Penetapan Kadar Hesperidin dengan

Menggunakan KLT Densitometri

Kelompok B5 – Prak Fitokimia E
Dini Badriyanti S. 1706021796
Nada Marcha P. 1706974536
Rezki Yuni Adelia 1706034722
Siska Silvany 1706034382
 Pendahuluan
● Penetapan kadar hesperidin dapat menggunakan KLT Densitometri
karena metode ini dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif, penggunaannya lebih mudah, murah, dan efisien
● Metode ini juga dinilai praktis karena hanya memerlukan sampel yang
sedikit dan waktu analisis yang singkat untuk melihat kemurnian dan
karakterisasi sampel dengan menggunakan standar

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 Hesperidin → Flavanon
LIBERTON, 1828 Sastry dan Row

Hesperides → Hesperidin Citrus mitis → Hesperidin

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 ● Buah jeruk mengandung senyawa flavonoid khususnya kalkon dan
flavanon yang sebagian besar berwarna kuning atau jingga
● Salah satu jenis flavanon yang terdapat dalam buah jeruk adalah
hesperidin
● Hesperidin merupakan senyawa yang tidak pahit dan sangat sukar larut
→ menyebabkan hesperidin mudah untuk diisolasi

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
Mengapa Penetapan Kadar Hesperidin menggunakan
KLT-Densitometri?
Tidak Perlu
Analisis
Analisis Cepat Pemurnian
Kuantitatif
Isolat

PERLU DIPERHATIKAN
Cara
Pelarut Sesuai
Penotolan
(trial & error)
Sampel
 Memahami
prosedur
penetapan kadar
senyawa
Hesperidin
dengan metode
KLT Densitometri

Tujuan Vestibulum
congue
Vestibulum
Menetapkan kadar
congue
senyawa Hesperidin
dengan KLT
Densitometri
Alat dan Bahan
 Alat

Penangas Air Pipa Kapiler Bejana Kromatografi Kertas Saring

Labu Volumetrik TLC Scanner Plat KLT (Silica Gel 60 F254) Pipet
Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 Bahan
❏ Jeruk Baby Egypt, Baby Pacitan, Mandarin
No. Eluen
Lokam, Mandarin Pakistan, Medan Super,
1. Metanol : Diklorometana (8:2)
Nipis, Sunkist, Peras, Purut, Santang, Sunkist
Nevel 2. Metanol : Diklorometana (9:1)
❏ Larutan Ca(OH)2 10% 3. Metanol : Diklorometana (1:9)
❏ HCl
4. Benzena : Metanol (9:1)
❏ Metanol
5. n-butanol : Asam Asetat : Aquadest
❏ Hesperidin Standar (9:6:1)
❏ Eluen
6. Kloroform : Asam Asetat (2:3)

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
Preparasi Sampel
 Pembuatan Larutan Standar
Ad sampai batas
(100mL)

(+)Metanol 50mL
100 mg Serbuk
1000 µg/mL

Alam, P., Alam, A., Anwer, M. K., & Alqasoumi, S. I. (2014).

Quantitative estimation of hesperidin by HPTLC in different varieties
of citrus peels. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 4(4),
262–266. doi:10.12980/apjtb.4.2014c1007 254 nm
Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 Tabel 1. Data Kromatogram Standar Hesperidin pada
Penentuan Pelarut
No Pelarut Rf Max Bentuk Puncak % Hesperidin (recovery)

1 Metanol:diklorometana (8:2) 0.84 Melebar 48.60

2 Metanol:diklorometana (9:1) 0.78 Meruncing, terbentuk 71.09

tailing

3 Metanol:diklorometana (1:9) 0.04 Meruncing, terbentuk 69.47

tailing

4 Benzena:Metanol (9:1) 0.04 Meruncing 75.88

5 n-butanol:asam 0.99 Meruncing, terbentuk 63.54

asetat:aquadest (9:6:1) fronting

6 Kloroform:asam asetat (2:3) 0.39 Meruncing 89.27

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 Pengenceran
-
- Pip
e
Larutan Induk 1000 Ad t 2 m
10 L
t) t) µg/mL mL
(p ipe pe
mL pi
0,4 L(
L 0,8
m mL 1,6 mL (pipet)
d 10
m 10 1.2mL (pipet)
a ad ad 10 mL
ad 10 mL
40µg/mL
80µg/mL
160µg/mL 200µg/mL

