Pengenalan Agarosa dan Elektroforesis Gel Poliakrilamid

dengan Kepekaan Sensitivitas Deteksinya.

Patricia Barril dan Silvia Nates
Instituto de Virología “Dr. J. M. Vanella ”, Facultad de Ciencias Médicas,
Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba,Argentina.

1. Perkenalan
Selama beberapa tahun terakhir teknik biologi molekuler, seperti reaksi berantai polimerase
(PCR), telah menjadi banyak digunakan untuk aplikasi medis dan forensik, serta penelitian,
dan deteksi dan karakterisasi organisme menular. Di bidang virologi, sudah
menunjukkan bahwa penggunaan teknik PCR menawarkan keuntungan yang tinggi
sensitivitas dan reproduktifitas dalam deteksi genom virus dan karakterisasi ketegangan
Namun, sensitivitas dalam mendeteksi fragmen DNA juga terkait dengan sensitivitas
dari matriks elektroforesis yang diterapkan untuk pengembangan produk PCR.
Elektroforesis melalui agarosa atau gel poliakrilamida adalah metode standar yang digunakan
untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan asam nukleat, karena kedua gel ini
bersifat berpori di alam. Di dalam bab evaluasi sensitivitas elektroforesis gel agarosa dan
poliakrilamida matriks dalam pendeteksian produk PCR dianalisis. Untuk tujuan ini, rotavirus
PCR amplikon digunakan sebagai model. Rotavirus manusia telah diakui sebagai penyebab
paling umum dehidrasi diare pada bayi dan anak kecil dalam skala dunia. Virus ini ditandai
dengan kehadiran 11 segmen RNA untai ganda dikelilingi oleh tiga yang terpisah
kerang, inti, kapsid dalam dan kapsid luar. Saat ini, rotavirus digolongkan ganda
Genotipe G dan P sesuai dengan perbedaan antigen netralisasi VP7 dan VP4
yang membentuk kapsid luar virion. Dua vaksin rotavirus telah dilisensikan di Internet
tahun 2006 di banyak negara. Meskipun studi keamanan dan kemanjuran skala besar
keduanya vaksin rotavirus telah menunjukkan kemanjuran yang sangat baik terhadap
gastroenteritis rotavirus yang parah (Ruiz-Palacios et al., 2006; Matson, 2006), kurangnya
data yang jelas tentang perlindungan terhadap genotipe yang tidak termasuk dalam formulasi
vaksin menggarisbawahi pentingnya virologi pengawasan, karakterisasi strain rotavirus dan
evaluasi dampaknya vaksin dalam mengurangi penyakit diare di wilayah kami (Gentsch et
al., 2005; Perez-Schael et al., 1990; Velazquez et al., 1996).
Selain itu, keberadaan beberapa genotipe G dan / atau P dalam spesimen individu dapat
terjadi menawarkan lingkungan yang unik untuk akuisisi infeksi campuran dan karenanya
untuk reassortment gen rotavirus. Ini dapat mempengaruhi keduanya, evolusi rotavirus dan
kemanjuran kinerja vaksin saat ini dan masa depan. Dalam konteks ini, pengetahuan tentang kedua
rotavirus genotipe yang beredar di masyarakat dan kejadian infeksi campuran rotavirus adalah
penting untuk memperoleh pemahaman mendalam tentang ekologi dan distribusi
strain rotavirus dan mengantisipasi perubahan antigenik yang dapat memengaruhi efektivitas vaksin.
Untuk tujuan ini, rotavirus G dan P genotipe ditentukan oleh ekstraksi virus RNA dari spesimen tinja
diikuti dengan analisis oleh PCR reverse-transcriptase semi-bersarang (RT-PCR) dengan primer
spesifik untuk wilayah gen yang mengkode VP7 atau VP4. Itu Produk PCR spesifik genotipe kemudian
dianalisis pada agarosa atau gel poliakrilamida diikuti oleh pewarnaan ethidium bromide atau
pewarnaan perak. Matriks yang digunakan untuk elektroforesis harus memiliki ukuran pori yang
dapat disesuaikan tetapi teratur lembam secara kimia, dan pilihan mana gel gel untuk digunakan
tergantung terutama pada ukuran
 fragmen-fragmen dipisahkan (Guilliatt, 2002). Seperti yang dikomentari sebelumnya, meskipun
pentingnya spesifisitas dan sensitivitas PCR dikenal, mekanisme dimana
hasil yang diukur sama pentingnya (Wildt et al., 2008).
2. Karakteristik umum dari matriks agarosa dan poliakrilamida
2.1 Elektroforesis gel Agarosa (AGE)
Agarose adalah polimer linier alami yang diekstraksi dari rumput laut yang membentuk matriks gel
oleh Ikatan hidrogen bila dipanaskan dalam buffer dan dibiarkan dingin. Untuk sebagian besar
aplikasi, hanya diperlukan agarosa komponen tunggal dan tidak diperlukan katalis polimerisasi.
Oleh karena itu, gel agarosa sederhana dan cepat untuk disiapkan (Chawla, 2004). Mereka yang
paling banyak media populer untuk pemisahan asam nukleat berukuran sedang dan besar dan
memiliki berbagai pemisahan tetapi daya penyelesaian yang relatif rendah, karena pita terbentuk di
gel cenderung kabur dan menyebar terpisah. Ini adalah hasil dari ukuran pori dan tidak dapat
sebagian besar dikontrol.

