VALIDASI METODE

ANALISIS MIKROBIOLOGI
Slamet Ibrahim, Marlia Singgih
Sekolah Farmasi-ITB
 PENDAHULUAN
Prinsip Praktek Pengujian yang Baik
(Good Analytical Practices) :
a. Pengujian dilakukan untuk memenuhi
suatu tujuan tertentu atau kebutuhan
pengguna
b. Pengujian dilakukan dengan
menggunakan metode, prosedur dan
peralatan yang telah teruji untuk
menjamin kesesuaian dan tujuan
pengujian
c. Pengujian dilakukan oleh personel yang
memiliki kualifikasi dan kompeten
d. Hasil pengujian harus ajeg atau
konsisten, tidak dipengaruhi oleh faktor
lokasi, personel dan peralatan
e. Laboratorium penguji harus mempunyai
prosedur jaminan dan pengendalian mutu
yang memadai
f. Laboratorium penguji harus diuji dan
dievaluasi oleh badan yang kompeten dan
tidak memihak (akreditasi)
 Validasi Metode Analisis

• Definisi :
Validasi Metode Analisis adalah proses
pembuktian atau konfirmasi pengujian
yang obyektif di Laboratorium, dan bahwa
metode itu memenuhi persyaratan yang
telah ditentukan, yang sesuai dengan
tujuan penggunaannya.
 Validasi Metode Analisis (lanjutan)
Tujuan :
• Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan,
selektivitas, akurasi, presisi, dll., sekaligus
menguji kelemahan dan keterbatasan
metode
• Menguji faktor-faktor yang dapat
mempengaruhi kinerja metode dan
mengetahui besarnya pengaruh itu
terhadap hasil analisis
• Melakukan verifikasi atau membuktikan
kinerja metode analisis baku yang
diadopsi/digunakan laboratorium
 Validasi Metode Analisis (lanjutan)
Syarat :
• Menggunakan instrumen dan peralatan
yang terkalibrasi
• Dilaksanakan oleh pesonel yang
kompeten
 Jenis Validasi Metode

• Validasi primer dilakukan jika

laboratorium menggunakan metode
analisis “baru” hasil pengembangan , atau
metode yang di modifikasi terhadap suatu
metode standard.
• Validasi sekunder dilakukan untuk
verifikasi, jika laboratorium menggunakan
atau mengadopsi metode standard yang
telah divalidasi.
 Parameter Validasi metode
analisis mikrobiologi
• Akurasi – Kecermatan
• Presisi (repeatability, reproducibility dan
intermediate precision) – Keseksamaan
• Sensitivitas – Kepekaan
• Selektivitas dan Spesifisitas
• Linearitas
• Rentang Hitung yang diterima
(acceptable) (batas atas dan batas
bawah dari rentang perhitungan)
• Robustness (Ketangguhan) metode
 Pedoman Validasi
• The United States Pharmacopeia (USP)
27, 2004 or new edition
• International Conference on
Harmonization, 1996
• Method Validation of Microbiological
Methods, guidance note : C & B and ENV
002, Singapore Accreditation Council,
July 2002.
• Feldsine, et.al., AOAC International
method Committee Guidelines for
Validation of Qualitative and Quantitative
Food Microbiological Official Method of
Analysis, Journal of AOAC International
Vol 85 No 5 2002
• Water quality – Guidance on Validation of
Microbiological Methods, Technical Report,
ISO/TR 13843 : 2000.
• Procedure for The Estimation and
Expression of Measurement Uncertainty in
Chemical Analysis, Nordic Committee on
Food Analysis, NMKL, No.5, 1997.
• APHA Standard methods for the
Examination of Water and Wastewater,
20th ed., 1998.
 Metode analisis mikrobiologi
1. Metode analisis KUALITATIF
2. Metode analisis KUANTITATIF
 Metode kualitatif
• Metode analisis yang responsnya berupa
presence atau absence (ada atau tidak
ada) yang dideteksi baik secara langsung
maupun tidak langsung terhadap sejumlah
sampel
 Metode kuantitatif
• Metode analisis yang responsnya berupa
jumlah dari analit , baik yang diukur secara
langsung (misalnya : enumerasi mikroba)
maupun secara tidak langsung (misalnya :
Nilai Absorbans, intensitas warna,
impedansi, dll) terhadap sejumlah sampel.
 Metode Analisis Mikrobiologi
• Kualitatif :
9 Uji langsung terhadap mikroba indikator
9 Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopik
9 Metode alternatif (Dye-reduction Test, Electrical Methods, ATP
Determination)
9 Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode
imunokimia, metode biologi molekuler)
• Kuantitatif :
9 Angka Lempeng Total (Total Plate Count)
9 MPN (Most Probable Number)
9 Uji potensi antibiotik
9 Uji sterilitas
9 Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik)
9 Uji efektivitas pengawet
Identifikasi Mikroorganisme

