RISALAH WAJIB FITZPATRICK

BAB 110
SENIN/ 15 JANUARI 2018 PK.12.00
dr. Riezky Januar Pramitha/ dr. Sylvia Anggraeni,Sp.KK

BAB 110
KETIDAKSTABILAN GENOM, PERBAIKAN DNA DAN
KANKER (II)
Thomas M. Rünger & Kenneth H. Kraemer

PENDEKATAN DIAGNOSIS KETIDAKSTABILAN GENOM DAN/ATAU DEFEK

PERBAIKAN DNA

Ketika dicurigai telah terjadi kelainan ketidakstabilan genom, klinisi ditantang untuk
memilih pemeriksaan laboratorium yang tepat untuk menegakkan diagnosis dan memberikan
petunjuk bagi pasien dan keluarga. Tabel 110-5 menyusun gambaran-gambaran klinis penting
yang dapat menjadi indikasi adanya kelainan tersebut dan seharusnya memicu klinisi untuk segera
memulai pemeriksaan. Berbagai pemeriksaan laboratorium untuk kestabilan genom, perbaikan
DNA dan respon terhadap agen-agen fisik dan kimia telah disusun pada Tabel 110-6.

TABEL 110-5
Gambaran Klinis Penting Yang Dapat Mengindikasikan Kelainan Ketidakstabilan Genom atau
Perbaikan DNA dan Memicu Klinisi untuk Memulai Pemeriksaan
KELAINAN GAMBARAN KLINIS
Xeroderma pigmentosum Terbakar atau muncul bula pada paparan sinar matahari minimal (pada beberapa pasien),
frecklimg masa anak-anak, kanker kulit dini atau multipel
Sindrom Cockayne Rasa terbakar pada paparan sinar matahari minimal, kegagalan pertumbuhan paska lahir,
tuli sensorineural
Trikhodistrofi Rasa terbakar pada paparan sinar matahari minimal (pada beberapa pasien), rambut rapuh,
iktiosis
Ataksia-teleangiektasia Teleangiektasia, ataksia, leukemia atau limfoma
Sindrom Bloom Fotosensitivitas, eritema malar, retardasi pertumbuhan, infeksi, kanker
Anemia Fanconi Anemia aplastik, retardasi pertumbuhan, bercak café-au-laiy, kelainan ibu jar, leukemia
mielogenosa akut
Diskeratosis kongenita Triad hiperpigmentasi retikulata, distrofik kuku dan leukoplakia mukosa
Sindrom Muir-Torre Tumor sebaseus, keratoakanthoma, riwayat pribadi atau keluarga dengan kanker kolon
Lihat Bab 139 untuk keterangan lebih lanjut
Tabel 110-6
Pemeriksaan Diagnostik Ketidakstabilan Genom, Perbaikan DNA dan Respon Terhadap Agen Fisik atau Kimia
 Fungsi sel utuh (proliferasi atau kematian sel)
 Jumlah sel (pertumbuhan pada kultur massa)
 Penggabungan Thymidine
 Kemampuan pembentukan koloni
 Integritas dan Kerusakan Kromosom
 Analisis kariotipe metaphase hapusan Giemsa
 Kerusakan kromosom G2
 Pertukaran kromatid pasangan
 Hibridisasi in situ fluorescense
 Pemeriksaan ketidakstabilan mikrosatelit

1
  Panjang Telomere
 Perbaikan DNA
 Sintesis DNA tidak terjadwal
 Inhibisi sintesis RNA
 Reaktivasi sel pejamu
 Assay comet
 Analisis imunologi terhadap kerusakan dan penghilangan DNA (enzyme-linked immunosorbent assay,slot
blot)
 Pemeriksaan ketidakstabilan mikrosatelit
 Karakteristik dan ekspresi gen-gen yang rusak
 Real-time polymerase chain reaction
 Western blotting
 DNA sequencing
Agen-agen ini tersusun pada Tabel 110-1

KEGUNAAN SEL-SEL KULTUR

Sel-sel yang langsung diambil dari pasien dan ditumbuhkan pada media kultur disebut dengan
kultur primer. Fibroblas dermis biasanya mudah tumbuh pada kultur dan dapat ditumbuhkan dari
spesimen biopsi kulit punch steril sebesar 2-4 mm. Permukaan dalam lengan atas telah terbukti
sesuai sebagai lokasi biopsi karena area ini mudah sembuh, skar yang dihasilkan tidak terlihat,
lokasi terhalang dari radiasi UV dan usaha untuk melakukan kultur dari spesimen ini biasanya
berhasil. Jaringan diletakkan pada media kultur steril (atau saline steril) dengan antibiotika dan
ditransportasikan ke laboratorium kultur sel dengan suhu kamar.
Kultur sel manusia tersedia untuk penelitian oleh National Institutes of Health-
fundedHuman Genetic Mutant Cell Repository (401 Haddon Ave, Camden, NJ 08103; telephone:
856–966-7377; http://ccr.coriell.org).