keuntungan dan kerugian lainnya dari menggunakan gel agarosa untuk DNA elektroforesis diringkas
dalam Tabel 1 (Stellwagen, 1998).

keuntungan kerugian

Media gel tidak beracun Biaya agarosa tinggi

Gel cepat dan mudah dilemparkan Pita kabur

Baik untuk memisahkan molekul DNA besar Pemisahan yang buruk dari berat molekul rendah sampel

Dapat memulihkan sampel dengan melelehkan gel,

mencerna dengan enzim agarosa atau mengobati

dengan garam chaotropic

2.2 Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE)

Gel poliakrilamida adalah gel yang terikat secara kimiawi yang dibentuk oleh polimerisasi
akrilamida dengan zat pengikat-silang, biasanya N, N-metilenebisakrilamida. Reaksinya
adalah polimerisasi radikal bebas, biasanya dilakukan dengan amonium persulfat sebagai
inisiator dan N, N, N ', N-tetramethylethylendiamine (TEMED) sebagai katalis. walaupun
gel umumnya lebih sulit untuk disiapkan dan ditangani, melibatkan waktu yang lebih lama
persiapan daripada gel agarose, mereka memiliki keunggulan utama dibandingkan gel agarose.
Mereka punya

daya penyelesaian yang lebih besar, dapat mengakomodasi jumlah DNA yang lebih besar tanpa
kehilangan yang signifikan dalam resolusi dan DNA yang pulih dari gel poliakrilamida sangat murni
(Guilliatt,2002). Selain itu, ukuran pori gel poliakrilamida dapat diubah dengan mudah dan
mode yang dapat dikendalikan dengan mengubah konsentrasi kedua monomer. Bagaimanapun juga
harus dicatat bahwa poliakrilamida adalah neurotoksin (bila tidak dipolimerisasi), tetapi dengan
 perawatan laboratorium yang tepat itu tidak lebih berbahaya daripada berbagai bahan kimia yang
biasa digunakan (Budowle & Allen, 1991). Beberapa kelebihan dan kekurangan menggunakan gel
poliakrilamida untuk elektroforesis DNA digambarkan pada Tabel 2 (Stellwagen, 1998).

keuntungan kerugian

Ikatan silang stabil secara kimia Monomer toksik

Pita tajam Gel membosankan untuk disiapkan dan sering bocor

Baik untuk pemisahan fragmen-fragmen dengan berat molekul Perlu gel baru untuk setiap percobaan
rendah

Keuntungan Kerugian Stabil secara kimiawi ikatan silang Monomer toksik Pita tajam Gel
membosankan untuk disiapkan dan sering bocor Baik untuk pemisahan dengan berat molekul
rendah fragmen Perlu gel baru untuk setiap percobaan Gel silang terikat secara kimiawi yang stabil
Tabel 2. Keuntungan dan kerugian elektroforesis gel poliakrilamida.

keuntungan kerugian

Ikatan silang stabil secara kimia Monomer toksik

Pita tajam Gel membosankan untuk disiapkan dan sering bocor

Baik untuk pemisahan fragmen-fragmen dengan Perlu gel baru untuk setiap percobaan
berat molekul rendah

