UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL, FRAKSI n-HEKSAN,

FRAKSI ETIL ASETAT DAN FRAKSI AIR DARI KULIT BUAH KOPI
ROBUSTA (Coffea canephora) TERHADAP Streptococcus mutans

SKRIPSI
Diajukan untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi S1 Farmasi
Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi “YAYASAN PHARMASI” Semarang

Nino Suryaning Kencana

1041211117

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI "YAYASAN PHARMASI"
SEMARANG
2016

1
ii
 HALAMAN PERNYATAAN

Yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Nino Suryaning Kencana

NIM : 1041211117

Judul : Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol, Fraksi n-Heksan,

Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Dari Kulit Buah Kopi

Robusta (Coffea canephora) Terhadap Streptococcus

mutans.

Tahun Pembuatan : 2016

Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi saya tidak terdapat karya yang

pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi,

dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang

pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu

dalam naskah skripsi saya dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Semarang, Juni 2016

Nino Suryaning Kencana

iii
 MOTTO DAN PERSEMBAHAN

“Tidak akan pernah kau temui akhiran tanpa awalan.

Jika Salah, Perbaiki. Jika Gagal, Coba Lagi.
Tapi,
Jika Kamu Menyerah, Semuanya Selesai.”

Dengan rasa syukur atas kehadirat Allah SWT yang selalu memberikan
perlindungan dan kemudahan, kupersembahkan karya ini untuk :

Ayah dan Ibu tercinta,

Sebagai wujud hormat dan baktiku

Kakak dan Adikku tersayang

Sebagai ungkapan rasa cinta dan sayangku

Bu Mur dan Bu Indah

Sebagai sumber inspirasi dan motivatorku

Sahabat-sahabatku yang selalu mendukungku

Diriku dan Almamaterku STIFAR

iv
 PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan sebab atas rahmat-Nya, penulis

dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak

Etanol, Fraksi n-Heksan, Fraksi Etil Asetat Dan Fraksi Air Dari Kulit Buah Kopi

Robusta (Coffea canephora) Terhadap Streptococcus mutans”. Skripsi ini disusun

untuk memenuhi salah satu syarat dalam mencapai gelar Sarjana Farmasi pada

Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi ”Yayasan Pharmasi” Semarang.

Dalam proses penyusunan skripsi ini penulis tidak lepas dari bantuan banyak

pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih

kepada :

1. Dra. Erlita Verdia Mutiara, M.Si., Apt., selaku Ketua Sekolah Tinggi Ilmu

Farmasi “Yayasan Pharmasi” Semarang yang telah memberikan bekal ilmu

pengetahuan dan kesempatan pada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

2. Intan Martha Cahyani, M.Sc., Apt., selaku Ketua Program Studi S1 Farmasi

Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi “Yayasan Pharmasi” Semarang yang telah

memberikan bekal ilmu pengetahuan dan kesempatan pada penulis untuk

menyelesaikan skripsi ini.

3. Dra. Sri Muryati, M.Kes., Apt., selaku dosen pembimbing I yang telah

memberikan arahan, bimbingan, dan motivasi dalam menyelesaikan skripsi ini.

4. Indah Sulistyarini, M.Si., selaku dosen pembimbing II yang telah memberikan

arahan, bimbingan, dan motivasi dalam menyelesaikan skripsi ini.

5. Lia Kusmita, M.Si., selaku dosen penguji I yang telah memberikan nasehat

dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

v
6. Dyan Wigati, M.Sc., Apt., selaku dosen penguji II yang telah memberikan

nasehat dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

7. Drs. Agus Suprijono, M.Kes., Apt., selaku dosen wali yang telah memberikan

semangat, pengarahan, nasehat dan saran selama ini.

8. Segenap dosen, staf dan karyawan Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi “Yayasan

Pharmasi” Semarang.

9. Ayah, Ibu, Kakak dan Adek serta keluarga besar yang tak pernah lelah

memberi doa dan dukungan dalam menyelesaikan skripsi ini.

10. Teman-temanku Nanda, Nandya, Intan, Gelis, Marisa, Nanik, Lina, Iin, Oyen,

Febry, Isnu, Zena, Fika, Tiu, Odil, Puput, Sumi, Trin, Arya terima kasih atas tawa,

dukungan, semangat, dan persahabatan yang sudah kalian berikan selama kuliah

sampai saat ini.

11. Semua teman-teman angkatan 2012 terutama kelas B dan teman-teman

laboratorium biologi farmasi, terima kasih atas bantuan dan kebersamaannya

selama kuliah dan terima kasih atas dukungan, semangat, dan do’anya.

Penulis berharap semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi

pembaca, khususnya dunia kefarmasian dan bidang kesehatan.

Semarang, Juni 2016

Penulis

vi
 SARI

Karies gigi adalah suatu penyakit jaringan keras gigi yang diakibatkan oleh
mikroorganisme yang dapat memfermentasikan karbohidrat sehingga terbentuk
asam dan menurunkan pH. Mikroorganisme patogen penyebab utama terjadinya
karies gigi adalah bakteri Streptococcus mutans. Pemberian antibiotika diharapkan
mampu mengeliminasi bakteri penyebab infeksi, namun penggunaannya yang
tidak tepat dapat menyebabkan terjadinya resistensi. Polifenol, pektin, kafein,
asam klorogenat dan tanin merupakan senyawa yang terkandung dalam kulit buah
kopi robusta (Coffea canephora) yang berpotensi sebagai antibakteri.
Pemanfaatan kulit buah kopi robusta merupakan upaya alternatif pengobatan
karies gigi.
Tujuan dari penelitian ini adalah 1) Mengetahui daya hambat ekstrak etanol,
fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta terhadap
Streptococcus mutans; 2) Mengetahui pengaruh perbedaan konsentrasi pada
masing-masing ekstrak etanol, fraksi n- heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air
kulit buah kopi robusta terhadap daya antibakteri pada pertumbuhan
Streptococcus mutans; 3) Mengetahui golongan senyawa yang memiliki aktivitas
antibakteri dengan cara bioautografi.
Ekstrak etanol kental kulit buah kopi robusta diperoleh dengan metode
remaserasi 4 x 24 jam dengan pelarut etanol 70%. Ekstrak kental etanol
difraksinasi menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat dan air. Ekstrak dan fraksi
kental diuji skrining fitokimia dan ditegaskan dengan uji Kromatografi Lapis
Tipis. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode sumuran dan pengukuran
zona bening menggunakan jangka sorong.
Hasil menunjukkan bahwa ekstrak etanol, fraksi n-heksan danfraksi etil
asetat mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, tanin dan triterpenoid/steroid.
Fraksi air mengandung flavonoid, alkaloid, saponin dan tanin. Diameter rata-rata
zona bening pada ekstrak 10%, 12,5% dan 15% berturut-turut sebesar 0,357 cm;
0,436 cm; 0,519 cm. Fraksi etil asetat sebesar 0,596 cm; 0,763 cm; 0,876 cm.
Fraksi air sebesar 0,549 cm; 0,575 cm; 0,622 cm. Sedangkan fraksi n-heksan tidak
ditemukan adanya zona bening yang terbentuk. Analisis data dengan software
SPSS menunjukkan hasil tidak berbeda signifikan antara fraksi etil asetat 10%
dengan fraksi air 12,5% (sig. 0,277>0,05), antara fraksi etil asetat 10% dengan
fraksi air 15% (sig. 0,206>0,05), antara fraksi air 10% dengan fraksi air 12,5%
(sig. 0,192>0,05), antara fraksi air 10% dengan ekstrak 15% (sig. 0,133>0,05).
Pengujian bioautografi kontak dilakukan pada ekstrak etanol, fraksi
n-heksan,fraksi etil asetat dan fraksi air. Setiap golongan senyawa yang di uji
bioautografi dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

Kata kunci: kulit kopi robusta, fraksi, Streptococcus mutans, bioautografi.

vii
 DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
i
HALAMAN PENGESAHAN
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
ii
HALAMAN PERNYATAAN
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
iii
HALAMAN MOTTO DAN PERSEMBAHAN
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
iv
PRAKATA
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
v
SARI
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
vii
DAFTAR ISI
...................................................................................................................
...................................................................................................................
viii
DAFTAR TABEL
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
xii
DAFTAR GAMBAR
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
xiii
DAFTAR LAMPIRAN

viii
 ix

..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
xiv
BAB I PENDAHULUAN
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
1
1.1 Latar Belakang Masalah

1
1.2 Rumusan Masalah

2
1.3 Batasan Penelitian

3
1.4 Tujuan Penelitian

4
1.5 Manfaat Penelitian

5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA DAN HIPOTESIS
.....................................................................................................................
.....................................................................................................................
6
2.1 Tinjauan Tentang Tanaman Kopi Robusta
..............................................................................................................
..............................................................................................................
6
2.1.1 Klasifikasi Tanaman Kopi Robusta
.....................................................................................................
.....................................................................................................
6
2.1.2 Morfologi Tanaman
.....................................................................................................
.....................................................................................................
6
2.1.3 Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)
.....................................................................................................
.....................................................................................................
7
 x

2.1.4 Kandungan Kimia Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora). .

..........................................................................................................
8
2.1.5 Khasiat dan Kegunaan
.....................................................................................................
.....................................................................................................
9
2.2 Tinjauan Tentang Flavonoid

9
2.3 Tinjauan Tentang Alkaloid

11
2.4 Tinjauan Tentang Tanin

12
2.5 Tinjauan Tentang Saponin

13
2.6 Tinjauan Tentang Triterpenoid/Steroid

14
2.7 Tinjauan Tentang Ekstraksi

14
2.8 Tinjauan Tentang Fraksinasi

18
2.9 Tinjauan Tentang Kromatografi

19
 2.9.1 Kromatografi Lapis Tipis
..................................................................................................
..................................................................................................
19
2.10 Tinjauan Tentang Karies Gigi

20
2.11Tinjauan Tentang Bakteri

21
2.11.1 Klasifikasi Bakteri Streptococcus mutans
..................................................................................................
..................................................................................................
22
2.11.2 Morfologi Streptococcus mutans
..................................................................................................
..................................................................................................
22
2.12 Tinjauan Tentang Media Pertumbuhan Bakteri

23
2.12.1 Media Mueller Hinton Agar
..................................................................................................
..................................................................................................
24
2.13 Tinjauan Tentang Antimikroba

25
2.13.1 Mekanisme Kerja Antibakteri
..................................................................................................
..................................................................................................
25
2.13.2 Metode Pengukuran Aktivitas Antibakteri
..................................................................................................
..................................................................................................
27
2.13.3 Kontrol Positif (Amoxcillin Trihidrat)
..................................................................................................
..................................................................................................
29
2.13.4 Kontrol Negatif (DMSO)

xi
 xii

..................................................................................................
..................................................................................................
30
2.14 Tinjauan Tentang Bioautografi

30
2.15 Hipotesis

32
BAB III METODE PENELITIAN
.....................................................................................................................
.....................................................................................................................
33
3.1 Obyek Penelitian
..............................................................................................................
..............................................................................................................
33
3.2 Sampel dan Teknik Sampling
..............................................................................................................
..............................................................................................................
33
3.2.1 Sampel
..................................................................................................
..................................................................................................
33
3.2.2 Teknik Sampling
..................................................................................................
..................................................................................................
33
3.3 Variabel Penelitian
..............................................................................................................
..............................................................................................................
33
3.3.1 Variabel Bebas
..................................................................................................
..................................................................................................
33
3.3.2 Variabel Terikat
..................................................................................................
..................................................................................................
34
3.3.3 Variabel Kontrol
 xiii

..................................................................................................
..................................................................................................
34
3.4 Teknik Pengumpulan Data
..............................................................................................................
..............................................................................................................
34
3.5 Alat dan Bahan Penelitian
..............................................................................................................
..............................................................................................................
35
3.5.1 Alat yang Digunakan
.....................................................................................................
.....................................................................................................
35
3.5.2 Bahan yang Digunakan
.....................................................................................................
.....................................................................................................
35
3.6 Prosedur Kerja
..............................................................................................................
..............................................................................................................
36
3.6.1 Determinasi Tanaman
..................................................................................................
..................................................................................................
36
3.6.2 Pengumpulan Bahan
..................................................................................................
..................................................................................................
36
3.6.3 Perolehan Sampel
..................................................................................................
..................................................................................................
36
3.6.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea
canephora).....................................................................................
.......................................................................................................
38
3.6.5 Perhitungan Nilai Rendemen
.......................................................................................................
.......................................................................................................
38
3.6.6 Fraksinasi Ekstrak
.......................................................................................................
.......................................................................................................
38
3.6.7 Uji Pendahuluan dan KLT
.......................................................................................................
.......................................................................................................
39
3.6.8 Pengujian Aktivitas Antibakteri
.......................................................................................................
.......................................................................................................
42
3.6.8.1 Strelisasi Alat
...........................................................................................
...........................................................................................
42
3.6.8.2 Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
...........................................................................................
...........................................................................................
42
3.6.8.3 Peremajaan bakteri Streptococcus mutans
...........................................................................................
...........................................................................................
43
3.6.8.4 Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)
...........................................................................................
...........................................................................................
43
3.6.8.5 Pembuatan Suspensi Bakteri
...........................................................................................
...........................................................................................
43
3.6.8.6 Larutan ½ Mc Farland
...........................................................................................
...........................................................................................
43
3.6.8.7 Pembuatan Media Mueller-Hinton Agar (MHA)

xiv
 xv

...........................................................................................
...........................................................................................
44
3.6.8.8 Pembuatan Ekstrak Etanol, Fraksi N-Heksan, Fraksi Etil
Asetat dan Fraksi Air Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea
canephora) dengan Berbagai Konsentrasi
...........................................................................................
...........................................................................................
45
3.6.8.9 Pembuatan Larutan Kontrol Positif (Amoxicillin
Trihidrat)
...........................................................................................
...........................................................................................
45
3.6.8.10 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol, Fraksi
n-Heksan, Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Kulit Buah
Kopi Robusta (Coffea canephora) dengan Metode
Sumuran

45
3.6.9 Uji Bioautografi
..................................................................................................
..................................................................................................
46
3.7 Skema Kerja
..............................................................................................................
..............................................................................................................
47
3.7.1 Skema Kerja Secara Umum
..................................................................................................
..................................................................................................
47
3.7.2 Ekstraksi Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)
..................................................................................................
..................................................................................................
48
3.7.3 Fraksinasi Kulit Biuah Kopi Robusta (Coffea canephora)
..................................................................................................
..................................................................................................
49
3.7.4 Identifikasi Senyawa Secara Kromatografi Lapis Tipis
 xvi

..................................................................................................
..................................................................................................
50
3.7.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri
..................................................................................................
..................................................................................................
51
3.7.6 Pengujian Bioautografi
..................................................................................................
..................................................................................................
52
3.8 Cara Analisis
..............................................................................................................
..............................................................................................................
53
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
.....................................................................................................................
.....................................................................................................................
54
BAB V SIMPULAN DAN SARAN
.....................................................................................................................
.....................................................................................................................
71
5.1 Simpulan
..............................................................................................................
..............................................................................................................
71
5.2 Saran
..............................................................................................................
..............................................................................................................
72
DAFTAR PUSTAKA
.....................................................................................................................
.....................................................................................................................
73
LAMPIRAN
.....................................................................................................................
.....................................................................................................................
79
 DAFTAR TABEL

Tabel Halaman
1. Deret Eluotropik.........................................................................................
18
2. Hasil Pengujian Bebas Etanol Ekstrak Etanol Kulit Buah Kopi Robusta
(Coffea canephora).....................................................................................
55
3. Hasil Skrining Fitokimia Serbuk, Ekstrak Etanol, Fraksi n-Heksan,
Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea
canephora)..................................................................................................
58
4. Hasil Identifikasi KLT Ekstrak dan Fraksi Kulit Buah Kopi Robusta
(Coffea canephora).....................................................................................
59
5. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi n-Heksan, Fraksi Etil Asetat dan
Fraksi Air....................................................................................................
64

xvii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman
1. Tanaman Kopi Robusta

7
2. Bagian-bagian dari buah kopi

8
3. Struktur Flavonoid

11
4. Struktur Alkaloid

11
5. Struktur Tanin

12
6. Struktur Saponin

13
7. Koloni Streptococcus mutans

22
8. Struktur Amoksisilin

30
9. Skema Kerja Secara Umum

47
10. Ekstraksi Secara Remaserasi Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea
canephora)

48
11. Fraksinasi Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

49
12. Identifikasi Senyawa Secara Kromatografi Lapis Tipis

xviii
 xix

50
13. Pengujian Aktivitas Antibakteri

51
14. Pengujian Bioautografi

52
15. Diagram Zona Bening Ekstrak Etanol, Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air
Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

66
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman
1. Surat Keterangan Identifikasi Tanaman
79
2. Surat Keterangan Bakteri Streptococcus mutans
80
3. Surat Keterangan Amoksisilin
81
4. Tanaman Kopi Robusta
82
5. Kulit Buah Kopi Robusta
83
6. Proses Pembuatan Serbuk Simplisia Kulit Buah Kopi Robusta
84
7. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Kopi Robusta
85
8. Fraksinasi Kulit Buah Kopi Robusta
86
9. Data Penimbangan
87
10. Hasil Uji Bebas Etanol Ekstrak Kulit Buah Kopi Robusta
88
11. Hasil Uji Pendahuluan
89
12. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Flavonoid Kulit Buah Kopi
Robusta
91
13. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Alkaloid Kulit Buah Kopi
Robusta
92
14. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Saponin Kulit Buah Kopi
Robusta
93
15. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Tanin Kulit Buah Kopi
Robusta
94

xx
 xxi

16. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Triterpen /SteroidKulit

Buah Kopi Robusta
95
17. Bakteri Streptococcus mutans
96
18. Pembuatan Media
97
19. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji dan Kontrol Positif
98
20. Sampel Ekstrak, Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Kulit Buah Kopi
Robusta
100
21. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol
101
22. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Etil Asetat
102
23. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Air
103
24. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi n-Heksan
104
25. Hasil Bioautografi Ekstrak
105
26. Hasil Bioautografi Fraksi n-Heksan
106
27. Hasil Bioautografi Fraksi Etil Asetat
107
28. Hasil Bioautografi Fraksi Air
108
29. Instrumen Penelitian
109
30. Hasil Uji Statistika
110

xxii
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Karies gigi adalah suatu penyakit jaringan keras gigi yang diakibatkan oleh

mikroorganisme yang dapat memfermentasikan karbohidrat sehingga terbentuk

asam dan menurunkan pH. Akibatnya terjadi demineralisasi jaringan keras gigi

(Sumawinata, 2002). Salah satu bakteri yang secara umum dianggap sebagai agen

penyebab utama karies gigi adalah Streptococcus mutans (Kidd dan Sally, 1991).

Menurut Octiara dan Budiarjo (2008), prosentase karies gigi yang disebabkan

Streptococcus mutans sebesar 74-94%.

Salah satu cara untuk mencegah terjadinya karies gigi adalah dengan

menghambat aktivitas bakteri rongga mulut. Penghambatan populasi bakteri

biasanya dilakukan dengan menggunakan obat antibiotik. Namun penggunaan

antibiotik yang kurang tepat dan pemberian antibiotik dalam jangka waktu lama

dapat menyebabkan terjadinya resistensi pada bakteri. Oleh karena itu perlu

dilakukan penelitian untuk mendapatkan alternatif pengganti antibiotik, salah

satunya dengan menggunakan bahan alam sebagai bahan baku pembuatan obat.

Bahan alam yang dapat digunakan sebagai obat salah satunya adalah kulit buah

kopi robusta (Coffea canephora).

Kulit buah kopi robusta merupakan limbah hasil perkebunan yang sejauh ini

hanya dimanfaatkan sebagai campuran pakan ternak dan sebagian diolah menjadi

pupuk kompos organik (Ummatin dan Alifia, 2015). Pemanfaatan limbah kulit

buah kopi robusta tersebut kurang efektif karena kulit buah kopi robusta memiliki

1
 2

kandungan senyawa kimia yang dapat dimanfaatkan lebih luas dalam bidang

kesehatan khususnya farmasi. Kandungan kimia yang terdapat dalam kulit buah

kopi robusta antara lain senyawa polifenol, pektin, kafein, asam klorogenat dan

tanin (Murthy, 2011). Senyawa yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri

yang terkandung di dalam kulit buah kopi robusta adalah kafein (Widyotomo dan

Mulato, 2007), fenol dan asam klorogenat (Fardiaz, 1995). Penelitian tentang

aktivitas antibakteri dari limbah kulit kopi telah dilkukan oleh Simanjuntak, dkk

(2014) dan diperoleh hasil bahwa ekstrak kulit kopi memiliki aktivitas antibakteri

terhadap bakteri Ralstonia solanacearum.

Dari ulasan tersebut, peneliti tertarik untuk mengetahui aktivitas antibakteri

ekstrak dan fraksi kulit buah kopi robusta terhadap Streptococcus mutans untuk

pengobatan penyakit karies gigi.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air kulit

buah kopi robusta (Coffea canephora) memiliki aktivitas antibakteri terhadap

pertumbuhan Streptococcus mutans ?

2. Apakah ada perbedaan aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan,

fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea canephora)

pada konsentrasi 10%, 12,5% dan 15% terhadap pertumbuhan Streptococcus

mutans ?

3. Golongan senyawa apakah yang diduga memiliki aktivitas sebagai antibakteri

dengan metode bioautografi ?

