang dirancang sedemikian
rupa sehingga memungkinkan pemindahan membran
penyaring ke media. Siapkan sampel menggunakan
metode yang tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian
Metode Penghitungan, pindahkan sejumlah yang sesuai
pada dua penyaring membran, saring segera. Bilas tiap
penyaringan sesuai dengan prosedur.
Untuk menentukan ALT, pindahkan satu penyaring
membran ke permukaan Soybean-Casein Digestic Agar.
Untuk menentukan AKK, pindahkan satu penyaring
membran yang lain ke permukaan Sabouraud Dextrose
Agar. Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest Agar pada
suhu 30 - 35 selama 3 - 5 hari dan cawan Sabouraud
Dextrose Agar pada suhu 20 - 25 selama 5 - 7 hari.
Hitung jumlah koloni per g atau per ml sediaan.
Untuk pengujian sampel transdermal patches,
secara terpisah saring 10% dari volume larutan seperti
tertera pada Penyiapan Sampel, gunakan dua penyaring
membran steril. Pindahkan satu membran pada Soybean-
Casein Digest Agar untuk ALT dan membran lainnya
pada Sabouraud Dextrose Agar untuk AKK.
METODE ANGKA LEMPENG TOTAL
Metode Tuang Siapkan sampel menggunakan metode
yang sesuai seperti tertera pada Uji Fertilitas dan
Kesesuaian Metode Penghitungan. Siapkan untuk
masing-masing media sekurang-kurangnya dua cawan
Petri untuk tiap tingkat pengenceran. Inkubasi cawan
Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30 - 35 selama
3 - 5 hari dan cawan Sabouraud Dextrose Agar pada
suhu 20 - 25 selama 5-7 hari. Pilih cawan dari satu
tingkat pengenceran dengan jumlah koloni tertinggi yang
kurang dari 250 untuk ALT dan 50 koloni untuk AKK.
Hitung jumlah rata-rata koloni dalam media biakan dan
jumlah koloni per g atau per ml sediaan.
Metode Sebar Siapkan sampel dengan metode yang
sesuai seperti tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian
Metode Penghitungan. Siapkan sekurang-kurangnya dua
cawan Petri untuk tiap media dan tiap tingkat
pengenceran. Untuk inkubasi dan penghitungan jumlah
koloni, lakukan seperti tertera pada Metode Tuang.
METODE ANGKA PALING MUNGKIN (APM)
Siapkan dan encerkan sampel dengan metode sesuai
seperti tertera pada Uji Fertilitas dan Kesesuaian
Metode Penghitungan. Inkubasi semua tabung selama
3-5 hari pada suhu 30 - 35. Jika perlu lakukan
subkultur, gunakan metode yang sesuai. Catat jumlah
tabung yang menunjukkan pertumbuhan mikroba pada
tiap tingkat pengenceran. Tentukan APM mikroba per g
atau ml sediaan berdasarkan Tabel 3.
Interpretasi Hasil
Angka Lempeng Total (ALT) dianggap sama dengan
angka koloni yang ditemukan pada Soybean-Casein
Digest Agar; jika koloni jamur ditemukan pada media
ini, dihitung sebagai bagian dari jumlah ALT. Total
jumlah kapang dan khamir (AKK) dianggap sama
dengan jumlah koloni yang ditemukan pada Sabouraud
Dextrose Agar; jika koloni bakteri ditemukan pada
media ini, maka dihitung sebagai bagian dari AKK. Jika
AKK diperkirakan melebihi kriteria penerimaan
berdasarkan pertumbuhan bakteri, dapat digunakan
Sabouraud Dextrose Agar yang mengandung antibiotik.
Jika penghitungan dilakukan menggunakan metode APM,
maka nilai penghitungan yang diperoleh merupakan
angka total mikroba aerobik (ALT).
Jika telah ditetapkan kriteria penerimaan untuk mutu
mikrobiologi, maka di-interpretasikan sebagai berikut:
- 101 koloni: maksimal penghitungan yang dapat
diterima = 20;
- 102 koloni: maksimal penghitungan yang dapat
diterima = 200;
- 103 koloni: maksimal penghitungan yang dapat
diterima = 2000; dan seterusnya.
Larutan dan media yang disarankan tertera pada Uji
Mikroba Khusus.
B. PENGUJIAN MIKROBA SPESIFIK
PENDAHULUAN
Pada Bab ini akan dijelaskan tentang Uji Batas
Mikroba Spesifik yang mungkin terdeteksi dengan
kondisi dan metode yang sesuai.
Metode uji dirancang untuk menetapkan suatu produk
memenuhi kriteria mutu secara mikrobiologi. Untuk
pelaksanaan pengujian ikuti petunjuk di bawah ini,
termasuk jumlah sampel dan interpretasi hasil uji.
Metode pilihan termasuk metode otomatik
dimungkinkan untuk digunakan setelah dibuktikan
kesetaraannya dengan metode farmakope.
 - 1331 -
PROSEDUR UMUM
Penyiapan sampel dilakukan seperti tertera pada Uji
enumerasi mikroba.
Jika produk yang akan diuji memiliki aktifitas
antimikroba, sebaiknya sifat antimikroba dihilangkan
atau dinetralkan seperti tertera pada Uji enumerasi
mikroba.
Jika digunakan bahan aktif permukaan (surfaktan)
untuk penyiapan sampel, harus dapat dibuktikan sesuai
dan tidak toksik bagi mikroba dan sesuai dengan
inaktivator yang digunakan dalam produk yang diuji
seperti tertera pada Uji enumerasi mikroba.
FERTILITAS DAN DAYA HAMBAT MEDIA,
KESESUAIAN UJI DAN
KONTROL NEGATIF
Gunakan Dapar Natrium KloridaPepton pH 7 atau
Dapar Fosfat pH 7,2 untuk membuat suspensi uji.
Gunakan suspensi tersebut dalam waktu 2 jam atau jika
digunakan sampai 24 jam harus disimpan pada suhu 2 - 8.
CLOSTRIDIA
Gunakan Clostridium sporogenes seperti ATCC
11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) atau
ATCC 19404 (NCTC 532 atau CIP 79.3). Biakkan galur
uji Clostridia dalam keadaan anaerob pada Reinforce
Medium for Clostridia pada suhu 30 - 35 selama 24
- 48 jam. Sebagai pilihan lain, siapkan dan encerkan sel
vegetatif dalam bentuk suspensi segar. Suspensi spora
stabil pada suhu 2 - 8 selama periode yang tervalidasi.
Kontrol Negatif

Untuk verifikasi kesesuaian kondisi pengujian, kontrol

Kemampuan metode deteksi mikroba yang terdapat
negatif dilakukan menggunakan pelarut yang sesuai
dalam produk yang diuji harus ditetapkan. Jika ada
menggantikan sediaan uji. Tidak boleh terjadi
perubahan kemampuan dalam pengujian atau ada
pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif juga dilakukan pada
perubahan dalam produk yang dapat mempengaruhi
saat dilakukan uji terhadap sediaan seperti tertera pada
hasil uji, harus dilakukan konfirmasi metode.
Pengujian Sediaan. Apabila terjadi kegagalan pada
kontrol negatif diperlukan investigasi.
Penyiapan Galur Uji
Fertilitas dan Daya hambat Media
Gunakan suspensi galur uji baku yang stabil. Galur uji
dipelihara dengan Teknik Biakan Lot Benih tidak lebih
Uji setiap bets media siap-pakai, media yang
dari 5 pasase dari master lot benih asli.
disiapkan dari media kering atau dari komponen media.
Verifikasi sifat seperti tertera pada Tabel 1.
MIKROBA AEROB
Uji Fertilitas Media Cair Inokulasikan ke dalam
media yang sesuai, mikroba uji dalam jumlah sedikit
Biakkan masing-masing galur bakteri di bawah ini,
(tidak lebih dari 100 koloni), inkubasi pada suhu
pisahkan masing-masing dalam wadah berisi media
tertentu, tidak lebih dari periode terpendek yang tertera
Soybean-Casein Digest Broth atau Soybean-Casein
pada prosedur uji. Untuk media cair, pertumbuhan
Digest Agar, pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam.
mikroba uji harus terlihat jelas dan harus sama dengan
Biakkan galur uji Candida albicans dalam Sabouraud
inokulum yang telah sesuai dengan hasil uji fertilitas
Dextrose Agar atau Sabouraud Dextrose Broth, pada
bets media sebelumnya.
suhu 20 - 25 selama 2 - 3 hari.
Uji Fertilitas Media Padat Gunakan Metode Sebar
seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji enumerasi
Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB
mikroba. Inokulasikan masing-masing cawan dengan
9518, CIP 4.83 atau
sejumlah mikroba uji yang sesuai (tidak lebih dari 100
NBRC13276
koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu tidak lebih dari
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB periode terpendek seperti tertera dalam prosedur uji.
8626, CIP 82.118 atau Pertumbuhan mikroba sama dengan inokulum yang telah
NBRC 13275 sesuai dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.
Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB Uji Daya Hambat Media Cair atau Padat
8545, CIP 53.126 atau Inokulasikan sejumlah mikroba uji paling sedikit 100
NBRC 3972 koloni pada sejumlah media yang diinkubasi pada suhu
Salmonella enterica ATCC 14028 tertentu tidak kurang dari periode terpanjang seperti
subsp enterica serovar tertera pada Prosedur uji. Tidak boleh ada pertumbuhan
Typhimurium atau mikroba uji.
sebagai pilihan lain Test for Indicative Properties Gunakan Metode
Salmonella enterica NBRC 100797, NCTC Sebar seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji
subsp enterica serovar 6017 atau CIP 80.39 enumerasi mikroba. Inokulasikan masing-masing cawan
Abony dengan mikroba sesuai (tidak boleh lebih dari 100
Candida albicans ATCC 10231, NCPF koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu dalam batas uji.
3179, IP 48.72 atau NBRC Ciri koloni mikroba uji harus terlihat jelas dan harus
1594 sama dengan inokulum yang sebelumnya.
 - 1332 -
Kesesuaian Metode Uji
Untuk masing-masing sediaan baru yang diuji lakukan
penyiapan sampel, seperti tertera pada Pengujian
Sediaan. Pada saat inokulasi suspensi sampel,
tambahkan masing-masing galur mikroba uji tidak lebih
dari 100 koloni dalam media pertumbuhan yang telah
ditentukan.
Lakukan uji seperti tertera pada Pengujian Sediaan
dengan masa inkubasi terpendek.
Mikroba uji spesifik harus dapat dideteksi dengan
reaksi dan sifat-sifat seperti dijelaskan dalam Pengujian
Sediaan.
Modifikasi prosedur uji untuk menetralkan aktifitas
antimikroba harus dilakukan (tertera pada
Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba
dalam Uji Enumerasi Mikroba).
Untuk sediaan yang telah diberi penetral aktivitas
antimikroba dengan mengacu pada prosedur yang sesuai,
dan ternyata aktivitas antimikroba tidak dapat
dinetralkan, maka diasumsikan bahwa tidak ada mikroba
yang terhambat dalam sediaan.

Tabel 1 Uji Fertilitas, Penghambatan dan Test for Indicative Properties

Uji/Media Sifat Mikroba Uji

Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-
negative
Media Cair Pengkaya Enterobacteriaceae Fertilitas E. coli
Mossel P.aeruginosa
Daya hambat S. aureus
Violet Red Bile Glucose Agar Fertilitas + indikatif E.coli
P.aeruginosa
Uji Escherichia coli
MacConkey Broth Fertilitas E.coli
Daya hambat S. aureus
MacConkey Agar Fertilitas + indikatif E.coli
Uji Salmonella
Rappaport Vassiliadis Salmonella Fertilitas Salmonella enterica subsp.
Enrichment Broth entericaserovar Typhimurium atau
Salmonella enterica subsp.
entericaserovar Abony
Daya hambat S.aureus
Xylose Lysine Deoxycholate Agar Fertilitas + indikatif Salmonella enterica
subsp.entericaserovar Typhimurium
atau Salmonella enterica subsp.
entericaserovar Abony
Uji Pseudomonas aeruginosa
Cetrimide Agar Fertilitas P.aeruginosa
Daya hambat E.coli
Uji Staphylococcus aureus
Mannitol Salt Agar Fertilitas + indikatif S.aureus
Daya hambat E.coli
Uji Clostridia
Reinforced Medium for Clostridia Fertilitas Cl.sporogenes
Columbia Agar Fertilitas Cl.sporogenes
Uji Candida albicans
Sabouraud Dextrose Broth Fertilitas C.albicans
Sabouraud Dextrose Agar Fertilitas + indikatif C.albicans
 - 1333 -
PENGUJIAN SEDIAAN
Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-negatif
Penyiapan sampel dan pra-inkubasi Siapkan sampel
1 dalam 10 volume pengencer dimana tidak lebih dari 1 g
sampel diuji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba,
gunakan Soybean-Casein Digest Broth sebagai
pengencer, campur, dan inkubasi pada suhu 20 - 25
selama waktu yang cukup untuk menumbuhkan bakteri
tetapi tidak cukup untuk memicu multiplikasi mikroba
(biasanya 2 jam tapi tidak boleh lebih dari 5 jam).
Uji negatif Kecuali dinyatakan lain dalam masing-
masing monografi, gunakan 1 g sediaan seperti tertera
pada Penyiapan Sampel dan Pra-inkubasi, dalam media
cair pengkaya Enterobacteriaceae Mossel. Inkubasi pada
suhu 30 - 35 selama 4 - 48 jam. Lakukan subkultur
pada cawan Violet Red Bile Glucose Agar. Inkubasi pada
suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam. Sampel memenuhi
syarat bila tidak ada pertumbuhan koloni.
Uji Kuantitatif
Seleksi dan subkultur Inokulasi sejumlah suspensi
dengan penyiapan sampel langsung ke dalam media
Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Encerkan
suspensi sampel hingga mengandung 0,1 g, 0,01 g dan
0,001 g (atau 0,1 ml, 0,01 ml dan 0,001 ml), dan inkubasi
pada suhu 30 - 35 selama 24 - 48 jam. Lakukan sub-
kultur dengan menginokulasi masing-masing biakan pada
cawan media Violet Red Bile Glucose Agar, inkubasi
pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam.
Interpretasi Hasil positif ditunjukkan dengan adanya
pertumbuhan koloni.
Catat hasil positif pada jumlah terkecil sediaan dan hasil
negatif pada jumlah terbesar sediaan. Tentukan Angka
Paling Mungkin (APM) dari bakteri menggunakan Tabel 2.
Tabel 2 Interpretasi Hasil
Hasil dari masing-masing jumlah
sediaan APM / g atau /ml
0,1 g atau 0,01 g atau 0,001 g
sediaan
0,1 ml 0,01 ml atau
0,001 ml
+ + + Lebih dari 103
+ + - Kurang dari 103
dan lebih dari 102
+ - - Kurang dari 102
dan lebih dari 10
- - - Kurang dari 10
Escherichia coli
Penyiapan sampel dan pra inkubasi Siapkan sampel
menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer dimana
tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti tertera pada Uji
Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 ml atau sejumlah sesuai
sampai 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam media Soybean-
Casein Digest Broth, dengan jumlah seperti tertera dalam
Kesesuaian Metode Uji, campur dan inkubasi pada suhu
30 - 35 selama 18 - 24 jam.
Seleksi dan Subkultur Kocok wadah, pindahkan 1 ml
biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 100 ml
MacConkey Broth, inkubasi pada suhu 42 - 44 selama
24 - 48 jam. Inokulasi biakan MacConkey Broth pada
cawan media Mac Conkey Agar, suhu 30 - 35 selama
18 - 72 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni menunjukkan
adanya E.Coli yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni
yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi
negatif.
Salmonella
Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi Siapkan sediaan
uji seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan
jumlah yang sesuai, tidak kurang dari 10 g atau 10 ml,
inokulasi ke dalam sejumlah volume Soybean-Casein
Digest Broth yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian
Metode Uji), campur dan inkubasi pada suhu 30 - 35
selama 18-24 jam.
Seleksi dan Subkultur Pindahkan 0,1 ml biakan
Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 10 ml media
Rappaport Vasiliadis Salmonella Enrichment Broth,
inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam.
Subkultur pada cawan Xylose Lysine Deoxycholate Agar,
inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 48 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni berwarna merah,
dengan atau tanpa titik hitam di bagian tengah
menunjukkan karakteristik Salmonella yang dikonfirmasi
dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh
tidak seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji
konfirmasi identifikasi negatif.
Pseudomonas aeruginosa
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan
sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer
dimana tidak lebih dari 1 g sediaan diuji seperti tertera
pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 ml atau
jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml, inokulasi ke
dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan
jumlah yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian
Metode Uji), campur dan inkubasi pada suhu 30 - 35
selama 18 - 24 jam.
Untuk menguji transdermal patches, gunakan
membran penyaring steril, saring sejumlah volume
sampel yang sesuai dengan satu patch (lihat
Transdermal Patches pada Penyiapan Sampel dalam
Uji Enumerasi Mikroba) dan masukkan penyaring
membran ke dalam 100 ml media Soybean-Casein Digest
Broth. Inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18-24 jam.
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan
media Cetrimide Agar dan inkubasi pada suhu 30 - 35
selama 18 - 72 jam.
 - 1334 -
Interpretasi Pertumbuhan koloni menunjukkan Candida albicans
adanya P.aeruginosa yang dikonfirmasi dengan uji
identifikasi. Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan
Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh sediaan yang akan diuji seperti tertera pada Uji
tidak seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji Endumerasi Mikroba. Gunakan 10 ml atau jumlah yang
konfirmasi identifikasi negatif. sesuai tidak kurang dari 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dalam
100 ml media Sabouraud Dextrose Broth, campur dan
Staphylococcus aureus inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 3 - 5 hari.
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan Sabouraud Dextrose Agar, dan inkubasi pada suhu 30 -
sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer 35 selama 24 - 48 jam.
dimana tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti tertera Interpretasi Adanya pertumbuhan koloni berwarna
pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 ml atau putih menunjukkan adanya C.albicans. yang dikonfirmasi
jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml, inokulasi ke dengan uji identifikasi.
dalam media Soybean-Casein Digest Broth, dengan Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada pertumbuhan
jumlah yang sesuai (seperti tertera pada Kesesuaian koloni seperti diuraikan di atas atau jika hasil uji
Metode Uji) campur dan inkubasi pada suhu 30 - 35 konfirmasi identifikasi negatif.
selama 18 - 24 jam.
Untuk menguji transdermal patches, gunakan LARUTAN DAN MEDIA KULTUR
membran penyaring steril, saring sejumlah volume YANG DISARANKAN
sampel yang sesuai dengan satu patch (lihat
Transdermal Patches pada Penyiapan Sampel [Catatan Bagian ini sebagai informasi.]
dalamUji Enumerasi Mikroba) dan masukkan penyaring Larutan dan media kultur berikut memenuhi tujuan
membran ke dalam 100 ml media Soybean-Casein seperti tertera pada uji kontaminasi mikroba dalam
Digest Broth. Inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - Farmakope. Media lain mungkin dapat digunakan setelah
24 jam. kesesuaiannya dibuktikan.
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada cawan Larutan Dapar Persediaan Timbang 34 g Kalium
media Mannitol Salt Agar dan inkubasi pada suhu 30 - Dihidrogen Fosfat P, masukkan ke dalam labu tentukur
35 selama 18 - 72 jam. 1000ml, larutkan dalam 500 ml air, atur pH menjadi
Interpretasi Pertumbuhan koloni berwarna kuning 7,2 0,2, tambahkan air murni sampai tanda, dan campur
atau putih dikelilingi zona kuning menunjukkan adanya homogen.
S.aureus yang di konfirmasi dengan uji identifikasi. Masukkan ke dalam wadah, dan sterilisasi. Simpan
Sediaan memenuhi syarat uji jika pertumbuhan koloni pada suhu 2 - 8.
tidak seperti diuraikan atau jika hasil uji konfirmasi Larutan Dapar Fosfat pH 7,2 Siapkan campuran air
identifikasi negatif. murni dan Larutan Dapar persediaan (800:1 v/v),
kemudian sterilisasi.
Clostridia
Larutan Dapar Natrium Klorida Pepton pH 7,0
Penyiapan Sampel dan Perlakuan Panas Siapkan Kalium dihidrogen fosfat 3,6 g
sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer Dinatrium hidrogen fosfat 7,2 g (setara
(dengan total volume minimum 20 ml) tidak kurang dari dihidrat 0,067 M fosfat)
2 g atau 2 ml sediaan untuk diuji seperti tertera pada Uji Natrium klorida 4,3 g
Enumerasi Mikroba. Pisahkan sampel menjadi dua Pepton (daging atau kasein) 1,0 g
bagian, sekurang-kurangnya 10 ml. Panaskan satu bagian Air murni 1000 ml
pada 80 selama 10 menit, dinginkan dengan cepat. Satu Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang
bagian lainnya tidak dipanaskan. tervalidasi.
Seleksi dan Subkultur Gunakan 10 ml atau jumlah
yang sesuai dengan 1 g atau 1 ml kemudian keduanya Soybean-Casein Digest Broth
diinokulasi ke dalam sejumlah Reinforced Medium for Pancreatic digest of casein 17,0 g
Clostridia yang sesuai, (seperti tertera pada Kesesuaian Papaic digest of soybean 3,0 g
Metode Uji). Inkubasi pada kondisi anaerob pada suhu
Natrium klorida 5,0 g
30 - 35 selama 48 - 72 jam.
Dibasa hidrogen fosfat 2,5 g
Interpretasi Pertumbuhan koloni anaerob bentuk
Glukosa monohidrat 2,5 g
batang (dengan atau tanpa endospora) memberikan reaksi
Air murni 1000 ml
katalase negatif, menunjukkan adanya Clostridia yang
dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3 0,2
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan
yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi siklus yang tervalidasi.
negatif.
 - 1335 -
Soybean-Casein Digest Agar Natrium klorida 5,0 g
Pancreatic digest of casein 15,0 g Glukosa monohidrat 10,0 g
Papaic digest of soybean 5,0 g Agar 15,0 g
Natrium klorida 5,0 g Merah netral 30 mg
Agar 15,0 g Kristal violet 2 mg
Air murni 1000 ml Air murni 1000 ml
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3 0,2 Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,4 0,2
pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan pada 25. Panaskan hingga mendidih, jangan dipanaskan
siklus yang tervalidasi. menggunakan otoklaf.