3. Konsentrasi gel
3.1 Konsentrasi gel agarosa
Persentase agarosa yang digunakan tergantung pada ukuran fragmen yang harus diselesaikan.
Itu konsentrasi agarosa disebut sebagai persentase agarosa terhadap volume buffer (b / v),
dan gel agarosa biasanya dalam kisaran 0,2% sampai 3% (Smith, 1993). Semakin rendah
konsentrasi agarosa, semakin cepat fragmen DNA bermigrasi. Secara umum, jika tujuannya
adalah untuk terpisah fragmen DNA besar, konsentrasi rendah agarosa harus digunakan, dan
jika tujuannya adalah untuk memisahkan fragmen DNA kecil, agarose konsentrasi tinggi.
 Tabel 3. Konsentrasi gel agarosa untuk menyelesaikan molekul DNA linier.

Konsentrasi agarosa (%) Kisaran ukuran DNA (bp)

0,2 5000-40000

0,4 5000-30000

0,6 3000-10000

0,8 1000-7000

1 500-5000

1,5 300-3000

2 200-1500

3 100-1000

3.2 Konsentrasi gel poliakrilamida

Pilihan konsentrasi akrilamida sangat penting untuk pemisahan molekul yang optimal
(Hames, 1998). Memilih konsentrasi akrilamida yang sesuai dan ikatan silang
agen, methylenebisacrylamide, ukuran pori dalam gel dapat dikontrol. Dengan meningkatnya
total persentase konsentrasi (T) monomer (akrilamida plus cross-linker) dalam gel,

ukuran pori berkurang dalam hubungan yang hampir linier. Gel persentase lebih tinggi (T lebih
tinggi),dengan pori-pori yang lebih kecil, digunakan untuk memisahkan molekul yang lebih kecil.
Hubungan persentase total monomer yang diwakili oleh cross-linker (C) lebih kompleks.
Para peneliti telah menetapkan nilai C 5% (19: 1 akrilamida / bisakrilamida) untuk sebagian besar
bentuk dari denaturasi elektroforesis DNA dan RNA, dan 3,3% (29: 1) untuk sebagian besar protein,
asli Gel DNA dan RNA. Untuk optimasi, gel poliakrilamid 5% hingga 10% dengan pengait silang
variabel dari 1% hingga 5% dapat digunakan. Menghubungkan silang rendah (di bawah 3% C)
menghasilkan "gel serat panjang"dengan ukuran pori meningkat (Glavač & Dean, 1996). Selain itu,
harus ditunjukkan bahwa pada konsentrasi akrilamida rendah / bisakrilamida penanganan gel sulit
karena mereka berlendir dan kurus. Tabel 4 memberikan perbandingan akrilamida / bisakrilamida
yang direkomendasikan dan persentase gel untuk rentang ukuran molekul yang berbeda.
 Tabel 4 memberikan perbandingan DNA/ RNA yang direkomendasikan dan
persentase gel untuk rentang ukuran molekul yang berbeda.
Acrylamide / Bis Rasio Gel% DNA Asli / RNA(bp) Didenaturasi
DNA / RNA (b