 3

1.3 Batasan Penelitian

1. Bagian tanaman yang digunakan adalah kulit buah kopi robusta (Coffea

canephora) yang sudah matang yang diperoleh dari perkebunan di daerah

Sumowono, Kabupaten Semarang.

2. Ekstrak yang digunakan untuk uji antibakteri terhadap Streptococcus mutans

adalah ekstrak kulit buah kopi robusta (Coffea canephora), yang diperoleh

dengan remaserasi serbuk kulit buah kopi robusta dalam etanol 70% selama

4 hari.

3. Fraksi yang digunakan untuk uji antibakteri terhadap Streptococcus mutans

adalah fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air yang diperoleh dengan

cara partisi menggunakan corong pisah.

4. Pelarut yang digunakan untuk fraksinasi adalah n-heksan, etil asetat, dan

aquadest.

5. Identifikasi kandungan senyawa pada ekstrak dan fraksi kulit buah kopi

robusta (Coffea canephora) dilakukan secara skrining fitokimia dan

kromatografi lapis tipis (KLT).

6. Bakteri yang digunakan untuk uji antibakteri adalah Streptococcus mutans

yang diperoleh dari Rumah Sakit Dr. Kariadi Semarang.

7. Media untuk pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans adalah Mueller

Hinton Agar (MHA).

8. Media untuk peremajaan bakteri Streptococcus mutans yaitu media Nutrient

Agar (NA).

9. Media yang digunakan untuk membuat suspensi bakteri yaitu media Nutrient

Broth (NB).
 4

10. Metode yang digunakan untuk uji antibakteri ekstrak dan fraksi kulit buah

kopi robusta (Coffea canephora) terhadap Streptococcus mutans adalah

dengan menggunakan metode difusi sumuran.

11. Sampel yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah ekstrak

etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta

dengan konsentrasi 10%, 12,5% dan 15%.

12. Aktivitas antibakteri yang diamati berupa zona bening pada media

pertumbuhan bakteri.

13. Kontrol positif yang digunakan untuk pengujian antibakteri adalah serbuk

amoksisilin trihidrat.

14. Kontrol negatif yang digunakan untuk pengujian antibakteri adalah DMSO.

15. Pelarut ekstrak dan fraksi digunakan DMSO.

1.4 Tujuan Penelitian

1. Mengetahaui aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil

asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea canephora) terhadap

Streptococcus mutans.

2. Mengetahui perbedaan aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan,

fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea canephora)

pada konsentrasi 10%, 12,5% dan 15% terhadap pertumbuhan Streptococcus

mutans.

3. Mengetahui golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dengan

metode bioautografi.
 5

1.5 Manfaat Penelitian

1. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat

mengenai manfaat kulit buah kopi robusta (Coffea canephora) sebagai limbah

yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri

Streptococcus mutans.

2. Penelitian ini diharapkan dapat dikembangkan menjadi produk atau sediaan

farmasi yang bermanfaat sebagai antibakteri terhadap Streptococcus mutans.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA DAN HIPOTESIS

2.1 Tinjauan Tentang Tanaman Kopi Robusta

2.1.1 Klasifikasi Tanaman Kopi Robusta

Berdasarkan litelatur diperoleh sistematika (taksonomi) tumbuhan, tanaman

kulit buah kopi robusta dapat diklasifikasikan sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Ordo : Rubiales

Famili : Rubiaceae

Genus : Coffea L

Spesies : Coffea canephora

Nama Indonesia : Kopi Robusta (Lampiran 1)

2.1.2 Morfologi Tanaman

Tanaman kopi mempunyai batang tegak, bercabang, dan tingginya bisa

mencapai 12 meter. Kopi mempunyai sistem percabangan yang agak berbeda

dengan tanaman lain. Tanaman ini mempunyai beberapa jenis cabang yang sifat

dan fungsinya berbeda. Cabang yang tumbuhnya tegak dan lurus disebut cabang

reproduksi. Cabang ini berasal dari tunas reproduksi yang terdapat di setiap ketiak

daun pada cabang utama atau cabang primer. Tanaman kopi berbunga setelah

berumur sekitar dua tahun. Bunga tersusun dalam kelompok, masing-masing

6
 7

terdiri dari 4-6 kuntum bunga. Pada setiap ketiak daun dapat menghasilkan 2-3

kelompok bunga. Bunga kopi berukuran kecil, mahkotanya berwarna putih dan

harum. Kelopak bunga berwarna hijau, dan benang sarinya terdiri dari 5-7 tangkai

berukuran pendek. Kelopak dan mahkota akan membuka saat bunga telah dewasa,

kemudian bunga tersebut akan berkembang menjadi buah yang disajikan pada

gambar 1.

Gambar 1. Tanaman Kopi Robusta (Murtafiah, 2012)

Buah muda berwarna hijau, kemudian kulitnya menguning dan menjadi

merah tua. Waktu yang diperlukan sejak terbentuknya bunga hingga buah menjadi

matang sekitar 6-11 bulan, tergantung jenis dan faktor lingkungannya. Buah

terdiri dari daging buah dan biji dengan diameter ± 5 mm. Umumnya, buah kopi

mengandung dua butir biji. Namun, ada juga yang berbiji satu atau sama sekali

tidak berbiji karena bakal biji tidak berkembang sempurna. Lembaga (endosperm)

merupakan bagian yang dimanfaatkan untuk membuat minuman kopi (Suwarto

dan Octavianty, 2010).

2.1.3 Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

Pada proses pengolahan biji kopi, ada bagian buah yang dibuang yaitu pulp

(bagian mesocarp), skin (bagian eksokarp), mucilage dan parchment (bagian

 8

endocarp) dan semua bagian itu disebut limbah kulit buah kopi. Limbah yang

dihasilkan sekitar 40-45% dari berat kopi yang diolah. Di Indonesia sendiri

pemanfaatan limbah ini hanya sebagai pakan ternak dan menjadi pupuk bagi

tanaman (Mahesa, 2012). Bagian-bagian dari buah kopi disajikan pada gambar 2.

Gambar 2. Bagian-bagian dari buah kopi (Esquivel dan Victor, 2011)

Buah kopi umumnya mengandung dua butir biji,tetapi ada juga yang berbiji

satu atau sama sekali tidak berbiji karena bakal biji tidak berkembang sempurna.

Lembaga atau endosperm merupakan bagian yang dimanfaatkan untuk membuat

minuman kopi (Suwarto dan Octavianty, 2010).

2.1.4 Kandungan Kimia Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

Kandungan dari kulit buah kopi robusta bergantung pada kondisi geografis,

sistem perkebunan dan lainnya. Kandungan dari kulit buah kopi robusta (Coffea

canephora) antara lain karbohidrat, protein, asam amino, garam mineral, tanin,

polifenol dan kafein. Selain itu, juga mengandung gula tereduksi, gula tidak

tereduksi, gula fermentasi yang utamanya adalah fruktosa, sukrosa dan galaktosa,

pektin, asam klorogenat, abu (Murthy, 2011). Beberapa senyawa polifenol yang
 9

terkandung adalah tanin, flavonol, flavan-3-ol, asam hidroksinamat dan kafein.

(Esquivel dan Victor, 2011).

2.1.5 Khasiat dan Kegunaan

Limbah kulit kopi jenis cangkang dan kulit ari biasanya dimanfaatkan

sebagai campuran pakan ternak dan sisanya dikembalikan ke alam bersama kulit

pulp sehingga dalam beberapa waktu sebagian diolah menjadi kompos organik

(Ummatin dan Alifia, 2015).

Berdasarkan penelitian Wibowo dalam Widyotomo (2013), limbah kopi

dapat digunakan sebagai media tanam alternatif dan memberikan pertumbuhan

yang baik pada Anthurium plowmanii Scoat. Penelitian pemanfaatan limbah

pengolahan kopi sebagai bahan baku proses produksi biogas juga telah banyak

dilakukan. Selain itu, limbah kopi juga memiliki aktivitas antioksidan (Murthy,

2011).

Senyawa fenolik seperti asam klorogenat memiliki efek positif terhadap

kesehatan antara lain mencegah genotoksisitas monokloramin pada mukosa

lambung (Shibata dkk., 2010), mengurangi resiko gout (Choi dan Gary, 2007),

menghambat pertumbuhan kanker (Lee dan Zhu, 2006) dan menurunkan resiko

penyakit jantung koroner, menurunkan berat badan (Tom, 2007).

2.2 Tinjauan Tentang Flavonoid

Flavonoid termasuk dalam golongan senyawa fenolik dengan struktur kimia

C6-C3-C6. Kerangka flavonoid terdiri atas satu cincin aromatik A, satu cincin

aromatik B, dan cincin tengah berupa heterosiklik yang mengandung oksigen dan

bentuk teroksidasi cincin ini dijadikan dasar pembagian flavonoid ke dalam sub-
 10

sub kelompoknya. Sistem penomoran digunakan untuk membedakan posisi

karbon di sekitar molekulnya (Redha, 2010). Flavonoid terdapat pada semua

bagian tumbuhan termasuk akar, daun, kayu, kulit, tepung sari, nektar, bunga,

buah dan biji (Harborne, 1987). Pengujian senyawa flavonoid dapat dilakukan

dengan metode Wilstater yang hasilnya berupa perubahan warna menjadi merah,

kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. Warna merah tua tersebut

menunjukkan adanya flavonol atau flavonon, sedangkan warna hijau sampai biru

menunjukkan adanya aglikon atau glikosida (Pratiwi dkk, 2013).

Aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia

senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa.

Flavonoid merupakan suatu senyawa polar, maka umumnya flavonoid larut dalam

pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida,

dimetilformamida, air dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoid

cenderung menyebabkan flavonoid mudah larut dalam air dan dengan demikian

campuran pelarut polar merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida.

Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon

cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter (Markham, 1988).

Senyawa flavonoid dapat diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada

dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid

mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi dan karena itu menunjukkan pita

serapan kuat pada daerah spektrum UV dan spektrum sinar tampak (Harborne,

1987). Struktur flavonoid disajikan pada gambar 3.

 11

B
A

Gambar 3. Struktur Flavonoid (Robinson, 1995)

2.3 Tinjauan Tentang Alkaloid

Alkaloid merupakan metabolit sekunder dari tumbuhan. Alkaloid mencakup

senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya

dalam gabungan sebagai bagian dari sistem siklik. (Harborne, 1987). Alkaloid

umumnya tidak larut dalam air, tetapi bereaksi dengan asam membentuk garam

yang larut dalam air, basa alkaloid akan larut dalam pelarut organik seperti eter,

kloroform atau pelarut relatif non polar serta dengan penambahan logam berat

akan terbentuk endapan. Alkaloid mengandung nitrogen sebagai bagian dari

sistem sikliknya, adanya substituen yang bervariasi seperti gugus amina, amida,

fenol dan metoksi menyebabkan alkaloid bersifat semi polar (Puspitasari dkk.,

2013). Struktur alkaloid disajikan pada gambar 4.

N
Gambar 4. Struktur Alkaloid (Robinson, 1995)

Pengujian alkaloid dengan penambahan dragendorf menunjukkan hasil

positif terbentuknya endapan merah bata (Septiana dan Partomuan, 2005).

Endapan yang terbentuk terjadi karena adanya ikatan kovalen koordinasi antara

ion logam K+ dengan alkaloid sehingga terbentuk kompleks kalium-alkaloid yang

mengendap (Nafisah dkk., 2014).

 12

2.4 Tinjauan Tentang Tanin

Tanin merupakan salah satu senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada

tanaman dan disintesis oleh tanaman. Tanin tergolong senyawa polifenol dengan

karakteristiknya yang dapat membentuk senyawa kompleks dengan

makromolekul lainnya (Waghorn dan McNabb, 2003). Menurut Robinson, (1991),

hasil positif pada pengujian tanin ditunjukkan dengan terbentuknya endapan

karena adanya ikatan hidrogen antara tanin dengan protein dalam gelatin

(Robinson, 1995).

Tanin dibagi menjadi dua kelompok yaitu tanin yang mudah terhidrolisis

dan tanin terkondensasi. Tanin yang mudah terhidrolisis merupakan polimer gallic

atau ellagic acid, sedangkan tanin terkondensasi merupakan polimer senyawa

flavonoid dengan ikatan karbon-karbon (Westendarp, 2006). Tanin terkondensasi

bersifat tidak larut dalam air dan semakin murni tanin terkondensasi maka

semakin kurang kelarutannya dalam air (Ashok dan Kumud, 2012). Pelarut yang

bersifat polar mampu mengekstrak senyawa kimia seperti tanin (Harborne, 1987).

Struktur tanin disajikan pada gambar 5.

Gambar 5. Struktur Tanin (Sumber: Harborne, 1987)

 13

2.5 Tinjauan Tentang Saponin

Saponin adalah jenis glikosida yang banyak ditemukan dalam tumbuhan.

Saponin memiliki karakteristik berupa buih. Sehingga ketika direaksikan dengan

air dan dikocok maka akan terbentuk buih yang dapat bertahan lama. Saponin

mudah larut dalam air dan tidak tarut dalam eter (Prihatman, 2001). Pengujian

golongan senyawa saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa stabil

(Majumdar, 2005). Busa tersebut dikarenakan adanya kombinasi struktur senyawa

penyusunnya yaitu rantai sapogenin nonpolar dan rantai samping polar yang larut

dalam air (Zahro dan Rudiana, 2013).

Saponin dikenal terdiri dari dua jenis, yaitu glikosida triterpenoid alkohol

dan glikosida steroid yang mempunyai rantai samping spiroketal. Kedua jenis

saponin ini larut dalam air dan etil asetat tetapi tidak larut dalam eter. Aglikonnya

disebut sapogenin, diperoleh dengan hidrolisis memakai enzim dan tanpa bagian

gula, ciri kelarutannya sama dengan sterol (Robinson, 1995). Struktur saponin

disajikan pada gambar 6.

Gambar 6. Struktur Saponin (Sumber: Osbourn, 1996)

 14

2.6 Tinjauan Tentang Triterpenoid/Steroid

Senyawa triterpenoid merupakan senyawa hidrokarbon yang dibedakan

berdasarkan jumlah satuan isoprene penyusunnya, grup metil dan atom oksigen

yang diikatnya (Robinson, 1995).

Steroid (sterol) adalah triterpen yang strukturnya berdasarkan sistem cincin

siklopentana perhidro fenantren. Secara umum, steroid dibedakan menjadi dua,

yakni fitosterol dan kolesterol. Fitosterol yang terdapat dalam tumbuhan

diantaranya sitosterol (-sitosterol), stigmasterol, dan kampesterol (Sirait, 2007).

Pengujian senyawa triterpenoid/steroid ditunjukkan dengan terbentuknya warna

biru atau hijau yang menunjukkan adanya steroid atau warna ungu atau jingga

menunjukkan adanya triterpenoid setelah penambahan H2SO4 pekat (Harborne,

1987). Triterpenoid merupakan senyawa yang tersusun dari rantai panjang

hidrokarbon C30 yang mengakibatkan senyawa ini bersifat non polar. Senyawa

triterpenoid yang berstruktur siklik berupa alkohol, aldehid atau asam karboksilat

dengan gugus-OH mengakibatkan senyawa triterpenoid bersifat semipolar

(Puspitasari dkk., 2013).

2.7 Tinjauan Tentang Ekstraksi

Kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari

bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair disebut dengan ekstraksi

(Depkes RI, 2000). Hasil dari proses ekstraksi disebut ekstrak. Ekstrak adalah

sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau

hewani menurut cara yang cocok, diluar pengaruh cahaya matahari (Depkes RI,

1986).
 15

Cara penyarian dapat dibedakan menjadi ekstraksi panas dan dingin. Secara

umum penyarian akan bertambah baik apabila permukaan serbuk simplisia yang

bersentuhan dengan cairan penyari semakin luas (Depkes RI, 1986).

Tujuan dari ekstraksi adalah untuk pemurnian, pemekatan, atau pemisahan

untuk tujuan analisis. Pemilihan metode tergantung dari bahan tanaman yang akan

diekstraksi. Ekstraksi bahan alam yang tahan terhadap suhu tinggi menggunakan

cara panas seperti soxhletasi atau proses refluks, sedangkan ekstraksi bahan

tanaman yang tidak tahan terhadap suhu tinggi dapat dilakukan maserasi atau

perkolasi. Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi cara dingin

(Depkes RI, 2000).

1. Maserasi

Maserasi adalah cara penyarian yang sederhana yang dilakukan dengan cara

merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus

dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif

tersebut akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antar larutan zat aktif

di dalam sel dan di luar sel. Peristiwa itu berulang-ulang terjadi sehingga terjadi

keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Cairan

penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol ataupun pelarut lain.

Keuntungan metode ekstraksi ini adalah cara pengerjaan dan peralatan yang

digunakan sederhana dan mudah digunakan. Kerugian adalah cara pengerjaan

lama. Metode maserasi dapat dilakukan dengan beberapa modifikasi antara lain

maserasi melingkar, maserasi digesti, remaserasi dan dengan pengadukan

(Depkes RI, 1986).

 16

2. Remaserasi

Metode remaserasi merupakan modifikasi dari maserasi. Maserasi

merupakan metode ekstraksi dengan cara merendam serbuk simplisia dalam

cairan penyari atau proses pengekstrakkan simplisia dengan menggunakan cairan

penyari pada temperatur ruangan (kamar) sedangkan pada remaserasi terjadi

penggantian cairan penyari dengan jumlah yang tetap hingga seluruh senyawa

aktif tersari dalam cairan penyari.

Prinsip remaserasi sama dengan maserasi, yakni adanya proses perendaman

simplisia dengan derajat kehalusan tertentu dan terjadinya kesetimbangan

konsentrasi antara senyawa aktif yang berada di dalam sel dan di luar sel dalam

cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel kemudian masuk

dalam rongga sel yang mengandung zat aktif sehingga akan melarutkan zat aktif.

Peristiwa ini akan terjadi berulang-ulang sehingga akan memaksimalkan hasil

ekstraksi (Depkes RI, 1986).

3. Cairan Penyari

Pada proses pembuatan ekstrak, cairan pelarut yang dipilih adalah pelarut

yang baik atau optimal untuk menyari senyawa kandungan yang berkhasiat atau

yang aktif. Sehingga senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan senyawa

kandungan lainnya, sehingga ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa

kandungan yang diinginkan (Depkes RI, 2000).

Jenis pelarut berkaitan dengan polaritas dari pelarut tersebut dan yang perlu

diperhatikan dalam proses ekstraksi adalah senyawa yang memiliki kepolaran

yang sama akan lebih mudah tertarik dengan pelarut yang memiliki tingkat
 17

kepolaran yang sama. Sehubungan dengan polaritas dari pelarut, terdapat tiga

golongan pelarut yaitu:

a. Pelarut polar

Memiliki tingkat kepolaran yang tinggi, cocok untuk mengekstrak senyawa-

senyawa yang polar dari tanaman. Salah satu contoh pelarut polar adalah: air,

metanol, etanol, asam asetat.

b. Pelarut semipolar

Pelarut semipolar memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah

dibandingkan dengan pelarut polar. Contoh pelarut ini adalah: aseton, etil asetat,

kloroform.

c. Pelarut nonpolar

Pelarut ini baik untuk mengekstrak senyawa-senyawa non polar, seperti

beberapa jenis minyak. Contoh pelarut non polar yaitu heksana, eter.

Syarat-syarat pelarut yang ideal untuk ekstraksi:

a) Tidak toksik

b) Mampu mengekstrak semua senyawa dalam simplisia

c) Mudah untuk dihilangkan dari ekstrak

d) Murah/ekonomis

Pemilihan cairan penyari umumnya berdasarkan sifat kepolaran senyawa

aktif yang dituju. Beberapa cairan penyari tersebut telah dikelompokkan ke dalam

deret eluotropik berdasarkan polaritasnya. Deret eluotropik disajikan pada tabel 2.

 18

Tabel 1. Deret Eluotropik

Tetapan dielektrik Tetapan dielektrik

Pelarut Pelarut
pada 200C pada 200C
n- heksana 1,89 Asam asetat (glasial) 6.15
Petroleum eter 1,90 Metil asetat 6.68
n-oktan 1.95 Tetrahidrofuran 7.58
n-dektan 1.99 Metilenklorida 9.08
n-dodekan 2.01 1-butanol 10.09
Sikliheksana 2.02 Piridina 12.30
1,4-dioksan 2.21 2-butanol 15.80
Benzena 2.28 n-butanol 17.80
Toluene 2.38 2-propanol 18.30
Furan 2.29 1-propanol 20.10
Asam propanoat 3.30 Aseton 20.70
Eter (dietil eter) 3.34 Etanol 24.30
Kloroform 4.81 Metanol 33.60
Butil asetat 5.01 Asam formiat 58.50
Etil asetat 6.02 Air 80.40
(Stahl, 1985)
Deret eluotropik memberikan informasi mengenai kepolaran suatu pelarut.

Semakin besar tetapan dielektriknya, maka pelarut tersebut semakin polar.

2.8 Tinjauan Tentang Fraksinasi

Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan yang bertujuan memisahkan

golongan utama kandungan yang satu dari golongan utama yang lain. Pemisahan

jumlah dan jenis senyawa menjadi fraksi yang berbeda sudah tentu berbeda yang

terkandung pada jenis tumbuhan (Harborne, 1987).