Sabouraud Dextrose Agar MacConkey Broth

Dekstrosa 40,0 g Pancreatic digest of gelatin 20,0 g
Mixture peptic digest of animal 10,0 g Laktosa monohidrat 10,0 g
tissue and pancreatic digest of Dehydrated ox bile 5,0 g
casein (1:1) Ungu bromokresol 10 mg
Agar 15,0 g Air murni 1000 ml
Air murni 1000 ml Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3 0,2
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6 0,2 pada 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus
pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan yang tervalidasi.
siklus yang tervalidasi.
MacConkey Agar
Potato Dextrose Agar Pancreatic digest of gelatin 17,0 g
Infusion from potatoes 200 g Peptones (meat and casein) 3,0 g
Dekstrosa 20,0 g Laktosa monohidrat 10,0 g
Agar 15,0 g Natrium klorida 5,0 g
Air murni 1000 ml Bile salts 1,5 g
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6 0,2 Agar 13,5 g
pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan Merah netral 30,0 mg
siklus yang tervalidasi. Kristal violet 1 mg
Air murni 1000 ml
Sabouraud Dextrose Broth Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,1 0,2
Dekstrosa 20,0 g pada suhu 25. Didihkan selama 1 menit dengan
Mixture Peptic Digest of Animal 10,0 g pengadukan konstan, kemudian sterilisasi menggunakan
Tissue and Pancreatic Digest of otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.
Casein (1:1)
Air murni 1000 ml Rappaport Vassiliadis Salmonela Enrichment Broth
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6 0,2 Soya peptone 4,5 g
pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan Magnesium klorida heksahidrat 29,0 g
siklus yang tervalidasi. Natrium klorida 8,0 g
Dikalium fosfat 0,4 g
Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Kalium dihidrogen fosfat 0,6 g
Pancreatic digest of gelatin 10,0 g Malachite green 0,036 g
Glukosa monohidrat 5,0 g Air murni 1000 ml
Dehydrated ox bile 20,0 g Larutkan dalam keadaan agak hangat. Sterilisasi
Kalium dihidrogen fosfat 2,0 g menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi,
Dinatrium hydrogen fosfat 8,0 g pada suhu tidak lebih dari 115. Setelah disterilisasi
dihidrat menggunakan otoklaf pH menjadi 5,2 0,2 pada suhu
Brilliant green 15 mg 25.
Air murni 1000 ml
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,2 0,2 Xylose Lysine Deoxycholate Agar
pada 25. Panaskan hingga 100 selama 30 menit dan Xylose 3,5 g
dinginkan segera. L-lysine 5,0 g
Laktosa monohidrat 7,5 g
Violet Red Bile Glucose Agar Sukrosa 7,5 g
Yeast extract 3,0 g Natrium klorida 5,0 g
Pancreatic digest of gelatin 7,0 g Yeast extract 3,0 g
Bile salts 1,5 g Merah fenol 80 mg
Agar 13,5 g
 - 1336 -
Sodium deoksikolat 2,5 g Columbia Agar
Sodium tiosulfat 6,8 g Pancreatic digest of casein 10,0 g
Besi (III) ammonium 0,8 g Meat peptic digest 5,0 g
sitrat Heart pancreatic digest 3,0 g
Air murni 1000 ml Yeast extract 5,0 g
Atur pH sehingga setelah pemanasan menjadi 7,4 0,2 Maized starch 1,0 g
pada suhu 25. Panaskan hingga mendidih, dinginkan Natrium klorida 5,0 g
hingga 50, tuang ke dalam cawan Petri. Jangan Agar, tergantung pada 10,0-15,0 g
disterilisasi menggunakan otoklaf. daya pembentukan gel
Air murni 1000 ml
ANTIMIKRO B Basahi dan larutkan agar menggunakan air murni, dan
panaskan hingga mendidih dengan pengadukan secara
terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sehingga setelah
Cetrimide Agar
sterilisasi menjadi 7,3 0,2 pada suhu 25. Sterilisasi
Pancreatic digest of 20,0 g
menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.
gelatin
Dinginkan hingga mencapai 45-50, bila perlu tambahkan
Magnesium klorida 1,4 g
gentamisin sulfat yang setara dengan 20 mg gentamisin
Dikalium sulfat 10,0 g basa, dan tuang ke dalam cawan Petri.
Setrimid 0,3 g
Agar 13,6 g
Air murni 1000 ml UJI EFEKTIFITAS PENGAWET <61>
Gliserol 10,0 ml
Panaskan hingga mendidih selama 1 menit dengan Pengawet adalah zat antimikroba yang ditambahkan pada
pengocokan. Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi sediaan non-steril untuk melindungi sediaan terhadap
7,2 0,2 pada 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf pertumbuhan mikroba yang ada atau mikroba yang masuk
dengan siklus yang tervalidasi. secara tidak sengaja selama ataupun sesudah proses
produksi. Dalam sediaan steril dosis ganda, pengawet
Mannitol Salt Agar ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba
Pancreatic digest of casein 5,0 g yang mungkin masuk pada pengambilan berulang.
Peptic digest of animal 5,0 g Pengawet tidak boleh digunakan sebagai pengganti
tissue cara produksi yang baik atau semata-mata untuk
Beef extract 1,0 g menurunkan populasi mikroba viabel dari produk tidak
D-manitol 10,0 g steril atau mengontrol bioburden pra-sterilisasi dari
Natrium klorida 75,0 g formulasi sediaan dosis ganda pada waktu diproduksi.
Agar 15,0 g Pengawet sesuai bentuk sediaan dalam farmakope
Merah fenol 0,025 g memenuhi syarat untuk Bahan Tambahan dalam
Air murni 1000 ml Ketentuan Umum.
Panaskan hingga mendidih selama 1 menit dengan Semua bahan antimikroba yang digunakan pada
pengocokan. Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi dasarnya toksik. Untuk melindungi konsumen secara
7,4 0,2 pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf maksimum, kadar pengawet yang efektif dalam kemasan
dengan siklus yang tervalidasi. akhir produk hendaknya di bawah tingkat toksik bagi
manusia.
Reinforced Medium for Clostridia Kadar pengawet yang ditambahkan dapat dikurangi apabila
bahan aktif dalam formulasi secara intrinsik mempunyai
Beef extract 10,0 g
aktivitas antimikroba. Untuk semua produk injeksi dosis
Pepton 10,0 g
ganda atau produk lain yang mengandung pengawet,
Yeast extract 3,0 g
harus menunjukkan efektivitas antimikroba baik sebagai
Soluble starch 1,0 g sifat bawaan dalam produk maupun yang dibuat dengan
Glukosa monohidrat 5,0 g penambahan pengawet. Efektivitas antimikroba juga
Sistein hidroklorida 0,5 g harus ditunjukkan untuk semua produk dosis ganda
Natrium klorida 5,0 g sediaan topikal, oral dan sediaan lain seperti tetes mata,
Natrium asetat 3,0 g telinga, hidung, irigasi dan cairan dialisis.
Agar 0,5 g Pengujian berikut dimaksudkan untuk menunjukkan
Air murni 1000 ml efektivitas pengawet. Penambahan pengawet harus
Basahi dan larutkan agar menggunakan air murni, dan dinyatakan pada etiket. Pengujian dan kriteria untuk
panaskan hingga mendidih dengan pengadukan secara efektivitas berlaku hanya pada produk di dalam wadah
terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sehingga setelah asli belum dibuka yang didistribusikan oleh produsen.
sterilisasi menjadi 6,8 0,2 pada suhu 25. Sterilisasi
menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.
 - 1337 -
KATEGORI SEDIAAN
Untuk tujuan pengujian, sediaan dibagi menjadi 4
kategori. Kriteria efektifitas antimikroba untuk sediaan
tergantung cara pemberiannya.
Tabel 1 Kategori Sediaan
Kategori Uraian Sediaan
1 Injeksi, sediaan parenteral lain
termasuk emulsi, sediaan tetes telinga,
sediaan steril tetes hidung, dan sediaan
optalmik yang dibuat dengan dasar atau
pembawa air.
2 Sediaan topikal yang dibuat dengan
dasar atau pembawa air, sediaan tetes
hidung non-steril, dan emulsi, termasuk
sediaan yang dioleskan ke membran
mukosa.
3 Sediaan oral selain antasida, dibuat
dengan dasar atau pembawa air.
4 Antasida yang dibuat dengan pembawa
air.
MIKROBA UJI
pengujian, satu pasase didefinisikan sebagai transfer
mikroba dari biakan yang ditetapkan, ke media segar.
Semua transfer dihitung. Dalam kondisi mikroba yang
dipelihara dengan teknik lot benih, maka setiap siklus
pembekuan, pencairan, dan penumbuhan kembali dalam
media segar, ditetapkan sebagai satu transfer. Teknik lot
benih hendaknya digunakan untuk penyimpanan kultur
jangka panjang.Biakan yang diterima dari ATCC harus
diresusitasi sesuai prosedur. Jika ditumbuhkan dalam
media cair, sel diendapkan dengan cara sentrifus.
Suspensikan kembali dalam media cair segar (1:20) dan
tambahkan dengan volume sama campuran gliserol 20%
(v/v dalam air) steril. Sel yang ditumbuhkan dalam media
agar dipanen dari permukaan media ke dalam media cair
gliserol 10%. Bagikan suspensi ini dalam jumlah kecil ke
dalam vial steril. Simpan vial dalam nitrogen cair atau
dalam freezer mekanik pada suhu tidak lebih dari 50.
Jika vial lot benih segar diperlukan, vial ini dapat
digunakan untuk menginokulasi serangkaian kultur kerja.
Kultur kerja ini kemudian dapat digunakan secara berkala
(setiap hari untuk bakteri dan khamir) untuk memulai
kultur inokula.
MEDIA
Seluruh media yang digunakan untuk pengujian harus
diuji fertilitas. Gunakan mikroba seperti tertera pada
Mikroba uji.

Gunakan biakan mikroba berikut: Candida albicans PERSIAPAN INOKULA

(ATCC No. 10231), Aspergillus niger (ATCC No.
16404), Escherichia coli (ATCC No. 8739), Persiapan sebelum pengujian, inokulasikan masing-
Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027) dan masing mikroba spesifik dari stok-biakan segar pada
Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538). Mikroba hidup permukaan media agar yang sesuai.
yang digunakan untuk pengujian tidak boleh lebih dari
lima pasase dari biakan ATCC asli. Untuk tujuan