19: 1 4 100-1500 70-500

6 60-600 40-400

8 40-500 20-200

10 30-300 15-150

12 20-150 10-100

29: 1 5 200-2000 70-800

6 80-800 50-500

8 60-400 30-300

10 50-300 20-200

12 40-200 15-150

20 <40 <40

4. Sistem buffer elektroforesis

Pemisahan efektif asam nukleat dengan elektroforesis gel agarosa atau poliakrilamida
tergantung pada pemeliharaan pH yang efektif dalam matriks. Oleh karena itu, buffer adalah
bagian integral dari teknik elektroforesis. Selain itu, mobilitas elektroforesis DNA dipengaruhi oleh
komposisi dan kekuatan ionik (kandungan garam) dari elektroforesis buffer (Somma & Querci, 2006).
Tanpa garam, konduktansi listrik minimal dan DNA nyaris tidak bergerak. Dalam buffer dengan
kekuatan ionik tinggi, konduktansi listrik sangat efisien dan sejumlah besar panas dihasilkan.
Berbagai kategori sistem buffer tersedia untuk elektroforesis: disosiasi dan non-disosiasi, terus
menerus dan terputus.
4.1 Dissociating dan non-dissociating systems buffer
Analisis elektroforetik asam nukleat untai tunggal dipersulit oleh yang sekunder
struktur diasumsikan oleh molekul-molekul ini. Pemisahan berdasarkan berat molekul
membutuhkan masuknya agen denaturasi, yang membuka untai DNA atau RNA dan
menghapus pengaruh bentuk pada mobilitas mereka. Asam nukleat membentuk struktur yang
distabilkan oleh hidrogen ikatan antara basis. Denaturasi membutuhkan gangguan ikatan
hidrogen ini.
umumnya sistem penyangga yang dipisahkan termasuk urea dan formamida sebagai
denaturants DNA. DNA terdenaturasi bermigrasi melalui gel-gel ini pada tingkat yang
hampir sepenuhnya bergantung pada komposisi dan urutan dasarnya. Mendenaturasi atau
memisahkan sistem buffer untuk protein termasuk penggunaan natrium dodesil sulfat (SDS).
Dalam sistem SDS-PAGE,dikembangkan oleh Laemmli (1970), protein dipanaskan dengan
SDS sebelum elektroforesis sehingga kepadatan muatan semua protein dibuat kira-kira sama.
Pemanasan di SDS, anionik deterjen, mendenaturasi protein dalam sampel dan berikatan erat
dengan molekul yang tidak dikeraskan (dengan muatan negatif bersih). Akibatnya, ketika
sampel ini dielektroforesis, protein terpisah menurut massa saja, dengan efek yang sangat
kecil dari perbedaan komposisi. Molekul DNA bermuatan negatif; Oleh karena itu
penambahan SDS dalam gel persiapan hanya dengan tujuan meningkatkan daya resolusi band
(Day &Humphries, 1994).Dengan tidak adanya denaturants, DNA beruntai ganda (dsDNA),
seperti produk PCR, tetap ada struktur heliks ganda, yang memberinya bentuk seperti batang
saat bermigrasi melalui gel. Selama elektroforesis molekul asli dalam sistem buffer non-
disosiasi, pemisahan berlangsung pada tingkat yang kira-kira berbanding terbalik dengan
log10 dari ukurannya.

4.2 Sistem buffer kontinu dan terputus-putus

Dalam sistem buffer kontinu, identitas dan konsentrasi komponen buffer adalah
sama di kedua gel dan tangki. Meskipun sistem buffer terus menerus mudah
menyiapkan dan memberikan resolusi yang memadai untuk beberapa aplikasi, band
cenderung lebih luas dan resolusi akibatnya lebih buruk di gel ini. Sistem penyangga ini
digunakan untuk sebagian besar formulir elektroforesis gel agarosa DNA, yang umumnya
mengandung EDTA (pH 8.0) dan Trisacetate (TAE) atau Tris-borate (TBE) pada konsentrasi
sekitar 50mM (pH 7,5-7,8). TAE lebih murah, tetapi tidak sekestabil TBE. Selain itu, TAE
memberikan resolusi yang lebih baik Pita DNA dalam pemisahan elektroforesis pendek dan
sering digunakan ketika DNA selanjutnya isolasi diinginkan. TBE digunakan untuk
elektroforesis gel poliakrilamida dari molekul yang lebih kecil DNA berat (MW <2000) dan
elektroforesis gel agarosa dari DNA yang lebih panjang di mana tinggi resolusi tidak penting.

Sistem terputus-putus (multifasik) menggunakan buffer yang berbeda untuk tangki dan gel, dan
seringkali dua buffer berbeda di dalam gel. Sistem terputus berkonsentrasi atau "menumpuk"
sampel menjadi zona yang sangat sempit sebelum pemisahan, yang menghasilkan peningkatan
ketajaman pita dan resolusi. Gel tersebut dibagi menjadi gel "susun" atas dengan persentase rendah
akrilamida dan pH rendah (6,8) dan gel pemisah dengan pH 8,8 dan pori-pori jauh lebih kecil (lebih
tinggi persentase akrilamida). Gel penumpukan mencegah DNA dengan berat molekul tinggi
hadir dalam sampel dari menyumbat pori-pori di bagian atas gel yang berjalan sebelum rendah
molekul DNA berat telah masuk. Baik, susun dan gel pemisah, hanya berisi klorida sebagai anion
bergerak, sedangkan buffer tangki mengandung glisin sebagai anionnya, pada pH
8.8. Keuntungan utama dari sistem buffer diskontinyu daripada sistem buffer kontinu
adalah bahwa sistem gel ini dapat mentoleransi volume sampel yang lebih besar (Rubin, 1975).