Pemisahan fraksi tersebut dilakukan untuk memanfaatkan sifat-sifat yang

terkandung dalam fraksi. Pada proses fraksinasi biasanya dilakukan proses

ekstraksi terlebih dahulu untuk menghasilkan ekstrak yang selanjutnya dipisahkan

melalui proses fraksinasi (Moran dan Rajah, 1994).

 19

2.9 Tinjauan Tentang Kromatografi

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dalam hal ini

komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salah

satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas,

yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang stasioner. Fasa

stasioner bisa berupa padatan maupun cairan, sedangkan fasa bergerak bisa berupa

cairan maupun gas (Underwood dan Day, 2002).

2.9.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis merupakan cara cepat dan mudah untuk melihat

kemurnian suatu sampel maupun karakterisasi sampel dengan menggunakan

standar. Cara ini praktis untuk analisa skala kecil karena hanya memerlukan bahan

yang sangat sedikit dan waktu yang dibutuhkan singkat. Kemurnian suatu

senyawa bisa dilihat dari jumlah bercak yang terjadi pada plat KLT atau jumlah

puncak pada kromatogram KLT. Uji kualitatif dengan KLT dapat dilakukan

dengan membandingkan waktu retensi kromatogrm sampel dengan kromatogram

senyawa standar (Markham, 1988).

Prinsip dari kromatografi lapis tipis adalah suatu analit bergerak naik atau

melintasi lapisan fase diam seperti gel silika, di bawah pengaruh fase gerak seperti

pelarut organik, yang bergerak melalui fase diam oleh kerja kapiler. Jarak

pemindahan oleh analit tersebut ditentukan oleh afinitas relatifnya untuk fase

diam dibanding fase gerak (Watson, 2009).

Tujuan pemisahan KLT antara lain untuk memperkirakan kandungan zat

berkhasiat yang ditunjukkan adanya bercak pada kromatogram serta digunakan

 20

parameter Rf (Retardation Factor). Bilangan Rf diperoleh dengan mengukur jarak

yang ditempuh senyawa terlarut dibagi dengan jarak yang ditempuh fase gerak

(jarak yang ditempuh cairan pengembang). Bilangan Rf selalu berupa pecahan dan

terletak antara 0,00-1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hRf ialah angka

Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai angka 0-100 (Stahl, 1985).

Jarak yang ditempuh senyawa dari garis awal

Rf = Jarak yang ditempuh fase gerak dari garis awal

2.10 Tinjauan Tentang Karies Gigi

Menurut Sumawinata (2002), kaires gigi adalah suatu penyakit jaringan

keras gigi yang diakibatkan oleh mikroorganisme yang mampu

memfermentasikan karbohidrat sehingga terbentuk asam dan menurunkan pH.

Akibatnya terjadi demineralisasi jaringan keras gigi. Tanda karies adalah

terjadinya demineralisasi mineral email dan dentin diikuti oleh disintegrasi bagian

organiknya. Terdapat empat faktor yang penting dalam terjadinya karies yakni

adanya bakteri kariogenik seperti Streptococcus mutans, karbohidrat yang cocok,

permukaan gigi yang rentan dan waktu. Hanya kalau keempat faktor itu ada maka

karies baru terjadi. Pada saat masih dini, karies dapat terhenti karena adanya

kemungkinan remineralisasi dan karies bukan penyakit yang tidak bisa dicegah.

Plak gigi merupakan lengketan yang berisi bakteri beserta produk-

produknya, yang terbentuk pada semua permukaan gigi. Akumulasi bakteri ini

tidak terjadi secara kebetulan melainkan terbentuk melalui serangkaian tahapan.

Jika email yang bersih terpapar di rongga mulut maka akan ditutupi oleh

lapisan organik yang amorf yang disebut pelikel. Pelikel ini terutama terdiri atas
 21

glikoprotein yang diendapkan dari saliva dan terbentuk segera setelah penyikatan

gigi. Sifatnya sangat lengket dan mampu membantu melekatkan bakteri-bakteri

tertentu pada permukaan gigi.

Bakteri yang mula-mula menghuni pelikel terutama berbentuk kokus dan

yang paling banyak ditemukan adalah Streptococcus. Organisme tersebut tumbuh,

berkembang biak dan mengeluarkan gel ekstra-sel yang lengket dan akan menjerat

berbagai bentuk bakteri yang lain. Plak akan bertambah tebal dan terdiri dari

berbagai macam mikroorganisme. Akhirnya, flora plak yang tadinya didominasi

oleh bentuk kokus berubah menjadi flora campuran yang terdiri atas kokus,

batang dan filamen (Kidd dan Sally, 1991).

2.11 Tinjauan Tentang Bakteri

Berdasarkan perbedaan didalam menyerap zat warna Gram bakteri dibagi

menjadi dua golongan yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Bakteri Gram positif menyerap zat warna pertama yaitu kristal violet yang

menyebabkan berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram negatif menyerap zat

warna kedua yaitu safranin dan menyebabkan berwarna merah muda

(Dwidjoseputro, 1982).

Bakteri Gram positif memiliki kandungan peptidoglikan yang tinggi (dapat

mencapai 50%) dibandingkan bekteri Gram negatif (sekitar 10%). Sebaliknya

kandungan lipida dinding sel bakteri Gram positif rendah sedangkan sel bakteri

Gram negatif tinggi yaitu sekitar 11-22% (Lay dan Hastowo, 1992).

2.11.1 Klasifikasi Bakteri Streptococcus mutans

Klasifikasi dari Streptococcus mutans adalah :

 22

Kingdom : Monera

Divisio : Firmicutes

Class : Bacilli

Order : Lactobacillus

Family : Streptococcaceae

Genus : Streptococcus

Species : Streptococcus mutans(Samaranayake, 2012).

2.11.2 Morfologi Streptococcus mutans

Streptococcus mutans merupakan bakteri Gram positif (+), bersifat non

motil atau tidak bergerak, berdiameter 1-2 µm, bakteri anaerob fakultatif.

Memiliki bentuk kokus yang sendirian, berbentuk bulat atau bulat telur dan

tersusun dalam rantai. Bakteri ini tumbuh secara optimal pada suhu sekitar 18°-

40° C. Streptococcus mutans biasanya ditemukan pada rongga gigi manusia yang

luka dan menjadi bakteri yang paling kondusif menyebabkan karies untuk email

gigi (Nugraha, 2008). Koloni bakteri Streptococcus mutans disajikan pada

gambar 7.

Gambar 7. Koloni Streptococcus mutans (Samaranayake, 2012)

Streptococcus mutans termasuk golongan Streptococcus viridans. Beberapa

bakteri lain yang masuk dalam golongan Streptococcus viridans yaitu

 23

Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius,

Streptococcus milleri (Antony dkk., 2010).

Streptococcus mutans merupakan kelompok α-Haemolyticus dan tergolong

bakteri Gram positif (+). Streptococcus mutans bersifat anaerob fakultatif dan non

motil atau tidak bergerak (Fani dkk., 2007).

Streptococcus mutans bersifat asidogenik yaitu menghasilkan asam,

asidodurik yaitu mampu tinggal pada lingkungan asam, dan menghasilkan suatu

polisakarida yang lengket disebut dextran. Oleh karena kemampuan ini,

Streptococcus mutans bisa menyebabkan lengket dan mendukung bakteri lain

menuju ke email gigi, dan asam melarutkan email gigi (Nugraha, 2008).

2.12 Tinjauan Tentang Media Pertumbuhan Bakteri

Media pertumbuhan bakteri atau media kultur bakteri adalah cairan

atau gel yang didesain untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme dan sel.

Terdapat dua jenis utama media pertumbuhan yaitu media yang digunakan

untuk kultur pertumbuhan sel tumbuhan atau binatang dan jenis yang kedua yaitu

kultur mikrobiologi yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme

seperti bakteri dan jamur (Madigan, 2005).

Menurut Haribi, (2008) berdasarkan bentuknya medium pertumbuhan yang

digunakan untuk kultur mikroba dibagi menjadi tiga macam yaitu :

1. Media Cair (Liquid Media), yaitu media yang berbentuk cair seperti Nutrient

Broth (NB), Brain Heart Infusion (BHI), Alkali Pepton Water (APW), dll.

Merupakan media pertumbuhan dalam bentuk cair, tersedia dalam

bentuk tabung dan umumnya hanya digunakan untuk menumbuhkan koloni

 24

bakteri dan tidak digunakan untuk melihat sifat bakteri ataupun melihat adanya

mikroorganisme lain yang tumbuh. Keuntungan dari penggunaan media cair

yaitu dapat melarutkan zat-zat yang dapat mengambat pertumbuhan bakteri.

2. Semi Solid Media. Media ini digunakan untuk uji motilitas, karena teksturnya

yang setengah padat akan memudahkan pergerakan bakteri. Media ini dibuat di

tabung dengan posisi tegak.

3. Media Padat, yaitu media yang berbentuk padat, media ini dapat berbentuk

media organik, contohnya Blood Agar Plate (BAP), Mac Conkey (MC),

Salmonella Shigella Agar (SSA), Nutrient Agar (NA), dll.

Media selektif untuk pertumbuhan Streptococcus mutans antara lain Mitis

Salivarius-Bacitracin (MSB), Mitis Salivarius-Bacitracin-Kanamycin (MSKB),

Glucosa-Sucrose-Tellurite-Bacitracin (GSTB), Trypticase-Yeast-Cystein-Sucrose

20%-Bacitracin (TYS20B), Tryptone-Yeast Extract-Cystein-Sucrose-Bacitracin

(TYCSB). Media TYS20B dilaporkan sebagai media yang lebih baik untuk isolasi

Streptococcus mutans dan perhitungannya dapat dilakukan dengan jumlah koloni

atau Colony Forming Unit (CFU/ml).

2.12.1 Media Mueller Hinton Agar

Mueller Hinton Agar (MHA) merupakan media yang sangat sering digunakan

untuk pengujian sensitivitas terhadap suatu antimikroba. Luas zona bening yang

ditunjukkan menjadi suatu bukti ketika mikroba uji terkena suatu antimikroba

yang aktif. MHA memiliki rentang pH 7,4 ± 0,2 (Oxoid Limited, 1982) pada suhu

250 C. Media ini berisi 30,0 % daging sapi infus; 1,75 % kasein hidrosilat; 0,15 %

pati dan 1,7 % agar.

 25

Media MHA digunakan untuk pengujian mikrobiologi secara klinis Media

MHA mengandung komposisi yang menguntungkan dan untuk meningkatkan

aktivitas bakteri dapat ditambahkan darah (Merck, 1988).

Lima persen darah domba dan nikotinamida adenin dinukleotida juga dapat

ditambahkan saat uji kerentanan dilakukan pada spesies Streptococcus. Tipe ini

juga sering digunakan untuk pengujian kerentanan Campylobacter (Atlas, 2004).

2.13 Tinjauan Tentang Antimikroba

Antibiotika adalah suatu bagian substansi atau zat-zat kimia yang

diperoleh dari atau dibentuk dan dihasilkan oleh mikroorganisme, zat-zat tersebut

dalam jumlah sedikit mampu menghambat kegiatan mikroorganisme yang lain.

Antibiotika tersebar di alam, dan memegang peranan penting dalam mengatur

populasi mikroba dalam tanah, air, limbah dan kompos. Antibiotika berbeda

dalam susunan kimia dan cara kerjanya. Antibiotika yang kini banyak digunakan,

kebanyakan dari genus Bacillus, Penicillium, dan Streptomyces (Waluyo, 2008).

2.13.1 Mekanisme Kerja Antibakteri

Mekanisme kerja obat antibakteri dikelompokkan dalam 4 kelompok utama,

yaitu :

1. Penghambatan terhadap sintesis dinding sel.

Sel bakteri dikelilingi oleh suatu struktur kaku yang disebut dinding sel.

Dinding sel bakteri melindungi membran protoplasma dari trauma mekanik

maupun non mekanik. Setiap zat yang mampu merusak dinding sel atau mencegah

sintesisnya akan menyebabkan terbentuknya sel-sel yang peka terhadap tekanan

 26

osmotik (Waluyo, 2007). Langkah awal penghambatan dinding sel bakteri oleh

obat berupa ikatan obat pada reseptor sel (Brooks dkk., 2005).

2. Penghambatan terhadap fungsi membran sel.

Membran sel memegang peranan vital dalam sel, yakni sebagai penghalang

dengan permeabilitas selektif, melakukan pengangkutan aktif, dan mengendalikan

susunan dalam sel. Membran sel mempengaruhi konsentrasi metabolit dan nutrisi

dalam sel dan merupakan tempat berlangsungnya pernafasan dan aktivitas

biosintetik tertentu (Waluyo, 2007). Bila fungsi membran terganggu,

makromolekul dan ion akan keluar dari sel kemudian sel rusak atau terjadi

kematian (Brooks dkk., 2005).

3. Penghambatan terhadap sintesis protein.

Sintesis protein merupakan hasil akhir dari dua proses utama, yakni

transkripsi dan translasi. Antibakteri ini bekerja dengan mengganggu sintesis

protein yang dilakukan oleh mRNA dan tRNA yang berlangsung di ribosom

(Waluyo, 2007).

4. Penghambatan terhadap sintesis asam nukleat.

Beberapa antibiotik yang mampu menghambat sintesis asam nukleat antara

lain rifampisin, sulfonamid, dan quinolon. Rifampisin menghambat pertumbuhan

bakteri dengan berikatan kuat pada enzim DNA Dependent RNA Polymerase

bakteri, sehingga sintesis RNA bakteri terhambat (Brooks dkk., 2005).

5. Penghambatan terhadap kerja enzim.

 27

Sel menghasilkan enzim dan protein yang membantu kelangsungan proses-

proses metabolisme, banyak zat kimia telah diketahui dapat mengganggu reaksi

biokimia misalnya logam-logam berat, golongan tembaga, perak, air raksa dan

senyawa logam berat lainnya umumnya efektif sebagai bahan antibakteri pada

konsentrasi relatif rendah. Logam-logam ini akan mengikat gugus enzim

sulfihidril yang berakibat terhadap perubahan protein yang terbentuk.

Penghambatan ini dapat mengakibatkan terganggunya metabolisme atau matinya

sel (Pelczar dan Chan, 1998).

Beberapa senyawa yang mampu menghambat kerja enzim antar lain adalah

nitrit dapat menghambat enzim fosfat dehidrogenase, sulfit akan menginaktifkan

enzim yang memiliki ikatan disulfida, asam benzoat dapat menghambat aktivitas

a-ketoglutarat dehidrogenase dan suksinat dehidrogenase (Parhusip, 2006).

2.13.2 Metode Pengukuran Aktivitas Antibakteri

Pengukuran daya antibakteri dapat dikelompokkan menjadi dua metode, yaitu :

1. Metode Difusi

a. Metode Disc Diffusion (Test Kirby and Bauer)

Metode ini digunakan untuk menentukan aktivitas agen antimikroba.

Piringan atau cakram yang berisi gen antimikroba diletakkan pada media agar

yang telah ditanami mikroba. Agen antimikroba akan berdifusi pada media agar

tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroba

oleh agen antimikroba pada permukaan media agar (Pratiwi, 2008).

b. Metode E-test
 28

Metode E-test digunakan untuk mengestimasi Minimun Inhibitory

Consentration, yaitu konsentrasi minimum suatu agen antimikroba untuk dapat

menghambat pertumbuhan mikroba. Pada metode ini digunakan strip plastik yang

mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan

pada permukaan media agar yang telah ditanam mikroba. Pengamatan dilakukan

pada area jernih yang ditimbulkannya, yang menunjukkan kadar agen antimikroba

yang menghambat pertumbuhan mikroba pada media agar (Pratiwi, 2008).

c. Ditch-plate technique.

Pada metode ini sampel berupa agen antimikroba diletakkan pada lubang

yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian

tengah secara membujur dan mikroba uji digoreskan ke arah lubang yang berisi

agen antimikroba (Pratiwi, 2008).

d. Cup-plate technique.

Metode ini serupa dengan metode disc diffusion. Pada media agar yang telah

ditanami mikroba dibuat lubang sumuran dan pada lubang sumuran tersebut diberi

agen antimikroba (Pratiwi, 2008).

e. Gradient-plate technique.

Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara

teoritis bervariasi dari nol hingga maksimal. Media agar dicairkan dan ditambah

larutan uji kemudian dicampur, dituang kedalam cawan petri, dan diletakkan

dalam posisi miring. Lapisan kedua dituang diatasnya, plate diinkubasi selama 24

jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan permukaan media

mengering. Mikroba uji digoreskan mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil
 29

dihitung sebagai panjang total pertumbuhan mikroba maksimal yang mungkin

dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan (Pratiwi, 2008).

2. Metode dilusi

a. Metode Dilusi Cair (Broth Dilution)

Metode ini digunakan untuk mengukur Kadar Hambat Minimum (KHM)

dan Kadar Bunuh Minimum (KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan

membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambah

dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat

jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang

ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair

tanpa penambahan mikroba uji maupun agen antimikroba, dan diinkubasi 18-24

jam. Media cair yang tetap terlihar jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai

KBM (Pratiwi, 2008).

b. Metode Dilusi Padat (Solid Dilution)

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media

padat. Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yag diuji

dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).

2.13.3 Kontrol Positif (Amoxcillin Trihidrat)

Amoksisilin digunakan untuk mengatasi infeksi yang disebabkan oleh

bakteri Gram negatif seperti Haemophilus influenza, Escherichia coli, Proteus

mirabilis, Salmonella. Amoksisilin juga dapat digunakan untuk mengatasi infeksi

yang disebabkan oleh bakteri Gram positif seperti Streptococcus pneumoniae,

Enterococci, nonpenicilinase-producing Staphylococci, Listeria. Amoksisilin

diindikasikan untuk infeksi saluran pernapasan, infeksi saluran kemih, infeksi

 30

klamidia, sinusitis, bronkitis, pneumonia, abses gigi dan infeksi rongga mulut

lainnya (Siswandono dan Soekarjo, 2000).

Struktur kimia amoksisilin disajikan pada gambar 8.

Gambar 8. Struktur Amoksisilin (Lay dan Hastowo, 1992)

Mekanisme kerja amoksisilin trihidrat yaitu dengan adanya cincin β-laktam

menghambat pembentukan peptidoglikan dari dinding sel sehingga sintesis

dinding sel terganggu yang menyebabkan sel lisis (Lay dan Hastowo, 1992).

2.13.4 Kontrol Negatif

Kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui apakah pelarut yang digunakan

mempunyai efek dalam menghambat bakteri. Kontrol negatif yang digunakan

adalah DMSO (Dimethyl Sulphoxide). Dimethyl Sulphoxide adalah zat yang

sangat polar dan memiliki sifat pelarut yang baik untuk bahan kimia organik dan

anorganik. Dimethyl Sulphoxide tidak memiliki aktivitas antibakteri (Sweetman,

2009).

2.14 Tinjauan Tentang Bioautografi

Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak

pada kromatogram hasil KLT yang mempunyai aktivitas antibakteri, antifungi,

dan antiviral (Pratiwi, 2008). Salah satu keuntungan bioautografi adalah dapat
 31

mengetahui aktivitas biologi secara langsung dari senyawa yang kompleks,

terutama yang terkait dengan kemampuan suatu senyawa untuk menghambat

pertumbuhan mikroba, mudah dilakukan, murah, peralatan yang digunakan

sederhana dan interpretasi hasilnya relatif mudah dan akurat. Faktor penting

dalam pengujian bioautografi meliputi sensitivias terhadap volume sampel,

selektivitas untuk mentukan mikroba target, dan adaptibilitas terhadap campuran

kompleks (Kusumaningtyas dkk., 2008).

Metode ini dimulai dengan kromatogam lapis tipis suatu ekstrak, kemudian

kromatogam diberi media yang telah diinokulasikan dengan mikroba uji dengan

konsentrasi tertentu. Ada beberapa cara yang digunakan dengan metode ini :

1. Metode Bioautografi kontak

Bioautografi kontak dilakukan dengan cara meletakkan plat KLT pada

media agar yang telah diinokulasikan dengan mikroba uji. Adanya senyawa

antimikroba ditandai dengan adanya daerah jernih yang tidak ditumbuhi mikroba

(Kusumaningtyas dkk., 2008).

2. Metode Bioautografi overlay

Media Agar yang telah dicampur dengan mikroorganisme di atas

permukaan plat KLT, media ditunggu hingga padat, kemudian diinkubasi. Area

hambatan dilihat dengan penyemprotan menggunakan tetrazolium klorida.

Senyawa yang aktif sebagai antimikroba akan tampak sebagai area jernih dengan

latar belakang ungu (Pratiwi, 2008).

2.15 Hipotesis
 32

1. Ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi

robusta (Coffea canephora) memiliki aktivitas antibakteri terhadap

pertumbuhan Streptococcus mutans

2. Ada perbedaan aktivitas antibakteri antara ekstrak etanol, fraksi etil asetat dan

fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea canephora) pada konsentrasi 10%,

12,5% dan 15%.

3. Golongan senyawa flavonoid, alkaloid, saponin, tanin dan triterpenoid/steroid

memiliki aktivitas antibakteri.

 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Obyek Penelitian

Objek pada penelitian ini adalah aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi

n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea

canephora) terhadap bakteri Streptococcus mutans yang ditunjukkan dengan

terbentuknya zona bening.

3.2 Sampel dan Teknik Sampling

3.2.1 Sampel

Sampel yang digunakan adalah kulit buah kopi Robusta.