Escherichia coli Salmonella thypi

Identifikasi mikroba
 Tahap Persiapan Validasi
Sebelum validasi dilakukan, hendaknya
laboratorium menyediakan atau menyiapkan
beberapa hal :
1. Mikroorganisme target atau acuan (lihat SR-02
:
persyaratan tambahan untuk akreditasi
laboratorium, Pengujian Kimia dan Biologi
SNI 17025, DP.01.16, Januari 2004)
2. Peralatan dan Instrumen ukur yang telah
dikalibrasi
3. Personel yang kompeten
4. Program Statistika untuk menghitung,
mengevaluasi dan menginterpretasikan hasil
pengujian
Parameter Validasi
 Akurasi (Kecermatan)
Definisi :
• Akurasi adalah kemampuan metode untuk
mengukur dan mendeteksi nilai aktual
atau nilai sebenarnya dari mikroorganisme
target dalam sampel
• Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau
kedekatan hasil pengujian dengan hasil
yang sebenarnya
 Akurasi (Kecermatan) (lanjutan)
Perhitungan :
• Rekoveri (Recovery) = Persen perolehan kembali
% Rek = H/A x 100

• Galat Relatif : (H – A)/A x 100

dimana H = hasil pengujian dengan metode
A = hasil sebenarnya dari
mikroorganisme
target
• Rekoveri Relatif : H/B x 100
dimana H = hasil pengujian metode
B = hasil pengujian metode standard
 Akurasi (Kecermatan) (lanjutan)
Cara pengujian :
• Spiked-placebo Recovery Method
• Standard Addition Method

Menggunakan 9 kali pengukuran ( 3 level

konsentrasi dengan 3 replikasi)
Contoh Perhitungan Akurasi dan
Rekoveri Metode
Jumlah angka lempeng total
Galur Teoritis Metode uji Metode
Baku
I 125 126 127
II 125 120 119
III 125 120 118
IV 125 125 128
V 125 132 131
Rata-rata 125 125 125
 Perhitungan
% Rekoveri = Hsl.metode uji/hsl teoritis x 100%

= 125/125 x 100% = 100%

% Rekoveri relatif = Metode uji/metode baku x

100%

= 125/125 x 100% = 100%

 Presisi (Keseksamaan)
Definisi
• Presisi adalah tingkat kesesuaian antara
hasil pengujian individual dengan hasil
rata-rata pengujian berulang pada sampel
yang homogen dengan kondisi pengujian
yang sama
• Presisi : keterulangan (repeatability),
ketertiruan (reproducibility), keseksamaan
antara (intermediate precision)
 Presisi (Keseksamaan) (lanjutan)
Cara Perhitungan
• Simpangan baku relatif (SBR = Relative
Standard Deviation=RSD) untuk
intermediate precision :

∑ [(log ai – log bi )/xi] 2

2p
ai dan bi : hasil pengujian i (1,2,3,…n)
xi = rata-rata = 1/n (log ai
+ log bi)
P = jumlah sampel yang
diuji
Contoh Perhitungan Intermediate Precision
pada ALT (angka lempeng total)
No. ALT (cfu/mL) logaritma (II/I)2
a b a b rata2 (I) selisih(II)

1 93 86 1,9685 1,9345 1,9515 0,0340

0,000303
2 34 30 1,5315 1,4771 1,5043 0,0544 0,001306
3 98 73 1,9912 1,8633 1,9273 0,1279 0,004404
4 89 83 1,9494 1,9191 1,9342 0,0303 0,000246
5 116 104 2,0645 2,0170 2,0407 0,0475 0,000540
6 168 156 2,2253 2,1931 2,2092 0,0322 0,000212
7 62 56 1,7924 1,7482 1,7703 0,0442
0,000623
8 38 28 1,5798 1,4472 1,5135 0,1326 0,007679
9 330 300 2,5185 2,4771 2,4978 0,0414 0,000275
10 2300 2040 3,3617 3,3096 3,3357 0,00521 0,000244
∑ = 0,015832