5. Memuat buffer
Ini adalah buffer yang akan ditambahkan ke fragmen DNA yang akan di-elektroforesis.
Buffer ini mengandung gliserol atau sukrosa untuk meningkatkan kepadatan larutan DNA;
jika tidak, sampel akan larut dalam menjalankan tangki penyangga dan tidak tenggelam ke
dalam kantong gel. Gel loading buffer juga mengandung pewarna yang memudahkan
pengamatan sampel selama pengisian gel dan elektroforesis, seperti bromophenol blue atau
xylene cyanol. Karena molekul-molekul ini kecil, mereka bermigrasi dengan cepat melalui
gel selama elektroforesis, sehingga menunjukkan kemajuan elektroforesis (Chawla, 2004).
Komponen dan konsentrasi 6X loading dye yang biasa digunakan adalah: 0,25%
bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol FF, 30% gliserin; atau 0,25% bromophenol blue, 50
mM EDTA, sukrosa 0,4%.
6. Tegangan / arus diterapkan
Semakin tinggi tegangan / arus, semakin cepat migrasi DNA. Jika voltase terlalu tinggi, band
goresan, terutama untuk DNA≥12-15kb, dapat terjadi. Apalagi tegangan tinggi menyebabkan a
peningkatan suhu dan arus buffer dalam waktu yang sangat singkat. Yang tinggi
Jumlah panas dan arus yang terbentuk dalam proses mengarah pada pencairan gel, DNA
pita tersenyum, penurunan resolusi pita DNA dan ledakan sekering. Karena itu, sangat
direkomendasikan tidak melebihi 5-8 V / cm dan 75 mA untuk gel ukuran standar atau 100 mA untuk
minigels. Di sisi lain, ketika voltase terlalu rendah, mobilitas DNA kecil (≤1kb) adalah
berkurang dan pelebaran pita akan terjadi karena dispersi dan difusi.

7. Memvisualisasikan DNA
Setelah elektroforesis selesai, ada berbagai metode yang dapat digunakan untuk membuat spesies
DNA yang terpisah dalam gel terlihat oleh mata manusia.

7.1 Pewarnaan Ethidium bromide (EBS)

Lokalisasi DNA dalam gel agarosa dapat ditentukan secara langsung dengan pewarnaan
konsentrasi rendah pewarna etidium bromida fluoresen interkalasi di bawah ultraviolet
cahaya. Zat warna dapat dimasukkan dalam keduanya, tangki penyangga yang sedang
berjalan dan gel, gel itu sendiri, atau gel bisa ternoda setelah pemisahan DNA. Untuk catatan
permanen, kebanyakan foto instan diambil dari gel di ruangan gelap. Penting untuk dicatat
bahwa etidium bromida adalah mutagen yang kuat dan cukup toksik setelah paparan akut.
Karena itu, sangat disarankan untuk menanganinya dengan sangat hati-hati

7.2 Pewarnaan perak (SS)

Pewarnaan perak adalah metode yang sangat sensitif untuk visualisasi asam nukleat dan protein
band setelah pemisahan elektroforesis pada gel poliakrilamida. Asam nukleat dan protein
mengikat ion perak, yang dapat direduksi menjadi butiran logam perak yang tidak larut. Perak yang
cukup deposisi terlihat sebagai pita coklat gelap pada gel. Semua protokol pewarnaan perak dibuat
dari langkah-langkah dasar yang sama, yaitu: i) fiksasi untuk menghilangkan senyawa yang
mengganggu, ii) perak impregnasi dengan larutan perak nitrat atau larutan kompleks perak-amonia,
iii) pembilasan dan pengembangan untuk membangun citra logam perak, dan iv) berhenti dan bilas
sampai akhir pengembangan sebelum pembentukan latar belakang yang berlebihan dan untuk
menghilangkan ion perak berlebih (Chevallet et al., 2006).