Tabel 2 Kondisi Biakan Pentuk Penyiapan Inokula

Waktu Inkubasi Waktu Inkubasi

Mikroba Media yang sesuai Suhu Inkubasi
Inokula Rekoveri Mikroba
Escherichia coli Soybean-Casein 32,5 2,5 18 24 jam 3 5 hari
(ATCC No.8739 ) Digest Broth;
Soybean-Casein
Digest Agar
Pseudomonas Soybean-Casein 32,5 2,5 18 24 jam 3 5 hari
aeruginosa Digest Broth;
(ATCC No. 9027) Soybean-Casein
Digest Agar
Staphylococcus aureus Soybean-Casein 32,5 2,5 18 24 jam 3 5 hari
(ATCC No. 6538) Digest Broth;
Soybean-Casein
Digest Agar
Candida albicans Sabouraud Dextrose 22,5 2,5 44 52 jam 3 5 hari
(ATCC No. 10231) Agar;
Sabouraud Dextrose
Broth
 - 1338 -
Mikroba Media yang sesuai Suhu Inkubasi
Aspergillus niger Sabouraud Dextrose 22,5 2,5
(ATCC No. 16404) Agar;
Sabouraud Dextrose
Broth
Kondisi biakan untuk inokula dalam media yang sesuai
yaitu Soybean-Casein Digest atau Sabouraud Dextrose
Agar seperti tertera pada Tabel 2 pada lampiran Uji
Batas Mikroba <51>.
Untuk memanen biakan bakteri dan C.albicans
gunakan salin LP steril, cuci biakan yang tumbuh di
permukaan, kumpulkan dalam wadah yang sesuai dan
tambahkan salin LP steril secukupnya hingga diperoleh
suspensi dengan jumlah mikroba lebih kurang 1 x 108
koloni per ml. Untuk memanen biakan A.niger gunakan
salin LP steril yang mengandung 0,05% polisorbat 80 P
dan tambahkan salin LP steril secukupnya hingga
diperoleh suspensi dengan jumlah mikroba lebih kurang
1 x 108 koloni per ml.
Cara lain, mikroba stok-biakan dapat ditumbuhkan
dalam media cair yang sesuai (misalnya Soybean Casein
Digest Broth atau Sabouraud Dextrose Broth) dan sel
mikroba dipanen dengan cara sentrifus kemudian dicuci
dan disuspensikan kembali dalam salin LP steril
secukupnya hingga diperoleh suspensi dengan jumlah
mikroba lebih kurang 1 x 10 8 koloni per ml. [Catatan
Perkiraan kadar inokula dapat dilakukan dengan
pengukuran turbidimetri untuk mikroba tantang. Bila
tidak segera digunakan dalam waktu 2 jam, suspensi
harus disimpan dalam lemari pendingin].
Tetapkan jumlah koloni per ml dari setiap suspensi,
menggunakan kondisi media dan waktu inkubasi untuk
rekoveri yang tertera pada Tabel 2 untuk memastikan
perkiraan jumlah awal. Nilai perkiraan ini digunakan
untuk mengkalibrasi ukuran inokula yang digunakan
dalam pengujian. Suspensi bakteri dan khamir harus
digunakan dalam waktu 24 jam dari panen, tetapi untuk
kapang dapat disimpan dalam lemari pendingin dalam
waktu sampai 7 hari.
PROSEDUR
Pengujian dapat dilakukan dalam tiap lima wadah asli
bila volume sediaan tiap wadahnya mencukupi dan
wadah sediaan dapat ditusuk secara aseptik (dengan
jarum dan alat suntik melalui tutup karet elastomerik),
atau dalam lima wadah bakteriologi bertutup steril,
berukuran mencukupi untuk volume sediaan yang
dipindahkan. Inokulasi tiap wadah dengan satu inokula
baku yang telah disiapkan dan diaduk. Volume suspensi
inokula yang digunakan antara 0,5% dan 1,0% dari
volume sediaan. Kadar mikroba uji yang ditambahkan
pada sediaan (Kategori 1, 2, dan 3) seperti halnya kadar
akhir sediaan uji setelah diinokulasi antara 1 x 105 dan 1
x 106 koloni/ml. Untuk sediaan Kategori 4 (antasida)
Waktu Inkubasi Waktu Inkubasi
Inokula Rekoveri Mikroba
6 10 hari 3 7 hari
kadar akhir sediaan uji setelah inokulasi antara 1 x 103
dan 1 x 104 koloni/ml.
Kadar awal mikroba viabel dalam setiap sediaan uji
diperkirakan berdasarkan kadar mikroba dalam inokula
standar ditetapkan dengan metode angka lempeng total.
Inkubasi wadah yang sudah diinokulasi pada
22,5 2,5. Ambil sampel dari setiap wadah pada
interval yang sesuai seperti tertera pada Tabel 3. Catat
setiap perubahan penampilan yang diamati pada interval
tersebut. Tetapkan dengan prosedur angka lempeng total
jumlah koloni yang ada dari setiap sediaan uji untuk
interval yang digunakan seperti tertera pada lampiran Uji
Batas Mikroba <51>. Pada uji angka lempeng total atau
pengenceran yang sesuai tambahkan inaktivator
(penetral) antimikroba spesifik. Kondisi ini digunakan
untuk validasi sampel berdasarkan kondisi media dan
waktu inkubasi rekoveri mikroba seperti tertera pada
Tabel 2. Dengan menggunakan jumlah koloni/ml
terhitung pada awal pengujian, hitung perubahan dalam
nilai log jumlah koloni/ml untuk setiap mikroba yang
digunakan pada setiap interval uji dan nyatakan sebagai
log reduksi.
KRITERIA EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA
Persyaratan untuk efektivitas antimikroba dipenuhi
jika kriteria spesifik pada Tabel 3 dipenuhi: Tidak terjadi
peningkatan lebih tinggi dari log 0,5 unit terhadap nilai
log mikroba awal.
Tabel 3 Kriteria untuk Mikroba uji
Untuk Sediaan Kategori 1
Bakteri Koloni tidak kurang dari 1,0 log reduksi
dari jumlah hitungan awal pada hari ke-
7, tidak kurang dari 3,0 log reduksi dari
hitungan awal pada hari ke-14, dan tidak
meningkat sampai dengan hari ke-28.
Kapang Koloni tidak meningkat dari jumlah
dan khamir hitungan awal sampai hari ke-7, 14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 2
Bakteri Koloni tidak kurang dari 2,0 log reduksi
dari jumlah awal pada hari ke-14, dan
tidak meningkat dari hari ke-14 sampai
hari ke-28.
Kapang Koloni tidak meningkat dari jumlah
dan khamir hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28.
 - 1339 -
Untuk Sediaan Kategori 3 optimal ditentukan dari pabrik. Amati lempeng setelah
Bakteri Koloni tidak kurang dari 1,0 log reduksi 24 dan 48 jam, catat jumlah koloni tiap lempeng; dan
dari jumlah hitungan awal pada hari ke- gunakan jumlah koloni yang diamati setelah 48 jam
14, dan tidak meningkat sampai dengan untuk menghitung hasil. Hitung jumlah rata-rata spora
hari ke-28. tiap indikator dari hasil penghitungan, menggunakan
Kapang Koloni tidak meningkat dari jumlah faktor pengenceran yang sesuai. Pengujian dinyatakan
dan khamir hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28. absah bila log jumlah spora per (kertas) pembawa pada
Untuk Sediaan Kategori 4 48 jam sama atau lebih besar dari log jumlah setelah 24
Bakteri, Koloni tidak meningkat dari jumlah jam dalam tiap wadah. Untuk Indikator Biologi
kapang dan hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28. Sterilisasi Uap Basah, Self-Contained lepaskan secara
khamir aseptik tiga buah pembawa dari masing-masing
wadahnya, dan perlakukan langsung seperti pada
Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah dengan
UJI KINERJA RESISTENSI INDIKATOR Pembawa Kertas.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah,
BIOLOGI <65>
Pemanasan Kering, dan Gas, dengan Pembawa Non-
Kertas, lepaskan secara aseptik tiga buah pembawa dari
PENGHITUNGAN ANGKA SPORA masing-masing kemasan asli atau wadahnya. Masukkan
tiap pembawa ke dalam wadah steril yang sesuai berisi
Untuk indikator biologi dengan pembawa kertas,
100 ml Air Murni dingin, dan sonikasi atau kocok
lepaskan tiga buah indikator biologi yang relevan dari
dengan pengocok-resiprok secukupnya. Lima belas
masing-masing wadahnya. Dispersikan kertas pembawa
menit atau lebih mungkin diperlukan untuk perolehan
dengan memasukkan ke dalam 250 ml blender steril
kembali yang optimal. Sebaiknya telah dilakukan studi
berisi 100 ml Air Murni dingin, campurkan hingga
pendahuluan untuk memastikan bahwa metode
terbentuk suspensi homogen. Umumnya pencampuran
perolehan kembali menghasilkan sedikitnya 50%-300%
dilakukan selama 15 menit atau lebih untuk memperoleh
perolehan kembali angka spora hidup. Pindahkan
perolehan kembali yang optimal. Pindahkan sejumlah 10
sejumlah 10 ml alikuot suspensi ke dalam 16x125 mm
ml alikuot suspensi ke dalam 16 x 125mm tabung
tabung bertutup ulir steril. Panaskan tabung berisi
bertutup ulir steril. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi
suspensi Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus
Uap Basah dengan Pembawa Kertas, panaskan tabung
coagulans pada 80 - 85 selama 10 menit. Panaskan
berisi suspensi dalam tangas air pada 95 - 100 selama
tabung berisi suspensi Geobacillus stearothermophilus
15 menit (syok panas) dimulai setelah suhu mencapai
pada 95 - 100 selama 15 menit. Penghitungan waktu
95. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Panas Kering
dimulai pada saat tiap rentang suhu pemanasan
dengan Pembawa Kertas dan Indikator Biologi
mencapai yang terendah. Dinginkan segera dalam tangas
Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas,
air es pada 0 - 4. Pindahkan masing-masing 1 ml
panaskan tabung berisi suspensi dalam tangas air pada
alikuot ke dalam dua tabung yang sesuai, dan lakukan
80 - 85 selama 10 menit dimulai setelah suhu mencapai
seri pengenceran secukupnya dalam Air Murni steril,
80. Dinginkan secara cepat dalam tangas air-es pada
pengenceran dipilih dengan hasil penghitungan 30 - 300
0 - 4. Pindahkan 1 ml alikuot masing-masing ke dalam
koloni, tetapi tidak kurang dari 6, pada tiap pasangan
dua tabung yang sesuai, dan lakukan seri pengenceran
lempeng dengan perlakuan sebagai berikut ini.
secukupnya dalam Air Murni steril, pengenceran dipilih
Bila indikator biologi mempunyai kadar spora rendah,
dengan hasil penghitungan 30 - 300 koloni, tetapi tidak
mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi dan
kurang dari 6, pada tiap pasangan lempeng dengan
menggunakan lempeng lebih banyak untuk tiap
perlakuan sebagai berikut ini. Bila indikator biologi
pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng untuk tiap
mempunyai kadar spora rendah, mungkin seri
alikuot. Masukkan 1 ml suspensi dari tingkat
pengenceran perlu dimodifikasi dan menggunakan
pengenceran yang dipilih ke dalam masing-masing dua
lempeng lebih banyak untuk tiap pengenceran. Siapkan
cawan Petri 15 - 100 mm. Dalam waktu 20 menit
seri terpisah lempeng untuk tiap alikuot. Masukkan 1,0
tambahkan pada tiap cawan 20 ml media Soybean-
ml suspensi dari tingkat pengenceran yang dipilih ke
Casein Digest Agar cair dan telah didinginkan 45 - 50.
dalam masing-masing dua cawan Petri 15 - 100 mm.
Campur dengan memutar cawan hingga suspensi
Dalam waktu 20 menit tambahkan pada tiap cawan 20
homogen.
ml media Soybean-Casein Digest Agar cair dan telah
Untuk G.stearothermophilus, B.atrophaeus, B.subtilis,
didinginkan 45 - 50. Campur dengan memutar cawan
dan B.coagulans, gunakan media Soybean-Casein Digest
hingga suspensi homogen, dan kemudian dibiarkan
Agar dan inkubasikan lempeng secara aerob dengan
memadat. Inkubasikan lempeng dengan posisi dibalik
posisi dibalik pada suhu berturut-turut untuk tiap
pada 55 - 60, untuk Indikator Biologi Sterilisasi
mikroba sebagai berikut: 55 - 60, 30 - 35, 48 - 52, atau
Uap Basah dengan Pembawa Kertas, dan pada 30 - 35
pada suhu optimum khusus sesuai dengan indikator
Indikator Biologi Sterilisasi Etilen Oksida, dengan
biologi pabrik. Amati lempeng setelah 24 dan 48 jam.
Pembawa Kertas dan Indikator Biologi Sterilisasi Panas
Catat jumlah koloni tiap lempeng. Hitung rata-rata
Kering dengan Pembawa Kertas atau pada suhu rekoveri jumlah spora tiap indikator dari hasil penghitungan,
 - 1340 -
menggunakan faktor pengenceran yang sesuai.
Pengujian dinyatakan absah bila log jumlah spora per
pembawa pada 48 jam sama atau lebih besar dari log
jumlah setelah 24 jam dalam tiap wadah.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah,
Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair,
menggunakan G.stearothermophilus, B.atrophaeus,
B.subtilis, dan B.coagulans sebagai indikator biologi,
disiapkan seri pengenceran secukupnya, suspensi asli
spora dengan Air Murni dingin steril dalam tabung
bertutup ulir 16 x 125 mm menggunakan prosedur
khusus penghitungan angka spora dengan Indikator
Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah, Pemanasan
Kering, dan Gas, dengan Pembawa Non-Kertas.
PENETAPAN NILAI-D
Lakukan seluruh pengujian seperti dijelaskan dalam
bagian ini di bawah kondisi aseptik, menggunakan
peralatan steril untuk mikroba non-termofilik.
Penetapan Nilai-D untuk G.stearothermophilus dan
B.coagulans dapat dilakukan di lingkungan tidak
diklasifikasi tetapi terkendali.
Peralatan
Peralatan uji untuk menetapkan resistensi
mikrobiologi yang dijelaskan secara rinci dalam ISO
18472, Sterilisasi Produk Kesehatan-Indikator Biologi
dan Kimia-Peralatan Uji. Rincian Resistometer Evaluasi
Indikator Biologi (REIB) secara individu bervariasi
dengan rancangan spesifik dan proses sterilisasi utama
bersama dengan yang digunakan. Tetapkan bahwa
kinerja bejana REIB sesuai dengan persyaratan standar
ISO untuk paparan indikator biologi, dengan perbedaan
rancangan yang dapat diterima.
Prosedur
Lakukan pengujian Nilai-D pada setiap pengaturan
kondisi sterilisasi, paket indikator biologi diberi tanda
(label) untuk digunakan. Ambil kelompok spesimen
indikator biologi sejumlah yang cukup dalam wadah asli
masing-masing, setiap kelompok terdiri dari tidak
kurang 5 spesimen. Jumlah kelompok menyediakan
rentang pengamatan dari tidak kurang dari satu label
nilai-D di bawah tanda waktu bertahan hidup (survival
time) sampai tidak kurang dari satu label nilai-D di atas
tanda waktu mematikan (kill time). Letakkan setiap
kelompok pada tempat spesimen (specimen holder)
terpisah yang sesuai yang memungkinkan setiap
spesimen terpapar kondisi sterilisasi yang telah
ditentukan pada lokasi khusus dalam bejana sterilisasi
REIB. Periksa alat REIB untuk parameter pengoperasian
menggunakan specimen holder tanpa spesimen. Pilih
seri tambahan waktu sterilisasi dari waktu terpendek
untuk spesimen yang diuji. Perbedaan pada seri waktu
sterilisasi, sedapat mungkin konstan dan perbedaan
antara waktu yang berdekatan tidak lebih besar dari 75%
nilai-D label.
Prosedur uji penggunaan bejana REIB untuk evaluasi
resistensi mikroba ditetapkan dalam standar ISO seri
11138. Indikator biologi sebaiknya mengikuti standar
yang sesuai. Metode uji dan penggunaan pembawa
dengan REIB mungkin dapat disesuaikan untuk
indikator biologi khusus. Metode dan peralatan yang
digunakan untuk pembawa kertas dapat berbeda dengan
pembawa lain dan secara substansial berbeda dari
penggunaan suspensi indikator biologi.
Kondisi pemaparan nilai-D untuk pembawa bahan
alternatif sama dengan kondisi yang digunakan untuk
menetapkan nilai-D pembawa kertas. Jika label pabrik
membolehkan penggunaan pembawa dengan berbagai
metode sterilisasi, maka data nilai-D, survival time,
kill time disediakan oleh pabrik untuk setiap metode
sterilisasi. Hal ini memungkinkan indikator biologi yang
diinokulasi pada pembawa selain kertas disterilisasi/
dekontaminasi dengan metoda gas atau uap seperti fase
uap hidrogen peroksida dan klorin dioksida.
Standar kondisi fisik evaluasi indikator biologi untuk
penggunaan dengan fase uap hidrogen peroksida dan
klorin dioksida belum ditetapkan. Dalam hal klorin
dioksida, kadar gas, kelembaban relatif, dan suhu
merupakan pengendali kondisi proses yang penting,
yang dapat diukur dengan akurat. Pabrik penghasil
indikator biologi menggunakan klorin dioksida harus
menyatakan kondisi yang harus dilakukan di bawah
penetapan nilai-D, sehingga pengguna dapat paling tidak
melihat resistensi banyak indikator biologi sebagai
pembanding untuk mengantisipasi kondisi yang
digunakan. Situasi dengan fase uap hidrogen peroksida
lebih kompleks, berbagai peralatan pabrik menawarkan
dekontaminasi atau kondisi sterilisasi yang berbeda. Jadi
tidak ada proses standar untuk melakukan dekontaminasi
dengan fase uap hidrogen peroksida atau sterilisasi
permukaan. Hal ini diikuti tidak adanya metode evaluasi
standar industri indikator biologi, walaupun mungkin
tidak berhubungan langsung antara kadar uap dan
kecepatan ataupun keefektivan inaktivasi indikator
biologi. Sebagai tambahan, sulit untuk mengases
kelembaban relatif secara akurat, yang sering ditetapkan
sebagai parameter proses kritis dengan adanya uap
hidrogen peroksida. Untuk alasan ini lebih masuk akal
untuk menetapkan resistensi indikator biologi menjadi
relatif atau ukuran relatif pabrik daripada nilai-D
sebenarnya. Selanjutnya tergantung peralatan dan proses
yang dikerjakan, dan ini menjadi tidak mungkin bagi
pengguna mengulangi uji resistensi biologi yang telah
dilakukan oleh pabrik.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah,
Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair,
dilakukan penetapan nilai-D untuk tiap mikroba untuk
menyediakan suspensi hasil panen spora cair. Uji
dilakukan dengan seri pengenceran berdasarkan status
titer spora dari suspensi dengan Air Murni dalam tabung
steril.
Bila suspensi dimasukkan pada atau dalam substrat
misal tutup elastomerik atau produk formulasi,
resistensinya mungkin berbeda dari yang ditetapkan
dalam Air Murni. Perbedaan itu mungkin bermakna
 - 1341 -
untuk penggunaan indikator biologi dan pengukuran
yang sesuai sebelumnya untuk digunakan dalam
aktivitas validasi sterilisasi.
Perolehan Kembali
Setelah melengkapi prosedur sterilisasi Indikator
Biologi untuk Sterilisasi Panas Kering dengan Pembawa
Kertas dan Indikator Biologi untuk Sterilisasi Etilen
Oksida, dengan Pembawa Kertas; atau Indikator Biologi
untuk Sterilisasi Uap dengan Pembawa Kertas yang
dapat diterapkan dan dalam catatan waktu tidak lebih
dari 4 jam, buka secara aseptik dan tambahkan tiap strip
ke dalam media sesuai (lihat Media di bawah Uji
Sterilitas <71>) untuk merendam indikator biologi
dalam tabung yang sesuai. Untuk tiap Indikator Biologi
untuk Sterilisasi Uap Basah, Self-Contained spesimen,
strip kertas direndam dalam media self-contained
menurut petunjuk pabrik, dalam catatan waktu tidak
lebih dari 4 jam. Inkubasi tiap tabung pada suhu rekoveri
optimal yang ditetapkan pabrik. Amati tiap tabung berisi
media yang diinokulasi pada interval yang cukup untuk
total 7 hari setelah inokulasi. (Bila terjadi pertumbuhan
pada saat pengamatan maka inkubasi tidak perlu
dilanjutkan). Catat jumlah spesimen yang tidak tumbuh
pada tiap waktu.
Untuk Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah,
Pemanasan Kering, dan Sterilisasi Gas, Pembawa
Bukan kertas, rekoveri spora dari pembawa indikator
biologi akan mengikuti prosedur yang dijelaskan dalam
prosedur Angka Total Spora Hidup. Metode penetapan
nilai-D indikator biologi dengan pembawa kertas dapat
digunakan untuk menghitung nilai-D untuk pembawa
bukan kertas. Kondisi inkubasi mikroba yang akan
digunakan untuk indikator biologi dengan pembawa
bukan kertas dijelaskan dalam bab Angka Total Spora
Hidup.
Untuk Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah,
Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair,
metode rekoveri setelah kondisi pemaparan sterilisasi
adalah metode yang dijelaskan dalam bab Angka Total
Spora Hidup suspensi spora cair, dan jika penetapan
nilai-D pemanasan kering dibuat dari suspensi B.
atrophaeus, prosedur rekoveri sama seperti dijelaskan
dalam Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah
dengan Pembawa Kertas.
Ketika digunakan Clostridium sporogenes sebagai
indikator biologi, metode persiapan, inokulasi, metode
rekoveri dan media harus diadaptasikan untuk dapat
mengakomodasi penggunaan pembentukan spora
anaerob.
Penghitungan
Penetapan nilai-D indikator biologi dapat dilakukan
menggunakan Metode Spearman-Karber Terbatas,
Kurva Survival atau prosedur Sumbu-Murphy-Cochran.
Lebih baik menggunakan metode sama dengan yang
ditetapkan oleh pabrik indikator biologi untuk
menetapkan nilai-D. Penggunaan metode berbeda akan
memberikan hasil berbeda lebih kepada sebagai alat dari
pada variasi kinerja indikator biologi.
Survival time dan Kill time
Gunakan dua kelompok, masing-masing terdiri dari
10 indikator biologi yang relevan, dalam wadah asli.
Tempatkan spesimen tiap kelompok dalam rak spesimen
yang memungkinkan tiap spesimen terpapar kondisi
sterilisasi pada lokasi khusus dalam bejana REIB.
Lakukan pemaparan spesimen untuk survival time
yang disyaratkan, masukkan ke dalam bejana, dan
pisahkan wadah yang berisi 10 spesimen. Ulangi
prosedur di atas segera, atau panaskan sebelumnya bila
selang waktu yang cukup telah dilampaui, sehingga
wadah yang berisi 10 spesimen kedua diperlakukan
sama seperti yang pertama kecuali untuk persyaratan
kill time.
Survival time dan kill time untuk seluruh
monografi indikator biologi dijelaskan dalam masing-
masing monografi.
UJI STERILITAS <71>
Prosedur farmakope ini didesain bukan untuk menjamin
bahwa satu bets produk adalah steril atau telah
disterilkan. Hal ini terutama harus disertai dengan
validasi proses sterilisasi atau prosedur proses aseptik.
Pengujian digunakan untuk bahan, sediaan, alat sesuai
dengan farmakope yang dipersyaratkan harus steril.
Hasil yang diterima menunjukkan bahwa tidak ada
kontaminasi mikroba ditemukan dalam sampel di bawah
kondisi pengujian.
TINDAKAN PENCEGAHAN TERHADAP
KONTAMINASI MIKROBA
Pengujian sterilitas dilaksanakan pada kondisi
aseptik. Untuk mencapai kondisi tersebut, lingkungan
pengujian harus dibuat sama seperti ketika uji sterilitas
dilakukan. Tindakan pencegahan untuk mencegah
kontaminasi tidak boleh mempengaruhi mikroba yang
ada dalam pengujian. Kondisi pengerjaan, ketika uji
dilakukan dimonitor secara berkala dengan melakukan
sampling yang sesuai pada area kerja dan kontrol yang
sesuai.
MEDIA DAN SUHU INKUBASI
Media untuk pengujian dapat dibuat seperti tertera di
bawah ini atau setara dengan media komersil yang
memenuhi syarat Uji Fertilitas Aerob, Anaerob dan
Kapang.
Media berikut adalah media yang sesuai untuk uji
sterilitas. Media Cair Tioglikolat terutama digunakan
untuk pertumbuhan bakteri anaerob, termasuk juga
untuk mendeteksi bakteri aerob. Soybean-Casein Digest
Medium sesuai untuk pertumbuhan kapang dan bakteri
aerob.
 - 1342 -
Media Cair Tioglikolat
L-Sistin P 0,5 g
Natrium klorida P 2,5 g
Dekstrosa monohidrat/anhidrat P 5,5/5,0g
Agar P 0,75 g
Yeast extract (larut dalam air) 5,0 g
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Natrium tioglikolat P atau 0,5 g
Asam tioglikolat P 0,3 ml
Larutan natrium resazurin P (1 dalam 1,0 ml
1000) dibuat segar
Air murni 1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,1 0,2
Campur dan panaskan hingga larut L-sistin P, natrium
klorida P, dekstrosa, yeast extract dan pancreatic digest
of casein dalam air murni. Larutkan natrium tioglikolat
P atau asam tioglikolat P ke dalam larutan dan atur pH
hingga setelah sterilisasi 7,1 0,2 dengan penambahan
natrium hidroksida 1 N. Jika diperlukan penyaringan,
panaskan kembali larutan tanpa mendidih, dan saring
selagi panas melalui kertas saring yang telah dibasahkan.
Tambahkan larutan natrium resazurin P, campur dan
tempatkan media dalam tabung yang sesuai, yang
memberikan perbandingan permukaan dengan
kedalaman media sedemikian rupa sehingga tidak lebih
dari setengah bagian atas media yang mengalami
perubahan warna sebagai indikasi masuknya oksigen
pada akhir masa inkubasi. Sterilisasi menggunakan
proses yang telah divalidasi. Jika media disimpan, maka
simpan pada suhu antara 2 dan 25 dalam wadah steril
tertutup rapat. Jika lebih dari sepertiga bagian atas media
terjadi warna merah muda, media dapat diperbaiki
kembali dengan pemanasan diatas tangas air atau dalam
uap air yang mengalir bebas hingga warna merah muda
hilang, dan dinginkan secepatnya, cegah masuknya
udara tidak steril ke dalam wadah. Media tidak boleh
digunakan lebih lama dari waktu penyimpanan yang
telah tervalidasi.
Media Cair Tioglikolat diinkubasi pada suhu 30 - 35.
Untuk sediaan yang mengandung pengawet raksa yang
tidak dapat diuji menggunakan metode Penyaringan
membran, Media Cair Tioglikolat diinkubasi pada suhu
20 - 25 sebagai pengganti Soybean Casein Digest
Medium yang telah tervalidasi yang tertera pada uji
Fertilitas Anaerob, Aerob dan Kapang. Media
Tioglikolat Alternatif dapat digunakan jika sudah
disetujui. Buat campuran menggunakan komposisi sama
seperti Media Cair Tioglikolat tetapi tidak menggunakan
agar P dan larutan natrium resazurin P. Sterilkan sama
seperti di atas. pH setelah sterilisasi 7,1 0,2. Panaskan
dalam tangas air sebelum digunakan dan inkubasi pada
suhu 30 - 35 dalam kondisi anaerob.
Soybean-Casein Digest Medium
Pancreatic digest of casein 17,0 g
Papaic digest of soybean meal 3,0 g
Natrium klorida P 5,0 g
Kalium fosfat dibasa P 2,5 g
Dekstrosa monohidrat/anhidrat P 2,5/2,3 g
Air murni 1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,3 0,2
Larutkan semua bahan padat dalam air murni, hangatkan
hingga larut. Dinginkan larutan hingga suhu ruang, dan
jika perlu atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,3
0,2 dengan penambahan natrium hidroksida 1N. Jika
perlu saring hingga jernih, bagikan dalam wadah-wadah
yang sesuai dan sterilisasi menggunakan proses yang
telah divalidasi. Simpan pada suhu antara 2 dan 25
dalam wadah steril dan tertutup baik, kecuali jika segera
digunakan. Media tidak boleh digunakan lebih lama dari
waktu penyimpanan yang telah tervalidasi.
Soybean Casein Digest Medium diinkubasi pada 22,5 2,5.
Media untuk Golongan Penisilin dan Sefalosporin
Jika media uji sterilitas akan digunakan pada metode
Inokulasi langsung ke dalam Media Uji seperti tertera
pada Uji Sterilitas Sediaan, modifikasi pembuatan
media, baik Media Cair Tioglikolat maupun Soybean
Casein Digest Medium sebagai berikut: Masukkan
secara aseptik pada setiap wadah media sejumlah -
laktamase untuk menginaktifkan sejumlah antibiotik
dalam zat uji. Tetapkan jumlah -laktamase yang
diperlukan untuk menginaktifkan antibiotik
menggunakan sediaan -laktamase yang sebelumnya sudah
diuji inaktivasi daya hambat dari penisilin atau
sefalosporin. [Catatan Media yang telah mengandung -
laktamase dapat juga digunakan untuk pengujian
dengan metode penyaringan membran].
Sebagai alternatif (Lakukan uji di daerah yang benar-
benar terpisah dari tempat uji sterilitas), tetapkan jumlah
-laktamase yang diperlukan di dalam media seperti
tertera pada Uji kesesuaian metode menggunakan
Staphylococcus aureus kurang dari 100 koloni (lihat
Tabel 1) sebagai bakteri tantang. Amati pertumbuhan
mikroba yang khas sebagai konfirmasi bahwa kadar -
laktamase sudah tepat.
Tabel 1 Galur Mikroba Uji yang sesuai untuk
penggunaan Uji Fertilitas dan Uji kesesuaian metode
Bakteri Aerob
Staphylococcus aureus ATCC 6538; CIP 4.83;
NCTC 10788; NCIMB 9518;
NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633; CIP 52.62;
NCIMB 8054; NBRC 3134
Pseudomonas ATCC 9027; NCIMB 8626;
aeruginosa1 IP 82.118; NBRC 13275
 - 1343 -
Bakteri Anaerob
Clostridium sporogenes2 ATCC 19404; CIP 79.3;
NCTC 532 atau ATCC
11437; NBRC 14293
Kapang
Aspergillusbrasiliensis ATCC 16404; IP 1431.83
(Aspergillus niger) MI 149007; NBRC 9455
1. Alternatif untuk Pseudomonas aeruginosa adalah Kocuria
rhizophila (Micrococcus luteus) ATCC 9341
2. Alternatif untuk Clostridium sporogenes, jika diinginkan
mikroba yang bukan pembentuk spora adalah Bacteroides
vulgatus ATCC 8482.
Media yang digunakan sesuai dengan uji di bawah ini.
Pengujian dilakukan sebelum atau bersamaan dengan
pengujian sediaan.
Sterilitas
Inkubasi sebagian dari media pada suhu yang sesuai
selama 14 hari. Tidak boleh ada pertumbuhan mikroba.
Uji Fertilitas untuk Aerob, Anaerob dan Kapang
Lakukan uji fertilitas terhadap tiap lot media siap
pakai dan tiap bets dari media yang dibuat menggunakan
media kering atau dari bahannya. Galur mikroba yang
sesuai dapat dilihat pada Tabel 1.
Inokulasikan sejumlah Media Cair Tioglikolat dengan
sejumlah mikroba berikut (tidak lebih dari 100 koloni),
menggunakan sejumlah media terpisah untuk setiap
spesies mikroba: Clostridium sporogenes, Pseudomonas
aeruginosa, dan Staphylococcus aureus. Inokulasikan
sejumlah Media Tioglikolat Alternatif dengan sejumlah
Clostridium sporogenes (tidak lebih dari 100 koloni).
Inokulasikan sejumlah Soybean Casein Digest
Medium dengan sejumlah mikroba berikut (tidak lebih
dari 100 koloni) menggunakan sejumlah media terpisah
untuk setiap spesies mikroba: Aspergillus brasiliensis,
Bacillus subtilis dan Candida albicans. Inkubasi tidak
lebih dari 3 hari untuk bakteri dan tidak lebih dari 5 hari
untuk kapang. Teknik pemeliharaan lot benih kultur
(sistem lot benih) untuk mikroba viabel yang
diinokulasikan tidak lebih dari 5 pasase yang diturunkan
dari lot benih master asli.
Media dapat digunakan jika terlihat pertumbuhan
mikroba dengan jelas.
CAIRAN PENGENCER DAN PEMBILAS
UNTUK PENYARINGAN MEMBRAN
Cairan A
Cara pembuatan Larutkan 1 g peptic digest of animal
tissue dalam air hingga 1 liter, jika perlu saring atau
sentrifus hingga jernih, atur pH hingga 7,1 0,2.
Bagikan ke dalam wadah-wadah, dan sterilisasi
menggunakan proses yang telah divalidasi.
Cara Pembuatan untuk Penisilin atau Sefalosporin
Jika perlu tambahkan secara aseptik pada larutan diatas,
sejumlah -laktamase steril yang cukup untuk
menginaktifkan aktifitas residu antibiotik pada membran
setelah larutan uji disaring (lihat Media untuk Golongan
Penisilin dan Sefalosporin.).
Cairan D
Untuk setiap liter Cairan A tambahkan 1 ml polisorbat
80 P, atur pH hingga 7,1 0,2, bagikan ke dalam
wadah-wadah, dan sterilisasi menggunakan proses yang
telah divalidasi. Gunakan cairan ini untuk bahan uji yang
mengandung lesitin atau minyak, atau untuk alat
kesehatan yang beretiket lumen steril.
Cairan K
Larutkan 5,0 g peptic digest of animal tissue; 3,0 g beef
extract dan 10,0 g polisorbat 80 P, dalam air hingga 1
liter. Atur pH hingga setelah sterilisasi pH 6,9 0,2.
Bagikan ke dalam wadah-wadah, dan sterilisasi
menggunakan proses yang telah divalidasi.
UJI KESESUAIAN METODE
Lakukan uji seperti tertera pada Uji Sterilitas Produk
menggunakan metode yang sama, kecuali untuk
modifikasi berikut ini:
Penyaringan Membran
Setelah isi wadah atau isi beberapa wadah yang diuji
disaring melalui membran, tambahkan inokulum dari
sejumlah kecil mikroba viable (tidak lebih dari 100
koloni) ke dalam pembilas steril terakhir yang digunakan
untuk membilas penyaring.
Inokulasi langsung
Setelah isi wadah atau isi beberapa wadah yang diuji
(gunakan helaian untuk benang bedah dan alat-alat
bedah yang digunakan dokter hewan) dimasukkan ke
dalam media, tambahkan sejumlah kecil inokulum
mikroba viable (tidak lebih dari 100 koloni) ke dalam media.
Pada kedua cara diatas, gunakan mikroba yang sama
seperti tertera pada Uji Fertilitas untuk Aerob, Anaerob
dan Kapang. Lakukan uji fertilitas sebagai kontrol
positif. Inkubasi semua wadah yang berisi media selama
tidak lebih dari 5 hari.
Jika setelah masa inkubasi terlihat pertumbuhan mikroba
dengan jelas secara visual dibandingkan dengan tabung
yang tidak berisi sampel, maka sampel tidak mempunyai
sifat antimikroba pada kondisi uji atau aktifitasnya telah
dihilangkan dengan sempurna. Uji sterilitas kemudian
dapat dilakukan tanpa modifikasi lebih lanjut.
Jika tidak terlihat pertumbuhan mikroba dengan jelas
pada tabung yang berisi sampel secara visual,
dibandingkan dengan tabung yang tidak berisi sampel,
maka sampel mempunyai aktifitas antimikroba yang
tidak dapat dihilangkan pada kondisi pengujian.
Modifikasi kondisi ini untuk menghilangkan daya
aktifitas antimikroba dan ulangi Uji Kesesuaian Metode.
 - 1344 -
Uji Kesesuaian Metode dilakukan untuk a) uji sterilitas
pada sediaan baru; b) ada perubahan yang dilakukan pada
kondisi pengujian. Uji Kesesuaian Metode dapat
dilakukan secara simultan dengan Uji Sterilitas Sediaan.
UJI STERILITAS SEDIAAN
Jumlah Bahan yang Diuji
Kecuali dinyatakan lain pada bab ini atau masing-masing
monografi, gunakan jumlah wadah seperti tertera pada
Tabel 3. Jika isi tiap wadah mencukupi (lihat Tabel 2) isi
wadah dapat dibagi sama banyak
dan ditambahkan pada media yang sesuai. [Catatan
Lakukan uji sterilitas menggunakan dua atau lebih media
yang sesuai]. Jika isi wadah tidak cukup untuk masing-
masing media, gunakan jumlah dua kali dari yang tertera
pada Tabel 3.
Pengujian terhadap contoh uji dapat dilakukan
menggunakan teknik Penyaringan Membran atau
Inokulasi Langsung ke dalam Media Uji. Gunakan juga
kontrol negatif yang sesuai. Teknik Penyaringan
Membran digunakan apabila sifat contoh sesuai, yaitu
untuk sediaan yang mengandung air dan dapat disaring,
sediaan yang mengandung alkohol atau minyak, dan
sediaan yang dapat dicampur dengan atau yang larut
dalam pelarut air atau minyak, dengan ketentuan bahwa
pelarut tidak mempunyai efek antimikroba pada kondisi
pengujian.