SBR = √ 0,015832/2 x 10 = 0,0281

KV = 100 x SBR = 2,81 %

 Sensitifitas dan Spesifisitas
Definisi
• Sensitifitas (Kepekaan) : Kemampuan
metode untuk mendeteksi/mengukur
mikroorganisme target dalam jumlah
sekecil mungkin
• Spesifisitas (Kemenjenisan): Kemampuan
metode untuk mendeteksi/mengukur
mikroorganisme tertentu secara cermat
dan seksama dengan adanya
mikroorganisme asing atau bahan/matriks
lain
 Sensitifitas dan Spesifisitas
(lanjutan)
Cara perhitungan
• Sensitifitas : Fraksi koloni/kultur yang
positif pada uji konfirmasi terhadap
pengujian presumtif
• Spesifisitas : Fraksi koloni/kultur yang
negatif pada uji konfirmasi terhadap
pengujian presumtif
• Selektifitas : Logaritma fraksi koloni/kultur
yang positif pada uji konfirmasi terhadap
jumlah pengujian
 Sensitifitas dan Spesifisitas (lanjutan)
Uji Presumtif Jumlah
positif (+) negatif (-)
Uji Konfirmatif
Positif (+) a b a+b
Negatif (-) c d c+d
Jumlah uji a+c b +d
a+b+c+d =n

Sensitifitas = a/(a+b)
Spesifisitas = d/(c+d)
Rasio positif palsu = c/(a+c)
Rasio negatif palsu = b/(b+d)
Efisiensi = (a+d)/n
Selektifitas absolut = RS = log (a/n)
Selektifitas apparent = F = log [(a+c)/n]
 Contoh
Uji Presumtif
Jumlah
positif (+) negatif (-)
Uji Konfirmatif
Positif (+) 250(a) 8(b) 258
Negatif (-) 20(c) 120(d) 140
Jumlah uji 270 128
398

Sensitifitas = a/(a+b) = 250/258 = 0,97

Spesifisitas = d/(c+d) = 120/140 = 0,86
Rasio positif palsu = c/(a+c) = 20/270 = 0,07
Rasio negatif palsu = b/(b+d) = 8/128 = 0,06
Efisiensi = (a+d)/n = 370/398 = 0,93
Selektifitas apparent = F = log [(a+c)/n] = log 270/398 =
0,1685
 Rentang Hasil Pengujian
• Rentang menunjukkan nilai terendah dan
tertinggi hasil pengujian yang dapat
ditentukan dengan cermat dan seksama

• Batas terendah (Lower limit)