PEMERIKSAAN DIAGNOSTIK KETIDAKSTABILAN GENOM DAN PERBAIKAN

DNA
Pemeriksaan untuk menilai ketidakstabilan genom dan/atau kapasitas perbaikan DNA dapat
dibedakan menjadi pemeriksaan fungsi seluler utuh dan pemeriksaan intergritas dan kerusakan
kromosom sebagai respon terhadap agen perusak DNA. Pemeriksaan lainnya menilai kecacatan
fungsi sel seperti perbaikan DNA atau karakter DNA atau menentukan ekspresi gen-gen yang
rusak (lihat Tabel 110-6).

PEMERIKSAAN FUNGSI SEL UTUH

Pemeriksaan fungsi sel utuh menilai kapasitas sel utuh untuk memperbaiki diri dari kerusakan
DNA. Pemeriksaan ini tidak memberikan informasi lebih mengenai tipe kerusakan spesifik yang
menghasilkan kerusakan seluler atau mekanisme perbaikan seluler, tetapi mereka memang
membentuk dasar untuk mengidentifikasi sel karena hipersensitif terhadap agen-agen perusak
DNA dan sering digunakan sebagai pemeriksaan skrining sederhana

JUMLAH SEL ATAU PENGGABUNGAN THYMIDINE

2
Salah satu dari pemeriksaan yang paling sederhana setelah paparan terhadap radiasi UB atau sinar-
X ialah melalui penilaian laju pertumbuhan pada kultur massa dengan menggunakan mikroskop
atau penghitung sel otomatis untuk menghitung jumlah sel-sel dengan menghitung penggabungan
thymidine radioaktif kepada DNA yang baru disintesis (lihat Tabel 110-6 dan 110-7).
TABEL 110-7
Urutan Pemeriksaan Diagnostik Yang Diusulkan Pada Penyakit Dengan Ketidakstabilan Genom
atau Perbaikan DNA

KEMAMPUAN MEMBENTUK KOLONI

Suatu pemeriksaan kemampuan pembentukan koloni menilai kapasitas sel tunggal dalam
kecukupan berproliferasi untuk membentuk koloni yang tampak mata (gbr 110-5)

Gambar 110-5 Assay sensitivitas sel mengenai kemampuan pembentukan koloni. Fibroblas Xeroderma
pigmentosum (XP) dari dua saudara penderita (XP12TA dan XP25TA), ayah mereka (XPH27TA) dan
saudara laki-laki yang tidak terkena (35TA) begitu pula fibroblas normal (96TA dan HSTA) diterapi dengan
radiasi 245nm ultraviolet (UVC) dan kemampuan pembentukan koloni ditegakkan. Untaian fibroblas
kelompok komplementasi C XP (XPC) dari saudara-saudara yang menderita jauh lebih sensitif
dibandingkan untaian normal dan menunjukkan hipersensiticitas paska UVC serupa. Sel-sel dari saudara
laki-laki yang tidak terkena dan ayah yang normal secara klinis, suatu defek karier heterozigot XPC,
memiliki kelangsungan hidup normal paska UVC. ( Dimodifikasi dari Slor H et al: Clinical, cellular, and

3
molecular features of an Israeli xeroderma pigmentosum family with a frameshift mutation in the XPC
Gene: Sun protection prolongs life. J Invest Dermatol 115:974, 2000)

PEMERIKSAAN INTERGRITAS DAN KERUSAKAN KROMOSOM

Kerusakan kromosom biasanya dinilai dari kultur primer dari leukosit darah perifer yang
distimulasi mitogen atau dari kultur jangka panjang garis sel fibroblas atau limfoblastoid.
Kemajuan siklus sel dihentikan pada metaphase melalui terapi sel dengan penghambat mitosis
seperti kolkisin. Pada prosedur ini, 23 pasangan kromosom metaphase dari satu sel disebarkan
pada area slide berlainan dan diwarnai (biasanya dengan hapusan Giemsa). Preparat dapat
dianalisa untuk jumlah kromosom per metaphase, morfologi kromosom individu, dan perlekatan
atau penyusunan kembali dari kromosom karena hubungan satu sama lain.