3.2.2 Teknik Sampling

Teknik sampling yang digunakan adalah teknik purposive sampling yaitu

pengambilan sampel berdasarkan tujuan tertentu. Kulit buah yang diambil adalah

kulit buah kopi matang berwarna merah.

3.3 Variabel Penelitian

Variabel dalam penelitian ini dibagi menjadi tiga macam variabel yaitu :

3.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak etanol, fraksi n-heksan,

fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta masing-masing dengan

konsentrasi 10%, 12,5% dan 15%.

33
 34

3.3.2 Variabel Terikat

Variabel terikat pada penelitian ini adalah aktivitas antibakteri ekstrak

etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air dengan masing-masing

konsentrasi 10%, 12,5% dan 15% terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus

mutans yang berupa diameter zona bening pada media.

3.3.3 Variabel Kontrol

Variabel terkontrol dalam penelitian ini adalah semua hal yang dikondisikan

dalam keadaan sama meliputi suhu dan waktu inkubasi (1 x 24 jam pada suhu

370), sterilisasi, media yang digunakan untuk mengembangbiakkan bakteri, media

yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri, koloni bakteri Streptococcus

mutans, penanaman suspensi bakteri dilakukan dengan metode tuang (pour plate),

volume ekstrak dan fraksisebanyak 80 µl, volume suspensi bakteri sebanyak

2,5 µl, volume kontrol positif dan kontrol negatif sebanyak 80 µl.

3.4 Teknik Pengumpulan Data

Metode pengumpulan data yang dilakukan adalah dengan metode

eksperimen sebenarnya (true eksperiment).

1. Skrining fitokimia hasil ekstraksi dan fraksinasi kemudian dilanjutkan dengan

uji kromatografi lapis tipis untuk masing-masing senyawa yang terkandung

dalam sampel.

2. Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode sumuran dengan replikasi

sebanyak lima kali dan pengukuran zona bening yang terbentuk menggunakan

jangka sorong.
 35

3.5 Alat dan Bahan Penelitian

3.5.1 Alat yang Digunakan

Alat yang digunakan untuk penelitian uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol,

fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air dari kulit buah kopi robusta

(Coffea canephora) terhadap Streptococcus mutans adalah bejana remaserasi,

batang pengaduk, penangas air, seperangkat alat gelas, oven, botol penyemprot,

cawan petri, jarum ose, rotary evaporator merek Heidolph, laminar air flow,

mikropipet merek Socorex, lampu UV 254, otoklaf merek Allamerican, pinset,

yellow tip merek Socorex, cylinder cup, blue tip merek Socorex, tabung reaksi,

jangka sorong merek Vernier Caliper.

3.5.2 Bahan yang Digunakan

Bahan utama yang digunakan untuk penelitian uji aktivitas antibakteri

ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air dari kulit buah kopi

robusta (Coffea canephora) terhadap Streptococcus mutans adalah kulit buah kopi

robusta. Bahan yang digunakan dalam penyarian simplisia yaitu etanol 70%,

n-heksan, etil asetat dan aquadest. Bahan yang digunakan untuk uji bebas etanol

70% adalah NaOH, NaNO2, asam sulfanilat, asam salisilat, asam asetat, HCl dan

H2SO4. Bahan yang digunakan untuk skrining fitokimia adalah HCl, pereaksi

dragendorf, serbuk Mg, amyl alkohol, FeCl3, NH4OH, kloroform, NaCl, asam

asetat glasial, gelatin, aquadest panas, eter dan H2SO4. Bahan yang digunakan

untuk kromatografi lapis tipis adalah n-butanol, asam asetat, air, amonia,

kloroform, etil asetat, dragendorf, kloroform, metanol, anisaldehid, H2SO4, etil

asetat, FeCl3 dan toluene. Bahan yang digunakan dalam pengujian mikrobiologi

yaitu bakteri Streptococcus mutans, media Mueller Hilton Agar (MHA), Nutrient
 36

Broth (NB), Nutrient Agar (NA), larutan ½ Mc. Farland, larutan kontrol positif

berupa antibiotik amoksisilin trihidrat dan larutan kontrol negatif serta pelarut

sampel yaitu DMSO.

3.6 Prosedur Kerja

3.6.1 Determinasi Tanaman

Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Sekolah Tinggi

Ilmu Farmasi “ Yayasan Pharmasi “ Semarang untuk memastikan bahwa kulit

buah kopi yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah kopi robusta

(Coffea canephora).

3.6.2 Pengumpulan Bahan

Kulit buah kopi robusta (Coffea canephora) yang digunakan berasal dari

perkebunan di daerah Sumowono, Kabupaten Semarang yang diambil dalam

bentuk segar. Bakteri Steptococcus mutans diperoleh dari Rumah Sakit

Dr. Kariadi Semarang, Semarang, Jawa Tengah.

3.6.3 Perolehan Sampel

Kulit buah kopi robusta yang sudah dikumpulkan selanjutnya diproses

menjadi simplisia dengan tahapan :

1. Sortasi basah

Kulit buah kopi yang didapat dilakukan proses sortasi basah untuk

menghilangkan bahan pengotor, seperti debu dan kotoran dan bagian tanaman lain

yang tidak digunakan yang melekat pada kulit buah kopi robusta, sehingga akan

menjamin mutu dari simplisia.

2. Pencucian
 37

Pencucian dilakukan untuk menghilangkan tanah dan kotoran lain yang

melekat pada bahan simplisia. Pencucian dilakukan dengan air bersih yakni air

PAM. Pencucian dilakukan sesingkat mungkin karena untuk melindungi zat-zat

yang mudah larut di dalam air.

3. Perajangan

Kulit buah kopi dirajang dengan membelah kulit menjadi dua bagian untuk

memudahkan proses pengeringan sehingga pengeringan dapat berlangsung lebih

cepat dan diperoleh simplisia yang terjamin kualitasnya.

4. Pengeringan

Proses pengeringan bertujuan untuk mengurangi kadar air sampai dibawah

10% dan menghentikan reaksi enzimatik sehingga didapatkan simplisia yang tidak

mudah rusak dan dapat disimpan dalam jangka waktu lama. Air yang masih

terdapat dalam simplisia pada kadar tertentu dapat menjadi media pertumbuhan

bagi mikroorganisme. Pengeringan simplisia dilakukan dengan menggunakan

sinar matahari dengan ditutup kain hitam.

5. Sortasi kering

Simplisia yang telah kering dilanjutkan dengan dilakukan sortasi kering

yakni pemilahan atau penghilangan debu maupun serangga yang masih terdapat

dalam simplisia yang sudah kering atau melalui proses pengeringan.

6. Pengecilan ukuran partikel

Simplisia diserbukkan dan diayak dengan ayakan no. 30/40. Simplisia yang

digunakan adalah simplisia yang lolos pada ayakan no. 30 dan tidak lolos pada

ayakan no. 40.

3.6.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

 38

Serbuk kulit buah kopi robusta (Coffea canephora) ditimbang seksama

sebanyak 250 gram. Serbuk kulit kopi robusta diremaserasi menggunakan pelarut

etanol 70% dengan perbandingan 1:7,5 dalam bejana tertutup. Serbuk direndam

selama 4 hari sambil sesekali dilakukan pengadukan dengan penggantian pelarut

tiap 24 jam. Residu dipisahkan dan filtrat (ekstrak etanol) dipekatkan dengan

rotary evaporator sampai terbentuk ekstrak kental. Ekstrak yang diperoleh

dipekatkan diatas penagas air dengan suhu 40-50o C sampai larutan penyari hilang

atau jumlahnya berkurang. Selanjutnya dilakukan uji bebas etanol, skrining

fitokimia, uji KLT, uji aktivitas antibakteri dan uji bioautografi ekstrak etanol,

fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air terhadap Streptococcus mutans.

3.6.5 Perhitungan Nilai Rendemen

Ekstrak kental yang didapat kemudian ditimbang untuk perhitungan

rendemen. Nilai rendemen dihitung dengan rumus seperti pada persamaan berikut.

Rendemen = (W/Wo) x 100%

Keterangan : W: bobot ekstrak kental dan Wo: bobot simplisia kering.

3.6.6 Fraksinasi Ekstrak

Ekstrak kental kulit buah kopi robusta (Coffea canephora) ditimbang 10

gram, ditambah dengan 100 ml aquadest, dilarutkan. Campuran dimasukkan

dalam corong pisah dan difraksinasi dengan 100 ml n-heksan. Fraksi n-heksan

ditampung, fraksi air difraksinasi dengan 100 ml etil asetat. Fraksi etil asetat dan

fraksi air ditampung. Masing-masing fraksi diuapkan diatas waterbath hingga

pekat (Daud dkk, 2011) dan dilanjutkan dengan skrining fitokimia, uji KLT, uji

aktivitas antibakteri dan uji bioautografi kontak terhadap Streptococcus mutans.

3.6.7 Uji Pendahuluan dan KLT

 39

Skrining fitokimia meliputi uji reaksi warna dan pengendapan serta

penegasan dengan KLT yang dilakukan terhadap beberapa golongan senyawa,

diantaranya:

1. Flavonoid

Serbuk simplisia, ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi

air masing-masing diambil kurang lebih 0,5 gram dilarutkan dalam etanol

kemudian dimasukkan dalam tabung reaksi. Serbuk Mg dan HCl pekat

ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Hasil tersebut ditambah amil alkohol,

dikocok dengan kuat dan dibiarkan hingga memisah. Bila terdapat flavonoid maka

akan terbentuk warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol

(Majumdar, 2005).

Lempeng silika gel GF 254, chamber penjenuhan, dan kertas penjenuhan

disiapkan. Fase gerak flavonoid n-butanol : asam asetat : air (4:1:5) dicampurkan,

dipisahkan, dan didiamkan semalam dalam corong pisah. Chamber dijenuhkan

dengan fase gerak n-butanol : asam asetat : air (BAA). Sampel ditotolkan pada

lempeng silika gel GF 254. Lempeng dielusi dengan jarak elusi 8 cm. Setelah

elusi selesai, lempeng silika gel 254 dikeluarkan, dikeringkan.Noda yang

terbentuk dilihat dan ditandai secara visual, lampu UV dan dengan penampak

bercak uap amonia. Harga Rf dihitung serta lihat warna noda yang dihasilkan.

Terbentuknya warna kuning kecoklatan menunjukkan adanya kandungan

flavonoid (Harbone, 1987).

2. Alkaloid
 40

Serbuk simplisia, ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi

air masing-masing diambil kurang lebih 0,5 gram dicampur dengan 1 ml HCl 2 N

dan 9 ml aquadest panas. Larutan dipanaskan selama 2 menit, kemudian

didinginkan dan disaring. Filtrat dimasukkan dalam tabung reaksi dan

ditambahkan pereaksi dragendorf. Sampel positif terdapat alkaloid bila terbentuk

endapan merah bata (Majumdar, 2005).

Lempeng silika gel GF 254, chamber penjenuhan, dan kertas penjenuhan

disiapkan. Fase gerak alkaloid, kloroform : etil asetat (70 : 30 ) dicampur

homogen. Chamber dijenuhkan dengan fase gerak. Sampel ditotolkan pada

lempeng silika gel GF 254. Lempeng dielusi dengan jarak elusi 8 cm. Setelah

elusi selesai, lempeng silika gel 254 dikeluarkan, dikeringkan. Noda yang

terbentuk dilihat dan ditandai secara visual, lampu UV dan dengan penampak

bercak dragendorf. Harga Rf dihitung serta lihat warna noda yang

dihasilkan.Terbentuknya warna orange-coklat menunjukkan adanya kandungan

alkaloid (Wagner dan Sabine, 2009).

3. Tanin

Serbuk simplisia, ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi

air masing-masing diambil kurang lebih 0,5 gram kulit buah kopi robusta (Coffea

canephora) ditambah dengan larutan gelatin 0,5 %. Terbentuknya endapan

menunjukkan adanya kandungan tanin (Robinson,1991).

Lempeng silika gel GF 254, chamber penjenuhan, dan kertas penjenuhan

disiapkan. Fase gerak etil asetat : metanol : air dengan perbandingan 100:13.5:10

yang telah dicampur. Chamber dijenuhkan dengan fase etil asetat : metanol : air.
 41

Sampel ditotolkan pada lempeng silika gel GF 254. Lempeng dielusi hingga batas

elusi, dikeringkan dan dilihat noda pada lampu UV. Setelah elusi mencapai batas,

lempeng silika gel 254 dikeluarkan, dikeringkan. Noda yang terbentuk dilihat dan

ditandai secara visual, lampu UV dan dengan penampak FeCl3. Harga Rf dihitung

serta lihat warna noda yang dihasilkan.Terbentuknya warna hijau kehitaman

menunjukkan adanya tanin (Trease dan Evans, 1978),

4. Saponin

Serbuk simplisia, ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi

air masing-masing diambil kurang lebih 0,5 gram dicampur dengan 10 ml air

panas kemudian didinginkan dan dikocok hingga muncul buih. Larutan didiamkan

selama 2 menit, kemudian diteteskan HCl 2 N. Bila terdapat senyawa saponin

dalam ekstrak maka akan terbentuk buih mantap selama 10 menit (Majumdar,

2005).

Sampel ditotolkan pada lempeng KLT (silika gel GF 254) lalu dielusi

dengan eluen kloroform:metanol:air (64:50:10) dengan jarak elusi 8 cm. Setelah

elusi selesai, lempeng dikeringkan kemudian lempeng tersebut disemprot dengan

penampak bercak vanilin-H2SO4(p). Harga Rf dihitung serta lihat warna noda

yang dihasilkan. Terbentuknya warna noda biru, biru-ungu, merah, kuning coklat

menunjukkan adanya kandungan saponin (Wagner dkk., 1984). Warna hijau

kehitaman juga menunjukkan adanya kandungan saponin (Sharma dan Ritu,

2013).

5. Terpenoid dan Steroid

 42

Serbuk simplisia, ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi

air 0,5 gram dicampur dengan eter, kemudian disaring dan diambil filtratnya.

Filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu. Residu

ditambah eter 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat.

Terbentuknya warna jingga, hijau ungu atau biru menunjukkan adanya kandungan

triterpenoid (Harbone, 1987).

Sampel ditotolkan pada lempeng KLT (silika gel GF 254) lalu dielusi

dengan eluen toluene: etil asetat (93 : 7) dengan jarak elusi 8 cm. Setelah elusi

selesai, lempeng dikeringkan, kemudian lempeng KLT disemprot dengan

penampak bercak anisaldehid-H2SO4(p) lalu dipanaskan pada suhu 110oC selama

5 sampai 10 menit. Harga Rf dihitung serta lihat warna noda yang dihasilkan.

Terbentuknya noda berwarna ungu menunjukkan adanya kandungan triterpenoid

(Wagner dan Sabine, 2009).

3.6.8 Pengujian Aktivitas Antibakteri

3.6.8.1 Strelisasi Alat

Alat-alat dari gelas yang telah dicuci bersih dan dibungkus dengan kertas

coklat disterilkan dengan otoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.

3.6.8.2 Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)

Media agar miring Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 1,4 gram

ditambahkan 50 ml aquadest. Larutan media NA dipanaskan sambil diaduk, untuk

melarutkan agarnya. Jika sudah terbentuk media NA yang jernih maka media

dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml, ditutup tabung

dengan sumbat kapas, kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC, 15
 43

Psi selama 15 menit. Tabung diletakkan dalam posisi miring dan dibiarkan

memadat.

3.6.8.3 Peremajaan bakteri Streptococcus mutans

Agar miring NA steril disiapkan, diambil satu ose biakan bakteri

Streptococcus mutans dengan ose bulat kemudian digoreskan pada permukaan NA

miring dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.

3.6.8.4 Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)

Media NB ditimbang sebanyak 1,2 g dalam beaker glass, ditambah aquadest

50ml. Larutan media NB dipanaskan di atas kompor sambil terus diaduk sampai

larut, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Erlenmeyer tersebut ditutup

dengan sumbat kapas kemudian disterilkan dengan otoklaf pada suhu 121 0C

selama 15 menit.

3.6.8.5 Pembuatan Suspensi Bakteri

Media NB sebanyak 10 ml disiapkan dalam tabung reaksi steril. Bakteri

hasil dari peremajaan yang berumur 1 x 24 jam diambil satu ose dimasukkan

dalam media NB. Kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 0C dan

diukur serapannya pada panjang gelombang 625 nm, disetarakan dengan larutan

½ Mc Farland.

3.6.8.6 Larutan ½ Mc Farland

Komposisi larutan 1/2 Mc Farland adalah sebagai berikut :

Larutan BaCl2.H2O 0,048 M 1,0 ml

Larutan H2SO4 0,18 M 99,0 ml.

Cara Pembuatan :
 44

1. Larutan H2SO4 0,18 M dibuat dengan cara mengukur H2SO4(p) sebanyak 1,0 ml

dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditambah aquadest steril

sampai volume 100 ml. Larutan diukur sebanyak 99,0 ml dimasukkan labu

takar 100,0 ml.

2. Larutan BaCl2.H2O 0,048 M dibuat dengan cara menimbang BaCl2 padatan

sebanyak 117,2 mg, dimsukkan ke labu takar 10 ml dan ditambah aquadest

steril sampai volume 10 ml. Larutan diukur sebanyak 1,0 ml dan dimasukkan

labu takar nomor 1.

3. Larutan dicukupkan sampai tanda batas dan dicampur sampai homogen, lalu

dipipet 50 ml ditambah media Nutrient Broth (NB) 50 ml dan dihomogenkan

dalam labu takar 100 ml.

4. Larutan ½ Mc Farland diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer

UV pada panjang gelombang 625 nm. Larutan ½ Mc Farland mempunyai

kekeruhan setara dengan 1 x 108 CFU/ ml dengan absorbansi 0,08-0,1.

3.6.8.7 Pembuatan Media Mueller-Hinton Agar (MHA)

MHA ditimbang sebanyak 3,8 gram, dilarutkan dalam 100 ml aquadest,

dipanaskan hingga mendidih di atas hotplate. Media dimasukkan ke dalam

erlenmeyer, disterilkan dengan autoklaf, dan disimpan dalam lemari es. Jika akan

dipergunakan, dipanaskan hingga mencair kembali.

3.6.8.8 Pembuatan Ekstrak Etanol, Fraksi N-Heksan, Fraksi Etil Asetat dan
Fraksi Air Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora) dengan
Berbagai Konsentrasi
 45

Ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah

kopi robusta (Coffea canephora) ditimbang dan diencerkan dengan menggunakan

larutan DMSO hingga didapatkan konsentrasi sebesar 15% sebanyak lima kali.

Masing-masing larutan stok diencerkan hingga didapatkan larutan dengan

konsentrasi 10% dan 12,5%.

3.6.8.9 Pembuatan Larutan Kontrol Positif (Amoxicillin Trihidrat)

Serbuk amoksisilin trihidrat ditimbang seksama 50,0 mg dilarutkan dalam

10,0 ml DMSO dan didapatkan konsentrasi 0,5%, dari konsentrasi 0,5 % dipipet

larutan tersebut sebanyak 1,0 ml kemudian ditambah DMSO sampai volume 10,0

ml dan didapatkan konsentrasi 0,05%, dari konsentrasi 0,05 % dipipet larutan

tersebut sebanyak 1,0 ml kemudian ditambah DMSO sampai volume 10,0 ml dan

didapatkan konsentrasi 0,005% kemudian digojog sampai homogen.

3.6.8.10 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol, Fraksi N-Heksan, Fraksi

Etil Asetat dan Fraksi Air Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea
canephora) dengan Metode Sumuran

Uji ini dilakukan dengan metode sumuran dengan cara meletakkan cylinder

cup di atas lapisan pertama media MHA yang sudah memadat, kemudian dituang

campuran suspensi Streptococcus mutans sebanyak 2,5 μl ke dalam 20 ml media

MHA dan lapisan media MHA kedua, dibiarkan memadat. Cylinder cup diangkat,

dimasukkan sebanyak 80 μl ke dalam sumuran ekstrak etanol, fraksi n-heksan,

fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea canephora) dengan

konsentrasi 10%, 12,5% dan 15%. Larutan Amoksisilin trihidrat sebagai kontrol

positif sedangkan larutan DMSO sebagai kontrol negatif. Cawan diinkubasi 1 x 24

 46

jam pada suhu 37oC kemudian diukur diameter hambatan pertumbuhan

Streptococcus mutans dengan menggunakan alat jangka sorong.

3.6.9 Uji Bioautografi

Pengujian bioautografi diawali dengan uji KLT dari sampel yang

memberikan aktivitas antibakteri. Lempeng hasil kromatogram yang telah di elusi

dengan eluennya ditempelkan pada suspensi bakteri Streptococcus mutansdalam

media Mueller Hilton Agar (MHA) selama 10 - 15 menit. Media yang telah

ditempelkan KLT diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Media yang telah

diinkubasi diamati senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri.