Hasil analisis / pengujian terendah yang
ditandai dengan galat analisis 20,0% dari
rata-rata (pengukuran minimal 3 kali)
 Contoh
ALT (cfu/lempeng) Galat baku Galat
relatif(%)
10 3,16 31,6
15 3,87 25,8
20 4,47 22,8
25 5,00 20,0
27 5,20
19,2
29 5,39
18,6
30 5,48
18,3
• Batas tertinggi (Upper limit)
Hasil analisis /pengujian koloni tertinggi yang
masih dapat dihitung dengan cermat dan
seksama ditandai dengan galat analisis 15,0%
dari rata-rata (pengukuran minimal 3 kali)
│2.LC – HC-1 │ ≥ 1,96
[ 2.LC – HC ]1/2
• Rentang hasil pengujian (lempeng agar)
– Sampel makanan dan obat-obatan : 25-250
cfu/lempeng
– Sampel air : 30-300 cfu/lempeng
– Kapang (Aspergillus niger) : 8-80 koloni/lempeng
 Linearity (Kelinieran)
(untuk penetapan potensi antibiotika)
Definisi
• Keliniearan adalah kemampuan metode analisis
yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang
berada dalam rentang konsentrasi memiliki
respon analit yang proporsional dengan
konsentrasi, secara langsung ataupun melalui
transformasi matematika
Cara pengujian
• Kurva baku disiapkan dan dianalisis 3 kali
dengan konsentrasi antara 50 – 150% kadar
aktual (FDA), untuk penentuan kadar dalam
sampel, tiga larutan baku digunakan : 80, 100
dan 120% konsentrasi target
 Linearity (Kelinieran) (lanjutan)
Parameter
• Kurva baku, dengan persamaan garis
(regresi linear, logaritma atau polinomial)
• Kepekaan analisis , F = ∆ y/ ∆ x untuk
setiap konsentrasi pada kurva baku
• Simpangan baku residual garis regresi
Sy/x = [∑(y-ŷ)2/n-2]1/2
dimana y = respon analit
ŷ = dihitung dari persamaan garis
regresi
 Linearity (Kelinieran) (lanjutan)
• Koefisien variasi fungsi regresi
Vx0 = S y/x . 100% , (Vx0 ≤ 2%)
b.x
• Koefisien korelasi ( r ≥ 0,999)
 Linearity (Kelinieran) (lanjutan)
a. Menggunakan persamaan garis
Perhitungan Kadar D = b log C + a
log Cs = Ds – a/ b
Diameter x dimana :
Hambat
x Cs = kons. analit dlm sampel
x
Ds = Diameter hambat
x
b. Menggunakan satu larutan baku dan
x
larutan blangko
log Cs = (Ds – a)/(Db – a) . log Cb
dimana :
Log Ci Cb = kons. analit dlm lar.baku
Syarat sampel untuk uji validasi
• Untuk metode analisis kualitatif, sampel yang
digunakan terdiri dari 3 macam sampel : sampel
yang tidak dikontaminasi, sampel yang sengaja
dikontaminasi pada jumlah yang mendekati
batas limit deteksi (Low Contamination Level),
sampel yang sengaja dikontaminasi pada jumlah
yang tinggi (High Contamination Level)
• Low contamination level : 1-5 cfu/25 g sampel
sedangkan high contamination level : 10-50
cfu/25 g sampel
• Untuk metode analisis kuantitatif, maka
sampel dibagi 4, yaitu : 1 sampel tanpa
diinokulasi, dan 3 sampel masing-masing
dengan low , medium dan high
contamination level.
• Low : pada batas limit deteksi
Medium : kira-kira dengan jumlah 1 log
lebih tinggi
High : kira-kira dengan jumlah 2 log lebih
tinggi
 Validasi Kit Pereaksi
Pertimbangan dalam memilih kit pereaksi
tidak semata mata dari aspek ekonomi,
tetapi termasuk :
• Kemudahan penanganan sampel dan
pereaksi yang digunakan,
• Cara penyimpanan dan stabilitas pereaksi
• Tingkat toksisitas pereaksi
• Kualitas hasil reaksi yang diberikan oleh
kit tersebut.
Tahapan dalam proses evaluasi kit
• Tahap I : Seleksi awal , yaitu mencakup
evaluasi terhadap kurva standard , ada tidaknya
reduksi data, evaluasi terhadap sensitivitas
pereaksi,
• Tahap II : Pemahaman prosedur penggunaan
kit , yaitu untuk mengevaluasi kemungkinan efek
matriks, perolehan kembali, reaksi silang , ada
tidaknya interferensi, kemudahan penanganan
sampel dan pereaksi
• Tahap III : Pengembangan data validasi, yaitu
evaluasi terhadap rentang normal hasil reaksi,
uji pada kondisi abnormal, adanya stimulasi atau
supresi, dan uji terhadap rentang kontrol
kualitas.
Robustness (Ketangguhan) metode
• Pengujian Ketangguhan sebenarnya harus
dilakukan pada saat fase pengembangan
metode dan tergantung pada faktor-faktor
yang berpengaruh pada pengujian
• Jika pengujian sangat peka terhadap
perubahan dalam kondisi analisis,maka
kondisi pengujian hendaknya dikendalikan
atau dilakukan dengan penuh kehati-
hatian
Robustness (Ketangguhan) metode
(lanjutan)

• Jenis keragaman kondisi pengujian yang

harus diperhatikan :
– Stabilitas sampel
– Pengaruh suhu inkubasi
– Pengaruh waktu inkubasi
– Kondisi aerobik atau anaerobik (untuk
pengujian mikroba tertentu)
– Pengaruh jenis media (nutrisi), dll
Robustness (Ketangguhan) metode
(lanjutan)

• Hasil pengujian dievaluasi secara

Statistika menggunakan ANOVA atau
Algoritma dari Yate