Tabel 2 Jumlah Minimum yang Digunakan untuk Tiap Media

Isi per wadah Jumlah minimum yang digunakan

(Kecuali dinyatakan lain)
Larutan
Kurang dari 1ml Seluruh isi tiap wadah
1 40 ml setengah isi tiap wadah, tetapi tidak kurang dari 1 ml
Lebih dari 40 ml, tidak lebih dari 100 ml 20 ml
Lebih dari 100 ml 10% isi wadah, tetapi tidak kurang dari 20 ml
Larutan antibiotik 1 ml
Sediaan larut dalam air lainnya atau dalam isopropil Seluruh isi tiap wadah, sebanding dengan tidak kurang dari
miristat 200 mg
Sediaan yang tidak larut, krim,dan salep, yang tersuspensi Gunakan isi tiap wadah yang sebanding dengan tidak
atau teremulsi kurang dari 200 mg

Zat Padat
Kurang dari 50 mg Seluruh isi tiap wadah
50 mg atau lebih, tetapi kurang dari 300mg Setengah isi tiap wadah, tetapi tidak kurang dari 50 mg
300 mg 5 g 150 mg
Lebih besar dari 5 g 500 mg

Benang bedah dan peralatan bedahlainnya untuk 3 potongan untuk helai (panjang tiap potong 30 cm)
penggunaan dokter hewan
Pembalut/ kapas/perban (dalam kemasan) 100 mg per kemasan
Benang bedah dan bahan sejenis yang dikemas untuk Seluruh alat
penggunaan sekali pakai
Alat Kesehatan lainnya Seluruh alat, potong kecil kecil atau diuraikan

Tabel 3 Jumlah Minimum Bahan yang diuji sesuai dengan Jumlah Bahan dalam Bets

Jumlah wadah dalam Bets* Jumlah Minimum wadah yang diuji tiap media (Kecuali
dinyatakan lain**)
Sediaan parenteral
Tidak lebih dari 100 wadah 10% atau 4 wadah, diambil yang lebih besar
Lebih dari 100, tetapi tidak lebih dari 500 wadah 10 wadah
Lebih dari 500 wadah 2% atau 20 wadah, diambil yang lebih kecil
Untuk sediaan volume besar 2% atau 10 wadah, diambil yang lebih kecil