120µg/mL

Alam, P., Alam, A., Anwer, M. K., & Alqasoumi, S. I. (2014). Quantitative estimation of hesperidin by HPTLC in different varieties of citrus peels. Asian Pacific
Journal of Tropical Biomedicine, 4(4), 262–266. doi:10.12980/apjtb.4.2014c1007
Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 Pembuatan Larutan Uji

Diambil 20 gram Filtrasi

(+) HCl
75 mL

Simplisia
(+) Kalium Hidroksida 10%
Semalam, 25 Derajat C

Mengandung Hesperidin

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
Metode Uji Larutan Sampel

Penotolan Densitometer

254 nm
Mengandung Hesperidin
Penetapan & Perhitungan Kadar
 Penetapan Kadar
Filtrat

Ukuran plat 1 cm x 7,5 cm Jarak rambat 6 cm

Panjang gelombang 254 nm

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 Hasil Kurva Kalibrasi

y= 15899 x + 869,55

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 Perhitungan Kadar
1. Luas area sampel Baby Egypt = 3063,3

Luas area sampel (y) = bx + a

3063,3 = 15899 x + 869,55

x = 0,1380

Kadar hesperidin = 0,1380 (%b/v)

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
2. Luas area sampel Baby 3. Luas area sampel Mandarin 4. Luas area sampel Jeruk Nipis
Pacitan = 1843,3 Lokam = 893,7 = 275

Luas area sampel (y) = bx + a Luas area sampel (y) = bx + a Luas area sampel (y) = bx + a

1843,3 = 15899 x + 869,55 893,7 = 15899 x + 869,55 275 = 15899 x + 869,55

x = 0,0615 x = 0,0018 x = 0,000

Kadar hesperidin = 0,0615 (%b/v) Kadar hesperidin = Kadar hesperidin = 0,000 (%b/v)
0,0018(%b/v)

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 5. Luas area sampel Santang = 6. Luas area sampel Sunkist
944,0 Nevel = 1445,2

Luas area sampel (y) = bx + a Luas area sampel (y) = bx + a

944,0 = 15899 x + 869,55 1445,2 = 15899 x + 869,55

x = 0,0049 x = 0,0360

Kadar hesperidin = 0,0049 (%b/v) Kadar hesperidin =

0,0018(%b/v)

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
 ● Kadar tertinggi hesperidin terdapat pada Baby Egypt (0,1380 %)
● Kadar hesperidin yang sangat rendah pada beberapa sampel seperti pada
jeruk mandarin pakistan, medan super, nipis tidak dapat dideteksi oleh
metode ini
● Keuntungan metode KLT → analisisnya cepat dan efisien
● Kekurangan → penentuan pelarut dengan cara mencoba (trial and error)
dan penotolan sampel yang cukup sulit

