Nama : Dwi Sri Yani Purwanti

NIM : P07134014038
Tanggal : 14 September 2016
Tempat : Lab. Imunoserologi

TPHA (TREPONEMA PALLIDUM HEMAGGLUTINATION ASSAY)

TEST

I. Tujuan
a. Tujuan Umum
1. Mahasiswa dapat mengetahui cara TPHA (Treponema Pallidum
Hemagglutination Assay) Test pada serum atau plasma probandus.
2. Mahasiswa dapat menjelaskan cara TPHA (Treponema Pallidum
Hemagglutination Assay) Test pada serum atau plasma probandus.
b. Tujuan Khusus
1. Mahasiswa dapat melakukan cara TPHA (Treponema Pallidum
Hemagglutination Assay) Test pada serum atau plasma probandus.
2. Untuk screening test secara kualitatif dan semikuantitatif untuk
membantu menegakkan diagnose sifilis (Treponematosis)
3. Mahasiswa dapat menginterpretasikan hasil TPHA (Treponema
Pallidum Hemagglutination Assay) Test pada serum atau plasma
probandus.

II. Metode
Indirect Hemagglutination

III. Prinsip
Berdasarkan reaksi hemaglutinasi secara imunologis antara eritrosit
unggas yang dilapisi oleh antigen Treponema pallidum pada reagen
denganantibodi spesifik dalam serum/plasma probandus.
IV. Dasar Teori
Sifilis disebabkan oleh bakteri spirochete Treponema pallidum dan
menyebar terutama melalui kontak seksual. Sifilis memiliki tahap
diprediksi, diagnostik dan pengobatan. Pasien yang diduga menderita sifilis
biasanya melakukan tes skrinning dengan tes nontreponemal, termasuk
Veneral Deases Research Laboratory (VDRL) dan tes Rapid Plasma Reagin
(RPR). Tes ini menjadi positif dalam waktu tiga minggu dari pengembangan
tahapan primer, sehingga pasien mungkin memiliki nontreponemal negatif
tes awal infeksi. (Peter L. Mattei.2012)
Bakteri Treponema pallidum tidak mudah dibudidaya dan tidak dapat
tumbuh pada media buatan. Bahkan, T. pallidum sulit untuk dikultur pada
media buatan atau dalam telur subur atau kultur jaringan. Dari berbagai
hewan, kelinci dapat terinfeksi di kulit, testis dan mata, meskipun tidak ada
penyakit progresif yang dihasilkan. (Neerja Jindal.2012).

Uji treponemal merupakan uji yang spesifik terhadap sifilis, karena uji
ini mendeteksi langsung antibodi terhadap antigen Treponema pallidum
(Islay Rodríguez. 2015). Treponema pallidum Hemagglutination Assay
(TPHA) merupakan Gold Standart pemeriksaan serologi untuk sifilis (
Naidu Narinder Kaur, 2012) tetapi dokter harus selalu mempertimbangkan
semua faktor-faktor lain seperti perilaku seksual, riwayat kesehatan, riwayat
pengobatan sebelumnya sifilis (Islay Rodríguez. 2015). Uji TPHA
(treponemal) ini biasanya digunakan sebagai uji lanjutan atau konfirmasi
dari uji non-treponemal untuk menilai respon dari bakteri treponemal
tersebut (Zhu, Lin, et al, 2014).

V. Alat Dan Bahan

a. Alat :
 Mikropipet 10 µl dan 200 µl
 Yellow tip
 Mikroplate V
  Tabung merah tanpa antikoagulan
 Sentrifuge
b. Bahan:
 Test cell
 Control cell
 Control postif
 Control negatif
 Dilluent
 Tissue

c. Sampel:
- Serum atau plasma
(Bila tidak segera diperiksa maka serum dapat disimpan pada suhu 2-80C
sampai 7 hari atau suhu -200C sampai 4 minggu. Sampel tidak dapat
digunakan jika Hemolisis dan kontaminasi bakteri).