 47

3.7 Skema Kerja

3.7.1 Skema Kerja Secara Umum

Serbuk simplisia kering Kulit buah kopi

robusta

Ekstraksi secara Remaserasi selama 4

hari

Ekstrak Uji bebas etanol

kental

Fraksinasi

Fraksi Fraksi Fraksi

n-heksan etil asetat air

Skrining fitokimia Uji KLT Pembuatan sampel Uji Bioautografi

dengan konsentrasi
10%, 12,5%, dan 15%

Uji aktivitas antibakteri

Analisis Data

Gambar 9. Skema Kerja Secara Umum

 48

3.7.2 Ekstraksi Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

250 gram serbuk simplisia kering buah kulit kopi robusta

Dimaserasi dengan pelarut etanol 70%
dengan perbandingan 1:7,5 (4 hari)

Dimaserasi kembali
Filtrat I menggunakan pelarut Ampas
etanol 70% baru dengan
perbandingan 1:7,5

Dimaserasi kembali
menggunakan pelarut
Filtrat II etanol 70% baru dengan Ampas
perbandingan 1:7,5

Dimaserasi kembali
menggunakan pelarut
Filtrat III etanol 70% baru dengan Ampas
perbandingan 1:7,5

Filtrat IV Ampas

Semua filtrat dikumpulkan dan dipekatkan dengan

menggunakan rotary vacuum evaporator

Ekstrak kental kulit buah kopi robusta

Gambar 10. Ekstraksi Secara Remaserasi Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)
 49

3.7.3 Fraksinasi Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

10 gram ekstrak kental kulit buah

kopi robusta (Coffea canephora)

Ditambah 100 ml aquadest

Difraksinasi dengan 100 ml n-heksan

Fraksi n-heksan Fraksi air

Diuapkan di Difraksinasi dengan

waterbath pada 100 ml etil asetat
suhu 500C

Fraksi etil asetat Fraksi air

Diuapkan di Diuapkan di
waterbath pada waterbath pada
suhu 500C suhu 800C

Fraksi kental
Fraksi kental Fraksi kental
n-Heksan
etil asetat air

Gambar 11. Fraksinasi Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

 50

3.7.4 Skema Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Hasil fraksinasi ditotolkan pada lempeng silika gel GF 254 nm

Uji Flavonoid Uji Alkaloid Uji Saponin Uji Uji Tanin

Dielusi dengan Dielusi Dielusi Triterpenoid Dielusi
n- dengan dengan Dielusi dengan etil
butanol:asam kloroform:etil kloroform: dengan asetat:metanol
asetat:air asetat (70:30) metanol:air toluen:etil :air
(4:1:5) (64:50:10) asetat (93:7) (100:13,5:10)

Lempeng dikeringkan, diamati noda pada sinar UV 254 nm dan dihitung nilai Rf

Diberikan Disemprot Disemprot Disemprot Disemprot

uap amonia penampak vanilin- anisaldehid- FeCl3
bercak H2SO4 H2SO4
dragendorf

Diamati noda dan dihitung nilai Rf

Gambar 12. Identifikasi Senyawa Secara Kromatografi Lapis Tipis

 51

3.7.5 Uji Aktivitas Antibakteri

Lar. ½ Mc.Farland Media NB 1 ose bakteri S. mutans

Digunakan sebagai Suspensi bakteri

baku pembanding Streptococcus mutans

Diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam

Diukur absorbansinya pada λ625 nm, disetarakan

dengan absorbansi baku pembanding

Diinokulasikan secara pour plate

pada media MHA yang telah
terpasang cylinder cup

Ditunggu hingga memadat, dilepas cylinder cup

Sumuran ditetesi dengan ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi

etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea
canephora) serta kontrol (+) Amoxicillin dan kontrol (-) DMSO

Diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam

Diukur zona bening

dengan jangka sorong

Gambar 13. Pengujian Aktivitas Antibakteri

 52

3.7.6 Uji Bioautografi

20 ml media MHA cair ditambahkan 5 µl

suspensi bakteri bakteri Streptococcus mutans

Dituangkan dalam cawan petri

dan ditunggu hingga memadat

KLT yang telah terelusi ditempelkan kedalam

media MHA dan ditunggu 15-30 menit

Lempeng KLT diambil dan cawan

diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 370C

Diamati zona bening

yang terbentuk

Gambar 14. Pengujian Bioautografi

 53

3.8 Cara Analisis

Data yang diperoleh berupa diameter zona bening dari ekstrak dan fraksi kulit

buah kopi robusta yang diukur menggunakan jangka sorong. Zona bening yang

diperoleh kemudian dikurangi dengan diameter lubang sumuran yang dibuat.

Diameter zona bening yang diperoleh dilakukan analisis secara statistika

parametrik dengan uji anava dua jalan menggunakan software SPSS 16,0. Jika

terdapat perbedaan maka dilanjutkan dengan pengujian pasca anava (post hoc).

Bila data tidak homogen, tidak berdistribusi normal atau tidak keduanya maka

dilakukan analisis statistika non parametrik uji Kruskall Wallis, jika terdapat

perbedaan dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney.

 BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri serta

perbedaan aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat

dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea canephora) pada konsentrasi 10%,

12,5% dan 15% terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Tujuan

selanjutnya adalah mengetahui golongan senyawa yang memiliki aktivitas

antibakteri secara bioautografi.

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi Sekolah Tinggi

Ilmu Farmasi “Yayasan Pharmasi” Semarang dengan tujuan untuk

mengidentifikasi tanaman dan mengetahui kebenaran sampel yang akan

digunakan pada penelitian, sehingga dapat menghindari kesalahan dalam

pengambilan dan pengumpulan sampel yang akan digunakan untuk penelitian.

Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan sebagai bahan

penelitian merupakan tanaman kopi robusta dengan surat keterangan identifikasi

terlampir pada lampiran 1. Kulit buah kopi robusta digunakan dalam penelitian

ini karena kulit buah kopi robusta mengandung senyawa-senyawa yang bersifat

antibakteri (Simanjuntak dkk., 2014). Uji kualitatif skrining fitokimia bertujuan

untuk mengetahui senyawa kimia apa saja yang terkandung dalam serbuk, ekstrak

dan masing-masing fraksi. Uji dilakukan terhadap senyawa flavonoid, alkaloid,

saponin, tanin dan triterpenoid/steroid.

Ekstraksi dilakukan secara remaserasi menggunakan etanol 70% karena

etanol dengan konsentrasi 70% efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif

yang optimal dan dapat meminimalkan tersarinya bahan pengganggu. Etanol

54
 55

merupakan pelarut organik yang mampu menarik senyawa-senyawa metabolit

sekunder. Gugus hidroksil yang terdapat pada etanol sebagai gugus polar dan

gugus alkil sebagai gugus non polar yang menyebabkan etanol mampu menyari

senyawa polar, semipolar dan non polar (Suryani, 2014). Remaserasi selama 4

hari diperoleh 69,97 gram ekstrak kental dengan rendemen sebanyak 27,99% dari

250 gram serbuk. Hasil rendemen kulit buah kopi menunjukkan hasil yang baik

bila dibandingkan dengan penelitian sebelumnya yang hanya menghasilkan

rendemen sebesar 10,98% (Mahesa, 2012). Hal ini dikarenakan waktu ekstraksi

yang dilakukan pada penelitian sebelumnya lebih singkat yaitu selama 3 hari.

Prosentase rendemen tersebut menunjukkan kemaksimalan dari pelarut yang

digunakan untuk menyari simplisia (Khoirani, 2013). Rendemen yang semakin

tinggi menandakan bahwa peluang dalam pemanfaatan sampel lebih besar

dibandingkan dengan sampel yang memiliki rendemen rendah (Kusumawati dkk.,

2008). Menurut Sani dkk (2014), pelarut etanol 70% berperan dalam

menghasilkan rendemen lebih banyak.

Ekstrak yang diperoleh, sebelum diuji antibakteri, diuji bebas etanol terlebih

dahulu untuk memastikan bahwa ekstrak telah bebas etanol dan aktivitas

antibakteri yang ditimbulkan dikarenakan oleh senyawa aktif yang diperoleh

bukan dari etanol yang bersifat antibakteri. Hasil pengujian bebas etanol

menunjukkan bahwa ekstrak telah bebas dari etanol. Berikut hasil pengujian bebas

etanol yang disajikan dalam tabel 2 berikut ini.

Tabel 2. Hasil Pengujian Bebas Etanol Ekstrak Etanol Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea
canephora)
Pereaksi Hasil positif berdasarkan pustaka Hasil penelitian
Asam sulfanilat + HCl + Larutan bewarna merah frambos Warna coklat
NaNO + NaOH (Schoorl, 1988) (-)
Asam asetat + H2SO4 (pekat) Bau pisang (Schoorl, 1988) Tidak berbau pisang (-)
Asam salisilat + H2SO4 (pekat) Bau wangi (Schoorl, 1988) Tidak berbau wangi (-)
 56

Hasil skrining fitokimia dari serbuk dan ekstrak yang disajikan pada tabel 3,

menunjukkan hasil yang sama yaitu mengandung senyawa flavonoid, alkaloid,

saponin, tanin dan triterpenoid/steroid. Hasil tersebut menunjukkan bahwa proses

penyarian berjalan baik dan pelarut yang digunakan dapat menyari seluruh

senyawa yang terkandung.

Hasil positif identifikasi kandungan kimia flavonoid adalah terbentuknya

warna merah, kuning, jingga pada amil alkohol. Identifikasi kandungan kimia

senyawa flavonoid menggunakan metode Wilstater, yaitu menggunakan logam

Mg yang berfungsi untuk mereduksi glikosida flavonol. Perubahan warna yang

ditimbulkan adalah warna merah, hal ini menunjukkan adanya flavonol. Warna

merah pada uji flavonoid disebabkan karena terbentuknya garam flavilium

(Achmad, 1986).

Penambahan HCl pada skrining fitokimia golongan senyawa alkaloid

dikarenakan alkaloid bersifat basa, ketika diekstrak dengan pelarut yang bersifat

asam akan terbentuk alkaloid dalam bentuk garam yang lebih mudah larut dalam

pelarut polar (Harborne, 1987). Uji skrining fitokimia pada golongan senyawa

alkaloid ditunjukkan dengan terbentuknya endapan merah bata pada penambahan

pereaksi dragendorf (Majumdar, 2005). Endapan yang terbentuk dikarenakan

adanya ikatan kovalen koordinasi ion logam K+ dari kalium tetraiodobismutat

dengan nitrogen alkaloid sehingga terbentuk kompleks kalium-alkaloid yang

mengendap (Nafisah dkk., 2014).

Skrining fitokimia golongan senyawa saponin menggunakan metode Forth

dan hasil positif ditunjukkan dnegan terbentuknya busa stabil. Busa tersebut
 57

dikarenakan adanya kombinasi struktur senyawa penyusunnya, yaitu rantai

sapogenin nonpolar dan rantai samping polar yang larut dalam air (Zahro dkk.,

2013).

Hasil positif pengujian golongan senyawa tanin ditunjukkan dengan

terbentuknya endapan. Tanin bereaksi dengan gelatin membentuk kopolimer

mantap yang tidak larut dalam air. Reaksi ini lebih sensitif dengan penambahan

NaCl untuk mempertinggi penggaraman dari tanin-gelatin (Marliana dkk, 2005).

Identifikasi kandungan kimia untuk senyawa triterpenoid, jika terbentuk

warna biru atau hijau menandakan adanya steroid, namun jika terbentuk warna

ungu atau jingga menunjukkan adanya triterpenoid (Harborne, 1987).

Ekstrak yang sudah didapat, dilanjutkan dengan fraksinasi, hal ini dilakukan

dengan tujuan untuk mengetahui sifat senyawa antibakteri dari kulit buah kopi

robusta berdasarkan kepolarannya. Oleh karena itu, fraksinasi dilakukan dengan

menggunakan tiga pelarut yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya. Pelarut

yang digunakan adalah n-heksan yang bersifat non polar, etil asetat yang bersifat

semi polar dan air yang bersifat polar.

Hasil fraksinasi dengan pelarut n-heksan diperoleh fraksi n-heksan dengan

rendemen sebesar 11,25%, dengan pelarut etil asetat diperoleh fraksi etil asetat

dengan rendemen sebesar 19,87% dan dengan pelarut air diperoleh fraksi air

dengan rendemen sebesar 65,80%. Ketiga fraksi kental dilakukan uji skrining

fitokimia sebagai tahapan awal identifikasi kandungan kimia. Hasil skrining

fitokimia fraksi n-heksan menunjukkan bahwa fraksi n-heksan mengandung

triterpenoid/steroid. Fraksi etil asetat mengandung flavonoid, alkaloid, saponin,

tanin dan triterpenoid/steroid. Fraksi air negatif terhadap triterpenoid/steroid.

 58

Hasil skrining fitokimia serbuk, ekstrak dan masing-masing fraksi disajikan pada

tabel 3.

Tabel 3. Hasil Skrining Fitokimia Serbuk, Ekstrak Etanol, Fraksi n-Heksan, Fraksi Etil
Asetat dan Fraksi Air Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)
Hasil Uji
Golongan Hasil Positif
Pereaksi Ekstrak Fraksi n- Fraksi Etil
Senyawa (pustaka) Serbuk Fraksi Air
Etanol heksan Asetat
Terbentuk warna
Warna Warna Warna Warna
Serbuk Mg merah, kuning, Bening
jingga jingga merah pada merah pada
+ HCl p + jingga pada pada amil
Flavonoid pada amil pada amil amil amil
amil alkohol lapisan amil alkohol
alkohol alkohol alkohol alkohol
alkohol (-)
(+) (+) (+) (+)
(Harborne, 1987)
Tidak
Endapan merah Endapan Endapan terbentuk Endapan Endapan
HCl 2N +
Alkaloid bata (Majumdar, merah bata merah bata endapan merah bata merah bata
Dragendorff
2005) (+) (+) merah bata (+) (+)
(-)
Tidak
Terbentuk Terbentuk
Dikocok + Buih mantap Busa stabil Busa stabil terbentuk
Saponin busa stabil busa stabil
HCl 2N (Majumdar, 2005) (+) (+) busa stabil
(+) (+)
(-)
Tidak
Terbentuk
+ NaCl + Endapan Endapan terbentuk Endapan Endapan
Tanin endapan
Gelatin (+) (+) endapan (+) (+)
(Robinson, 1991)
(-)
Jingga, hijau,
Eter + asam
Triterpenoid/ ungu atau biru Berwarna Berwarna Berwarna Berwarna Berwarna
asetat
(Harborne, 1987) hijau hijau hijau hijau coklat
Steroid anhidrat +
(+) (+) (+) (+) (-)
H2SO4 p
Keterangan :
(+) Positif mengandung senyawa kimia
(-) Negatif mengandung senyawa kimia
Identifikasi senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol, fraksi n-heksan,

fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta juga dilakukan secara

kromatografi lapis tipis untuk menegaskan senyawa-senyawa yang terkandung

dalam ekstrak, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air. Berikut hasil

penegasan identifikasi senyawa secara KLT pada ekstrak etanol, fraksi n-heksan,

fraksi etil asetat dan fraksi air disajikan pada tabel 4.

 59

Tabel 4. Hasil Identifikasi KLT Ekstrak dan Fraksi Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea
canephora)
Warna Noda
Golongan
Sampel Nilai Rf dengan Penampak Keterangan Pustaka
Senyawa
Bercak
0,90 Kuning kecoklatan +
0,84 Kuning kecoklatan +
Ekstrak
0,73 Kuning kecoklatan +
0,58 Biru kehijauan -
n-heksan 0,78 Kuning + (+)
0,85 Kuning kecoklatan + Kuning kecoklatan
Etil Asetat 0,62 Abu kebiruan - (Harborne, 1987)
Flavonoid 0,52 Kuning +
0,86 Kuning kecoklatan +
0,83 Kuning kecoklatan +
Air 0,72 Kuning kecoklatan +
0,57 Abu kebiruan -
0,73 Jingga kecoklatan +
Ekstrak
0,56 Jingga kecoklatan +
0,85 Kuning kecoklatan + (+)
n-heksan
0,68 Kuning kecoklatan + Orange-Coklat
0,72 Coklat + (Wagner dan Sabine,
Alkaloid 0,50 Coklat + 2009)
Etil Asetat +
0,36 Coklat
0,12 Coklat +
Air 0,13 Cokat +
0,94 Ungu +
Ekstrak 0,81 Ungu + Biru, biru-ungu, merah
0,63 Hijau kehitaman + , kuning coklat
n-heksan 0,93 Hijau + (Wagner dkk., 1984 )
0,75 Coklat + Hijau kehitaman
Etil Asetat (Sharma dan Ritu,
Saponin 0,56 Ungu +
0,77 Coklat kekuningan + 2013)
Air
0,67 Coklat kekuningan +
0,46 Hijau kehitaman +
0,26 Hijau kehitaman +
Ekstrak
0,22 Hijau kehitaman +
0,10 Hijau kehitaman + (+)
n-heksan 0,87 Hijau + Hijau Kehitaman
0,35 Hijau kehitaman + (Trease dan Evans,
Etil Asetat
0,17 Hijau kehitaman + 1978)
Tanin 0,32 Hijau kehitaman +
Air 0,23 Hijau kehitaman +
0,18 Hijau kehitaman +
0,42 Ungu +
Ekstrak
0,27 Ungu +
n-heksan 0,37 Ungu +
0,97 Ungu + (+)
Triterpenoid/ 0,87 Ungu + Ungu
Etil Asetat
Steroid 0,28 Ungu + (Wagner dan Sabine,
0,21 Ungu + 2009)
Air - - -
 60

Hasil KLT ekstrak etanol, fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat mengandung

flavonoid, alkaloid, saponin, tanin dan triterpen/steroid. Sedangkan fraksi air

tidak mengandung triterpenoid/steroid.

Uji KLT senyawa flavonoid menggunakan fase gerak n-butanol, asam asetat

dan air dengan perbandingan (4:1:5) dan penampak bercak uap amonia. Flavonoid

terdeteksi dengan menunjukkan warna noda kuning kecoklatan setelah diberikan

uap amonia (Harborne, 1987). Berdasarkan penelitian Narwade dkk., (2012), uji

KLT senyawa flavonoid menggunakan fase gerak n-butanol, asam asetat dan air

dengan perbandingan (4:1:5) terdeteksi pada Rf1 sebesar 0,78; Rf2 sebesar 0,59

dengan warna noda kuning hingga coklat. Flavonoid pada ekstrak terdeteksi

dengan warna noda kuning kecoklatan pada Rf1 sebesar 0,90; Rf2 sebesar 0,84 dan

Rf3 sebesar 0,73. Aglikon flavonoid bersifat kurang polar dan cenderung mudah

larut dalam pelarut non polar (Markham, 1988). Flavonoid terdeteksi pada fraksi

n-heksan dengan nilai Rf 0,78 dan warna noda kuning setelah diberi uap amonia.

Fraksi etil asetat menunjukan hasil positif flavonoid pada nilai Rf 0,85 dengan

warna kuning kecoklatan dan nilai Rf 0,52 dengan warna kuning. Flavonoid

merupakan senyawa polifenol yang mempunyai sejumlah gugus hidroksi sehingga

cenderung bersifat polar (Markham, 1988). Senyawa flavonoid pada fraksi air

terdeteksi pada nilai Rf 0,86; 0,83; 0,72 dengan warna noda kuning kecoklatan.

Uji senyawa alkaloid menggunakan fase gerak kloroform dan etil asetat

dengan perbandingan 70:30 dan penampak bercak dragendorf. Hasil positif

menunjukan warna noda orange sampai coklat setelah disemprot dengan pereaksi

dragendorf (Wagner dan Sabine, 2009). Alkaloid pada ekstrak terdeteksi dengan
 61

terbentuknya warna noda jingga kecoklatan, pada fraksi n-heksan menunjukkan

warna noda kuning kecoklatan sedangkan pada fraksi etil asetat dan fraksi air

menunjukkan warna coklat. Alkaloid umumnya larut dalam pelarut non polar

namun menurut Prasetyo dkk (2015), golongan alkaloid ada yang bersifat kurang

polar juga ada yang bersifat semi polar. Pelarut yang bersifat polar atau semipolar

dapat digunakan untuk mengesktrak senyawa alkaloid seperti alkaloid kuartener

(Harborne, 1987).

Pada uji KLT senyawa saponin menggunakan fase gerak kloroform, metanol

dan air dengan perbandingan 64 : 50 : 10. Terbentuknya warna biru, biru-ungu,

merah, kuning coklat setelah disemprot vanilin dan asam sulfat menunjukkan

positif saponin (Wagner dkk, 1984). Berdasarkan penelitian sebelumnya pada uji

KLT senyawa saponin dengan fase gerak yang sama menghasilkan nilai Rf1

sebesar 0,62; Rf2 sebesar 0,75; Rf3 sebesar 0,87 dan Rf4 sebesar 0,90 dengan warna

noda hijau kehitaman, hal ini menunjukkan positif senyawa saponin (Sharma dan

Paliwal, 2013). Saponin dalam ekstrak etanol terdeteksi pada nilai Rf 1 sebesar

0,63 dengan warna noda hijau kehitaman, hampir sama dengan penelitian Sharma

dan Ritu (2013) dan Rf2 sebesar 0,81 serta Rf3 sebesar 0,94 dengan warna noda

ungu. Saponin memiliki gugus steroid dan triterpenoid sebagai gugus non polar.

Fraksi n-heksan menunjukkan hasil positif saponin dengan Rf dan warna noda

hampir sama dengan Sharma dan Ritu (2013) yaitu terbentuknya warna noda hijau

pada Rf 0,93. Uji saponin pada fraksi etil asetat dihasilkan dua noda yang positif

yang ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi coklat pada Rf 0,75 dan

warna ungu pada Rf 0,56. Ikatan glikosida yang terdapat pada saponin
 62

menyebabkan saponin cenderung bersifat polar (Puspitasari dkk., 2013). Saponin

terdeteksi pada fraksi air dengan nilai Rf 0,77 dan Rf 0,67 dengan warna noda

coklat kekuningan.