8. Tujuan penelitian ini

Tujuan dari penelitian yang disajikan dalam bab ini adalah untuk menganalisis pengaruh gel
matriks elektroforesis (agarosa dan poliakrilamida) dan sistem pewarnaan (etidium
bromida dan pewarnaan perak) dalam deteksi amplikon genotipe G rotavirus (produk dari
dsDNA).
9. Bahan dan metode
9.1 Koleksi genotipe amplikon Rotavirus G
Koleksi spesimen 2148 sampel tinja diperoleh dari anak di bawah 3 tahun
usia yang dirawat di rumah sakit umum dan swasta yang berbeda di Kota Córdoba,
Argentina, selama periode 1979-2009. Dari 2148 spesimen tinja, total 590
(27,5%) positif untuk infeksi rotavirus dan semuanya memiliki genotipe G
oleh RT-PCR diikuti oleh heminested-PCR. Secara singkat, diekstraksi RNA dari sampel
tinja secara terbalik ditranskripsi menjadi VP7-gen cDNA panjang penuh dengan primer
generik Beg9 / End9. Kemudian, produk cDNA digunakan sebagai template untuk PCR VP7-
amplifikasi dengan pasangan primer Beg9 / End9 yang sama. Produk PCR panjang penuh
VP7 digunakan sebagai templat dalam kombinasi dengan dua koktail primer dan jenis yang
spesifik generik reverse primer End9 untuk G-genotyping (Gouvea et al., 1990). Koktail
adalah sebagai berikut: G1 (aBT1), G2 (aCT2), dan G3 (aET3) dalam satu campuran, dan G4
(aDT4), G8 (aAT8) dan G9 (aFT9) di yang kedua. Amplikon yang diperoleh dianalisis secara
komparatif oleh metode elektroforesis gel agarosa standar dan pewarnaan etidium bromida
(AGE / EBS) dan elektroforesis gel poliakrilamid dan pewarnaan perak (PAGE / SS).
Amplikon itu yang menunjukkan hasil sumbang diurutkan untuk memverifikasi spesifisitas
band divisualisasikan

Gambar. 1. Algoritma untuk evaluasi perbedaan sensitivitas antara agarosa dan

matriks elektroforesis gel poliakrilamida dalam deteksi asam nukleat. Algoritma dilakukan
untuk evaluasi perbedaan sensitivitas antara agarosa dan matriks elektroforesis gel poliakrilamida
dalam deteksi asam nukleat ditunjukkan pada Gambar 1

9.2 Mempersiapkan, menjalankan dan menodai 2% gel agarosa

Ukuran yang diharapkan dari produk PCR spesifik genotipe adalah 749bp (G1), 652bp (G2),
374bp (G3), 583bp (G4), 885bp (G8), dan 306bp (G9). Karena itu, konsentrasi agarose 2%
digunakan untuk elektroforesis amplikon PCR (Tabel 5). Gel agarose dirawat dengan etidium
bromida untuk visualisasi selanjutnya dari amplikon DNA (konsentrasi akhir 0,5 ug / ml). Ethidium
bromide ditambahkan ke sediaan gel untuk meminimalkan limbah yang mengandung etidium
bromida. Volume yang sama dari 10ul heminested-PCR produk dan buffer Phyndia (0,02M Tris-HCl
pH 7,4, 0,3M NaCl, 0,01M MgCl2, SDS 0,1%, 5mM EDTA, 4% sukrosa, 0,04% bromofenol biru)
dicampur dan dimuat ke dalam gel, bersama dengan tangga DNA 100pb, untuk perbandingan ukuran
amplikon di kemudian hari. Gel agarose adalah di-elektroforasi dalam menjalankan buffer TBE
(0,09M Tris-Borate, 0,002M EDTA) selama 30-60 menit pada 80-100V. Setelah dijalankan, produk
PCR divisualisasikan dalam transilluminator UV.
Bahan Kuantitas / volume