PERTUKARAN KROMATID SAUDARA

Selama replikasi DNA, kromatid terkadang berganti posisi disepanjang lengan kromosom. Sister
chromatid exchange (SCE) ini dapat dideteksi dengan mengizinkan sel-sel untuk tumbuh melalui
dua siklus replikasi didalam medium yang mengandung analog asam nukleat bromodeoxyuridine
(BrUdR) (Gbr 110-6). SCE diperkirakan berhubungan dengan perbaikan rekombinasi DNA
walaupun arti pastinya belum dimengerti.

Gambar 110-A. Assay sister chromatid exchange dari intergritas kromosom. Setelah siklus pertama
replikasi, DNA dari untaian tersintesis baru dilabel dengan bromodeoxyuridine (BrUdR), diamana untaian
lama tidak dilabel. Kromosom-kromosom ini tampak seragam gelap dengan pewarnaan Giemsa. Sesudah
siklus kedua replikasi dari media mengandung BrUdR, satu lengan kromosom akan terdiri dari 2 kromatid
berlabel, dimana yang lainnya akan terdiri dari satu kromatid berlabel dan satu tidak berlabel. Lengan
pengganti ganda akan berwarna terang dimana lengan dengan pengganti tunggal akan berwarna gelap.
Apabila SCE terjadi pada saat replikasi, satu bagian dari tiap lengan kromosom akan menjadi pengganti
ganda dan pengganti tunggal lainnya dengan BrUdR. B. Kultur limfosit darah perifer normal tak ruak
memiliki sekitar sepuluh SCE per metafase. C. Limfosit darah perifer terkultur dari pasien dengan sindrom
Bloom memiliki peningkatan SCE berlipat ganda (dengan izin dari Chaganti RS, Schonberg S, German J:
A manyfold increase in sister chromatid exchanges in Bloom’s syndrome lymphocytes. Proc Natl Acad Sci
U S A 71:4508, 1974).

4
PANJANG TELOMER
Telomer yang diperpendek merupakan khas sel dari pasien dengan diskeratosis kongenita.
Beberapa metode dapat digunakan untuk mengukur panjang telomer, termasuk pengukuran
terminal restriction fragment (TRF) dengan Southern blot, fluorescence in situ hybridization
(FISH) dengan immunostaining, quantitative polymerase chain reaction (PCR), analisis panjang
telomer tunggal, dan flow-cytometry dengan FISH (flow-FISH). Pemeriksaan-pemeriksaan ini
biasanya dilakukan pada sel darah putih yang langsung diisolasi, bukan pada sel kultur.

PEMERIKSAAN PERBAIKAN DNA

Sintesis DNA Tidak Terjadwal
Salah satu pemeriksaan NER yang paling umum digunakan adalah sintesis DNA tidak terjadwal.
Pemeriksaan ini telah digunakan untuk mengukur perbaikan DNA pada kulit manusia utuh, pada
kultur sel epidermis atau dermis, dan pada sel darah, dan untuk diagnosis prenatal menggunakan
sel cairan amnion. Pemeriksaan sintesis DNA tidak terjadwal mengukur sintesis DNA terkait-
perbaikan pada sel-sel G1-G2 (yang biasanya tidak mensintesis DNA). Sel-sel diberikan radiasi
UV atau agen perusak DNA lainnya dan kemudian diinkubasi di media yang mengandung thimidin
radioaktif. Selama proses NER, kerusakan disingkirkan dan thimidin radioaktif digabungkan
kedalam area perbaikan. Sel-sel ini diberikan fiksatif yang berselimutkan emulsi autoradiografik
(fotografik), dan disimpan dalam gelap selama interval yang cukup dan kemudian emulsi
dikembangkan. Radiasi UV pada fibroblas normal menghasilkan peningkatan tinggi dalam jumlah
butiran yang terlihat pada seluruh nuklei. Sebaliknya, radiasi fibroblas XP yang tidak dapat
memperbaiki kerusakan perbaikan DNA menghasilkan beberapa butiran didalam nuklei.

Inhibisi Sintesis RNA

Setelah paparan terhadap radiasi UV, sel normal sementara mengurangi sintesis RNA dari gen-
gen aktif. Sintesis kembali ketika kerusakan diperbaiki. Kembalinya sintesis RNA tertunda pada
pasien-pasien dengan CS dan beberapa bentuk XP.