Handayani, S., Sunarto., Kristianingrum S. (2005). Kromatografi Lapis Tipis Untuk Penentuan Kadar Hesperidin dalam Kulit Buah Jeruk. Jurnal Penelitian Saintek, 10(1).
Sesi Tanya Jawab Presentasi
Sesi 1 (PK Piperin dengan KLT Densitometri)
Penanya Novi : Saat analisis, Bagaimana menentukan jumlah std dan jumlah sampel pada KLT?
Jawaban : Penotolan standar minimal 5 untuk membuat kurva kalibrasi. Namun, untuk sampel sebaiknya dilakukan
secara triplo.
Penanya Syahri : R→ 0,96? Faktor apa saja yang membuat R tersebut kurang baik?
Jawaban : Faktor bisa dari kondisi elusidasi kurang optimal, misal adanya fronting/tailing. Atau juga faktor eksternal
seperti dari alat atau praktikan. Nilai R yang dibawah 0,99… menandakan kurang akurat. Serta bisa disebabkan karena penotolan
yang kurang benar.
Yeyen : Bagaimana kita menentukan fase gerak analisis dan perbandingannya?
Jawaban : untuk menentukan fase gerak analisis perlu dilakukan optimasi terlebih dahulu (trial n error). Dibuat beberapa
campuran dan perbandingan fase gerak. Nanti dilihat yang Rf nya lebih bagus dan menghasilkan peak atau spektrum meruncing
bagus (tidak tailing/fronting)
Raihani : Agar penotolan KLT tidak melebar atau tailing, itu gimana?
Jawaban : Untuk pemilihan pelarut harus sesuai (lakukan optimasi) dan saat penotolan tidak terlalu menekan plat serta
volume tidak usah terlalu banyak. Namun, untuk menetapkan banyaknya volume penotolan lakukan optimasi terlebih dahulu. Apabila
dalam volume tertentu sudah baik absorbansinya maka menggunakan banyak volume yang menghasilkan absorbansi baik tersebut
(Pertanyaan Prof Berna)
Ibu Babay : Apakah penggunaan solvent dapat diulang beberapa kali?
Jawaban : Sebaiknya 1 kali saja, Karena saat digunakan berkali-kali Rf nya bisa jadi lebih kecil. Hal ini bisa terjadi
karena komposisi eluen bisa saja sudah tidak akurat seperti penggunaan pertama. Namun, tergantung jumlah eluennya juga. Apabila
chambernya besar bisa digunakan sebanyak 2 kali dan biasanya digunakan untuk mencoba eludasi saja. (Penjelasan Prof Berna)
Sesi 2 (PK β-Sitosterol dengan KLT Densitometri)
Pertanyaan dari Kelompok 3

Al Lifia R.U : Berapa lama waktu yang dibutuhkan untuk menjenuhkan chamber? Jawaban :
Dikatakan jenuh apabila fase gerak telah mencapai ujung atas dari kertas saring yang
diletakkan di dalam chamber, sehingga lama waktu penjenuhan salah satunya akan
bergantung pada seberapa besar ukuran chamber yang digunakan.

Avini Risda : Mengapa chamber yang tidak disaturasi mengalami effect smiley? Jawaban :
Chamber yang tidak jenuh terkadang masih memiliki uap air yang dapat menyebabkan efek
smiley akibat tegangan permukaan dari air yang menyebabkan efek smiley yang menyerupai
meniskus.
Sesi 2 (PK β-Sitosterol dengan KLT Densitometri)
Disqi Fahira : Apakah penotolan otomatis dapat mengurangi risiko tailing? Jawaban :
Ya, karena penotolan otomatis lebih akurat dalam konsentrasi sampel yang ditotolkan
dan lebih rapi karena sehingga berkurangnya pelebaran totolan yang mana keduanya
merupakan faktor-faktor yang dapat menyebabkan tailing.

Dina Lestari : Tujuan metanol di prewashing? Jawaban : Metanol digunakan sebagai

prewashing agent untuk menghilangkan kotoran dari plat yang bersifat polar.
Umumnya prewashing dilakukan dengan campuran metanol-kloroform untuk
menghilangkan kotoran dari plat yang bersifat polar dan nonpolar.
Sesi 2 (PK β-Sitosterol dengan KLT Densitometri)
Bu Babay :

1. Berapa kali solvent untuk elusi boleh digunakan? Jawaban : Tergantung jumlah
pelarut yang digunakan. Solvent untuk elusi memang sebaiknya digunakan yang
baru dan fresh, jika jumlahnya sedikit karena ditakutkan terjadi penguapan,
sehingga komposisi solventnya berubah, apabila jumlahnya banyak maka dapat
digunakan 2 kali.
Sesi 3 (PK Fenol total dengan Spektro UV)
Pertanyaan dari Kelompok 5

Pengujian folin-ciocalteu untuk apa? Berapa panjang gelombang untuk

penetapan fenol total? (Nada Marcha)

❖ Pereaksi folin-ciocalteu untuk penetapan kadar fenol total. Pereaksi ini

akan mengoksidasi fenolat, membentuk kompleks
fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru, sehingga dapat diukur dan
dideteksi dengan spektrofotometer.
❖ Panjang gelombang untuk penetapan kadar fenol total adalah 744,8 nm.
Sesi 3 (PK Fenol total dengan Spektro UV)

Penentuan panjang gelombang bagaimana caranya? (Prof Berna)