Zat Padat antibiotik

Produk ruahan dalam kemasan <5g 20 wadah
Produk ruahan dalam kemasan >5g 6 wadah
Produk ruahan dan campuran lihat Produk ruahan padat
 - 1345 -
Sediaan mata dan sediaan lain yang tidak disuntikkan
Tidak lebih dari 200 wadah
Lebih dari 200 wadah
Jika sediaan dalam bentuk wadah dosis tunggal,gunakan
skema diatas untuk sediaan parenteral
Benang bedah dan peralatan bedah lainnya untuk
penggunaan dokter hewan
Tidak lebih dari 100 bahan
Lebih dari 100, tetapi tidak lebih dari 500 bahan
Lebih dari 500 bahan
Produk ruahan padat
Sampai 4 wadah
Lebih dari 4 wadah, tetapi tidak lebih dari 50 wadah
Lebih dari 50 wadah
*Jika besarnya bets tidak diketahui, gunakan jumlah maksimum
**Jika isi satu wadah cukup untuk diinokulasikan ke dalam dua media, kolom ini menyatakan jumlah wadah yang diperlukan untuk
kedua media.
Penyaringan Membran
Gunakan penyaring membran dengan porositas tidak
lebih dari 0,45 m yang telah terbukti efektif menahan
mikroba. Sebagai contoh, penyaring selulosa nitrat
digunakan untuk larutan yang mengandung air, minyak
dan larutan mengandung alkohol berkadar rendah; dan
penyaring selulosa asetat digunakan untuk larutan
mengandung alkohol berkadar tinggi. Penyaring khusus
yang sesuai mungkin diperlukan untuk sediaan tertentu
(misal: untuk antibiotik).
Teknik pengujian di bawah ini menggunakan membran
berdiameter lebih kurang 50 mm. Jika digunakan
penyaring dengan diameter yang berbeda, volume larutan
pengencer dan pembilas harus disesuaikan. Peralatan
penyaring dan membran disterilisasi dengan cara yang
sesuai. Peralatan dirancang hingga larutan uji dapat
dimasukkan dan disaring pada kondisi aseptik, membran
dapat dipindahkan secara aseptik ke dalam media, atau
dapat dilakukan inkubasi setelah media dimasukkan ke
dalam alat penyaring itu sendiri.
LARUTAN DALAM AIR
Jika perlu pindahkan sejumlah kecil pengencer steril yang
sesuai seperti Cairan A ke dalam membran dan saring.
Pengencer dapat mengandung bahan penetral dan/atau
bahan inaktifator yang sesuai, misalnya pada kasus
antibiotik.
Pindahkan isi wadah atau beberapa wadah yang akan
diuji ke dalam satu membran atau beberapa membran,
jika perlu diencerkan dengan pengencer steril yang dipilih
sesuai volume yang digunakan pada Uji Kesesuaian
Metode, tetapi jumlah yang digunakan tidak kurang dari
yang tertera pada Tabel 2 dan Tabel 3. Saring segera. Jika
sediaan mempunyai daya antimikroba, cuci membran
tidak kurang dari tiga kali dengan cara menyaring tiap
kali dengan sejumlah volume pengencer yang digunakan
pada Uji Kesesuaian Metode. Setiap pencucian tidak
lebih dari 5 kali 100 ml per membran, meskipun jika
selama uji kesesuaian metode ditemukan pencucian
5% atau 2 wadah, diambil yang lebih besar
10 wadah
2% atau 5 kemasan, diambil yang lebih besar, sampai total
maksimum 20 kemasan
10% atau 4 bahan,diambil yang lebih besar
10 bahan
2% atau 20 bahan, diambil yang lebih kecil
Tiap wadah
20% atau 4 wadah, diambil yang lebih besar
2% atau 10 wadah, diambil yang lebih besar
tersebut tidak dapat menghilangkan daya antimikroba
secara sempurna.
Pindahkan seluruh membran utuh ke dalam media atau
potong menjadi dua bagian yang sama secara aseptik dan
pindahkan masing-masing bagian ke dalam dua media
yang sesuai. Gunakan volume yang sama pada tiap media
seperti pada Uji Kesesuaian Metode. Sebagai pilihan lain,
pindahkan media ke dalam membran pada alat penyaring.
Inkubasi media selama tidak kurang dari 14 hari.
ZAT PADAT YANG DAPAT LARUT
Gunakan untuk tiap media tidak kurang dari sejumlah
sediaan seperti tertera pada Tabel 2 dan Tabel 3, larutkan
dalam pelarut yang sesuai, air steril untuk injeksi, natrium
klorida steril, atau larutan steril yang sesuai seperti
Cairan A dan lakukan uji seperti tertera pada Larutan
dalam Air menggunakan penyaring membran yang sesuai
untuk pelarut yang telah dipilih.
MINYAK DAN LARUTAN MINYAK
Gunakan untuk tiap media tidak kurang dari sejumlah
sediaan seperti tertera pada Tabel 2 dan Tabel 3. Minyak
dan larutan minyak viskositas rendah dapat disaring
melalui membran kering tanpa pengenceran. Minyak
kental dapat diencerkan dengan pengencer steril seperti
isopropil miristat P yang tidak mempunyai daya
antimikroba pada kondisi pengujian. Biarkan minyak
menembus membran dengan gaya beratnya sendiri,
kemudian saring dengan menggunakan tekanan atau
penghisapan secara bertahap.
Cuci membran tidak kurang dari tiga kali dengan cara
menyaring, tiap kali dengan 100 ml larutan steril yang
sesuai, seperti Cairan A yang mengandung bahan
pengemulsi yang sesuai dengan kadar yang sesuai seperti
pada Uji Kesesuaian Metode, misalnya polisorbat 80 P
dengan kadar 10 g per liter (Cairan K ).
Pindahkan membran atau beberapa membran ke dalam
media seperti tertera pada Larutan dalam Air, dan
inkubasi pada suhu dan waktu yang sama.
 - 1346 -
SALEP DAN KRIM
Gunakan untuk tiap media tidak kurang dari sejumlah
sediaan seperti tertera pada Tabel 2 dan Tabel 3. Salep
dengan basis lemak dan emulsi air dalam minyak dapat
diencerkan sampai 1% dalam isopropil miristat P seperti
metode diatas, jika perlu dengan pemanasan tidak lebih
dari 40. Pada kasus tertentu, mungkin diperlukan
pemanasan tidak lebih dari 44. Saring sesegera mungkin,
dan lakukan seperti pada Minyak dan Larutan minyak.
ALAT SUNTIK TERISI
Untuk alat suntik terisi tanpa jarum steril, keluarkan isi
dari tiap alat suntik ke dalam satu atau dua tabung
penyaring membran yang terpisah atau ke dalam tabung
pengumpul yang terpisah untuk dipindahkan lagi.
Jika jarum steril menyatu dengan alat suntik, keluarkan
langsung isi tiap alat suntik seperti diatas dan lakukan uji
seperti tertera pada Larutan dalam Air. Uji sterilitas
jarum menggunakan prosedur Inokulasi Langsung seperti
tertera pada Uji Kesesuaian Metode.
ZAT PADAT UNTUK INJEKSI
SELAIN ANTIBIOTIK
Konstitusi bahan uji seperti tertera pada etiket dan
lakukan pengujian seperti tertera pada Larutan dalam Air
atau Larutan Minyak. [Catatan Jika perlu, dapat
ditambahkan pengencer berlebih untuk membantu
konstitusi dan penyaringan].
ZAT PADAT ANTIBIOTIK UNTUK INJEKSI
Produk ruahan yang dikemas <5 g Dari 20 wadah,
pindahkan secara aseptik masing-masing lebih kurang
300 mg zat padat ke dalam labu Erlenmeyer steril 500 ml,
larutkan dalam lebih kurang 200 ml Cairan A; atau
konstitusi masing-masing dari 20 wadah, seperti tertera
pada etiket dan pindahkan sejumlah larutan atau suspensi
setara dengan 300 mg zat padat ke dalam labu
Erlenmeyer steril 500 ml, larutkan dalam lebih kurang
200 ml Cairan A. Lakukan uji seperti tertera pada
Larutan dalam Air atau Minyak dan Larutan Minyak.
Produk ruahan yang dikemas 5 g Dari 6 wadah
pindahkan secara aseptik masing-masing lebih kurang 1 g
zat padat ke dalam labu Erlenmeyer steril 500 ml,
larutkan dalam lebih kurang 200 ml Cairan A dan
campur; atau konstitusi masing-masing dari 6 wadah
seperti tertera pada etiket, pindahkan sejumlah larutan
yang setara dengan lebih kurang 1 g zat padat ke dalam
labu Erlenmeyer steril 500 ml, larutkan dalam lebih
kurang 200 ml Cairan A. Lakukan uji seperti tertera pada
Larutan dalam Air.
ZAT PADAT ANTIBIOTIK, RUAHAN
DAN CAMPURAN
Secara aseptik ambil secukupnya zat padat dari sejumlah
wadah yang sesuai (lihat Tabel 2), campur hingga
diperoleh komposit yang setara dengan lebih kurang 6 g
zat padat, dan pindahkan ke dalam labu Erlenmeyer steril
500 ml, larutkan dalam lebih kurang 200 ml Cairan A.
Lakukan uji seperti tertera pada Larutan Air.
SEDIAAN AEROSOL STERIL
Untuk sediaan cair dalam bentuk aerosol bertekanan,
bekukan wadah dalam campuran etanol P-es kering pada
suhu minimal -20 selama lebih kurang 1 jam. Jika
memungkinkan, biarkan propelan menguap sebelum
wadah dibuka secara aseptik, dan pindahkan isinya ke dalam
labu pengumpul steril, tambahkan 100 ml Cairan D ke
dalam labu pengumpul, dan campur perlahan-lahan.
Lakukan uji seperti tertera pada Larutan dalam Air atau
Minyak dan Larutan Minyak.
ALAT KESEHATAN DENGAN LUMEN
BERETIKET STERIL
Secara aseptik alirkan Cairan D sejumlah tidak kurang
dari 10 kali volume lumen alat yang akan diuji.
Kumpulkan cairan ke dalam labu steril yang sesuai, dan
lakukan uji seperti tertera pada Larutan dalam Air atau
Minyak dan Larutan Minyak.
Pada kasus alat suntik steril kosong, ambil pengencer
steril melalui jarum, jika jarum terpasang pada alat, atau
melalui jarum steril yang khusus dipasangkan untuk
pengujian ini, dan tekan isi ke dalam labu pengumpul
steril. Lakukan uji seperti diatas.
Inokulasi Langsung ke dalam Media
Pindahkan sejumlah sediaan uji seperti tertera pada Tabel
2 dan Tabel 3 langsung ke dalam media hingga volume
sediaan tidak lebih dari 10% volume media, kecuali
dinyatakan lain.
Jika sediaan uji mempunyai aktifitas antimikroba,
lakukan uji setelah dinetralisasi dengan bahan penetral
yang sesuai atau dengan cara mengencerkan dalam
sejumlah media yang cukup. Jika diperlukan penggunaan
volume besar dari sediaan, maka lebih baik digunakan
media yang lebih pekat dan dilakukan pengenceran
bertahap. Jika sesuai, media pekat dapat ditambahkan
langsung ke dalam sediaan dalam wadah.
LARUTAN MINYAK
Gunakan media yang telah ditambahkan bahan
pengemulsi yang sesuai dengan kadar seperti tertera pada
Uji Kesesuaian Metode, misalnya polisorbat 80 P
dengan kadar 10 g per liter.
 - 1347 -
SALEP DAN KRIM
Siapkan dengan mengencerkan lebih kurang 1 dalam 10
dengan bahan pengemulsi yang sudah dipilih ke dalam
pengencer steril yang sesuai, seperti Cairan A. Pindahkan
sediaan yang telah diencerkan ke dalam media yang tidak
mengandung bahan pengemulsi.
Inkubasi media yang telah diinokulasi selama tidak
kurang dari 14 hari. Amati biakan beberapa kali, selama
masa inkubasi. Pada saat pengamatan, kocok secara
perlahan biakan pada sediaan yang mengandung minyak
setiap hari. Jika digunakan Media Cair Tioglikolat untuk
mendeteksi mikroba anaerob, tidak boleh dikocok atau
campur perlahan dengan maksud untuk mempertahankan
kondisi anaerob.
BENANG BEDAH DAN ALAT BEDAH LAIN
UNTUK PENGGUNAAN DOKTER HEWAN
Gunakan untuk tiap media tidak kurang dari sejumlah
sediaan seperti tertera pada Tabel 2 dan Tabel 3. Buka
kemasan tersegel secara aseptik, dan masukkan tiga
bagian helaian pada tiap media, lakukan seperti tertera
pada Larutan dalam Air. Lakukan uji terhadap tiga
bagian, panjang masing-masing 30 cm, yang dipotong
dari awal, tengah dan ujung helaian. Gunakan seluruh
helaian dari kemasan yang baru dibuka.
Pindahkan tiap bagian helaian ke dalam media yang
sesuai. Gunakan media yang cukup untuk bahan yang
diuji (20 - 150 ml).
ZAT PADAT
Ambil sejumlah sediaan dalam bentuk kering padat (atau
yang terlebih dahulu dibuat suspensi dalam pengencer
steril dalam kemasan langsung), sesuai dengan jumlah
yang tertera pada Tabel 2 dan Tabel 3. Pindahkan bahan
yang diperoleh ke dalam 200 ml Media Cair Tioglikolat,
dan campur. Dengan cara sama, pindahkan sejumlah
sama ke dalam 200 ml Soybean Casein Digest Medium,
dan campur. Lakukan uji seperti diatas.
KAPAS MURNI, PERBAN, PEMBALUT BEDAH
DAN BAHAN SEJENISNYA
Dari setiap kemasan kapas, perban gulung, atau pembalut
bedah yang besar, ambil secara aseptik dua bagian atau
lebih masing-masing 100 - 500 mg dari bagian paling
dalam. Untuk bahan dengan kemasan tunggal, ambil
secara aseptik seluruh bahan. Rendam bagian dari bahan
ke dalam tiap media, dan lakukan uji seperti diatas.
ALAT KESEHATAN STERIL
Bahan dapat direndam langsung atau diuraikan. Untuk
menjamin bahwa lumen juga kontak dengan media,
rendam sejumlah unit yang sesuai ke dalam sejumlah
volume media yang cukup untuk merendam alat dengan
sempurna, dan lakukan uji seperti diatas.
Untuk alat kesehatan yang sangat besar, rendam bagian
alat yang kontak langsung dengan pasien ke dalam
sejumlah volume media secukupnya yang dapat
membasahi seluruh bagian tersebut.
Untuk kateter yang mempunyai lumen dan bagian luarnya
harus steril, potong menjadi bagian-bagian sehingga
media dapat kontak dengan keseluruhan lumen atau isi
lumen dengan media, dan kemudian rendam unit yang
utuh.
Pengamatan dan Penafsiran Hasil Uji
Pada interval waktu tertentu dan akhir periode inkubasi,
amati secara visual adanya pertumbuhan mikroba dalam
media. Jika bahan uji menimbulkan kekeruhan pada
media sehingga tidak dapat ditetapkan secara visual ada
atau tidaknya pertumbuhan mikroba, 14 hari sejak mulai
inkubasi, pindahkan sejumlah media (tiap tabung tidak
kurang dari 1 ml) ke dalam media segar yang sama,
kemudian inkubasi bersama-sama tabung awal selama
tidak kurang dari 4 hari.
Jika tidak terjadi pertumbuhan mikroba, maka bahan uji
memenuhi syarat sterilitas. Jika terbukti terjadi
pertumbuhan mikroba, maka bahan uji tidak memenuhi
syarat sterilitas, kecuali dapat ditunjukkan bahwa uji tidak
absah disebabkan oleh hal yang tidak berhubungan
dengan bahan uji. Uji dikatakan tidak absah jika satu atau
lebih kondisi dibawah ini dipenuhi:
a. Data pemantauan mikrobiologi terhadap fasilitas uji
sterilitas menunjukkan ketidaksesuaian
b. Pengkajian prosedur uji yang digunakan selama
pengujian menunjukkan ketidaksesuaian
c. Pertumbuhan mikroba ditemukan pada kontrol negatif
d. Setelah dilakukan identifikasi mikroba yang diisolasi
dari hasil uji, pertumbuhan mikroba (beberapa
mikroba) dapat dianggap berasal dari kesalahan pada
bahan uji, atau teknik pengujian yang digunakan pada
prosedur uji sterilitas.
Jika pengujian dinyatakan tidak absah, lakukan uji ulang
dengan jumlah bahan yang sama dengan uji awal. Jika
tidak terbukti terjadi pertumbuhan mikroba pada uji
ulang, maka contoh memenuhi syarat uji sterilitas. Jika
ditemukan pertumbuhan mikroba pada uji ulang, maka
contoh tidak memenuhi syarat uji sterilitas.
Aplikasi Uji untuk Sediaan Injeksi, Sediaan Obat
Mata, dan Sediaan bukan Injeksi yang Harus
Memenuhi Syarat Uji Sterilitas
Jika menggunakan teknik penyaringan membran, bila
memungkinan gunakan seluruh isi wadah, tetapi tidak
kurang dari sejumlah yang tertera pada Tabel 2, encerkan
jika perlu dengan larutan steril yang sesuai, seperti
Cairan A, hingga lebih kurang 100 ml.
Jika menggunakan teknik Inokulasi Langsung ke dalam
media, gunakan sejumlah seperti tertera pada Tabel 2,
kecuali dinyatakan lain. Uji untuk bakteri dan kapang
pada uji sterilitas dilakukan terhadap sediaan uji yang
sama. Jika volume atau jumlah isi dalam satu wadah tidak
 - 1348 -
cukup untuk pengujian, gunakan isi dari dua atau lebih
wadah untuk diinokulasikan ke dalam media berbeda.
Jumlah Minimum Sediaan Uji
Jumlah minimum sediaan yang diuji yang berhubungan
dengan ukuran satu bets, tertera pada Tabel 3.
DESAIN DAN ANALISIS PENETAPAN
HAYATI <81>
Umum
Potensi beberapa obat farmakope harus ditetapkan
dengan uji hayati. Faktor kendali dalam desain pengujian
dan analisis adalah variabilitas sistem uji hayati, yang
respons rata-ratanya dapat bervariasi antar laboratorium
dan dari waktu ke waktu dalam laboratorium yang sama.
Untuk mengendalikan jenis variasi ini, respons obat
farmakope dibandingkan terhadap Baku Pembanding
Farmakope Indonesia atau baku pembanding lain yang
sesuai. Untuk mudahnya, setiap baku pembanding
tersebut disebut Baku dan setiap sediaan yang diuji atau
contoh disebut Uji dan masing-masing akan dinyatakan
dengan simbol S dan U.
Setelah variabel terusut dari pembandingan Baku dan
Uji ditiadakan, variansi kesalahan dihitung dari variasi
yang masih ada, yang meskipun tidak terkendali namun
dapat diukur. Variansi kesalahan diperlukan dalam
menghitung interval keyakinan dari potensi yang diuji.
interval keyakinan juga disebut interval fidusial, dihitung
sedemikian sehingga batas tertinggi dan batas terendah
dari 20 pengujian, diharapkan 19 mendekati potensi
sebenarnya sediaan uji. Banyak prosedur pengujian
menetapkan rentang interval keyakinan yang dapat
diterima, dan mungkin diperlukan dua atau lebih
pengujian independen untuk memenuhi batas yang
disyaratkan. Batas keyakinan dari masing-masing
pengujian komponen umumnya tumpang tindih.
Tujuan dari bab ini ialah menyajikan perhitungan yang
ringkas dari prosedur biometri untuk uji hayati
Farmakope Indonesia, dengan berbagai bagiannya saling
berhubungan. Meskipun prosedur dirancang terutama
untuk pengujian sediaan tunggal, persamaan untuk
pengujian gabungan dari beberapa sampel diberikan
dalam bab ini dan disimpulkan dalam bagian akhir. Bukti
bahwa pengujian potensi memenuhi syarat batas
keyakinan, juga dapat didasarkan pada metode biometri
lain yang mempunyai presisi sama dengan metode yang
tertera disini.
Tabel istilah dalam persamaan yang digunakan
diberikan pada akhir bab ini.
Langkah-langkah yang diperlukan
untuk Perhitungan Potensi
Desain untuk memperkecil variansi kesalahan
Variasi respons sedapat mungkin dikurangi dengan
pembatasan bobot badan, umur, penanganan awal,
lingkungan dan faktor-faktor sejenis. Pada sejumlah
pengujian, hewan percobaan atau yang setara
ditempatkan secara acak tetapi dalam jumlah sama untuk
dosis-dosis berbeda dari Baku dan Uji. Hal ini dilakukan
melalui proses acak yang objektif. Penyusunan jumlah
individu yang sama pada tiap perlakuan
menyederhanakan perhitungan-perhitungan berikutnya, dan
umumnya mengarahkan ke interval keyakinan yang
terpendek untuk sejumlah pengamatan yang telah
ditentukan.
Pada beberapa pengujian, respons potensial dapat
dihimpun dalam kelompok homogen di awal perlakuan.
Perbedaan diantara kelompok, kemudian dipisah sehingga
tidak berpengaruh buruk terhadap potensi maupun
interval keyakinan. Satu unit dalam setiap kelompok yang
diambil secara acak mengalami tiap perlakuan. Contoh
kumpulan acak adalah daerah-daerah bening di dalam
satu lempeng pada pengujian antibiotik, dan 4 pembacaan
berpasangan berurutan pada tikus yang sama dalam
pengujian injeksi vasopresin. Dua kelompok diperoleh
jika setiap hewan percobaan digunakan dua kali, seperti
pada penetapan potensi injeksi tubokurarin klorida dan
injeksi insulin. Dalam hal ini baik perbedaan rata-rata di
antara individu maupun urutan perlakuan tidak dapat
menyebabkan penyimpangan potensi atau presisi. Pada
penetapan aktivitas vitamin B12 dan kalsium pantotenat
secara mikrobiologi, tabung replikasi ditempatkan pada
dua atau lebih kelompok lengkap yang terpisah, disusun
secara acak dalam tiap kelompok. Hal ini membatasi
variasi yang disebabkan posisi atau urutan dalam satu
kelompok menjadi perbedaan dalam setiap replikat
lengkap.
Peniadaan data pengamatan yang menyimpang
Respons yang menyimpang karena tidak memenuhi
prosedur selama penetapan, dikeluarkan. Nilai
menyimpang yang lain mungkin ditemukan setelah
respons ditabulasi, tetapi kemudian dapat dihubungkan
dengan ketidakteraturan uji, yang membenarkan
peniadaan nilai tersebut. Peniadaan respons yang tampak
menyimpang dapat menjadi sumber bias. Secara umum,
peniadaan data pengamatan hanya berdasarkan besaran
relatif adalah prosedur yang sebaiknya dihindari. Jika hal
ini tidak dapat dihindarkan, maka tiap respons yang
dicurigai menyimpang dapat diuji dengan salah satu dari
dua kriteria:
1. Kriteria pertama berdasarkan pada variasi di dalam
kelompok tunggal dengan respons yang diduga setara.
Secara umum, satu data pengamatan yang absah dari 25
atau 50 kali percobaan akan ditolak, sepanjang respons
yang identik dalam kelompok relatif sedikit. Mulai
dengan nilai yang diduga menyimpang, susun respons
dalam urutan besaran dari y ke yN, N adalah banyaknya
pengamatan di dalam kelompok. Hitung perbedaan relatif
( y 2 y1 )
G1
( y N y1 )
jika N = 3 hingga 7,
 - 1349 -
( y 3 y1 )
G2
( y N 1 y1 )
jika N = 8 hingga 13 atau
( y3 y1 )
G2
( y N 2 y1 )
jika N = 14 hingga 24
Jika G1, G2 atau G3 melampaui nilai kritis dalam Tabel 1
untuk N yang diamati, maka secara statistik nilai
menyimpang dapat ditiadakan.
Kriteria ini juga dapat diterapkan dalam penetapan
mikrobiologi yang tiap perlakuan ditunjukkan oleh
transmitans dalam tiap dua kelompok lengkap terpisah.
Kurangi tiap transmitans dalam kelompok pertama
dengan nilai pasangannya dalam kelompok kedua, dan
rekam tiap perbedaan dengan tanda positif atau negatif.
Mulai dari perbedaan yang paling besar, susun N
perbedaan dalam urutan besaran dari y1 hingga yN dan
hitung perbedaan relatif G1, G2 atau G3. Jika melampaui
nilai kritis dalam Tabel 1, maka satu dari dua transmitans
memberikan perbedaan yang diduga menyimpang dan
dapat diidentifikasi dengan pemeriksaan atau
membandingkan dengan nilai yang diharapkan (lihat
kolom berikut). Ulangi proses dengan perbedaan yang
masih tersisa bila suatu nilai yang menyimpang
diperkirakan ada di pasangan kedua.
2. Kriteria kedua membandingkan rentang dari satu
seri k = 2 kelompok atau lebih. Kelompok yang berbeda
dapat mengalami perlakuan yang berbeda, tetapi semua f
respons dalam tiap kelompok mewakili perlakuan yang
sama. Hitung rentang tiap kelompok dengan cara respons
tertinggi dikurangi respons terendah dalam masing-
masing dari k kelompok. Nilai rentang k terbesar dibagi
dengan jumlah semua rentangan yang ada dalam seri
adalah R*. Rujuk R* ini kepada Tabel 2. Jika k tidak lebih
besar dari 10, gunakan nilai dari bagian atas Tabel 2; bila
k lebih besar dari 10, kalikan R* dengan (k + 2) dan bila
perlu interpolasikan di antara nilai-nilai dari bagian
bawah Tabel 2. Jika R* melebihi nilai tabel atau hasil
interpolasinya, kelompok dengan rentang terbesar
dicurigai dan pemeriksaan komponennya biasanya akan
mengidentifikasi pengamatan yang diperkirakan
menyimpang. Proses dapat diulangi dengan rentangan
yang tersisa apabila diduga ada yang menyimpang di
kelompok kedua.
Penggantian nilai yang hilang Sebagaimana
disebutkan dalam monografi dan pada bab ini,
perhitungan potensi dan interval keyakinan dari respons
total untuk tiap dosis sediaan memerlukan jumlah
pengamatan yang sama dalam tiap respons total. Jika
pengamatan hilang atau diperoleh respons tambahan dari
baku, maka kesetimbangan dapat diperbaiki dengan satu
dari prosedur berikut hingga dapat digunakan persamaan
yang biasa.
1. Kurangi jumlah pengamatan dalam kelompok yang
lebih besar sehingga jumlah respons sama untuk tiap
perlakuan. Jika hewan ditetapkan secara acak pada tiap
kelompok perlakuan, maka tiadakan satu atau lebih
respons yang dipilih secara acak dari tiap kelompok yang
lebih besar, atau kurangkan harga rata-rata tiap kelompok
yang lebih besar dari total awal bila diperlukan. Teknik
yang disebut terakhir lebih disukai jika dengan sengaja
menambahkan hewan berlebih ke dalam kelompok baku.
Bila penetapan terdiri dari kumpulan acak, maka gunakan
hanya kumpulan yang lengkap.
2. Sebagai alternatif kadang-kadang kelompok yang
lebih kecil dapat digunakan bila jumlah respons yang
hilang tidak lebih dari satu dalam suatu perlakuan atau
10% dalam keseluruhan penetapan. Penggantian untuk
setiap nilai yang hilang dapat diperkirakan dengan
metode a atau metode b. Satu derajat bebas (n)
dihilangkan dari variansi kesalahan s2 untuk tiap
penggantian dengan metode manapun kecuali pada
penetapan mikrobiologi yang setiap respons berdasarkan
pada jumlah dari dua transmitans atau lebih dan hanya
satu transmitants yang diganti.
(a) Jika hewan telah digunakan untuk perlakuan
secara acak, tambahkan rata-rata respons sisa dalam
kelompok yang tidak lengkap kepada totalnya. Pada
penetapan mikrobiologi, bila satu dari dua transmitans
hilang pada suatu perlakuan, tambahkan perbedaan rata-
rata di antara kelompok, dihitung dari semua pasangan
yang lengkap, kepada transmitans yang tersisa untuk
memperoleh pengganti.
(b) Jika penetapan terdiri dari kumpulan acak, ganti
nilai yang hilang dengan:
fT ' r kT 't T '
y' (1)
( f 1)( k 1)
f adalah banyaknya kelompok; k adalah banyaknya
perlakuan atau dosis dan Tr , Tt dan T berturut-turut
adalah nilai total untuk kumpulan acak, perlakuan dan
penetapan yang didalamnya ada pengamatan yang hilang.
Jika penetapan terdiri dari n kuadrat Latin dengan k baris
yang bersamaan, nilai yang hilang diganti dengan:
k ( n ' T ' c T r ' Tt '
y' (1 a)
( k 1)( n ' k 1)
n adalah banyaknya kuadrat Latin dengan k baris yang
bersamaan, k adalah jumlah perlakuan atau dosis dan Tc,
Tr, Tt dan T berturut-turut adalah total tidak lengkap
untuk kolom, baris, perlakuan dan penetapan yang di
dalamnya ada pengamatan yang hilang.
Jika lebih dari satu nilai yang hilang, substitusi rata-
rata perlakuan untuk sementara pada semua tempat
kecuali dari tempat kosong, dan hitung y untuk yang
lainnya dengan persamaan 1. Ganti tiap subtitusi awal
dengan persamaan 1 dan ulangi proses dengan perkiraan
berturut-turut hingga diperoleh y yang tetap untuk tiap
pengamatan yang hilang.
 - 1350 -
Tabel 1

Uji untuk nilai penyimpangan. Dalam contoh dari populasi normal, perbedaan sama atau lebih besar dari nilai G1, G2 adan
G3 dengan probabilitas P = 0,02 nilai yang menyimpang dapata terjadi hanya pada satu ujung atau dengan P = 0,04 nilai-
nilai yang menyimpang dapat terjadi pada kedua ujung.