VI. Cara Kerja

a. Kualitatif:
 Siapkan alat, bahan dan reagen yang digunakan pada meja praktikum
(semua komponen pemeriksaan disuhu kamarkan terlebih dahulu ±
30 menit).
 Sebelum itu, darah disentrifuge terlebih dahulu untuk mendapat
serumya.
1. Diambil 190 µl diluent pada tempat well.
2. Tambahkan 10 µl sampel ke dalam tempat well tersebut.
3. Homogenkan.
 Test:
1. Pipet 25 µl campuran diluent spesiment yang dibuat ke test well
dan control well.
2. Pipet 25 µl control positif dan control negative ke control positif
well dan control negative well.
 3. Tambahkan 75 µl test cell ke test well, control positif dan control
negative dan 75 µl control test ke control well.
4. Inkubasi 15-300C selama 45-30 menit.
5. Baca aglutinasi yang terbentuk.
b. Semi Kuantitatif:
 Siapkan alat, bahan dan reagen yang digunakan pada meja praktikum
(semua komponen pemeriksaan disuhu kamarkan terlebih dahulu ±
30 menit).
 Sebelum itu, darah disentrifuge terlebih dahulu untuk mendapat
serumya.
 Spesimen diluent:
1. Diambil 190 µl diluent pada tempat well.
2. Tambahkan 10 µl sampel kedalam tempat well tersebut.
3. Homogenkan.

 Titrasi:
1. Siapkan 8 sumur.
2. Untuk sumur 1 dikosongkan, sedangkan sumur 2-8 ditambahkan
25 µl diluent.
3. Untuk sumur 1 ditambahkan 25 µl campuran diluent spesiment.
4. Pipet 25 µl campuran diluent spesiment ke sumur 2 lalu
dihomogenkan.
5. Ambil 25 µl campuran dari sumur 2 ke sumur 3 dan seterusnya.
Pada sumur 8 dibuang 25 µl campuran tersebut.
 Test:
1. Ditambahkan 75 µl test cell ke sumur 1-8.
2. Inkubasi 15-300C selama 45-30 menit.
3. Baca aglutinasi yang terbentuk.
4. Tentukan titernya.
VII. Interpretasi Hasil
a. Secara Kualitatif:
 Tes negative : Tidak terjadi hemaglutinasi pada permukaan sel,
hanya
terdapat titik berwarna merah ditengah sel (<1/80).
 Tes positif : Terjadi terjadi hemaglutinasi pada permukaan sel
(>1/80).
b. Secara Semi Kuantitatif:
Jumlah titer equivalen dengan pengenceran. Titer ditentukan
berdasarkan tingkat pengenceran tertinggi yang masih menunjukkan
adanya positif (+) aglutinasi.

Sumur ke- Pengenceran Serum

1 1 : 80

2 1 : 160

3 1 : 320

4 1 : 640

5 1 : 1280

6 1 : 2560

7 1 : 5120

8 1 : 10.240
VIII. Hasil Pengamatan
Data Probandus :
Nama (Kode) :J
Jenis Kelamin :X
Sampel : Serum
 Secara Kualitatif Test
Hasil : Negatif (-) = tidak terbentuk hemaglutinasi pada
permukaan sel, hanya terdapat titik berwarna
merah ditengah sel.

Control negative + Test Cell = hasil negatif

Control Positif + Test Cell = hasil positif

Sampel + Conctrol Cell = hasil negatif

Sampel + Test Cell = hasil negatif

 Secara Kuantitatif test

Hasil : Tidak dilakukan uji kuantitatif karena pada uji
kualitatif menunjukan hasil negatif (-).

IX. Pembahasan

Sifilis adalah suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri Treponema

pallidum dari golongan spirochete anaerob. Penyakit ini dapat ditularkan
melalui hubungan seksual dan tidak dapat bertahan hidup di luar inangnya
(Manju Bala. 2012). Infeksi sifilis berlangsung melalui beberapa tahapan
yaitu primer, sekunder, tersier dan kuartener. Dimana pada tahap awal akan
menimbulkan luka yang disebut dengan chancres kemudian berkembang
disertai dengan ruam sifilis pada periode panjang dormansi. (Insertkit.2014)

Tes Serologi tetap menjadi andalan dari pengujian laboratorium untuk

sifilis, kecuali pada tahap sangat awal infeksi ketika deteksi langsung dari
treponema dalam materi dari lesi dengan tanah gelap atau mikroskop
fluorescent diperlukan. Organisasi Kesehatan Dunia (WHO)
merekomendasikan penggunaan kombinasi tes non-treponemal dan tes
treponemal untuk tes skrining dan penegakan diagnostik (Manju Bala.
2012).