Senyawa tanin diuji KLT dengan menggunakan eluen etil asetat : metanol :

air dengan perbandingan 100 : 13,5 :10. Menurut Trease dan Evans, (1978), hasil

positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau kehitaman setelah disemprot

FeCl3. Pada penelitian ini, senyawa tanin positif terkandung dalam ekstrak, fraksi

n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air yang ditunjukkan dengan terbentuknya

warna hijau, hijau kehitaman setelah disemprot FeCl3.

Triterpenoid/steroid diuji KLT dengan fase gerak toluen : etil asetat dengan

perbandingan 93 : 7 serta penampak bercak anisaldehid-asam sulfat. Hasil positif

ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu (Wagner dan Sabine, 2009). Pada

ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat mengandung triterpenoid dengan

terbentuknya warna noda ungu setelah disemprot anisaldehid-asam sulfat. Fraksi

air menunjukkan hasil negatif karena tidak terbentuknya warna ungu.

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan untuk mengetahui kemampuan

ekstrak, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi air sebagai antibakteri

terhadap Streptococcus mutans. Metode sumuran digunakan karena memiliki

keuntungan yakni aktivitas antibakteri sampel dapat diamati ke segala arah yakni

baik di permukaan, tengah maupun pada lapisan bawah dan dapat menampung

sampel dengan jumlah sesuai yang diinginkan. Penggunaan MHA (Mueller

Hinton Agar) sebagai media pertumbuhan bakteri karena media MHA

mengandung daging sapi, kasein hidrosilat, pati dan agar sehingga memungkinkan

untuk Streptococcus mutans tumbuh. Daging sapi dan kasein hidrosilat berfungsi
 63

untuk menyediakan nitrogen, vitamin, karbon, dan asam amino yang diperlukan

oleh Streptococcus mutans untuk pertumbuhannya. Agar digunakan sebagai agen

pemadat. (Acumedia, 2011). Media MHA memiliki rentang pH 7,4 ± 0,2. pH

tersebut merupakan pH optimal untuk pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans

yaitu 7,4-7,6. Suspensi bakteri yang telah disetarakan dengan absorbansi larutan

standar ½ Mc Farland sebesar 0,08 - 0,1 digunakan pada pengujian antibakteri

dengan tujuan untuk mendapatkan konsentrasi bakteri 1x108 CFU/ml. Penanaman

suspensi bakteri Streptococcus mutans menggunakan metode pour plate sehingga

bakteri yang ditambahkan ke dalam media MHA (Mueller Hinton Agar) dapat

berdifusi merata pada seluruh media, mulai dari permukaan sampai kedalam

media MHA sehingga terjadi kontak langsung dengan sampel yang terdapat dalam

sumuran.

Proses pelarutan sampel uji serta sebagai kontrol negatif pada penelitian ini

digunakan DMSO (Dimetilsulfokzida) karena menurut Nusslein dkk (2006),

DMSO tidak memiliki aktivitas antibakteri dan DMSO merupakan pelarut yang

dapat melarutkan komponen polar maupun nonpolar (Parhusip dkk., 2003)

sehingga aktivitas antibakteri yang dihasilkan tidak dipengaruhi oleh DMSO

melainkan senyawa yang terkandung dalam sampel. Oleh karena itu, DMSO

digunakan sebagai kontrol negatif, sedangkan kontrol positif digunakan

Amoksisilin dengan konsentrasi 0,0049%. Kontrol positif dipilih bahan yang telah

diuji baik secara klinis maupun praklinis yang mampu memberikan aktivitas

antibakteri. Pemilihan amoksisilin sebagai kontrol positif karena dari hasil

penelitian AL-Haroni dan Skaug (2007) menyatakan bahwa amoksisilin memiliki

spektrum luas dan sering digunakan dalam pengobatan gigi yang didukung oleh
 64

penelitian Devi dkk (2011) yang menyatakan bahwa amoksisilin merupakan agen

pembunuh bakteri Streptococcus sp yang paling baik. Fungsi dari kontrol positif

adalah sebagai pembanding untuk mengetahui aktivitas antibakteri sampel.

Amoksisilin mempunyai rumus cincin β-laktam sehingga dapat mempengaruhi

kerja enzim dalam membentuk peptidoglikan yang merupakan komponen

pembentuk dinding sel bakteri yang menyebabkan sintesis dinding sel terganggu

dan menyebabkan lisis (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Streptococcus mutans

yang termasuk dalam bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang tersusun atas

asam teikoat dan beberapa polisakarida, sehingga aktivitas Streptococcus mutans

dapat dihambat oleh amoksisilin.

Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak, fraksi etil

asetat dan fraksi air memiliki aktivitas antibakteri yang ditandai dengan

terbentuknya zona bening disekitar lubang. Rata-rata diameter zona bening yang

dihasilkan ditunjukan pada tabel 5.

Tabel 5. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi n-Heksan, Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air

Rata-Rata Diameter Zona Bening (cm)

Bahan
10% 12,5% 15% Kontrol + Kontrol -
Ekstrak 0,357 0,436 0,519 1,367 0,000
Fraksi Etil asetat 0,596 0,763 0,876 1,366 0,000
Fraksi Air 0,549 0,575 0,622 1,376 0,000
Fraksi n-Heksan 0,000 0,000 0,000 1,382 0,000
Keterangan : Diameter zona bening merupakan rerata ± SD (n=5)

Pada tabel 5 menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas

antibakteri yang lebih tinggi daripada ekstrak dan fraksi air. Fraksi etil asetat

dengan konsentrasi 15% mempunyai rata-rata diameter zona bening 0,876 cm

sedangkan dengan konsentrasi yang sama pada fraksi air memiliki rata-rata zona
 65

bening sebesar 0,622 dan pada ekstrak sebesar 0,519. Sedangkan pada fraksi n-

heksan tidak ditemukan adanya aktivitas antibakteri. Sehingga, hal ini

menunjukkan bahwa senyawa-senyawa nonpolar yang tersari dalam n-heksan

tidak berpotensi dalam menimbulkan aktivitas antibakteri yang ditegaskan secara

bioautografi dengan hasil tidak ditemukannya zona bening yang terbentuk dari

semua senyawa dalam fraksi n-heksan. Sedangkan senyawa semipolar yang tersari

dalam etil asetat memiliki potensi terbesar dalam menimbulkan aktivitas

antibakteri yang berdasarkan hasil bioautografi menunjukkan bahwa semua

senyawa dalam fraksi etil asetat mampu menimbulkan zona bening. Senyawa

polar yang tersari dalam aquadest memiliki potensi antibakteri lebih rendah dari

fraksi etil asetat yang berdasarkan hasil bioautografi menunjukkan bahwa

senyawa flavonoid, alkaloid, saponin, dan tanin fraksi air yang berpotensi

menimbulkan aktivitas antibakteri. Potensi antibakteri pada ekstrak lebih rendah

dibanding fraksi etil asetat maupun fraksi air, karena dalam ekstrak masih

terkandung campuran senyawa dengan kepolaran yang berbeda-beda. Meskipun

hasil bioautografi juga menunjukkan bahwa semua senyawa berpotensi dalam

menghasilkan aktivitas antibakteri, tetapi adanya senyawa non polar dalam

ekstrak dapat menutupi aktivitas dari senyawa-senyawa polar dan semipolar

dalam ekstrak yang berpotensi dalam menimbulkan aktivitas antibakteri.

Streptococcus mutans merupakan bakteri Gram positif yang terdiri dari komponen

utama asam teikoat dan beberapa polisakarida. Asam teikoat merupakan suatu

polimer yang larut air dan bersifat polar, yang membawa beragam gula (Brooks
 66

dkk, 2001). Hal ini menyebabkan bakteri Streptococcus mutans lebih sukar

ditembus oleh senyawa antibakteri yang bersifat non polar.

Diagram zona bening ekstrak dan fraksi kulit buah kopi robusta disajikan

pada Gambar 15.

Gambar 15. Diagram Zona Bening Ekstrak, Fraksi n-Heksan, Fraksi Etil Asetat dan
Fraksi Air Kulit Buah Kopi Robusta (Coffea canephora)

Berdasarkan diagram yang disajikan pada gambar 15 menunjukkan bahwa

Semakin besar konsentrasi yang digunakan semakin besar pula nilai rerata zona

bening yang dihasilkan yang artinya besarnya konsentrasi dan diameter zona

bening berbanding lurus satu sama lain. Zona bening yang diukur pada penelitian

ini adalah zona bening radikal yaitu suatu daerah yang sama sekali tidak

ditemukan adanya pertumbuhan bakteri. Aktivitas antibakteri berupa zona bening

yang dihasilkan dikarenakan adanya senyawa-senyawa yang terkandung dalam

fraksi yang memiliki kemampuan untuk menimbulkan aktivitas antibakteri

terhadap Streptococcus mutans.

 67

Senyawa flavonoid dapat merusak membran sitoplasma yang dapat

menyebabkan bocornya metabolit penting dan menginaktifkan sistem enzim

bakteri. Kerusakan ini memungkinkan nukleotida dan asam amino keluar dan

mencegah masuknya bahan-bahan aktif ke dalam sel, yang berdampak pada

kematian bakteri. Pada saat terjadi kerusakan membran sitoplasma, ion H + dari

senyawa fenol dan turunannya (flavonoid) akan menyerang gugus polar (gugus

fosfat) sehingga molekul fosfolipida akan terurai menjadi gliserol, asam

karboksilat dan asam fosfat, yang mengakibatkan fosfolipida tidak mampu

mempertahankan bentuk membran sitoplasma akibatnya membran sitoplasma

akan bocor dan bakteri akan mengalami hambatan pertumbuhan dan bahkan

kematian (Prajitno, 2007). Hasil penelitian Sabir (2005), flavonoid mampu

menghambat pertumbuhan Streptococcus mutans.

Kemampuan alkaloid dalam memberikan aktivitas antibakteri dikarenakan

adanya interaksi antara gugus basa nitrogen dalam alkaloid dengan asam amino

penyusun dinding sel. Reaksi ini mengakibatkan terjadinya perubahan struktur

serta susunan asam amino yang akan berdampak pada perubahan susunan rantai

DNA pada inti sel. Perubahan tersebut mengakibatkan perubahan keseimbangan

genetik sehingga DNA inti sel akan mengalami kerusakan. Akibatnya inti sel

bakteri akan lisis, kegiatan sel akan terhenti dan bakteri akan menjadi in aktif.

Alkaloid sebagai antimikroba dengan cara mengganggu komponen penyusun

peptidoglikan pada sel bakteri (Robinson, 1991).

Saponin merupakan senyawa aktif yang bersifat antibakteri yang bekerja

dengan meningkatkan permeabilitas membran sel sehingga membran menjadi

tidak stabil dan mengakibatkan hemolisis sel (Rosidah dkk, 2014). Menurut Nuria
 68

dkk (2009), mekanisme saponin sebagai antimikroba dengan cara menurunkan

tegangan permukaan. Diabsorbsinya saponin pada permukaan sel akan

mengakibatkan kerusakan membran sel dengan naiknya permeabilitas membran

atau kebocoran sel. Kematian sel kemungkinan karena hilangnya bahan-bahan

esensial sel.

Tanin mempunyai target pada polipeptida dinding sel sehingga

pembentukan dinding sel menjadi kurang sempurna. Ketidakstabilan pada dinding

sel dan membran sitoplasma bakteri menyebabkan fungsi permeabilitas selektif,

fungsi pengangkutan aktif, pengendalian susunan protein dari sel bakteri menjadi

terganggu yang akan berakibat pada lolosnya makromolekul dan ion dari sel,

sehingga sel bakteri menjadi kehilangan bentuknya dan terjadilah lisis (Maliana

dkk.,2013). Tanin mampu menimbulkan aktivitas antibakteri terhadap

Streptococcus mutans dengan berikatan pada asam lipoteikot di permukaan sel

(Majidah dkk., 2014).

Mekanisme triterpenoid sebagai antibakteri adalah bereaksi dengan porin

(protein transmembran) pada membran luar dinding sel bakteri, membentuk ikatan

polimer yang kuat sehingga mengakibatkan rusaknya porin. Rusaknya porin yang

merupakan pintu keluar masuknya senyawa akan mengurangi permeabilitas

dinding sel bakteri dan mengakibatkan sel bakteri akan kekurangan nutrisi,

sehingga pertumbuhan bakteri terhambat atau mati (Ratih dkk., 2012).

Triterpenoid mampu menghasilkan aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus

mutans (Bontjura dkk., 2015).

 69

Data zona bening diolah secara statistika dengan menggunakan software

SPSS 16.0 (Statistical Product and Service Solution). Uji statistik dengan program

SPSS dilakukan untuk mengetahui adanya perbedaan zona bening masing-masing

ekstrak dan fraksi hasilnya berbeda signifikan atau tidak. Diawali dengan uji

normalitas dan uji homogenitas. Hasil uji statistika disajikan pada lampiran 43.

Pengujian normalitas bertujuan untuk mengetahui data berdistribusi normal

atau tidak. Ketentuan dari uji normalitas data adalah probabilitas kesalahan kurang

dari 0,05 maka sampel tidak berdistribusi normal, namun jika signifikansi lebih

dari 0,05 maka sampel berdistribusi normal. Berdasarkan hasil uji normalitas

dinyatakan bahwa data menunjukkan berdistribusi normal dengan nilai

signifikansi lebih dari 0,05.

Pada pengujian homogenitas bertujuan untuk mengetahui varian antar

perlakuan berdistribusi homogen atau tidak. Ketentuan dari uji homogenitas

adalah jika nilai signifikansi atau probabilitas kesalahan kurang dari 0,05 maka

sampel dinyatakan tidak homogen, namun jika signifikansi lebih dari atau sama

dengan 0,05 maka sampel dinyatakan homogen. Pada hasil uji homogenitas

dinyatakan bahwa data homogen dengan nilai signifikansi lebih dari 0,05.

Selanjutnya dilakukan uji anava 2 dengan persyaratan jika signifikansi

kurang dari 0,05 maka antar kelompok ada perbedaan, namun jika lebih dari 0,05

maka dapat disimpulkan antar kelompok tidak berbeda. Berdasarkan hasil uji

anava 2 jalan menunjukkan signifikasi kurang dari 0,05 sehingga ada perbedaan

antar kelompok yaitu ekstrak, fraksi etil asetat, dan fraksi air. Perbedaan tersebut

ditunjukan dengan adanya perbedaan rata-rata diameter zona bening antara

 70

ekstrak, fraksi etil asetat, dan fraksi air. Ekstrak menghasilkan rata-rata diameter

zona bening sebesar 0,357 cm; 0,436 cm dan 0,519 cm. Fraksi etil asetat

menghasilkan rata-rata diameter zona bening sebesar 0,596 cm; 0,763 cm dan

0,876 cm. Fraksi air menghasilkan rata-rata diameter zona bening sebesar 0,549

cm; 0,575 cm; dan 0,622 cm.

Uji Post Hoc dilakukan sebagai tindak lanjut uji anava 2 jalan. Pengujian

statistika Post Hoc bertujuan ntuk mengetahui antar kelompok yang berbeda

signifikan. Ketentuan pada uji Post Hoc adalah jika nilai signifikansi (probabilitas

kesalahan) kurang dari 0,05 maka antar kelompok ada perbedaan yang signifikan,

namun jika nilai signifikansi lebih dari 0,05 maka dapat disimpulkan antar

kelompok tidak berbeda signifikan. Berdasarkan hasil uji Post Hoc, semua data

pada tiap kelompok menunjukkan perbedaan yang signifikan, kecuali antara fraksi

etil asetat 10% dengan fraksi air 12,5%, antara fraksi etil asetat 10% dengan fraksi

air 15%, antara fraksi air 10% dengan fraksi air 12,5%, antara fraksi air 10%

dengan ekstrak 15%.

 BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

1. Ekstrak etanol, fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea

canephora) memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri

Streptococcus mutans.

2. Terdapat perbedaan aktivitas antibakteri antara ekstrak etanol, fraksi etil asetat

dan fraksi air kulit buah kopi robusta, tetapi tidak ada perbedaan yang

signifikan antara fraksi etil asetat 10% dengan fraksi air 12,5%, antara fraksi

etil asetat 10% dengan fraksi air 15%, antara fraksi air 10% dengan fraksi air

12,5%, antara fraksi air 10% dengan ekstrak 15%.

3. Golongan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri adalah Flavonoid,

Alkaloid, Tanin, Saponin dan Triterpenoid/Steroid.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa yang mempunyai aktivitas

antibakteri pada kulit buah kopi robusta (Coffea canephora).

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai aktivitas antibakteri kulit

buah kopi robusta (Coffea canephora) terhadap bakteri lain.

3. Perlu dilakukan pengembangan dalam bentuk sediaan farmasi dari ekstrak

etanol, fraksi etil asetat dan fraksi air kulit buah kopi robusta (Coffea

canephora) sebagai sediaan antibakteri.

71
 DAFTAR PUSTAKA

Achmad, S.A. 1986. Kimia Organik Bahan Alam. Jakarta : Karnunika.

Acumedia, M. 2011. Mueller Hinton Agar (7101). http://www.neogen.com (7

Februari 2016)

Al-Haroni, M., dan Skaug, N. 2007. Incidence Of Antibiotic Prescribing In Dental

Practice In Norway And Its Contribution To National Consumption. JAC.
59: 1163.

Antony, B., Rekha, B., Anup, K.S., Thomas, K., dan Ramanathan, K. 2010.
Semiquantitation And Characterization Of Streptococcus mutans From
Patients Under Going Orthodontic Treatment. J Biosci Tech. 1. (2): 59.

Ashok, P.K., dan Kumud, U. 2012. Tannins Are Astringent.Phytojournal. 1. (3) :

48.

Atlas, R.M. 2004. Handbook of Microbiological Media. 3rd Ed. London : CRC
Press.

Aziz, T., Sendry, F., dan Aziz, D. M., 2014. Pengaruh Jenis Pelarut Terhadap
Persen Yield Alkaloid Dari Daun Salam India (Murraya koenigii). Teknik
Kimia. 2. (20) : 4-5.

Bontjura, S., Olivia, A.W., dan Krista, V.S. 2015. Uji efek antibakteri daun leilem
(Clerodendrum minahassae l.) terhadap bakteri Streptococcus mutans. Sam
Ratulagi. Pharmacon Jurnal Ilmiah Farmasi. 4. (4): 96-99.

Brooks, G.F., Janet, S.B., dan Stephen, A.M. 2005. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s
Mikrobiologi Kedokteran. Edisi I. Jakarta: Salemba Medika

Choi, H.K., dan Gary, C. 2007. Coffee, Tea, And Caffeine Consumption And
Serum Uric Acid Level: The Tird National Health And Nutrition
Examination Survey. Arthritis Care & Research. 57. (5): 816-821.

Daud, M.F., Esti, R. S., dan Endah, R. 2011. Pengaruh Perbedaan Metode
Ekstraksi Terhadap Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Jamu Biji
(Psidium guajava L.) Berdaging Buah Putih. Dalam Prosiding SnaPP
Sains, Teknologi dan Kesehatan. Bandung : Universitas Islam Bandung.

Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan

Obat. Jakarta : Departemen Kesehatan RI.

______________________. 1986. Materia Medika Indonesia. Edisi IV. Jakarta :

Departemen Kesehatan RI.

72
 73

Devi, A., V. Singh., dan A.B. Bhatt. 2011. Antibiotic Sensitivity Pattern Of
Streptococcus Against Commercially Available Drugs And Comparison
With Extract Of Punica granatum. International Journal of Pharma and
Bio-Sciences.2. (2): 504-508.

Dwidjoseputro. 1982. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Esquivel, P., dan Victor M.J. 2011. Functional Properties Of Coffee And Coffee
By-Products. Food Research International. 46: 24

Fardiaz, S. 1995. Antimicrobial Activity of Coffe (Coffea robusta) Extract.

ASEAN Food Journal. 10. (3) : 103

Fani M.M., Kohanteb, J., dan Dayaghi, M. 2007. Inhibitory Activity Of Garlic
(Allium Sativum) Extract On Multidrug Resistant Streptococcus mutans.
JISPPD: 164-166

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Cara Modern Menganalisa Tumbuhan.

Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung:
Institut Teknologi Bandung

Haribi, R. 2008. Media dan Reagen untuk Laboratorium Mikrobiologi. Semarang:

Universitas Muhammadiyah Semarang.

Kidd, E.A.M., dan Sally J.B. 1991. Dasar-dasar Karies Penyakit dan
Penanggulangannya (Essentials of dental caries: the disease and its
management). Diterjemahkan oleh Sumawinata N., dan Safrida Faruk.
Jakarta: EGC

Kusumaningtyas, E., Astuti, E., dan Darmono. 2008. Sensitivitas Metode

Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam Penentuan Senyawa
Antikapang. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 6. (2): 75-79.

Kusumawati R, Tazwir, Wawasto A. 2008. Pengaruh rendemen dalam asam

klorida terhadap kualitas gelatin tulang kakap merah (Lutjanus sp.). Jurnal
Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan. 3. (1): 63-68

Lay, B. W., dan Hastowo, S. 1992. Mikrobiologi. Jakarta: CV. Rajawali Press

Lee, W.J., dan Zhu, B.T. 2006. Inhibition Of DNA Methylation By Caffeic Acid
And Chlorogenic Acid, Two Common Catechol-Containing Coffee
Polyphenols. Carcinogenesis. 27. 2: 269-277.