N 3 4 5 6 7
G1 0,976 0,846 0,729 0,644 0,586
N 8 9 10 11 12 13
G2 0,780 0,725 0,678 0,638 0,586 0,578
N 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
G3 0,602 0,579 0,559 0,542 0,527 0,514 0,502 0,491 0,481 0,472 0,464

Tabel 2

Uji untuk kumpulan yang mengandung nilai penyimpangan. Hitung rentang dari f pengamatan dalam tiap k kelompok,
semua kelompok dalam suatu seri sama ukurannya. Perbandingan R* dari rentang terbesar terhadap jumlah k rentangan yang
diamati akan sama atau lebih besar dari nilai-nilai kritik berikut pada probabilitas P = 0,0.

Jumlah
R* kritis untuk rentangan masing-masing dari f pengamatan
rentang
k 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2 0,962 0,862 0,803 0,764 0,736 0,717 0,702 0,691 0,682
3 0,813 0,667 0,601 0,563 0,539 0,521 0,507 0,498 0,489
4 0,681 0,538 0,479 0,446 0,425 0,410 0,398 0,389 0,382
5 0,581 0,451 0,398 0,369 0,351 0,338 0,328 0,320 0,314
6 0,508 0,389 0,342 0,316 0,300 0,288 0,280 0,273 0,267
7 0,451 0,342 0,300 0,278 0,263 0,253 0,245 0,239 0,234
8 0,407 0,305 0,267 0,248 0,234 0,225 0,218 0,213 0,208
9 0,369 0,276 0,241 0,224 0,211 0,203 0,197 0,192 0,188
10 0,339 0,339 0,220 0,202 0,193 0,185 0,179 0,174 0,172
Jumlah (k + 2) R* kritis untuk rentangan masing-masing dari f pengamatan
rentang
k 2 3 4 5 6 7 8 9 10
10 4,06 3,04 2,65 2,44 2,30 2,21 2,14 2,09 2,05
12 4,06 3,03 2,63 2,42 2,29 2,20 2,13 2,07 2,04
15 4,06 3,02 2,62 2,41 2,28 2,18 2,12 2,06 2,02
20 4,13 3,03 2,62 2,41 2,28 2,18 2,11 2,05 2,01
50 4,26 3,11 2,67 2,44 2,29 2,19 2,11 2,06 2,01
 - 1351 -
Perhitungan Potensi dari Penetapan Tunggal
Petunjuk untuk perhitungan potensi dari data
penetapan tunggal tertera pada masing-masing
monografi. Dalam penetapan yang menekankan pada
interpolasi dari kurva dosis-respons dan memenuhi
kondisi untuk keabsahan uji yang ditetapkan berikut,
potensi dapat dihitung dengan metode yang sesuai
dengan bab ini.
Perencanaan penetapan meliputi perkiraan potensi
sediaan uji agar dapat digunakan dosis yang setara
dengan baku. Semakin dekat kebenaran perkiraan asal
dengan hasil penetapan, semakin tepat perhitungan
potensi. Perbandingan dosis tertentu dari baku, dalam g
atau unit FI terhadap dosis sediaan uji yang
bersangkutan dihitung seperti tertera pada monografi,
secara seragam dinyatakan sebagai R. Log potensi relatif
dalam jumlah perkiraan awal sama dengan baku
dinyatakan sebagai M. Secara ideal, M tidak berbeda
secara signifikan dari nol. Log potensi adalah:
M = M + log R (2)
atau
Potensi = P* = antilog M = (antilog M)R
Penetapan dari Penentuan Langsung Dosis
Ambang Perbandingan dosis ambang rata-rata baku dan
sediaan uji memberikan potensi secara langsung. Dosis
ambang ditetapkan dua kali pada setiap hewan, satu kali
dengan baku dan satu kali dengan sediaan uji. Tiap dosis
dikonversi kepada harga logaritmanya, perbedaan (x)
antara kedua log-dosis ditetapkan untuk setiap hewan,
dan potensi dihitung dari rata-rata perbedaan tersebut.
Pada Uji Endotoksin Bakteri <201>, rata-rata
geometrik titik akhir pengenceran untuk sediaan uji
sesuai baku (dikalikan dengan faktor pengenceran, bila
dapat digunakan), memberikan kadar endotoksin dalam
sediaan uji.
Pada penetapan ini, interval fidusial tergantung pada
variabilitas dosis ambang.
Penetapan tidak langsung dari hubungan antara
log dosis dan respons Umumnya dosis ambang tidak
dapat diukur secara langsung; oleh karena itu, potensi
ditetapkan secara tidak langsung dengan
membandingkan respons dari dosis baku yang diketahui
dengan satu atau lebih dosis yang sama dari sediaan uji.
Dalam rentang dosis yang terbatas, biasanya suatu
respons yang sesuai dapat digambar sebagai suatu garis
lurus terhadap log-dosis, merupakan kondisi yang
menyederhanakan perhitungan potensi dan interval
keyakinan. Kemiringan dan posisi hubungan log-dosis
respons ditentukan dalam setiap penetapan dengan
menggunakan dua atau lebih tingkat dosis baku atau
lebih baik dikehendaki meliputi baku maupun sediaan
uji.
Pada penetapan heparin natriun, interval antara dosis
yang menghasilkan penjedalan dan yang tidak adalah
sedemikian kecil sehingga kurva dosis-respons tidak
ditentukan secara tegas. Rata-rata yang bergerak
digunakan sebagai ganti intepolasi log-dosis yang
menyebabkan 50% penjendalan baik pada baku maupun
sediaan uji yang menuntun ke log potensi (seperti tertera
pada perhitungan Heparin Natrium). Presisi potensi
diperkirakan dari kesuaian diantara penetapan yang
berdiri sendiri dari kesediaan uji yang sama.
Untuk obat yang ditetapkan secara hayati, kurva
respons terhadap log-dosis pada rentang dosis yang
memadai, harus berupa garis lurus. Jika diperlukan uji
pendahuluan atau penetapan tergantung pada interpolasi
dari kurva multi-dosis baku, gambarkan di kertas
koordinat kurva respons rata-rata baku tiap tingkat dosis
pada ordinat terhadap log-dosis x pada absis. Jika secara
prinsip garis cenderung linier dalam rentang dosis yang
ditentukan, maka unit respons awal dapat digunakan
langsung sebagai y; jika garis jelas merupakan
lengkungan, transformasi yang sesuai tiap pembacaan
awal dapat menghasilkan linieritas.
Salah satu transformasi yang mungkin ialah logaritma;
cara lain pada penetapan mikrobiologi cara tabung, y =
(100 - % transmitans) yang terhadap log-dosis x tidak
membentuk garis linier, maka diubah ke nilai probit.
Dalam hal ini bila serapan tidak dapat dibaca langsung,
maka % transmitans untuk tiap tabung atau larutan uji
lebih dulu diubah menjadi serapan: A = 2- log (%
transmitans). Setiap nilai serapan kemudian diubah
menjadi % pengurangan pertumbuhan bakteri sebagai:
100 ( AC A )
% penguranga n
AC
c adalah kerapatan rata-rata untuk tabung kontrol
(tanpa antibiotik atau dengan vitamin berlebih) dalam
kelompok atau rak tabung yang sama. Persentase
pengurangan kemudian diubah ke dalam nilai probit
seperti tertera pada Tabel 3 hingga diperoleh harga y
yang baru untuk semua perhitungan selanjutnya.
Transformasi probit memberikan keuntungan dalam hal
memperlebar rentang kerja dari linieritas, bahkan bila
sebagian dari hubungan dosis-respons tidak linier dalam
unit asal dari 100% transmitans, asalkan masa inkubasi
tidak diperpanjang melewati fasa logaritma pertumbuhan
dalam tabung kontrol.
LD50 pada Uji keamanan injeksi besi dekstran
dihitung menggunakan log-dosis dan probit. Keempat
dosis injeksi dalam mg besi per kg bobot badan diubah
menjadi x1 = 2,574, x2 = 2,699, x3 = 2,875 dan x4 =
3000. Nilai probit sesuai jumlah kematian yang diamati
dalam tiap kelompok 10 tikus dinyatakan berturut-turut
sebagai y1, y2, y3 dan y4 dan diberikan pada Tabel 3
untuk kematian dari 10% hingga 90%. Untuk kematian
yang diamati dari 0 dan 10 terdekat ke dosis yang
menyebabkan separuh kematian gunakan pendekatan
probit berturut-turut 3,02 dan 6,98; hilangkan nilai akhir
(pada x1 atau x4) bila tidak berdekatan dengan separuh
kematian. Oleh karena informasi dalam probit bervariasi
dengan yang diharapkan, tetapkan pendekatan bobot
relatif w tiap probit, untuk menghitung LD50 injeksi
seperti diperlihatkan pada tabel berikut.
 - 1352 -
Tabel 3
Probit (deviasi normal + 5) sesuai dengan persentase dalam margin

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66
10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12
20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45
30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72
40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97
50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23
60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50
70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81
80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23
90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
99
7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09

Tabel 4
Koefisien x * untuk menghitung respons YL dan YH diperkirakan oleh kuadrat terkecil pada k log-dosis nilai terendah dan
tertinggi jika ditempatkan pada interval yang sama.

Jumlah Y akhir yang 1 2 3 4 5 6 Pembagi

Dosis diperkirakan
3 YL 5 2 -1 6
YH -1 2 5 6
4 YL 7 4 1 -2 10
YH -2 1 4 7 10
5 YL 3 2 1 0 -1 5
YH -1 0 1 2 3 5
6 YL 11 8 5 2 -1 -4 21
YH -4 -1 2 5 8 11 21

LD50 untuk uji keamanan ini, dalam mg besi per kg

bobot tubuh, dihitung dengan rumus:
Jumlah 0 atau 10 1 atau 9 2 atau 8 3 atau 4 atau 6

kematian 6 LD 50 anti log( x ( 5 y ) / b ) (2c)
Bobot, w 0,3 0,7 1,0 1,2 1,3
Pada penetapan kuantal yang tidak termasuk dalam
Hitung rata-rata yang tertimbang Farmakope ini, seperti penetapan insulin dengan mencit,
perhitungan dengan probit meliputi pengaturan lain yang
( wx ) tidak tercantum di sini.
x
Jika kurva respons rata-rata Y t dari tiap dosis baku
terhadap log-dosis berbentuk linier, dan k dosis
dan ditempatkan dalam interval yang sama pada skala
( wy ) logaritma, respons yang diperkirakan (YL dan YH) pada
y
(2a) ujung dari garis yang paling sesuai dapat langsung
dihitung dengan koefisien x * dari Tabel 4, yang sesuai
dari jumlah bobot, w, empat (atau tiga) respons yang dengan k log-dosis yang berturutan, dengan rumus:
dapat diterima dalam jumlah log-dosis tertimbang yang
sama, (wx), dan dari probit, (wy). Dari jumlah

produk tertimbang , (wxy)1 dan kuadrat tertimbang, ( x y1 )

YL
(wx2), hitung kemiringan b dari garis log-dosis probit pembagi
dengan rumus: dan


( wxy ) x ( wy ) ( x y1 )
b (2b) YH
( wx 2 ) x ( wx ) pembagi
 - 1353 -
berarti jumlah dari nilai-nilai yang mengikutinya. Jika Penetapan Potensi Antibiotik secara Mikrobiologi
dibuat kurva YL dan YH terhadap log-dosis rendah dan <131>, kemiringan b dari garis lurus yang paling sesuai
tinggi, XL dan XH, nilai-nilai tersebut dapat dihubungkan dapat dihitung dengan ketentuan dalam Tabel 5 dan
dengan suatu garis lurus dengan kemiringan: respons rata-rata pada tiap dosis atau Tt = f yang
jumlah ys(f) adalah tetap untuk tiap dosis, sebagai:
(Y H Y L )
b
(X H X L )
(4) ( x1 y t ) x 1T t (6)
b '
'
Pada suatu log-dosis x baku yang dipilih respons yang eb i fe b i
diperkirakan adalah: Koefisien x1 adalah faktor pengali yang baik dari
pembedaan (x- ) di sekitar log-dosis rata-rata , dan ebi
Y y b( x x) (5)
adalah faktor pengali yang sesuai dari (x- )2. Respon
Y perkiraan pada suatu log-dosis X dapat dihitung
= (x)/k, dan = (YL+ YH)/2 atau untuk perkiraan di
dengan mensubtitusi kemiringan penetapan b dalam
dalam suatu kumpulan, y adalah respons rata-rata untuk
persamaan 5 dan rata-rata baik dari semua respons
baku dalam kumpulan.
Jika hubungan log-dosis respons adalah linier, tetapi k baku pada seluruh penetapan ataupun dari tiap kumpulan
dosis (dinyatakan dalam ml) terletak dalam urutan secara terpisah.
arimatik seperti dalam Tabel 5 (yang merujuk pada

Tabel 5
Koefisien x1 untuk menghitung kemiringan b dari kurva log-dosis respons jika dosis ditempatkan pada skala arimetik

Koefisien x1 untuk menghitung b dari respons y pada dosis,

Jumlah dalam ml Pembagi ebi Log dosis
dosis 1 1,5 2 3 4 5 rata-rata
4 - -29 -12 12 29 - 14,4663 0,38908
5 -34 - -9 5 15 23 24,7827 0,41584
5 - -20 -11 2 11 18 13,3249 0,45105
6 -15 -8 -3 4 9 13 14,1017 0,37588

POTENSI YANG DIINTERPOLASI
DARI KURVA BAKU
Jika kurva log-dosis respons baku suatu penetapan
merupakan garis lengkung dan secara grafik
menghubungkan titik-titik, jumlah baku yang diharapkan
menghasilkan tiap respons y yang diamati dari sediaan
uji diperkirakan dengan jalan interpolasi dari kurva dan
kemudian ditentukan kadar dari larutan uji tersebut.
Jika respons baku dapat dibuat linier terhadap log-
dosis, maka secara numerik dihubungkan oleh garis
lurus, seperti dijelaskan pada bagian terdahulu. untuk
penetapan dalam kumpulan acak, kurva baku dihitung
dengan b untuk penetapan dan untuk untuk tiap
kumpulan dan respons yU dalam tiap tabung sediaan uji
dalam kumpulan tersebut diubah ke log-potensi relatif
perkiraan.
( yU YS )
X (7)
b
YS adalah respons yang diperkirakan dengan kurva baku
pada log-dosis x perkiraan sediaan uji. Rata-rata
perkiraan terpisah setiap f kumpulan, M = X/f adalah
log-potensi relatif sediaan uji.
 - 1354 -
Tabel 6

Koefisien faktorial x1 untuk analisis uji hayati tertimbang, log-dosis baku yang berturutan (Si) dan sediaan uji
(Ui) dipilah sama, masing-masing dengan banyaknya respons yang sama (f) yang mempunyai jumlah
keseluruhan Tt

Koefisien faktorial x1 untuk tiap dosis

Desain Baris S1 S2 S3 S4 U1 U2 U3 U4 ei Ti
2,2 a -1 -1 1 1 4 T
b -1 1 -1 1 4 Ta
ab 1 -1 -1 1 4 Tbab
3,3 a -1 -1 -1 -1 -1 1 6 T
b -1 0 1 1 0 1 4 Ta
ab 1 0 -1 -1 0 1 4 Tb
q 1 -2 1 1 -2 1 12 Tab
aq -1 2 -1 -1 -2 1 12 Tqaq
4,4 a -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 8 T
b -3 -1 1 3 -3 -1 1 3 40 Ta
ab 3 1 -1 -3 -3 -1 1 3 40 Tb
q 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 8 Tab
aq -1 1 1 -1 1 -1 -1 1 8 Tqaq

Untuk Persamaan Tetapan Nilai tetapan untuk Desain

menghitung No. 2,2 3,3 4,4
M 8,10 c 1 4/3 5
L 26,29 c 1 8/3 5

Penetapan faktorial dari respons tiap perlakuan Jika

beberapa fungsi dari respons dapat dibuat linier terhadap
log-dosis, potensi yang diuji dihitung dari respons total
untuk tiap perlakuan dan presisinya diukur berdasarkan
interval keyakinan. Hal ini memerlukan (1) dalam unit
yang sesuai respons y bergantung secara linier pada log-
dosis dalam rentang dosis penetapan dan (2) banyaknya
(f) respons adalah sama pada setiap tingkat dosis, baik
baku maupun sediaan uji. Nilai y dijumlah pada tiap
tingkat dosis setiap sediaan. Pada kombinasi yang
berbeda, total keseluruhan, Tt, menunjukkan secara
langsung log-potensi relatif dan keabsahan penetapan
uji. Koefisien faktorial pada Tabel 6, 7 dan 8
menunjukkan cara penggabungannya. Dalam suatu baris
tertentu tiap Tt dikalikan dengan koefisien yang
bersangkutan dan hasil kali dijumlahkan untuk
memperoleh Ti Ti dalam baris-baris berikutnya
mempunyai arti yang sama dalam semua penetapan.
Ta dalam baris pertama mengukur perbedaan dalam
respons rata-rata baku dalam sediaan uji. Tb dalam baris
kedua mengantarkan secara langsung kepada kemiringan
gabungan dari kurva dosis-respons untuk baku dan
sediaan uji. Baris ketiga sampai kelima (ab, q dan aq)
digunakan untuk menguji keabsahan penetapan, seperti
diterangkan pada bagian lebih lanjut. Dari total Ta dan
Tb, hitung log-potensi relatif sediaan uji, sebelum
disesuaikan untuk potensi perkiraannya sebagai:
M ' ciTa / Tb (8)
i adalah interval dalam logaritma antara log-dosis yang
berurutan baik baku maupun sediaan uji dan tetapan c
diberikan terpisah dbagian bawah tiap Tabel . Setiap M
dikoreksi menjadi log-potensi M dengan persamaan 2.
Jika dosis-dosis ditempatkan tidak sama pada skala log
seperti dalam Tabel 8, sebagai gantinya gunakan tetapan
ci pada bagian bawah Tabel.
Dalam penetapan kadar yang seimbang, seperti pada
penetapan kortikotropin, hitung M dengan koefisien
dalam Tabel 6. Jika satu sediaan mempunyai kurang satu
dosis dari yang lainnya tetapi log-dosis yang berturutan
dari baku dan sediaan uji keduanya mempunyai selisih
sebesar tetapan interval i, gunakan koefisien faktorial
pada Tabel 7, untuk koreksi perbedaan sebenarnya
diantara log-dosis rata-rata yang diamati,
hitung dengan rumus:
M ' xS xU M ' (9)
 - 1355 -
Tabel 7

Koefisien faktorial x1 untuk menganalisis penetapan tertimbang pasrsial log-dosis baku yang berturutan (S) dan sediaan uji
(U1) dipilah sama, masing-masing dengan banyaknya (f) respons yang sama dengan jumlah keseluruhan Tt. Jika banyaknya
dosis yang berurutan dari sediaan uji lebih satu dari banyaknya pada baku, tukar tempat S1 dan U1 dalam judul dibalikkan
semua tanda dalam baris a, ab dan aq.