Reaktivasi Sel Pejamu

Assay reaktivasi sel pejamu ini didasarkan pada kenyataan bahwa plasmid tidak memiliki
kemampuan untuk memperbaiki DNA melainkan tergantung pada sistem perbaikan seluler.
Sehingga ketika plasmid dengan kerusakan DNA bertransfeksi kedalam sel pejamu, enzim
perbaikan DNA dari sel pejamu perlu memperbaiki kerusakan sebelum gen plasmid diekspresikan.
Karena itu plasmid rusak diperkirakan berekspresi di tingkat yang lebih tinggi pada sel-sel dengan
kapasitas perbaikan normal. Plasmid non replikasi yang mengandung gen untuk firefly enzyme
luciferase yang banyak digunakan dan dibentuk untuk memberikan ekspresi pada sel-sel manusia;
pemberian cahaya memberikan hasil kuantitatif untuk perbaikannya. (Gbr 110-7)

5
Gambar 110-7 Assay reaktivasi plasmid sel pejamu dengan penempatan pada kelompok
komplemetasi xeroderma pigmentosum (XP). Plasmid ini dirusak oleh radiasi ultraviolet (UV) dan
dimasukkan kedalam kultur sel manusia melalui teknik transfeksi. Enzim perbaikan DNA sel ini
memperbaiki keruskan melalui cara yang serupa dengan DNA seluler. DNA yang diperbaiki
kemudian akan berfungsi menyalin gen luciferase terkode plasmid pada sel manusia. Jumlah
aktivitas dalam sel pejamu kemudian mencerminkan sistem perbaikan DNA Seluler. Assay ini
juga dapat digunakan untuk menentukan kelompok komplementasi dengan cara ko-transfeksi
plasmid yang diberi UV ditambah plasmid yang mengekspresikan DNA kompementar XP tipe-
liar (cDNA). B. Hasil dari percobaan reaktivasi plasmid sel pejamu dan penempatan kelompok
komplementas dengan sel XP46DC defisien perbaikan DNA eksisi. Plasmid yang diberi UV
menunjukkan ekspresi rendah terhadap sel XP65BE yang ditingkatkan hanya melalui ko-transfeksi
dengan mengekspresikan plasmid cDNA XPC tipe liar. Hasil ini mengindikasikan bahwa sel
XP65BE berada pada kelompok komplementasi C XP(XPC). rLu= relative light units; pCMVluc
dan pLUC = plasmid mengandung gen luciferase; pXPA=pXPG= plasmid mengekspreikan
kelompok komplementasi A-G xeroderma pigmentosum.

Assay Comet
Assay comet merupakan teknik sel tunggal yang menyebabkan deteksi dan kuantitasi kerusakan
DNA, terutama kerusakan untaian DNA yang entah dikenalkan langsung oleh agen perusak DNA
atau oleh endonuklease perbaikan pada daerah-daerah kerusakan DNA tipe lainnya. Untuk assay
ini, sel-sel rusak disimpan dalam agarose, dilisis dan dipaparkan terhadap ladang listrik. Pada
ladang listrik, DNA bermigrasi keluar dari nukleus membentuk “komet” ketika diwarnai. Pada
saat terjadi kerusakan untaian DNA, DNA bermigrasi keluar dari nukleus lebih cepat dan
kemudian menghasilkan komet lebih panjang. Karena itu panjang dari komet sesuai proporsi
dengan fragmentasi nukleus DNA. Assay ini dimodifikasi untuk mendeteksi kerusakan DNA
untaian tunggal atau ganda, kerusakan UV, atau kerusakan DNA oksidatif. Sel-sel dari pasien
dengan DNA memiliki defek perbaikan pada assay komet paska UV.

6
Ketidakstabilan Mikrosatelit
DNA normal memiliki puluhan ribu daerah dengan CA dinukleotid berulang atau motif pendek
hingga panjang lima nukleotida. Pada individu normal, tiap mikrosatelit ini (disebut juga simple
sequence repeats atau short tandem repeat) memiliki ukuran seragam. Namun ukuran ini sangat
bervariasi diantara individu berbeda dan seringkali digunakan dalam “sidik jari” DNA. Tampilan
sekuens abnormal lebih panjang atau pendek berulang pada jaringan berbeda atau tumor dari
pasien yang disebut ketidakstabilan mikrosatelit. Hal ini dapat dikaitkan dengan defek gen
perbaikan mismatch.