Madigan M. 2005. Brock Biology of Microorganisme. London: Prentice Hall

Majidah, D., Dwi W. A. F., dan Achmad G. 2014. Daya Antibakteri Ekstrak Daun
Seledri (Apium graveolens L.) Terhadap Pertumbuhan Streptococcus
mutans Sebagai Alternatif Obat Kumur. Artikel Ilmiah Hasil Penelitian
Mahasiswa.Jember : Universitas Jember
 74

Majumdar, M. 2005. Evaluation of Tectona grandis Leaves For Wound Healing

Activity. Disertasi. Bangalore : Departement of Pharmacology, Krupanidhi
College of Pharmacy.

Maliana, Y., Siti K., dan Farah D. 2013. AktivitasAntiakteri Kulit Garcinia
mangostana Linn. Terhadap Pertumbuhan Flavobacterium dan
Enterobanter Dari Captotermes curvignathus Holmgren. Protobiont. 2. (1):
7-11.

Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Diterjemahkan Oleh

Padmawinata K. Bandung : Institut Teknologi Bandung

Marliana, E. 2007. Analisis Senyawa Metabolit Sekunder Dari Batang

Spatholobus ferrugineus (Zoll & Moritzi) Benth Yang Berfungsi Sebagai
Antioksidan. Jurnal Penelitian MIPA. 1. (1): 23-28.

Merck, E. 1988. Culture Media Handbook. Darmstadt : Federal Republic of

Germany

Moran, D.P.J. dan K.K. Rajah. 1994. Fastin Food Products. Blackie Academic
and Profesional, Glasgow.

Murtafiah, A. 2012. Daya Hambat Ekstrak Biji Kopi Robusta (Coffea robusta)
terhadap Streptococcus mutans. Skripsi. Jember : Fakultas Kedokteran
Gigi, Universitas Jember

Murthy, P.S. 2011. Biotechnological Approaches To Production Of Bioactives

From Coffee By-Products. Thesis. India : Scientist PPSFT Department

Nafisah, M., Suyatno., Tukiran., danNurul,H. 2014. Uji Skrining Fitokimia Pada
Ekstrak Hexan, Kloroform dan Metanol Dari Tanaman Patika Kebo
(Euphorbiae hirtae). Dalam Prosiding Seminar Nasional Kimia. Surabaya :
FMIPA, Universitas Negeri Surabaya

Narwade, V.T., A. A. Waghmare., dan A. L. Vaidya. 2012. Detection of Minor

Flavonoids from Tragia plukenetii A. R. Smith. International
Multidisciplinary. 2. (3): 51-52.

Nugraha, A. W. 2008. Streptococcus mutans, Si Plak Dimana-mana. Yogyakarta :

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Nuria, M.C., Arvin F., dan Sumantri. 2009. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak
Etanol Daun Jarak Pagar Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus 25923,
Eschericia coli ATCC 25922, Salmonella thypi ATCC 1408. Mediagro. 5.
(2): 26-37.
 75

Nusslein, K., Lachelle, A., Jason, R., Cullen, O., dan Gregory, N.T. 2006. Broad-
Spectrum Antibacterial Activity By A Novel Abiogenic Peptide Mimic.
Microbiology. 152: 1913-1918.

Octiara, E., dan Sarworini, B. 2008. Strptococcus mutans : Faktor Virulensi dan
Target Spesifik Vaksin. Dent. J. 13.(2) : 180-185.

Osbourn, A. 1996. Saponin and Plant Defense – A Soap Story. Trends in Plant
Sciences. Elsevier Sciences Ltd.

Oxoid. 1982. The Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and Other
Laboratory Service. Fifth edition. Australia : Oxoid Limited.

Parhusip, A.J.N. 2006.Kajian Mekanisme Antibakteri Ekstrak Andaliman

(Zanthoxylum acanthopodium DC) Terhadap Bakteri Patogen
Pangan.Disertasi. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Parhusip, A., Sedarnawati, Y., dan Yenni, E. 2003. Kajian Metode Ekstraksi
Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC). Jurnal Ilmu dan Teknologi
Pangan. 1. (1): 114.

Pelczar. M.J. dan E.C.S Chan. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI

Press.

Prajitno, A. 2007. Uji Sensitifitas Flavonoid Rumput Laut (Eucheuma cottoni)

Sebagai Bioaktif Alami Terhadap Bakteri Vibrio Harveyi. Jurnal
PROTEIN. 15. (2): 66-70

Prasetyo, S., Wesley, A., dan Tedi, H. 2015. The Pre-chromatography Purification of
Crude Oleoresin of Phaleria Macrocarpa Fruit Extracts by Using 70 %-v/v
Ethanol. Dalam Prosiding Seminar Nasional Teknik Kimia “Kerjuangan”.
Bandung : Universitas Khatolik Parahyangan.

Pratiwi, D., Sri, W.,dan Isnindar. 2013. The Test Of Antioxidant Activity From
Bawang Mekah Leaves (Eleutherine americana Merr.) Using DPPH (2,2-
Diphenyl-1-Picrylhydrazyl) Method. Traditional Medicine Journal. 18. (1):
12.

Pratiwi, S. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga.

Prihatman, K. 2001. Saponin untuk Pembasmi Hama Udang. Penelitian

Perkebunan Gambung. Bandung.

Puspitasari, L., Swastini, D.A., dan Arisanti, C.I.A. 2013. Skrining Fitokimia
Ekstrak Etanol 95% Kulit Buah Manggis (Garcia mangostana L.). Artikel
Ilmiah. Bukit Jimbaran : Universitas Udayana.
 76

Ratih, M.S., Depi, P., dan Purwanto. 2012. Daya Antibakteri Ekstrak Daun Pare
(Momodica charantia) Dalam Menghambat Pertumbuhan Streptococcus
viridans. Artikel Ilmiah Hasil Penelitian Mahasiswa.Jember : Universitas
Jember

Redha, A. 2010. Flavonoid: Struktur, Sifat Antioksidatif Dan Peranannya Dalam

Sistem Biologis. Jurnal Belian. 9. (2) : 196-202.

Robinson, T. 1991. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : Institute

Teknologi Bandung.

Rosidah, A.N., Pujiana, E.L., dan Pudji, A. 2014. Daya Antibakteri Ekstrak Daun
Kendali (Hippobroma longiflora [L] G. Don) Terhadap Pertumbuhan
Streptococcus mutans. Jurnal Pustaka Kesehatan: 1-5.

Sabir, A. 2005. Aktivitas antibakteri Flavonoid Propolis Trigona sp Terhadap

Bakteri Streptococcus mutans (in vitro). Dental Journal. 38. (3): 135-141.

Salamah, E., Eka, A., dan Sri, P. 2008. Penapisan Awal Komponen Bioaktif Dari
Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) Sebagai Senyawa Antioksidan.
Buletin Teknologi Hasil Perkebunan. 11. (2): 123.

Samaranayake, L. 2012. Essential Microbiology For Dentistry. Hongkong :

Elsivier.

Schoorl. 1998. Materi Pelengkap Kemurnian Cara Pemisahan Obat. Yogyakarta :

Universitas Gajah Mada Press

Septiana, E., dan Partomuan, S. 2015. Aktivitas Antimikroba dan Antioksidan

Ekstrak Beberapa Bagian Tanaman Kunyit (Curcuma longa). Fitofarmaka.
5. (1): 31-36.

Sharma, V., dan Ritu, P. 2013. Isolation and Charactarization os Saponins From
Moringa oleifera (Moringaeceae) Pods. Int J Pharm Sci. 5. (1): 180-182

Shibata, H., Yuji S., Mikiko O., dan Yasuhisa K. 1999. Natural antioxidant,
chlorogenic acid, protects against DNA breakage caused by
monochloramine. Biosci, Biotechnology. 63. (7): 1295-1296.

Simanjuntak, S., Made, S., dan I Ketut, S. 2014. Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah
Beberapa Tanaman dan Daya Hambatnya Terhadap Pertumbuhan Ralstonia
solanacearum pada Cabai. E-Jurnal Agroekoteknologi Tropika. 3. (2): 97-
103.

Sirait, M. 2007. Penuntun Fitokimia dalam Farmasi. Bandung: Penerbit Institut

Teknologi Bandung.
 77

Siswandono., dan Soekardjo, H.B. 2000. Kimia Medisinal I & II. Surabaya :
Airlangga University Press.

Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Bandung :

Institut Teknologi Bandung.

Sumawinata, N. 2002. Senarai Istilah Kedokteran Gigi. Jakarta : EGC.

Suryani., Rini, H., Nurlena, I., Ahmad, Z., dan Hasnawati. 2014. Uji Aktivitas
Tabir Surya Formula Sediaan Losio Ekstrak Metanol Daun Mangkokan
(Nothophanax scutellarium Merr.). Medula.2: 126-127

Suwarto dan Octavianty, Y. 2010. Budi Daya Tanaman Perkebunan Unggulan.

Jakarta : Penebar Swadaya.

Sweetman. 2009. Martindale The Complete Drug Reference. UK : Pharmaceutical

Press.

Tom, E. 2007. The Effect Of Chlorogenic Acid Enriched Coffee On Glucose

Absorbtion In Healthy Volunteers And Its Effect On Body Mass. The
Journal of International Medical Research. 35: 900-908.

Trease dan Evans. 1978. Phamacognosy. Eleventh edition. London : Balliere

Tindall.

Ummatin, C., dan Alivia, A. 2015. Optimalisasi Proses Gasifikasi Dari Limah
Kulit Kopi (Coffea robusta) Menjadi Fenol Berupa Asap Cair Dengan
Variasi Waktu Dan Ukuran Partiel Bahan. Journal of Chemical
Engginering: 1-4.

Underwood dan Day, Jr. 2002. Analisa Kimia Kuantitatif. Diterjemahkan oleh
Pudjaatmaka. Edisi V. Jakarta: Erlangga.

Waghorn, G.C. dan W.C. McNabb. 2003. Consequences Of Plant Phenolic

Compounds For Productivity And Health Of Ruminants. Proc. Nutr. Soc.
62: 383-392.

Wagner, H., Rudolf, B., Dieter, M., Pei, G.X., dan Anton, S.1984.
Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal Medicines “Thin-Layer
and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs”. Edisi
Kedua. New York : Springer.

Wagner, H., dan Sabine, B. 2009. Plant Drug Analysis A Thin Layer
Chromatography Atlas. Edisi Kedua. New York : Springer.

Waluyo, L. 2008. Teknik Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. UPT. Malang :

UMM Press
 78

Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum Edisi Revisi. Malang : UMM Press

Watson, D. G. 2007. Analisis Farmasi : Buku Ajar Untuk Mahasiswa Farmasi

dan Praktisi Kimia Farmasi Edisi 2. Jakarta : Buku Kedokteran EGC

Westendarp, H. 2006. Effect of tannins in animal nutrition. Dtsch. Tieratztl.

Wochenschr. 113. (7): 264-268.

Widyotomo, S. 2013. Potensi Dan Teknologi Diversifikasi Limbah Kopi Menjadi

Produk Bermutu Dan Bernilai Tambah. Review Penelitian Kopi dan
Kakao. 1. (1): 63-80.

Zahro, L., dan Rudiana, A. 2013. Uji Efektivitas Antibakteri Ekstrak Kasar
Saponin Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus) Terhadap Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli. UNESA Journal of Chemistry. 2. (3): 121.
Lampiran 1. Surat Keterangan Identifikasi Tanaman

79
Lampiran 2. Surat Keterangan Bakteri Streptococcus mutans

80
Lampiran 3. Surat Keterangan Amoksisilin

81
Lampiran 4. Tanaman Kopi Robusta

82
Lampiran 5. Kulit Buah Kopi Robusta

83
Lampiran 6. Proses Pembuatan Serbuk Simplisia Kulit Buah Kopi Robusta

Buah Kopi Hasil Pemanenan Pulper Kopi

Pencucian Kulit dan Kopi

sebelum sesudah

Perajangan Pengeringan

Serbuk Simplisia Kulit Kopi Robusta Penghalusan

84
 Lampiran 7. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Kopi Robusta

Remaserasi Penyaringan

Pemekatan Ekstrak Cair

Rotary evaporator Waterbath

Ekstrak Kental

85
 Lampiran 8. Fraksinasi Kulit Buah Kopi Robusta

Fase n-heksan Fase etil asetat

Fase air Fase air Fase air

Fraksi cair n-heksan Fraksi cair etil asetat Fraksi cair air

Fraksi kental n-heksan Fraksi kental etil asetat Fraksi kental air

86
 Lampiran 9. Data Penimbangan

Berat cawan + ekstrak kental = 254,29 gram

Berat cawan kosong = 184,32 gram
Berat ekstrak kental = 69,97 gram
% Rendemen ekstrak = 69,97 gram x 100% = 27,99%
250 gram

Berat cawan + fraksi n-heksan kental = 85,87 gram

Berat cawan kosong = 82,50 gram
Berat fraksi n-heksan kental = 3,37 gram
% Rendemen fraksi n-heksan = 3,37 gram x 100% = 11,23%
30 gram

Berat cawan + fraksi etil asetat kental = 78,26 gram

Berat cawan kosong = 72,30 gram
Berat fraksi etil asetat kental = 5,96 gram
% Rendemen fraksi etil asetat = 5,81 gram x 100% = 19,86%
30 gram

Berat cawan + fraksi air kental = 161,14 gram

Berat cawan kosong = 141,40 gram
Berat fraksi air kental = 19,74 gram
%Rendemen fraksi air = 19,74 gram x 100% = 65,80%
30 gram

87
Lampiran 10. Hasil Uji Bebas Etanol Ekstrak Kulit Buah Kopi Robusta

Hasil berdasar pengujian Dokumentasi

(-)
Warna merah frambose

(-)
Bau pisang

(-)
Bau Wangi

88
 Lampiran 11. Hasil Uji Pendahuluan

Sampel
Hasil
Fraksi Fraksi
Senyawa berdasarkan Serbuk Fraksi Etil
Ekstrak Air
pustaka
n-heksan Asetat

Flavonoid
(+)warna merah,
kuning, merah
tua, hijau sampai
biru pada
lapisan amil
alkohol
(Harborne,
1987) (+) (+) (-) (+) (+)

Alkaloid

(+) endapan
merah bata
dengan reagen
dragendorf
(Majumdar,
2005)
(+) (+) (+) (+)
(-)

Saponin

(+) buih mantap

(Majumdar,
-
2005)

(+) (+) (-) (+) (+)

89
 90

Tanin

(+) endapan
(Robinson,
1991)

(+) (+) (-) (+) (+)

Triterpen/
Steroid
(+) warna
jingga, hijau,
ungu atau biru
(Harborne,
1987) (+) (+) (+) (+) (-)

Ungu Hijau ungu Hijau Hijau Ungu Coklat

 Lampiran 12. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Flavonoid Kulit
Buah Kopi Robusta

EKSTRAK FRAKSI n-heksan

Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,90 Kuning 0,90 Ungu 0,90 Kuning 0,78 Hijau 0,78 Ungu 0,78 Kuning
kecoklatan
0,84 Kuning 0,84 Ungu 0,84 Kuning
kecoklatan
0,73 Kuning 0,73 Ungu 0,73 Kuning
kecoklatan
0,58 Hijau 0,58 Ungu 0,58 Biru
kekuningan kehijauan
FRAKSI etil asetat FRAKSI air
Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,85 coklat 0,85 Ungu 0,85 Kuning 0,86 coklat 0,86 ungu 0,86 Kuning
kecokla kecoklatan
tan
0,62 Hijau 0,62 Ungu 0,62 Abu 0,83 Coklat 0,83 Ungu 0,83 Kuning
kebiruan kecoklatan
0,52 Coklat 0,52 ungu 0,52 Kuning 0,72 coklat 0,72 Ungu 0,72 Kuning
kekunin kecoklatan
gan
0,57 Coklat 0,57 Ungu 0,57 Abu
kekunin kebiruan
gan

91
Lampiran 13. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Alkaloid Kulit
Buah Kopi Robusta

EKSTRAK FRAKSI n-heksan

Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,56 Coklat 0,56 Ungu 0,73 Jingga 0,68 Kuning 0,68 Kuning 0,85 Kuning
kecoklat kecoklat
an an
0,56 Jingga 0,68 Kuning
kecokat kecoklat
an an
FRAKSI etil asetat FRAKSI air
Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,72 Coklat 0,72 Ungu 0,72 Coklat 0,13 Coklat 0,68 Ungu 0,13 Coklat
0,50 Coklat 0,50 Ungu 0,50 Coklat 0,13 Ungu
0,36 Coklat 0,36 Ungu 0,36 Coklat
0,12 Coklat 0,12 Ungu 0,12 Coklat

92
Lampiran 14. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Saponin Kulit
Buah Kopi Robusta

EKSTRAK FRAKSI n-heksan

Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,94 Merah 0,94 Ungu 0,94 Ungu 0,93 Hijau 0,93 Hijau 0,93 Hijau
jambu
0,81 Ungu 0,81 Ungu 0,81 Ungu
0,63 Kuning 0,25 Ungu 0,63 Hijau
kehijaua kehitam
n an
FRAKSI etil asetat FRAKSI air
Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,75 Coklat 0,75 Ungu 0,75 Coklat 0,77 Coklat 0,77 ungu 0,77 Coklat
kekunin
gan
0,56 Ungu 0,67 Coklat 0,67 Ungu 0,67 Coklat
kekunin
gan
0,31 Ungu

93
Lampiran 15. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Tanin Kulit
Buah Kopi Robusta

EKSTRAK FRAKSI n-heksan

Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,63 ungnu 0,46 Hijau 0,87 kuning 0,87 Ungu 0,87 Hijau
kehitaman
0,46 Ungu 0,26 Hijau
kehitaman
0,26 Ungu 0,22 Hijau
kehitaman
0,22 Ungu 0,10 Hijau
kehitaman
0,10 Ungu
FRAKSI etil asetat FRAKSI air
Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,70 Kuning 0,73 Ungu 0,35 Hijau - - 0,62 Ungu 0,32 Hijau
kehitaman kehitaman
0,35 Ungu 0,17 Hijau 0,32 Ungu 0,23 Hijau
kehitaman kehitaman
0,17 Ungu 0,23 Ungu 0,18 Hijau
kehitaman
0,18 Ungu

94
Lampiran 16. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Triterpen
/SteroidKulit Buah Kopi Robusta
EKSTRAK FRAKSI n-heksan
Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

- - - - 0,42 Ungu 0,37 Ungu 0,37 ungu 0,37 Ungu
0,27 Ungu

FRAKSI etil asetat FRAKSI air

Penampak Penampak
Visual UV 254 nm Visual UV 254 nm
Bercak Bercak

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

0,28 Coklat 0,50 Ungu 0,97 Ungu - - - - - -
0,21 Coklat 0,35 Ungu 0,87 Ungu
0,28 Ungu 0,28 Ungu
0,21 Ungu 0,21 Ungu

95
Lampiran 17. Bakteri Streptococcus mutans

Suspensi bakteri
Media Agar Miring
Streptococcus mutans

96
 Lampiran 18. Pembuatan Media

1. Nutrient Agar (NA)

Formula : “Lab Lemco” Powder 1
Yeast Extract 2
Peptone 5
Sodium Chloride 5
Agar 15
Cara Pembuatan : 1,4 gram serbuk Nutrient Agar ditimbang, dan dilarutkan
dalam 50 ml aquadestilata, dipanaskan sampai larut kemudian disterilkan.

2. Nutrient Broth (NB)

Formula : “Lab Lemco” Powder 1
Yeast Extract 2
Peptone 5
Sodium Chloride 5
Cara Pembuatan : 800 mg serbuk Nutrient Broth ditimbang, dilarutkan dalam
100 ml aquadestilata dan diaduk sampai larut, kemudian disterilkan.

3. Mueller Hinton Agar (MHA)

Komposisi dalam 1 Liter:
Casein hidrolysate 17,5 g
Beef extract 300 g
Starch 1,5 g
Agar 17 g
pH 7,3 ± 0,1 at 25ºC
Cara Pembuatan : 38 gram serbuk Mueller Hinton Agar (MHA) ditimbang,
dilarutkan dalam 1000 ml aquadestilata dan dipanaskan sampai larut,
kemudian disterilkan.

97
 Lampiran 19. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji dan Kontrol Positif

1. Larutan induk ekstrak dan fraksi konsentrasi 15% dibuat sebanyak 1 ml

x 1 ml = 0,15 gram

Cara pembuatan : Ditimbang masing-masing fraksi sebanyak 0,15 gram dan

dilarutkan ke dalam DMSO.

2. Konsentrasi ekstrak dan fraksi 12,5% dibuat sebanyak 100 μl

V 1 . C1 = V 2 . C2

100 μl .12,5% = V2 . 15%

V2 = 83,3 μl ~ 83 μl

Cara pembuatan : Dipipetlarutan induk masing-masing ekstrak dan fraksi

sebanyak 83 μl dan dilarutkan ke dalam DMSO.

3. Konsentrasi fraksi 10% dibuat sebanyak100 μl

V 1 . C1 = V 2 . C2

100 μl .10% = V2 . 15%

V2 = 66,7 μl ~ 67 μl

Cara pembuatan :Dipipetlarutan induk masing-masing ekstrak dan fraksi

sebanyak 67 μl dan dilarutkan ke dalam DMSO.