Koefisien factorial x1 untuk tiap dosis

Desain Baris S1 S2 S3 S4 U1 U2 U3 ei Ti
2,1 a -1 -1 2 1 6 Ta
b -1 1 0 1 2 Tb

3,2 a -1 -1 -1 -1 -1 1 6 T
b -1 0 1 1 0 1 4 Ta
ab 1 0 -1 -1 0 1 4 Tb
q 1 -2 1 1 -2 1 12 Ta

4,3 a -3 -3 -3 -3 4 4 4 84 T
b -3 -1 1 3 -2 0 2 28 Ta
ab 3 1 -1 -3 -5 0 5 70 Tb
q 3 -3 -3 3 2 -4 2 60 Tab
aq -1 1 1 -1 1 -2 1 10 Tqaq

Untuk Persamaan Tetapan Nilai tetapan untuk Desain

menghitung No. 2,1 3,2 4,3
M 8,10 c 1/2 5/6 7/6
L 26,29 c 25/12 49/12

Pada penetapan dengan dosis yang berturutan tidak
ditempatkan dalam log-interval yang sama, log-potensi relatif
dari sediaan uji tunggal dapat dihitung dengan persamaan 8
dengan koefisien faktorial dan ei pada Tabel 8.
Pada penetapan dengan dua atau lebih sediaan uji
menggunakan baku yang sama, dengan garis dosis-
respons yang sejajar di dalam kesalahan eksperimental,
tiap log-potensi relatif dapat dihitung dengan kemiringan
penetapan yang sama sebagai berikut: Untuk tiap
sediaan, tentukan faktor kemiringan Tb = (x1Tt) atau
(x1Y), harga-harga x1 adalah koefisien faktorial untuk
baku dalam baris
yang sesuai b dari Tabel 6 atau Tabel 8. Log-potensi
relatif dari tiap sediaan uji adalah:
M ' cih'Ta / 2 Tb ' (10)
h adalah banyaknya harga-harga Tb, yang dijumlahkan
dalam denominator.
Penetapan dari perbedaan respons Jika dosis baku
dan sediaan uji dibuat berpasangan dan perbedaan
respons dihitung untuk tiap pasangan, perbedaan ini
tidak dipengaruhi oleh variasi dalam kepekaan rata-rata
pembacaan pasangan. Penetapan insulin dengan 2 dosis
yang dibuat berpasangan, sesuai dengan desain pertama
dalam Tabel 6, dan memerlukan empat kumpulan kelinci
yang sama, masing-masing disuntik dua kali seperti
tertera pada Penetapan Potensi Insulin <161>.
Perbedaan (y) dalam respons gula darah dari tiap kelinci
terhadap kedua perlakuan mengarah ke log-potensi
relatif M (lihat dua paragraph pertama dari bab
Perhitungan potensi dari penetapan tunggal). Injeksi
Oktositosin ditetapkan berdasarkan perubahan tekanan
darah pada hewan percobaan tunggal setelah
penyuntikan bergantian dari dosis tunggal baku dan satu
dari dua dosis sediaan uji. Perhitungan potensi dari
perbedaan respons sedian uji dan rata-rata dari dua
respons yang berdekatan baku adalah setara dengan
desain pertama pada Tabel 7 dengan membalikkan S dan
U, I adalah log-interval di antara dua tingkat dosis
sediaan uji.
 - 1356 -
Tabel 8

Koefisien faktorial x1 untuk menganalisis penetapan dengan sekuen 3- atau 4-dosis sebesar 1,5; 2,0; 3,0 dan 4,0 tiap dosis
mempunyai banyak respons (f) yang sama

Dosis Baku Dosis sediaan Uji

Desain Baris 1,5 2,0 3,0 4,0 1,5 2,0 3,0 4,0 ei Ti
4,4 a -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 8 T
b -29 -12 12 29 -29 -12 12 29 3940 Ta
ab 29 12 -12 -29 -29 12 12 29 3940 Tb
q 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 8 Tab
aq -1 1 1 -1 1 -1 -1 1 8 Tqaq

3,3 a -1 -1 -1 1 1 1 6 Ti
b -25 -3 28 -25 -3 28 2836 T
ab 25 3 -28 -25 -3 28 2836 Ta
q 31 -53 22 31 -53 22 8508 Tb
aq -31 53 -22 31 -53 22 8508 Tab
Tqaq

3,3 a -1 -1 -1 1 1 1 6 T
b -28 3 25 -28 3 25 2836 Ta
ab 28 -3 -25 -28 3 25 2836 Tb
q 22 -53 31 22 -53 31 8508 Tab
aq -22 53 -31 22 -53 31 8508 Tqaq

Kesalahan Eksperimental dan Uji Keabsahan
Penetapan Istilah yang digunakan di sini, kesalahan
eksperimental, merujuk ke variasi sisa dalam respons
dari indikator biologik, bukan untuk kesalahan dalam
prosedur atau untuk nilai menyimpang yang memerlukan
penggantian. Kesalahan eskperimental diukur berkenaan
dengan variansi kesalahan pada respons tunggal atau
unit lain, yang dinyatakan secara seragam sebagai s2,
meskipun ada perbedaan dalam definisi unit. Hal ini
diperlukan dalam uji keabsahan penetapan dan dalam
menghitung interval keyakinan.
Variansi Kesalahan Dosis Ambang Masing-masing
dosis ambang diukur secara langsung dalam beberapa
penetapan. Pada penetapan Digitalis masing-masing
dosis ambang dinyatakan dengan simbol z, banyaknya
atau frekuensi z oleh f, dan jumlah dari z untuk tiap
sediaan oleh T, dengan subskrip S dan U masing-masing
untuk baku dan sediaan uji. Hitung variansi kesalahan
dari z sebagai:
T
2
T S2
z 2
fS
U
fU
kesalahan tunggal dari kombinasi deviasi y sekitar rata-
s2 (11)
n
n = fS + fU - 2 derajat bebas. Dalam penetapan lain, tiap
log-dosis ambang sediaan uji yang diinjeksikan
dikurangi log-dosis baku yang bersangkutan pada kelinci
yang sama untuk memperoleh perbedaan individual x.
Karena tiap x mungkin positif atau negatif (+ atau ),
maka perlu diperhatikan tanda yang benar pada semua
penjumlahan. Nyatakan total x untuk hewan yang
diinjeksi dengan baku pada hari kedua sebagai T2.
Hitung variansi kesalahan dari x dengan n = N 2
derajat bebas sebagai:
T 2 T2
2
x S
2
f
s2 (12)
n
N adalah total jumlah kelinci untuk menyelesaikan
penetapan, tidak termasuk penggantian nilai hilang
untuk menyelamatkan ukuran dari dua kumpulan.
Variasi kesalahan dari Respons Individual Pada
penetapan di farmakope, perbedaan dalam dosis yang
mengubah respons rata-rata diperkirakan tidak
mempengaruhi variabilitas dalam respons. Perhitungan
variansi kesalahan tergantung pada desain penetapan dan
bentuk pengaturan untuk setiap nilai yang hilang. Tiap
respons lebih dulu diubah ke dalam unit y yang
digunakan dalam menghitung potensi. Tentukan variansi
rata untuk tiap tingkat dosis, jumlahkan untuk setiap
tingkat. Nilai y yang meragukan dapat diuji seperti
dijelaskan pada Peniadaan data pengamatan yang
menyimpang, dan nilai menyimpang yang telah terbukti
dapat diganti sebagai nilai yang seperti tertera pada
Penggantian nilai yang hilang.
Dalam desain yang paling sederhana, unit respons
 - 1357 -
diatur secara acak untuk tiap tingkat dosis, seperti pada f(Tr) menunjukkan sumber variasi yang tidak
penetapan kortikotropin. Jika nilai yang hilang diganti mempengaruhi potensi yang diperkirakan dan oleh sebab
dengan menambahkan rata-rata y yang tersisa pada suatu itu dikeluarkan dari kesalahan penetapan. Hitung
tingkat dosis kepada totalnya, maka derajat bebas (n) perkiraan variansi kesalahan dari kuadrat masing-masing
pada variansi kesalahan dikurangi dengan satu untuk tiap y dan jumlah marginal, sebagai:
penggantian, tetapi tidak diperlukan perubahan lain
dalam perhitungan. Dengan menganggap bahwa f sama
T T T2
2 2
untuk semua dosis atau kelompok, hitung variansi y 2 t

t

kesalahan dari variasi dalam dosis untuk semua nilai y k f N
sebagai berikut: s2 (16)
n
Tt 2
y T = Ty = Tt dan n = (k 1) (f 1) derajat bebas harus
2

f
s2
dikurangi dengan satu untuk tiap perbedaan dalam tabel
(13) asal yang telah diisi dengan perhitungan.
n Jika urutan perlakuan merupakan sumber variasi
Tt adalah total pada tiap dosis dari nilai f dari y, terdapat tambahan yang penting, pengaruhnya dapat dikoreksi
sebanyak k total Tt dan derajat bebas n = f-k, dengan f dengan rejim dosis untuk suatu seri dari n kuadrat Latin
dikurangi 1 untuk penggantian. dengan k baris secara bersama. Buat Tabel pengamatan
Jika variasi dalam f diatur dengan mengurangkan nilai respons y dari tiap hewan penetapan dalam kolom yang
rata-rata kelompok dari total kelompok, hitung variansi terpisah menurut urutan dosis. Respons dari tiap k dosis
kesalahan dari y yang diamati dan total Tt yang tidak terjadi sering kali sama dalam tiap k baris dan dalam nk
diatur sebagai: kolom, n adalah banyaknya kuadrat Latin. Jumlahkan
respons y dalam tiap baris (Tr) dalam tiap kolom (Tc),
dan dalam Tabel yang terpisah, untuk tiap dosis atau
Tt 2
y
2 perlakuan (Tt). Suatu pengamatan yang hilang dapat
f diganti menggunakan persamaan 1a seperti dijelaskan
s2 (14) pada Penggantian nilai yang hilang. Hitung variasi
n kesalahan dari kuadran masing-masing y dan dari total
n=f-k marginal dan perlakuan sebagai:

Dalam perhitungan hasil penetapan menggunakan

T T T
2 2 2
koefisien dari Tabel 6 atau Tabel 8, s2 dapat dihitung 2T 2
y
t

c
2
t

dari respons y untuk tiap h sediaan, meliputi h sediaan n' k k n' k N
uji dan tingkat dosis baku yang berkaitan. Untuk tiap s2
(16a)
n
sediaan, hitung T1 = y dan faktor kemiringan Tb = (x1y),
nilai dari x1 adalah kooefisien faktorial untuk baku pada T = yy = Tr = Tc = Tt dan N= (k 1) (nk-2)
baris b yang sesuai Tabel 6 atau Tabel 8. Variansi
kesalahan penetapan adalah:

y
2 T '2

2( Tb ) 2
s2 k h ' eb f
n (15)
derajat bebas n = h(k 1) 1, dan eb adalah ei dari
Tabel dan baris yang sama sebagai koefisien x1.
Variasi kesalahan pada Desain Terbatas Pada
beberapa penetapan, respons individual terjadi dalam
tiga atau lebih kumpulan acak. Contoh kumpulan adalah
pasangan hewan dalam penetapan vitamin D, daerah-
daerah bening dalam tiap lempeng pada penetapan
antibiotik. Masing-masing nilai y dari penetapan ini
disusun dalam Tabel dua arah, tiap kolom menunjukkan
perlakuan atau dosis yang berbeda dan tiap baris
menunjukkan kumpulan acak. Nilai-nilai yang hilang
derajat bebas harus dikurangi dengan satu untuk tiap
perbedaan dalam tabel asal yang telah diisi dengan
perhitungan.
Pada penetapan dengan reaksi yang terjadi dalam
pasangan, perbedaan di antara hewan penetapan atau
reaksi pasangan secara otomatis dipisah-pisah dengan
menghitung penetapan dari perbedaan dalam suatu
pasangan sebagai respons. Pada insulin, respons adalah
perbedaan y dalam gula darah pada kelinci tunggal
setelah dua kali penyuntikan seperti tertera pada
Penetapan Potensi Insulin <161>. Setelah pengaturan
untuk kehilangan kelinci selama penetapan, hitung
variansi kesalahan dan respons pada semua empat
kelompok dan dari total kelompok Ti = T1 hingga T4
sebagai :
Ti
2

y
2
dapat diganti seperti dijelaskan pada Penggantian nilai-
nilai yang hilang. Total kolom k adalah Tt yang
f (17)
diperlukan untuk analis desain tertimbang. Total baris s2
n
 - 1358 -
banyaknya kelinci f adalah sama dalam tiap kelompok
dan derajat bebas n = 4 (f 1), dikurangi dengan satu
untuk setiap penggantian kelinci yang hilang selama
penetapan. Pada penetapan Injeksi Oksitosin, setiap y
menunjukkan perbedaan antara respons tekanan darah
terhadap suatu dosis sediaan uji dan respons rata-rata
untuk dua dosis baku yang berdekatan. Hitung variansi
kesalahan dari y sebagai:
2
T2
2
Ti
y2 (18)
f
s2
n
n = 2(f 1) derajat bebas; T1 adalah total y untuk dosis
rendah sediaan uji dan T2 untuk dosis tinggi.
Pada penetapan secara mikrobiologi yang dihitung
dengan interpolasi dari suatu kurva baku, ubah tiap
perbedaan antara respons pasangan terhadap unit log-
dosis, X, menggunakan persamaan 7. Dengan setiap
perbedaan X sebagai unit, suatu komposit s2 dihitung
dari variasi nilai-nilai X dalam f untuk tiap sediaan uji,
dijumlahkan dari semua h sediaan uji dalam penetapan
sebagai:
T 2
X 2 x Suatu penetapan dapat tidak memenuhi uji keabsahan
dan masih digunakan untuk memperkirakan potensi yang
f
s2 (19)
n yang kedua untuk sediaan uji yang sama seperti
Tx = X untuk sediaan uji tunggal dan derajat bebas nx
= f h.
Pengujian Keabsahan Penetapan Sebagai tambahan
pada persyaratan yang khusus dalam tiap monografi dan
kombinasi kurva log-dosis respons dengan kemiringan
yang signifikan seperti tertera pada statistik C dalam
bagian selanjutnya, dua kondisi menentukan keabsahan
dari masing-masing penetapan faktorial: (1) kurva log-
dosis respons sediaan uji harus sejajar dengan kurva
baku di dalam kesalahan eksperimental, dan (2) kedua
kurva tidak menyimpang secara signifikan dari garis
lurus. Jika penetapan sudah dibuat secara acak sempurna
atau terdiri dari kumpulan acak, pengujian yang
diperlukan adalah menghitung dengan koefisien faktorial
untuk ab, q, dan aq dari Tabel 6 sampai Tabel 8 dan
total perlakuan Tt. Jumlahkan hasil kali koefisien dalam
tiap baris yang bersangkutan dengan Tt untuk
mendapatkan total hasil kali Ti yang subskrip i masing-
masing berlaku untuk ab, q, dan aq. Masing-masing dari
ketiga perbandingan Ti2/ef dihitung dengan nilai ei yang
sesuai dari tabel dan dengan f yang sama dengan
banyaknya y dalam tiap Tt. Pada baris ab diuji
kesejajaran garis dosis-respons dan ini adalah satu-
satunya pengujian yang ada pada penetapan dengan 2
dosis. Dengan tiga atau lebih dosis dari kedua sediaan,
dalam baris q adalah pengujian lengkungan yang
dikombinasi pada arah yang sama, dan dalam baris aq
pengujian lengkungan yang terpisah pada arah yang
berlawanan. Jika tiap perbandingan dalam penetapan
dengan 3 atau 4 dosis melebihi s2 sebesar tiga kali lipat,
hitung:
T 2
i
ef
F3 2 (20)
3s
Untuk penetapan dengan 2 dosis, hitung:
2
T ab
F1
2
e ab fs (21)
dan untuk penetapan 3,2 (Tabel 7) tentukan:
T 2
i
ef
F2 2
(22)
2s
Untuk suatu penetapan absah F1, F2 atau F3 tidak
melebihi nilai yang tertera pada Tabel 9 (pada
kemungkinan 1 dalam 20) untuk derajat bebas n dalam
s2.
kemudian dapat dikombinasi dengan hasil penetapan
diuraikan pada bagian lebih lanjut. Suatu tingkat dosis
akhir baik baku maupun sediaan uji atau keduanya dapat
berada di luar daerah linier. Dengan tiga atau lebih
tingkat dosis dan nilai-nilai Ta Tab dan Taq yang relatif
besar, total respons Tt pada suatu dosis akhir dari suatu
sediaan dapat mendekati batas tertinggi atau terendah
dan menjadi penyebab nilai-nilai yang besar Tab dan Taq.
Tt dapat dihilangkan dan penetapan dihitung kembali
dengan desain yang sesuai pada Tabel 7. Jika penetapan
kemungkinan memenuhi pengujian dalam persamaan 20
atau 22, hasil potensi yang didapat, M, dapat
dikombinasi dengan hasil dari penetapan kedua dalam
menghitung log-potensi sediaan uji seperti tertera pada
Kombinasi dari penetapan yang berdiri sendiri. Jika Ta
tidak signifikan tetapi Tq menunjukkan garis lengkung
kombinasi yang signifikan, dosis yang terbesar (atau
terkecil) dari kedua sediaan yang mungkin terlalu besar
(atau terlalu kecil). Penghilangan nilai-nilai tersebut
dapat menghasilkan penetapan yang absah dengan
koefesien faktorial untuk desain yang lebih kecil
berikutnya pada Tabel 6 atau Tabel 8. Tq atau Tq yang
signifikan secara statistik dapat diabaikan dan semua
tingkat dosis dipakai tanpa menyebabkan bias log-
potensi M yang dihitung dari interval keyakinan lebih
besar dari 5% apabila kesamaan berikut benar:
2 2
Tb 100 Tq
eb eq
 - 1359 -
atau Perhitungan umum Meskipun banyak bentuknya, uji
T '
b
2

100 T ' q
2

(23)
eb eq
tiap Tb dan Tq, dihitung dengan Tt (atau y) untuk sediaan
tunggal dikali koefisien untuk Baku dalam baris b dan q
berurutan. Jika Ta dan Tab keduanya signifikan pada
penetapan dengan 2 dosis, satu Tt mungkin di luar
daerah linier. Kadang-kadang perkiraan awal atau
potensi perkiraan dapat dihitung dari nilai Tt yang tersisa
dan desain pertama dalam Tabel 7. Pada penetapan
insulin dan obat-obat lain yang responsnya dibuat
berpasangan, uji kesejajaran sedemikian tidak peka
sehingga dihilangkan. Jika tabung-tabung dalam tiap
kumpulan diatur secara sistematik sebagai ganti cara
acak pada penetapan mikrobiologi, uji keabsahan dapat
mempunyai bias dari pengaruh posisi.
INTERVAL DAN BATAS KEYAKINAN
DARI POTENSI
hayati dapat digolongkan dalam dua kategori umum: (1)
log-potensi dihitung langsung dari harga rata-rata atau
perbedaan rata-rata, dan (2) dihitung dari rasio dua
statistik.
(1) Bila log-potensi dari suatu penetapan dihitung
sebagai rata-rata dari beberapa log-potensi yang
diperkirakan mempunyai presisi lebih kurang sama, log-
interval keyakinan adalah:
2 st
L (24)
k
s adalah deviasi baku dari log-potensi perkiraan tunggal,
t dibaca dari Tabel 9 dengan derajat bebas n dalam s, dan
k adalah banyaknya perkiraan yang dirata-ratakan.
Persamaan yang serupa digunakan dan log-potensi
dihitung sebagai rata-rata x dari k perbedaan x, dengan
deviasi baku s dari suatu x tunggal. Dalam hal manapun,
log-potensi M perkiraan terletak ditengah interval
keyakinan, sehingga internal keyakinan adalah:

Uji hayati memberikan suatu perkiraan dari potensi XM=M+L dan M=ML atau XM=ML (25)
sebenarnya dari sediaan uji. Perkiraan tersebut terletak
dalam suatu interval keyakinan, yang dihitung Batas-batas tertinggi dan terendah diubah menjadi
sedemikian rupa sehingga kemungkinan tidak lebih dari antilogaritma untuk mendapatkan batas-batas potensi
1 dalam 20 (P = 0,05) bahwa potensi sebenarnya lebih yang jelas.
besar dari batas tertinggi interval keyakinan atau lebih
rendah dari batas terendah. Mengingat interval tersebut (2) Lebih sering, log-potensi atau potensi dihitung dati
ditentukan oleh sejumlah faktor yang dapat suatu rasio dan dalam hal ini panjang dari interval
mempengaruhi perkiraan potensi, presisi yang keyakinan dinyatakan sebagai log-interval dalam
diperlukan untuk sebagian besar uji hayati diberikan persamaan
dalam monografi dengan istilah interval keyakinan, yang
berhubungan secara langsung dengan potensi atau L 2 (C 1) (CM '2 c 'i 2 ) (26)
logaritmanya.