KARAKTER DAN EKSPRESI GEN CACAT

Real-Time Polymerase Chain Reaction
Beberapa mutasi penyebab penyakit, termasuk yang bertanggungjawab terhadap kelainan
ketidakstabilan genom mengganggu fungsi produk gen dengan cara mengganti sekuens asam
aminonya. Pada beberapa gen ketidakstabilan genom, mutasi penyebab penyakit menyebabkan
penghentian dini kodon untuk sintesis protein. Mutasi ini menyebabkan tidak hanya pemendekan
tetapi juga messenger RNA (mRNA) level rendah terhadap produk gen melalui suatu proses yang
dinamakan nonsense-mediated message decay. Level mRNA ini dapat diukur secara tepat
menggunakan quantitative reverse transcriptase real-time polymerase chain reaction. Contohnya
mRNA XPC level rendah telah ditemukan pada sel-sel dari kebanyakan pasien XP dengan defek
pada gen ini.

Western Blotting
Beberapa mutasi mengakibatkan penurunan level atau ukuran protein terkode, seringkali melalui
pembentukan penghentian dini kodon. Penurunan level protein sering ditemukan melalui Western
blotting. Sel-sel dilisis dan protein diekstraksi dan dipisahkan melalui gel elektroforesis. Protein
terpisah ini ditransfer pada membran dan diperiksa dengan antibodi yang spesifik terhadap protein
tujuan. Intensitas pewarnaan antibodi mencerminkan jumlah protein didalam sel dan lokasinya
pada membran mengindikasikan ukuran dari molekul protein. Misalnya level rendah atau tidak
terdeteksi dari protein eta polymerase didapatkan kebanyakan dari sel pasien varian XP.

DNA Sequencing
Sekuensing langsung gen cacat merupakan standart baku dalam menentukan adanya mutasi.
Langkah akhir dalam mengkonfirmasi diagnosis mungkin adalah sekuensing DNA untuk
menentukan mutasi penyebab penyakit. Berdasarkan harafiah, mutasi penyebab penyakit
mengubah fungsi gen. Namun tidak semua perubahan pada sekuens gen mengubah fungsi protein
terkode. Pada genom manusia didapatkan jutaan polimorfisme nukleotida tunggal atau perubahan
pada satu nukleotida, yang tidak dikaitkan dengan penyakit dan mungkin tidak akan mengubah
komposis asam amino dari protein terkode. Pada kelainan resesif, tiap orangtua yang tidak terkena
secara klinis memiliki satu alel normal dan satu alel yang berpotensi mutasi penyebab penyakit.
Anak yang terkena menerima alel dengan mutasi penyebab penyakit dari masing-masing orangtua.

7
Dua mutasi harus selalu dari gen yang sama, walaupun mereka tidak selalu identik dengan satu
sama lain.

PERTIMBANGAN PEMERIKSAAN DIAGNOSTIK

Diagnosis kelainan ketidakstabilan genom atau perbaikan DNA seringkali merupakan proses multi
langkah. Langkah sekuens yang disarankan telah disusun pada Tabel 110-7. Ketika pemeriksaan
baru dikembangkan dan informasi baru didapatkan melalui kelainan ini, prosedur pemeriksaan
juga dapat berubah. Selain itu keputusan mengenai jangkauan pemeriksaan dibuat dengan
pertimbangan biaya pemeriksaan dan apakah informasi tambahan dapat mengubah terapi. Sebagai
contoh, sekuens DNA jarang diperlukan untuk menegakkan diagnosis XP pada anak dengan
gambaran klinis klasik dan sel yang hipersensitif terhadap kematian akibat UV dan memiliki
kecacatan perbaikan DNA. Tetapi ketika keluarga memiliki satu anak dengan XP dan
mempertimbangkan memiliki anak lagi, sekuens DNA dapat memberikan pilihan kemungkinan
diagnosis prenatal melalui sekuens DNA dari spesimen biopsi trofoblas.
Konsul genetika merupakan unsur penting dalam manajemen pasien untuk penyakit
genetik ini. Fungsi ini dilakukan oleh dokter atau konselor genetik terlatih.
Di Amerika Serikat, hanya laboratorium bersertifikat sesuai dengan Clinical Laboratory
Improvement Act (CLIA) yang diizinkan melakukan pemeriksaan khusus ini dalam konteks
perawatan pasien. Pemeriksaan ini dilakukan pada laboratorium penelitian biasanya terbatas
dalam penggunaannya pada praktik klinis. Namun beberapa laboratorium penelitian telah
mengidentifikasi suatu mutasi penyakit pada sel dari pasien yang kemudian telah dikonfirmasi
oleh laboratorium bersertifikat CLIA dan digunakan pada praktik klinis. Daftar dari fasilitas
laboratorium pemeriksaan terkini dari penyakit-penyakit ini dapat ditemukan di website
http://genetests.org, yang didanai oleh National Institutes of Health.