Agarose 2 gr 2 gr

Ethidium bromide (10 mg / ml) 5 ul

Air deionisasi 100 ml

9.3 Mempersiapkan, menjalankan dan menodai 10% gel poliakrilamida

Karena ukuran amplikon yang diharapkan PCR berada dalam kisaran 306-749bp, gel poliakrilamida
6% konsentrasi harus digunakan, karena konsentrasi ini direkomendasikan untuk pemisahan
produk antara 80 dan 800bp. Namun, penanganan gel ini sulit karena mereka terlalu berlendir.
Untuk alasan ini, konsentrasi gel meningkat menjadi 10% dalam pemisahan gel, mencapai
pemisahan yang baik dari semua amplikon PCR dalam gel konsentrasi ini. Sama volume 10ul dari
produk PCR heminested dan buffer Phyndia dicampur dan dimuat ke 10% gel poliakrilamida dengan
ketebalan 1mm. Seiring dengan produk PCR, 100pb
Gel pemisah Gel susun

Bahan volume Bahan volume

Acrylamide 30% 2,5 ml Acrylamide 30% 400 μl

Bisacrylamide 1% 0,95 ml Bisacrylamide 1% 250 μl

Tris-hcl 3M (ph 8,7) ) 0,95 ml Tris-hcl 1M (ph 6,8) 315 μl

SDS 10% 75 μl SDS 10% 25 μl

Air deionisasi 3,2 ml Air deionisasi 1,5 ml

TEMED 5 μl Temed 2.5 μl

Amonium persulfat 10% 100 μl Amonium persulfat 10% 25 μl

Volume akhir 7,78 ml Volume akhir 2,52 ml

11 Tangga DNA juga dimuat dalam gel. Elektroforesis dilakukan dalam sel BioRad di a
sistem buffer non-disosiasi dan terputus-putus (stacking gel buffer Tris-HCl 1M pH 6,8
dan memisahkan buffer gel Tris-HCl 3M pH 8.7). Keduanya, dalam penumpukan dan separasi gel
solusi, 10% SDS ditambahkan untuk meningkatkan daya resolusi elektroforesis (Hari &
Humphries, 1994). Elektroforesis dilakukan dalam menjalankan buffer pH 8,9 (0,3% Tris,
1,44% Glycine, 0,1% SDS) selama 2 jam pada 60mA. Resep yang digunakan untuk terputus-putus
10% persiapan gel poliakrilamid digambarkan pada Tabel 6. Setelah elektroforesis, gel poliakrilamida
diwarnai dengan perak nitrat mengikuti Herring et al. (1982) metode. Itu terdiri dari: i) fiksasi
fragmen DNA dalam etanol 10% dan 0,5% asam asetat glasial, ii) pewarnaan dengan larutan perak
nitrat 0,011M, iii) pengembangan dengan 0,75M NaOH dan 7,6% formaldehid, dan iv) menghentikan
proses dengan glasial 5% asam asetat ketika gambar yang diinginkan telah dikembangkan. Durasi
setiap langkah perak pewarnaan ditunjukkan pada Tabel 7.

Langkah Larutan Waktu

1 Memperbaiki larutan 30 menit
2 Air dideionisasi 2 menit
3 Pewarnaan larutan 30 menit
4 Air terdeionisasi 10 detik
5 Larutan pengembang 10-15 menit (hingga pita
terlihat)
6 Menghentikan Larutan tanpa
batas

Setelah pewarnaan perak, gel poliakrilamida dikeringkan dan diawetkan. Setiap

poliakrilamida gel ditempatkan di antara dua kertas plastik alami (satu menempel pada gelas)
dan direndam dalam larutan pengeringan yang mengandung 69% metanol dan 1% gliserol.
Gel dikeringkan di suhu kamar untuk 24-48 jam (Giordano et al., 2008).

10. Hasil
10.1 Deteksi genotipe Rotavirus G oleh AGE / EBS dan PAGE / SS
Di bawah kondisi eksperimental yang dijelaskan, analisis oleh AGE / EBS dari rotavirus 590 sampel
positif menunjukkan bahwa total 32 (5,4%) sampel tidak menampilkan tipe PCR G. produk
amplifikasi setelah elektroforesis gel. Dari 558 sampel yang mengungkapkan PCR amplikon, 324
(58,1%) adalah infeksi genotipe G tunggal dan 234 (41,9%) genotipe G campuran infeksi (dua atau
lebih amplikon terungkap dalam sampel yang sama). Di samping itu, Analisis PAGE / SS dari amplikon
PCR mengungkapkan bahwa semua sampel positif rotavirus (n = 590) menunjukkan setidaknya satu
amplikon. Dari 590 sampel, 318 (53,9%) adalah G tunggal