4. Konsentrasi kontrol positif (Amoksisilin)

Berat 1 tablet amoksisilin (500 gram) = 0,7128 gram x 712,8 mg = 71,28 mg

Kertas + zat = 0,5642 gram

Keras = 0,4940 gram

Zat = 0,0702 gram

Konsentrasi sebenarnya x 500 mg = 49,24 mg = 0,0492 gram

98
 99

0,0492 gram
x 100% = 0,49 %
10 ml

Ditimbang 0,0492 gram amoksisilin ditambahkan DMSO hingga 10

ml.kemudian dihomogenkan.

Pengenceran 1 : 10

V1 .C1 = V2 . C2

V1 . 0,49% = 10ml . 0,049%

V1 = 1,0 ml

Diukur 1,0 ml larutan amoksisilin 0,49% kemudianditambahkan DMSO

hingga 10 ml.

Pengenceran 1 : 10

V1 .C1 = V2 . C2

V1 . 0,049% = 10ml . 0,0049%

V1 = 1,0 ml

Diukur 1,0 ml larutan amoksisilin 0,049% kemudianditambahkan DMSO

hingga 10 ml.
Lampiran 20. Sampel Ekstrak, Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Kulit Buah
Kopi Robusta

100
 Lampiran 21. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol

12,5%
%

10%
K-
15%

K+

Diameter Zona Bening (cm)

Ekstrak Kontrol
Replikasi
10% 12,5% 15% Positif Negatif
1 0,308 0,452 0,546 1,386 0,000
2 0,378 0,399 0,564 1,334 0,000
3 0,346 0,428 0,496 1,396 0,000
4 0,380 0,414 0,488 1,382 0,000
5 0,376 0,488 0,502 1,338 0,000
± SD 0,357 ± 0,031 0,436 ± 0,034 0,519 ± 0,033 1,367 ± 0,028 0,000 ± 0,000

101
 Lampiran 22. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Etil Asetat

12,5%

10%
15%
K-

K+

Diameter Zona Bening (cm)

Replikasi Fraksi Etil Asetat Kontrol
10% 12,5% 15% Positif Negatif
1 0,566 0,810 0,824 1,396 0,000
2 0,648 0,738 0,886 1,344 0,000
3 0,532 0,756 0,842 1,330 0,000
4 0,656 0,730 0,892 1,392 0,000
5 0,582 0,784 0,938 1,372 0,000
± SD 0,596 ± 0,053 0,763 ± 0,033 0,876 ± 0,044 1,366 ± 0,029 0,000 ± 0,000

102
 Lampiran 23. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Air

12,5%
%

10%
15%
K-

K+

Diameter Zona Bening (cm)

Replikasi Fraksi Air Kontrol
10% 12,5% 15% Positif Negatif
1 0,502 0,544 0,604 1,410 0,000
2 0,560 0,578 0,610 1,380 0,000
3 0,536 0,556 0,672 1,372 0,000
4 0,558 0,610 0,632 1,332 0,000
5 0,590 0,588 0,592 1,388 0,000
± SD 0,549 ± 0,032 0,575 ± 0,026 0,622 ± 0,031 1,376 ± 0,028 0,000 ± 0,000

103
 Lampiran 24. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi n-Heksan

K-

Diameter Zona Bening (cm)

Replikasi Fraksi n-Heksan Kontrol
10% 12,5% 15% Positif Negatif
1 0,000 0,000 0,000 1,380 0,000
2 0,000 0,000 0,000 1,374 0,000
3 0,000 0,000 0,000 1,412 0,000
4 0,000 0,000 0,000 1,346 0,000
5 0,000 0,000 0,000 1,396 0,000
± SD 0,000 ± 0,000 0,000 ± 0,000 0,000 ± 0,000 1,382 ± 0,025 0,000 ± 0,000

104
 Lampiran 25. Hasil Bioautografi Ekstrak

FLAVONOID ALKALOID SAPONIN

TANIN TRITERPENOID

105
 Lampiran 26. Hasil Bioautografi Fraksi n-Heksan

FLAVONOID ALKALOID SAPONIN

TANIN TRITERPENOID

106
 Lampiran 27. Hasil Bioautografi Fraksi Etil Asetat

FLAVONOID ALKALOID SAPONIN

TANIN TRITERPENOID

107
 Lampiran 28. Hasil Bioautografi Fraksi Air

FLAVONOID ALKALOID SAPONIN

TANIN

108
 Lampiran 29. Instrumen Penelitian

Otoklaf LAF (Laminair Air Flow)

Inkubator Neraca timbangan

Spektrofotometer UV-Vis

109
 Lampiran 30. Hasil Uji Statistika

1. Data Pencilan

2. Uji Normalitas Antar Kelompok

110
 111

3. Uji Homogenitas Antar Kelompok

4. Uji Perbedaan

5. Uji Antar Sampel

 112

6. Uji Antar Konsentrasi

 113

7. Uji Antar Kelompok

Multiple Comparisons
zonahambat
LSD
95% Confidence Interval
Mean Difference (I-
(I) kelompok (J) kelompok J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
*
f. etil asetat 10% f. etil asetat 12,5% -.1668000 .0196961 .000 -.206198 -.127402
f. etil asetat 15% -.2796000* .0196961 .000 -.318998 -.240202
*
f. etil asetat + -.7700000 .0196961 .000 -.809398 -.730602
f. etil asetat - .5968000* .0196961 .000 .557402 .636198
f. air 10% .0476000* .0196961 .019 .008202 .086998
f. air 12,5% .0216000 .0196961 .277 -.017798 .060998
f. air 15% -.0252000 .0196961 .206 -.064598 .014198
f. air + -.7796000* .0196961 .000 -.818998 -.740202
f. air - .5968000* .0196961 .000 .557402 .636198
*
ekstrak 10% .2392000 .0196961 .000 .199802 .278598
ekstrak 12,5% .1606000* .0196961 .000 .121202 .199998
ekstrak 15% .0776000* .0196961 .000 .038202 .116998
*
ekstrak + -.7704000 .0196961 .000 -.809798 -.731002
ekstrak - .5968000* .0196961 .000 .557402 .636198
f. etil asetat f. etil asetat 10% .1668000* .0196961 .000 .127402 .206198
12,5% *
f. etil asetat 15% -.1128000 .0196961 .000 -.152198 -.073402
f. etil asetat + -.6032000* .0196961 .000 -.642598 -.563802
f. etil asetat - .7636000* .0196961 .000 .724202 .802998
f. air 10% .2144000* .0196961 .000 .175002 .253798
*
f. air 12,5% .1884000 .0196961 .000 .149002 .227798
f. air 15% .1416000* .0196961 .000 .102202 .180998
f. air + -.6128000* .0196961 .000 -.652198 -.573402
f. air - .7636000* .0196961 .000 .724202 .802998
ekstrak 10% .4060000* .0196961 .000 .366602 .445398
ekstrak 12,5% .3274000* .0196961 .000 .288002 .366798
*
ekstrak 15% .2444000 .0196961 .000 .205002 .283798
ekstrak + -.6036000* .0196961 .000 -.642998 -.564202
ekstrak - .7636000* .0196961 .000 .724202 .802998
f. etil asetat 15% f. etil asetat 10% .2796000* .0196961 .000 .240202 .318998
*
f. etil asetat 12,5% .1128000 .0196961 .000 .073402 .152198
f. etil asetat + -.4904000* .0196961 .000 -.529798 -.451002
f. etil asetat - .8764000* .0196961 .000 .837002 .915798
*
f. air 10% .3272000 .0196961 .000 .287802 .366598
f. air 12,5% .3012000* .0196961 .000 .261802 .340598
f. air 15% .2544000* .0196961 .000 .215002 .293798
*
f. air + -.5000000 .0196961 .000 -.539398 -.460602
f. air - .8764000* .0196961 .000 .837002 .915798
ekstrak 10% .5188000* .0196961 .000 .479402 .558198
ekstrak 12,5% .4402000* .0196961 .000 .400802 .479598
*
ekstrak 15% .3572000 .0196961 .000 .317802 .396598
ekstrak + -.4908000* .0196961 .000 -.530198 -.451402
ekstrak - .8764000* .0196961 .000 .837002 .915798
114
 115

f. etil asetat + f. etil asetat 10% .7700000* .0196961 .000 .730602 .809398
*
f. etil asetat 12,5% .6032000 .0196961 .000 .563802 .642598
*
f. etil asetat 15% .4904000 .0196961 .000 .451002 .529798
f. etil asetat - 1.3668000* .0196961 .000 1.327402 1.406198
f. air 10% .8176000* .0196961 .000 .778202 .856998
f. air 12,5% .7916000* .0196961 .000 .752202 .830998
*
f. air 15% .7448000 .0196961 .000 .705402 .784198
f. air + -.0096000 .0196961 .628 -.048998 .029798
f. air - 1.3668000* .0196961 .000 1.327402 1.406198
ekstrak 10% 1.0092000* .0196961 .000 .969802 1.048598
ekstrak 12,5% .9306000* .0196961 .000 .891202 .969998
*
ekstrak 15% .8476000 .0196961 .000 .808202 .886998
ekstrak + -.0004000 .0196961 .984 -.039798 .038998
*
ekstrak - 1.3668000 .0196961 .000 1.327402 1.406198
*
f. etil asetat - f. etil asetat 10% -.5968000 .0196961 .000 -.636198 -.557402
f. etil asetat 12,5% -.7636000* .0196961 .000 -.802998 -.724202
*
f. etil asetat 15% -.8764000 .0196961 .000 -.915798 -.837002
f. etil asetat + -1.3668000* .0196961 .000 -1.406198 -1.327402
f. air 10% -.5492000* .0196961 .000 -.588598 -.509802
*
f. air 12,5% -.5752000 .0196961 .000 -.614598 -.535802
f. air 15% -.6220000* .0196961 .000 -.661398 -.582602
*
f. air + -1.3764000 .0196961 .000 -1.415798 -1.337002
f. air - .0000000 .0196961 1.000 -.039398 .039398
*
ekstrak 10% -.3576000 .0196961 .000 -.396998 -.318202
*
ekstrak 12,5% -.4362000 .0196961 .000 -.475598 -.396802
ekstrak 15% -.5192000* .0196961 .000 -.558598 -.479802
*
ekstrak + -1.3672000 .0196961 .000 -1.406598 -1.327802
ekstrak - .0000000 .0196961 1.000 -.039398 .039398
*
f. air 10% f. etil asetat 10% -.0476000 .0196961 .019 -.086998 -.008202
f. etil asetat 12,5% -.2144000* .0196961 .000 -.253798 -.175002
*
f. etil asetat 15% -.3272000 .0196961 .000 -.366598 -.287802
*
f. etil asetat + -.8176000 .0196961 .000 -.856998 -.778202
f. etil asetat - .5492000* .0196961 .000 .509802 .588598
f. air 12,5% -.0260000 .0196961 .192 -.065398 .013398
f. air 15% -.0728000* .0196961 .000 -.112198 -.033402
f. air + -.8272000* .0196961 .000 -.866598 -.787802
*
f. air - .5492000 .0196961 .000 .509802 .588598
ekstrak 10% .1916000* .0196961 .000 .152202 .230998
*
ekstrak 12,5% .1130000 .0196961 .000 .073602 .152398
ekstrak 15% .0300000 .0196961 .133 -.009398 .069398
*
ekstrak + -.8180000 .0196961 .000 -.857398 -.778602
*
ekstrak - .5492000 .0196961 .000 .509802 .588598
 116

f. air 12,5% f. etil asetat 10% -.0216000 .0196961 .277 -.060998 .017798
f. etil asetat 12,5% -.1884000* .0196961 .000 -.227798 -.149002
f. etil asetat 15% -.3012000* .0196961 .000 -.340598 -.261802
*
f. etil asetat + -.7916000 .0196961 .000 -.830998 -.752202
f. etil asetat - .5752000* .0196961 .000 .535802 .614598
f. air 10% .0260000 .0196961 .192 -.013398 .065398
f. air 15% -.0468000* .0196961 .021 -.086198 -.007402
f. air + -.8012000* .0196961 .000 -.840598 -.761802
f. air - .5752000* .0196961 .000 .535802 .614598
*
ekstrak 10% .2176000 .0196961 .000 .178202 .256998
*
ekstrak 12,5% .1390000 .0196961 .000 .099602 .178398
ekstrak 15% .0560000* .0196961 .006 .016602 .095398
*
ekstrak + -.7920000 .0196961 .000 -.831398 -.752602
ekstrak - .5752000* .0196961 .000 .535802 .614598
f. air 15% f. etil asetat 10% .0252000 .0196961 .206 -.014198 .064598
*
f. etil asetat 12,5% -.1416000 .0196961 .000 -.180998 -.102202
f. etil asetat 15% -.2544000* .0196961 .000 -.293798 -.215002
*
f. etil asetat + -.7448000 .0196961 .000 -.784198 -.705402
f. etil asetat - .6220000* .0196961 .000 .582602 .661398
*
f. air 10% .0728000 .0196961 .000 .033402 .112198
f. air 12,5% .0468000* .0196961 .021 .007402 .086198
f. air + -.7544000* .0196961 .000 -.793798 -.715002
*
f. air - .6220000 .0196961 .000 .582602 .661398
ekstrak 10% .2644000* .0196961 .000 .225002 .303798
*
ekstrak 12,5% .1858000 .0196961 .000 .146402 .225198
ekstrak 15% .1028000* .0196961 .000 .063402 .142198
*
ekstrak + -.7452000 .0196961 .000 -.784598 -.705802
*
ekstrak - .6220000 .0196961 .000 .582602 .661398
f. air + f. etil asetat 10% .7796000* .0196961 .000 .740202 .818998
*
f. etil asetat 12,5% .6128000 .0196961 .000 .573402 .652198
f. etil asetat 15% .5000000* .0196961 .000 .460602 .539398
f. etil asetat + .0096000 .0196961 .628 -.029798 .048998
*
f. etil asetat - 1.3764000 .0196961 .000 1.337002 1.415798
f. air 10% .8272000* .0196961 .000 .787802 .866598
*
f. air 12,5% .8012000 .0196961 .000 .761802 .840598
f. air 15% .7544000* .0196961 .000 .715002 .793798
*
f. air - 1.3764000 .0196961 .000 1.337002 1.415798
ekstrak 10% 1.0188000* .0196961 .000 .979402 1.058198
*
ekstrak 12,5% .9402000 .0196961 .000 .900802 .979598
*
ekstrak 15% .8572000 .0196961 .000 .817802 .896598
ekstrak + .0092000 .0196961 .642 -.030198 .048598
*
ekstrak - 1.3764000 .0196961 .000 1.337002 1.415798
 117

f. air - f. etil asetat 10% -.5968000* .0196961 .000 -.636198 -.557402

f. etil asetat 12,5% -.7636000* .0196961 .000 -.802998 -.724202
*
f. etil asetat 15% -.8764000 .0196961 .000 -.915798 -.837002
*
f. etil asetat + -1.3668000 .0196961 .000 -1.406198 -1.327402
f. etil asetat - .0000000 .0196961 1.000 -.039398 .039398
*
f. air 10% -.5492000 .0196961 .000 -.588598 -.509802
f. air 12,5% -.5752000* .0196961 .000 -.614598 -.535802
*
f. air 15% -.6220000 .0196961 .000 -.661398 -.582602
f. air + -1.3764000* .0196961 .000 -1.415798 -1.337002
ekstrak 10% -.3576000* .0196961 .000 -.396998 -.318202
*
ekstrak 12,5% -.4362000 .0196961 .000 -.475598 -.396802
ekstrak 15% -.5192000* .0196961 .000 -.558598 -.479802
*
ekstrak + -1.3672000 .0196961 .000 -1.406598 -1.327802
ekstrak - .0000000 .0196961 1.000 -.039398 .039398
*
ekstrak 10% f. etil asetat 10% -.2392000 .0196961 .000 -.278598 -.199802
*
f. etil asetat 12,5% -.4060000 .0196961 .000 -.445398 -.366602
f. etil asetat 15% -.5188000* .0196961 .000 -.558198 -.479402
*
f. etil asetat + -1.0092000 .0196961 .000 -1.048598 -.969802
f. etil asetat - .3576000* .0196961 .000 .318202 .396998
*
f. air 10% -.1916000 .0196961 .000 -.230998 -.152202
f. air 12,5% -.2176000* .0196961 .000 -.256998 -.178202
*
f. air 15% -.2644000 .0196961 .000 -.303798 -.225002
*
f. air + -1.0188000 .0196961 .000 -1.058198 -.979402
f. air - .3576000* .0196961 .000 .318202 .396998
*
ekstrak 12,5% -.0786000 .0196961 .000 -.117998 -.039202
ekstrak 15% -.1616000* .0196961 .000 -.200998 -.122202
*
ekstrak + -1.0096000 .0196961 .000 -1.048998 -.970202
*
ekstrak - .3576000 .0196961 .000 .318202 .396998
ekstrak 12,5% f. etil asetat 10% -.1606000* .0196961 .000 -.199998 -.121202
f. etil asetat 12,5% -.3274000* .0196961 .000 -.366798 -.288002
f. etil asetat 15% -.4402000* .0196961 .000 -.479598 -.400802
*
f. etil asetat + -.9306000 .0196961 .000 -.969998 -.891202
*
f. etil asetat - .4362000 .0196961 .000 .396802 .475598
f. air 10% -.1130000* .0196961 .000 -.152398 -.073602
f. air 12,5% -.1390000* .0196961 .000 -.178398 -.099602
f. air 15% -.1858000* .0196961 .000 -.225198 -.146402
*
f. air + -.9402000 .0196961 .000 -.979598 -.900802
f. air - .4362000* .0196961 .000 .396802 .475598
*
ekstrak 10% .0786000 .0196961 .000 .039202 .117998
*
ekstrak 15% -.0830000 .0196961 .000 -.122398 -.043602
ekstrak + -.9310000* .0196961 .000 -.970398 -.891602
*
ekstrak - .4362000 .0196961 .000 .396802 .475598
118
 119

ekstrak 15% f. etil asetat 10% -.0776000* .0196961 .000 -.116998 -.038202
f. etil asetat 12,5% -.2444000* .0196961 .000 -.283798 -.205002
*
f. etil asetat 15% -.3572000 .0196961 .000 -.396598 -.317802
f. etil asetat + -.8476000* .0196961 .000 -.886998 -.808202
*
f. etil asetat - .5192000 .0196961 .000 .479802 .558598
f. air 10% -.0300000 .0196961 .133 -.069398 .009398
f. air 12,5% -.0560000* .0196961 .006 -.095398 -.016602
f. air 15% -.1028000* .0196961 .000 -.142198 -.063402
f. air + -.8572000* .0196961 .000 -.896598 -.817802
*
f. air - .5192000 .0196961 .000 .479802 .558598
ekstrak 10% .1616000* .0196961 .000 .122202 .200998
*
ekstrak 12,5% .0830000 .0196961 .000 .043602 .122398
*
ekstrak + -.8480000 .0196961 .000 -.887398 -.808602
ekstrak - .5192000* .0196961 .000 .479802 .558598
*
ekstrak + f. etil asetat 10% .7704000 .0196961 .000 .731002 .809798
f. etil asetat 12,5% .6036000* .0196961 .000 .564202 .642998
*
f. etil asetat 15% .4908000 .0196961 .000 .451402 .530198
f. etil asetat + .0004000 .0196961 .984 -.038998 .039798
f. etil asetat - 1.3672000* .0196961 .000 1.327802 1.406598
f. air 10% .8180000* .0196961 .000 .778602 .857398
f. air 12,5% .7920000* .0196961 .000 .752602 .831398
*
f. air 15% .7452000 .0196961 .000 .705802 .784598
f. air + -.0092000 .0196961 .642 -.048598 .030198
f. air - 1.3672000* .0196961 .000 1.327802 1.406598
ekstrak 10% 1.0096000* .0196961 .000 .970202 1.048998
ekstrak 12,5% .9310000* .0196961 .000 .891602 .970398
*
ekstrak 15% .8480000 .0196961 .000 .808602 .887398
ekstrak - 1.3672000* .0196961 .000 1.327802 1.406598
ekstrak - f. etil asetat 10% -.5968000* .0196961 .000 -.636198 -.557402
*
f. etil asetat 12,5% -.7636000 .0196961 .000 -.802998 -.724202
*
f. etil asetat 15% -.8764000 .0196961 .000 -.915798 -.837002
*
f. etil asetat + -1.3668000 .0196961 .000 -1.406198 -1.327402
f. etil asetat - .0000000 .0196961 1.000 -.039398 .039398
*
f. air 10% -.5492000 .0196961 .000 -.588598 -.509802
f. air 12,5% -.5752000* .0196961 .000 -.614598 -.535802
*
f. air 15% -.6220000 .0196961 .000 -.661398 -.582602
*
f. air + -1.3764000 .0196961 .000 -1.415798 -1.337002
f. air - .0000000 .0196961 1.000 -.039398 .039398
*
ekstrak 10% -.3576000 .0196961 .000 -.396998 -.318202
*
ekstrak 12,5% -.4362000 .0196961 .000 -.475598 -.396802
*
ekstrak 15% -.5192000 .0196961 .000 -.558598 -.479802
*
ekstrak + -1.3672000 .0196961 .000 -1.406598 -1.327802
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
120