❖ Dengan cara diukur pada skala wavelength 800-400 nm, lalu dilihat dulu
absorbansinya harus antara rentang 0,2 - 0,8, selanjutnya dicari panjang
gelombang yang memberikan absorbansinya paling maksimal (paling
besar) → maka itulah yang dipilih sebagai panjang gelombang.
Sesi 3 (PK Fenol total dengan Spektro UV)

Pada preparasi, kenapa larutan didiamkan 2 jam sebelumnya? (Siska

Silvany)

❖ Sebenarnya didiamkan juga pada keadaan gelap, tidak hanya pada suhu
ruang. Hal ini dikarenakan reagennya sensitif dengan cahaya dan bisa
terganggu reaksinya, maka didiamkan dulu supaya selesai reaksinya
sebelum di spektrofotometri.
Sesi 3 (PK Fenol total dengan Spektro UV)
Apakah ada standar lain yang bisa digunakan untuk penetapan kadar
fenol total selain asam galat? (Dini)

❖ Menurut jurnal-jurnal yang sudah dibaca, untuk penetapan kadar fenolik

kebanyakan menggunakan standar asam galat karena asam galat itu
turunan hidrobenzoat yang merupakan asam fenol sederhana yang
murni dan stabil. Tapi seharusnya bisa juga digunakan standar lain,
asalkan standar tersebut merupakan golongan fenol.
Sesi 4 (PK Flavonoid total dengan Spektro UV)
Pertanyaan dari Kelompok 7

Anggi Aprilia Prawidi : Alasan penambahan AlCL3 dan Natrium Asetat? Alasan penambahan
AlCL3 adalah ? Jawaban : agar terbentuk kompleks sehingga terjadinya pergeseran panjang
gelombang ke daerah visible ditandai dengan kelarutannya menjadi warna kuning.Alasan
penambahan Natrium Asetat adalah untuk mempertahankan panjang gelombang pada
daerah visible.

Lola Miftahul Fidini: Bagaimana cara menghindari serapan pelarut pada saat penetapan
kadar dengan menggunakan UV-Vis? Jawaban : Pelarut yang digunakan harus dioptimasi.
Pelarut yang digunakan harus pelarut yang pro analisis bukan pelarut yang pro teknis.
Sesi 4 (PK Flavonoid total dengan Spektro UV)
Syifa Amalia : Mengapa saat preparasi larutan standar harus ditunggu selama satu jam?
Jawaban : Diinkubasi agar reaksi dengan AlCl3 sama Na asetat bisa berlangsung sempurna
jadi intensitas warnanya lebih maksimal.

Ratu Juwita : Blangko isi nya apa aja? Jawaban : Blangko itu isinya etanol 0,5 ml + 1,5 etanol
(p) 1,5 ml + 0,1 ml na asetat 1 M + 2,8 ml aquades lalu didiamkan 10 menit.

Bu Berna :

1. Cara mencari panjang gelombang maksimal? Jawaban Untuk melihat skala panjang
gelombang maksimum, dilihat apakah panjang gelombang itu absorbansinya sudah
masuk range 0,2-0,8. Perlu dilakukan optimasi panjang gelombang yang digunakan.
Sesi 4 (PK Flavonoid total dengan Spektro UV)
Bu Babay :

1. Apa kriteria pelarut yang digunakan selain bisa melarutkan sampel? Jawaban : Harus bisa melarutkan
sampel, tidak boleh mengganggu absorbansi pada uvUV harus transparan dalam keadaan normal,
pelarut pro analisis. harus transparan dalam keadaan normal, sifanya inert jadi tidak boleh
mengganggu senyawa yg diuji, tidak mengandung ikatan rangkap yang terkonjugasi dengan
molekulnya.
2. Apakah penggunaan solvent dapat diulang beberapa kali? Jawaban: solven eluen sebaiknya sekali
digunakan. Jika mengandung komponen yang mudah menguap jadi tidak bisa dipakai karena ada
beberapa komponen yang hilang dan jika digunakan maka hasilnya akan kurang baik. Frekuensi
penggunaan solven juga bisa dilihat dari ukuran chambernya. Kalau chamber besar, eluennya bisa
dipakai 2 kali. Jika chamber yang digunakan kecil, maka eluennya hanya dapat sekali pakai.