Sistem Jumlah jenis infeksi rotavirus

pengembangan
Single Double Triple
AGE / EBS 324 234 0

Halaman / SS 318 240 32

infeksi genotipe dan 272 (46,1%) adalah infeksi tipe G campuran (240 ganda dan 32 tiga)
infeksi). Harus ditunjukkan bahwa, total infeksi genotipe G triple terdeteksi oleh PAGE / SS
dikembangkan sebagai infeksi genotipe G ganda atau tunggal oleh AGE / EBS. Hasilnya
digambarkan dalam Tabel 8. Jumlah sampel yang menggambarkan setiap genotipe G
ditunjukkan pada Tabel 9 dan Gambar 2. The hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa
sistem AGE / EBS standar mengungkapkan jumlah yang lebih rendah

Genotipe Jumlah genotipe yang terdeteksi oleh

Usia/EBS Halaman/SS
G1 461 504

G2 46 88
G3 12 19
G4 253 255
G5 2 2
G8 2 3
G9 16 23
Total 792 894

11. Diskusi
Pada perbandingan berdampingan yang disajikan dalam penelitian ini, metode deteksi
amplikon mengungkapkan secara umum bahwa jumlah genotipe yang lebih tinggi (11,4%)
dapat dideteksi oleh HALAMAN / SS (n = 894) dibandingkan dengan AGE / EBS (n = 792).
Dalam banyak kasus, produk PCR divisualisasikan sebagai pita pingsan oleh PAGE / SS dan
kemudian dikonfirmasi sebagai spesifik dengan urutan nukleotida, adalah
terjawab oleh teknik standar (AGE / EBS). Biasanya genotipe G1 dan G4 yang umum
terungkap sebagai pita yang kuat, sedangkan genotipe lainnya sering kali dinyatakan lemah
band. Oleh karena itu, kecenderungan AGE / EBS untuk mendeteksi tingkat genotipe G yang
lebih rendah adalah genap lebih jelas untuk genotipe yang lebih jarang, yaitu G2, G3, G8 dan G9.
Selain itu, 32 (5,4%) sampel positif rotavirus tidak mengungkapkan amplicon tipe PCR G setelah AGE
/ EBS, sementara itu semuanya ditugaskan ke genotipe G setelah PAGE / SS. Selain itu, penurunan
deteksi genotipe rotavirus oleh AGE / EBS sehubungan dengan PAGE / SS juga berdampak pada
tingkat infeksi rotavirus campuran. Atas dasar pengamatan ini, itu mungkin disarankan bahwa
tingkat infeksi genotipe G campuran yang dilaporkan di seluruh dunia, mungkin lebih tinggi jika
sistem pengembangan standar, AGE / EBS, akan digantikan oleh PAGE / SS teknik.
Kehadiran berulang beberapa genotipe G dalam spesimen individu dapat menawarkan yang unik
lingkungan untuk reassortment gen rotavirus. Gagasan ini menyoroti perlunya meningkatkan
metode yang memungkinkan mengungkap koinfeksi rotavirus dalam penelitian selanjutnya.
Penemuan-penemuan ini akan menarik untuk meningkatkan pengetahuan saat ini tentang evolusi
rotavirus dan menentukan potensi dampak infeksi campuran pada cakupan rotavirus-vaksin dan
efisiensi vaksin Secara keseluruhan, hasil yang diperoleh dalam penelitian ini menyoroti bahwa
metodologi yang digunakan untuk PCR visualisasi produk dapat menjadi elemen penting
untuk deskripsi yang beredargenotipe rotavirus dalam suatu komunitas dan tingkat infeksi
genotipe G campuran. Mengingat pengenalan vaksin rotavirus baru-baru ini di banyak
negara, benar identifikasi genotipe G yang terlibat dalam penyakit diare dan kecocokan
genotipe G terisolasi dengan yang tergabung dalam formulasi vaksin sangat penting untuk
evaluasi yang akurat dari kemanjuran vaksin rotavirus.

12. Pengakuan
Karya ini mendapat dukungan keuangan dari Dewan Sains dan Teknologi
Universitas Nasional Cordoba, Argentina (Grant 2009-2010).