Tabel 9
Nilai-nilai t, t2, Fi dan X2 untuk derajat bebas n yang berbeda yang akan dilebihi dengan suatu probabilitas
P = 0,05 (atau 0,95 rentang keyakinan)*

n t T2 = F 1 F2 F3 X2 n t T2 = F 1 F2 F3 X2
1 12,706 161,45 - - 3,84 19 2,093 4,381 3,52 3,13 30,1
2 4,303 18,51 19,00 19,16 5,99 20 2,086 4,351 3,49 3,10 31,4
3 3,182 10,128 9,55 9,28 7,82 21 2,080 4,325 3,47 3,07 32,7
4 2,776 7,709 6,94 6,59 9,49 22 2,074 4,301 3,44 3,05 33,9
5 2,571 6,608 5,79 5,41 11,07 23 2,069 4,279 3,42 3,03 35,2
6 2,447 5,987 5,14 4,76 12,59 24 2,064 4,260 3,40 3,01 36,4
7 2,365 5,591 4,74 4,35 14,07 25 2,060 4,242 3,38 2,99 37,7
8 2,306 5,318 4,46 4,07 15,51 26 2,056 4,225 3,37 2,98 38,9
9 2,262 5,117 4,26 3,86 16,92 27 2,052 4,210 3,35 2,96 40,1
10 2,228 4,965 4,10 3,71 18,31 28 2,048 4,196 3,34 2,95 41,3
11 2,201 4,844 3,98 3,59 19,68 29 2,045 4,183 3,33 2,93 42,6
12 2,179 4,747 3,89 3,49 21,03 30 2,042 4,171 3,32 2,92 43,8
13 2,160 4,667 3,81 3,41 22,36 40 2,021 4,085 3,23 2,84 55,8
14 2,145 4,600 3,74 3,34 23,68 60 2,000 4,001 3,15 2,76 79,1
15 2,131 4,543 3,68 3,29 25,00 120 1,980 3,920 3,07 2,68 146,6

16 2,120 4,494 3,63 3,24 26,30
17 2,110 4,451 3,59 3,20 27,59
18 2,101 4,414 3,55 3,16 28,87
*adopsi dari bagian-bagian Tabel III hingga IV dari Statistical Tables for Biological, Agricultural and Medical Research,
R.A. Fisher and F.Yates, Oliver and Boyd, Ltd., Edinburgh.
M adalah log-potensi relatif seperti telah didefinisikan
dalam Perhitungan Potensi dari suatu Penetapan
Tunggal; i adalah log-interval dosis yang berurutan dan c
adalah tetapan karakteristik dari prosedur penetapan.
Istilah C tergantung pada ketepatan dengan kemiringan
kurva dosis-respons telah ditentukan. (Hal ini kadang-
kadang dinyatakan dalam istilah g = (C 1)/C). Dalam
penetapan faktorial dihitung sebagai:
Tb
2 perkiraan dari sediaan uji. Batas keyakinan tertinggi dan
C
Tb eb fs 2t 2
2
(27)
s2 adalah variansi kesalahan dari pengamatan tunggal, t2
dibaca dari Tabel 9 dengan derajat bebas dalam s2; f
adalah banyaknya respons dalam tiap Tt yang digunakan
untuk menghitung Tb dan Tb serta eb dihitung dengan
koefisien faktorial untuk baris b dalam Tabel 6 hingga
Tabel 8. Variansi kesalahan s2 dalam persamaan 26
tergantung pada desain penetapan, seperti ditunjukkan
untuk setiap obat pada bagian selanjutnya. Pada
penetapan yang absah C merupakan bilangan positif.
Dalam penetapan dua atau lebih sediaan uji terhadap
baku bersama, semuanya dengan kurva dosis-respons
yang sejajar dalam batas kesalahan eksperimental, C
dapat dihitung dengan variansi kesalahan s2 untuk
penetapan dan dengan kemiringan penetapan sebagai:
C
T '
b
2 interval keyakinan L dengan persamaan 26 dan
T
b
' 2
eb fh ' s 2 t 2
2
(28)
Faktor kemiringan Tb = (x1Tt) atau (x1y) untuk tiap
h sediaan, termasuk baku, dihitung dengan koefisein
faktorial x1 untuk baku dalam baris b yang sesuai dari
Tabel 6 hingga Tabel 8. Jika total perlakuan Tt
mencakup satu atau lebih penggantian untuk respons
yang hilang, ganti ebf dalam persamaan 27 atau ebfh/2
dalam persamaan 28 dengan f2(x12/f), tiap x1 adalah
koefisien faktorial dalam baris b dari Tabel 6 hingga
Tabel 8, dalam bab ini, dan f adalah banyaknya respon
dalam Tt yang bersangkutan, sebelum menambahkan
pengganti. Dengan C ini, hitung interval keyakinan
sebagai :
c' i 2 h'
L 2 (C 1) (CM ' 2 ) (29)
2 fu
Dalam penetapan yang dihitung dari suatu rasio, log-
potensi M yang paling mungkin terletak tidak tepat di
- 1360 -
1,960 3,841 3,00 2,60 -
tengah interval keyakinan. Batas keyakinan tertinggi dan
terendah dalam logaritma adalah :
XM =logR+CM+L dan logR=CML (30)
C sering kali agak lebih besar sedikit dari satuan, dan
makin tepat cara penetapannya, harga C makin
mendekati tepat 1. R = zs/zu adalah perbandingan dosis
baku dan sediaan uji yang bersesuaian atau potensi
terendah dalam log-potensi diubah secara terpisah
menjadi antilogaritmanya untuk memperoleh potensi
yang bersesuaian.
Interval Keyakinan untuk Penetapan Individual
Oleh karena interval keyakinan dapat berbeda dalam
rincian dari pola-pola umum di atas, maka hitung untuk
tiap penetapan dengan cara-cara khusus yang diberikan
di bawah nama bahan pada paragraf berikut.
Penetapan Antibiotik Interval keyakinan dapat
dihitung dengan persamaan 24 dan persamaan 25.
Kalsium pantotenat Untuk log-potensi yang diperoleh
dengan interpolasi dari kurva baku, interval keyakinan
dapat dihitung dengan persamaan 19 dan persamaan 24.
Untuk log-potensi yang dihitung dengan persamaan 8
dan persamaan 10, s2 dapat dihitung dengan persamaan
15, C dengan persamaan 27 atau persamaan 28, dan
persamaan 29.
Injeksi Kortikotropin Hitung log interval keyakinan
dengan persamaan 26 dan persamaan 27, koefisien dan
tetapan dalam Tabel 6 untuk penetapan 3 dosis, dan s2
seperti yang ditentukan dengan persamaan 13 atau
persamaan 14.
Digitalis Hitung interval keyakinan sebagai :
2
z fu
L 2 (C 1) C s (31)
zu fs
fu dan fs adalah banyaknya pengamatan pada sediaan uji
dan pada bak, dan
zu
2
C
s 2t 2 (32)
zu
2
ditentukan dengan s2 dari persamaan 11. Batas
keyakinan untuk potensi dalam unit F1 adalah :
 - 1361 -
log-potensi M, harga M digabungkan untuk menentukan
z 2 potensi rata-rata tertimbang dari sediaan uji. Kecuali
X p* R C s 1 L (33) pada penetapan Heparin Natrium yang log-potensi sama
zu 2
besar disetimbangkan, ketepatan relatif dua atau lebih M
definisi R dapat dilihat pada daftar istilah simbol. terpisah menentukan bobot yang ditentukan untuk setiap
nilai dalam menghitung harga rata-rata dan interval
Gonadotropin Korionik Lakukan seperti untuk Injeksi keyakinannya.
Korikotropin. Sebelum menggabungkan dua atau lebih M terpisah
Heparin Natrium Bila dua penentuan terpisah log- yang diperkirakan, konsistensi bersamanya harus diuji.
potensi M berbeda lebih dari 0,05; lakukan penetapan Bila harga-harga M konsisten, masing-masing interval
tambahan dan hitung variansi kesalahan dari M di antara keyakinannya akan tumpang tindih atau bila tumpang
nilai-nilai N sebagai : tindihnya kecil, hitung harga pendekatan M2. Tentukan
dari tiap h penetapan individual suatu bobot w, yang
M 2
M 2
dinyatakan sebagai :
(34)
N 4t 2
s2 w (38)
n L2
n = N-1 derajat kebebasan. Dengan nilai-nilai ini, dengan panjang interval keyakinan L yang dihitung
tentukan interval keyakinan dalam logaritma (L) dengan dengan persamaan yang sesuai dari bagian terdahulu,
persamaan 24. dan t2 dibaca dari Tabel 9 untuk derajat bebas n dalam
Injeksi Insulin Hitung variasi kesalahan (s2) dari y variansi kesalahan pengujian. Jumlahkan masing-masing
dengan persamaan 16 dan C sebagai : bobot untuk memperoleh w. Kemudian suatu
pendekatan x2 dengan h-1 derajat bebas ditentukan
2
Tb sebagai :
C
T 2
s 2t 2 N (35)

wMw
b 2
2 2
Pendekatan X M wM (39)
t2 dari Tabel 9 tergantung kepada n = 4(f-1) derajat
bebas dalam s2 dan N = 4 f adalah jumlah dari perbedaan
dalam empat kelompok. Dengan persamaan 26 hitung Untuk dua penetapan dengan log-potensi M1 dan M2 dan
interval keyakinan L dalam logaritma, dengan ci2 = bobot w1 dan w2 persamaan 35 disederhanakan menjadi
0,09062. Batas keyakinan tertinggi dan terendah dalam :
unit Insulin FI diperoleh dari antilogaritma dari XM pada 2
persamaan 30. w w M M
2 1 2 1 2
Injeksi Oksitosin Hitung perkiraan log interval ke- Pendeka tan X M (40)
yakinan dengan persamaan 26, sebagai berikut : w w
1 2
(T2 T1 ) 2 dengan satu derajat bebas. Jika pendekatan M2 benar-
C
T2 T1 2 4 f 1s t

2 2 (36) benar terletak di bawah nilai kritis 2 dalam Tabel 9,
gunakan bobot w dalam menghitung log-potensi rata-rata
3 M dan interval keyakinan L. Jika M2 mendekati atau
2
s ditentukan dengan persamaan 18 dan melebihi nilai kritis ini, sebagai gantinya gunakan semi-
bobot w (persamaan 47 ketika menghitung M).
4 f 1 Hitung log-potensi rata-rata M dari dua atau lebih
c
8 f 1
(37) penetapan yang sama-sama konsisten sebagai:

M
(wM )
w
Aktivitas Vitamin B12 Lakukan seperti Kalsium (41)
Pantotenat.

Kombinasi dari Penetapan yang Ini adalah nilai tunggal yang paling mungkin di dalam
Berdiri Sendiri interval keyakinan gabungan dengan panjang Lc
ditetapkan sebagai akar dari:
Bila metodenya memungkinkan, tambahan hewan
2
w w w (42)
dapat ditambahkan pada penetapan yang kurang presisi 4t
2 L 1 4
hingga hasil-hasil yang digabungkan mengurangi L
interval keyakinan dalam batas yang ditentukan dalam C w 2w n
monografi. Jika diperlukan dua atau lebih penetapan
yang berdiri sendiri, masing-masing ditujukan kepada
 - 1362 -
tiap n = n 4(h-2)/(h-1) dan tL2 diinterpolasi dari Tabel Jika M2 pada persamaan 39, dari h = 4 atau lebih
9 dengan derajat bebas: perkiraan M, melebihi tingkat kritis dalam Tabel 9 lebih
dari 50%, dan bobot w berbeda kurang dari 30%, h
nL
w 2
perkiraan dari M dapat diperiksa untuk nilai me-
w / n
2 nyimpang dapat dihilangkan dalam menghitung M
dengan w.
Untuk dua penetapan (h = 2) dengan log-potensi M1 dan Jika potensi obat ditetapkan berulang kali di suatu
M2 dan bobot w1 dan w2, persamaan di atas dapat ditulis laboratorium dengan menggunakan metode uji hayati
kembali sebagai: yang sama, penetuan berturutan dari kemiringan b dan
variansi kesalahan s2 dapat tersebar ecara acak di dalam
kesalahan pengambilan contoh uji di sekitar nilai yang
2
4t 4w w 1 1 umum untuk setiap parameter. Dengan membuat kurva
1 1 2
2 L
L (43) perkiraan dari penetapan yang berturutan pada suatu peta
C w
w 1 2
2 n n kendali mutu untuk masing-masing statistik dan
menghitng nilai tengah dan batas kendali yang
w = w1 + w2. Apabila Lc interval keyakinan untuk menyatakan variasi acak yang diperbo-lehkan,
suatu perkiraan kombinasi, tidak melebihi persyaratan memungkinkan untuk memeriksa secara terus-menerus
dalam monografi, batas keyakinan tertinggi dan terendah konsistensi dari suatu teknik penetapan secara terus-
dalam Lc di atas dan di bawah M, untuk memperoleh menerus.
interval keyakinan mendekati 95%.
Jika variasi potensi hasil penetapan anatara h Apabila perkiraan dari b dan s dari penetapan tunggal
penentuan terpisah, seperti diuji dengan M2, mencapai terletak dalam batas kendali, maka dapat diganti dengan
atau melebihi P = 0,05, beberapa perkiraan ditetapkan rata-rata yang diperoleh laboratorium. Tolak tiap
semi-bobot w. Dari bobot w, hitung variansi dari tiap M penetapan yang statistiknya berada di luar batas kendali,
sebagai: atau terima penetapan hanya setelah penelitian saksama
validitasnya.
1 L2
V (44)
w 4t 2 Penetapan Gabungan dari Beberapa Sediaan

Hitung variansi heterogenitas antara penetapan se-bagai : Setiap monografi menguraikan penetapan dari sediaan
uji tunggal terhadap baku. Meskipun tidak diberikan
M
2
secara tegas, beberapa sediaan uji yang berbeda, sering
M 2

h V dimasukkan dalam penetapan yang sama dan masing-
v (45) masing dibandingkan secara terpisah dengan respons
h 1 h
yang sama terhadap baku. Kenyataan ini menjamin
Atau, bila h = 2 bertambahnya jumlah pengamatan dengan baku. Dengan
f pengamatan pada tiap tingkat dosis dari masing-masing
v
M 1 M 2 2 V1 V2 h sediaan uji yang berbeda, jumlah pengamatan pada
2 2 (46) tiap tingkat dosis baku dapat bertambah secara
menguntungkan, bila h besar, menjadi fh. Aturan ini
Bila V bervariasi secara jelas hingga v yang dihitung hanya dapat digunakan sebagai pendekatan di mana
seperti di atas merupakan angka negatif, sebagai perbedaan-perbedaan kecil atau kesetaraan harus
gantinya hitung suatu perkiraan v dengan menghilangkan dipisah-pisah, dan dalam hal manapun hanyalah bersifat
bagian setelah tanda minus pada persamaan 45 dan anjuran.
persamaan 46. Jika semua dari beberapa penetapan yang dilakukan
bersamaan memenuhi persyaratan keabsahan, dan
Semi-bobot dinyatakan sebagai : mempunyai kurva log-dosis respons yang linier dengan
1 kemiringan b yang sama dan variansi kesalahan s2 yang
w
V v (47) sama dari garis-garis tersebut, kedua nilai statistik tadi
dapat dipandang sebagai karakteristik penetapan.
Substitusi w dan w untuk w dan w dalam Kombinasi semua bukti dari penetapan yang sama
persamaan 41 untuk memperoleh rata-rata semi-bobot menjadi nilai tunggal kemiringan penetapan
M. Hal ini terletak dekat dengan tengah interval keyakin- menghasilkan perkiraan b yang lebih stabil dan dapat
an dari perkiraan panjang Lc, dipercaya, dibandingkan jika setiap sediaan uji dianalisis
secara terpisah. Demikian pula derajat bebas dan
4t 2 kehandalan dari variasi kesalahan s2 dapat bertambah.
Lc'
2

w (48) Interval keyakinan yang dihitung dengan nilai-nilai

gabungan untuk b dan s2 lebih kecil dalam rata-rata
dan t2 dari Tabel 9 mempunyai n derajat bebas. dibandingkan bila berdasarkan hanya kepada bagian data
yang relevan. Untuk perhitungan atau penggunaan
 - 1363 -
perkiraan penetapan yang demikian lihat persamaan 10,
15, 16, 19, 28 dan 29. Potensi perkiraan dengan
kemiringan yang dihitung dari sediaan uji tunggal dan
baku terletak di dalam bagian dari interval keyakinan
yang dihitung dari gabungan kemiringan untuk seluruh
penetapan. Karena didasarkan pada bukti, cara yang
terakhir dianggap merupakan perkiraan yang lebih baik.

DAFTAR ISTILAH
Simbol Keterangan
A serapan untuk menghitung % pengurangan pertumbuhan bakteri dari pengamatan kekeruhan

b kemiringan dari garis lurus hubungan respons (y) dengan log-dosis (x) [Persamaan 2b, 4, 5, 6]

c tetapan untuk menghitung M dengan persamaan 8 dan 10

c tetapan untuk menghitung L dengan persamaan 26 dan 29

ci tetapan untuk menghitung M bila dosis ditempatkan seperti tertera pada Tabel 8.
2
ci tetapan untuk menghitung L bila dosis ditempatkan seperti tertera pada Tabel 8.

C Simbol untuk menghitung ketepatan dari kemiringan dalam interval keyakinan [Persa-maan
27, 28, 35,36].

2 Tetapan statistik untuk menguji kesignifikanan suatu ketidaksesuaian [Tabel 9].

M2 2 untuk menguji ketidaksesuaian antara log-potensi perkiraan yang berbeda [Persamaan 39,
40].

eb ei dari baris b dalam Tabel 6 hingga Tabel 8.

ebi perkalian dari (x x)2 {tabel 5; Persamaan 6]

ei jumlah kuadrat dari koefisien faktorial dalam tiap baris dari Tabel 6 dan Tabel 8.

eq ei dari baris q dalam Tabel 6 dan Tabel 8

f banyaknya respons pada tiap kali tingkat dosis dari suatu sediaan; banyaknya replikat atau
kumpulan.

fs banyaknya pengmatan pada baku.

fu banyaknya pengamatan pada sediaan uji

F1 hingga F3 rasio variansi yang diamati dengan derajat bebas 1 sampai 3 dalam pembilang [Tabel 9].

G1, G2 dan G3 perbedaan relatif dalam pengujian untuk nilai yang menyimpang [Tabel 1].

h banyaknya sediaan uji dalam penetapan ganda.

h banyaknya sediaan dalam penetapan ganda, termasuk baku dan h sediaan uji, h = h + 1

i interval dalam logaritma antara log dosis berurutan, sama untuk baku dan sediaan uji.

k banyaknya log-potensi perkiraan dalam suatu rata-rata [Persamaan 24; banyaknya perla-kuan
atau dosis (Tabel 4; Persamaan 1, 13, 15, 16); banyaknya rentang atau kelompok dalam suatu
seri [Tabel 2]; banyaknya baris, kolom, dan dosis dalam suatu kuadrat latin tunggal
[Persamaan 1a, 16a].

L panjangnya interval keyakinan dalam logaritma [Persamaan 24, 26, 29, 38], atau dalam
pengertian ukuran dari potensi relatif dari pengenceran-pengenceran yang dibandingkan
[Persamaan 48]