Tes serologis yang paling umum digunakan untuk menegakkan sifilis

adalah tes non-treponemal dan treponemal. Tes non-treponemal seperti RPR
atau VDRL digunakan untuk mengukur respon host terhadap antigen non-
treponemal seperti cardiolipin dan lesitin dilepaskan dari sel inang rusak,
serta bahan lipoprotein seperti dirilis dari Treponema. Sedangkan tes non-
treponemal umumnya dianggap sensitif pada sifilis awal, tapi kelemahannya
dapat memberikan hasil reaksi positif palsu, reaksi negatif palsu karena
fenomena prozone, dan kurangnya sensitivitas di tahap akhir dari infeksi.
(Narinder Kaur Naidu, dkk. 2012).

Treponema pallidum Hemagglutination Assay (TPHA) merupakan

Gold Standart pemeriksaan serologi untuk sifilis ( Naidu Narinder Kaur,
2012) namun dokter tetap harus selalu mempertimbangkan faktor-faktor lain
seperti perilaku seksual, riwayat kesehatan, riwayat pengobatan sebelumnya
sifilis, dll (Islay Rodríguez. 2015). Uji TPHA (treponemal) ini biasanya
digunakan sebagai uji lanjutan atau konfirmasi dari uji non-treponemal
untuk menilai respon dari bakteri treponemal (Zhu, Lin, et al, 2014).
Meskipun TPHA bukan tes yang memiliki sensitifitas dan spesifisitas 100%,
namun kemudahan dalam melakukan tes ini di laboratorium membuatnya
menjadi pilihan yang lebih baik daripada tes treponemal yang lainnya
(Mangala Adisesh. 2015).

Pada praktikum Imunoserologi yaitu tentang TPHA (Treponema

Pallidum Hemagglutination Assay) Test, dilakukan sesuai dengan prosedur
yang tertera pada kit-insert reagen TPHA. Uji TPHA yang dilakukan,
didasarkan pada reaksi hemaglutinasi yang terjadi antara antibodi yang
terdapat dalam serum atau plasma dengan eritrosit unggas yang telah
dilapisi oleh antigen Treponema pallidum. Hema aglutinasi merupakan
penggumpalan sel eritrosit yang tekah dilekati antigen dengan antibodi
dalam serum . Pada praktikum ini tempat/wadah yang digunakan untuk
mereaksikan reagen dan sampel adalah mikroplate yang transparan, hal ini
dikarenakan agar praktikan dapat lebih mudah untuk mengamati reaksi
hemaglutinasi yang terjadi dari reaksi yang dilakukan. Sampel yang
diperbolehkan yaitu serum atau plasma, pada praktikum ini menggunakan
sampel dalam bentuk serum. Sebelum melakukan praktikum, praktikan
harus menggunakan APD yang lengkap dan benar, serta alat dan bahan yang
akan digunakan disiapkan terlebih dahulu khususnya reagen yang akan
digunakan disuhu ruangkan terlebih dahulu agar hasil dari pemeriksaan
yang dilakukan lebih akurat.

Uji kualitatif pada tes TPHA merupakan pemeriksaan konfirmasi dari

tes VDRL yang menunjukan hasil positif. Pada pemeriksaan TPHA secara
kualitatif yang dilakukan sesuai dengan yang tertera pada petunjuk (insert
kit), yaitu menggunakan 5 sumur mikroplate. Masing-masing sumur tersebut
memiliki fungsi yang berbeda-beda, sebagai berikut:

1) Pada sumur 1 digunakan untuk pencampuran specimen diluent.

2) Pada sumur 2 digunakan untuk control cell

3) Pada sumur 3 digunakan untuk test cel

 4) Pada sumur 4 dan 5 digunakan untuk pegujian control positif dan
negatif

Pemeriksaan TPHA secara kualitatif dilakukan dengan cara membuat

specimen diluent pada sumur 1 terlebih dahulu dengan mencampurkan 190
µL diluent dan 10 µL sampel lalu dihomogenkan. Selanjutnya dipipet
campuran tersebut masing – maisng sebanyak 25 µL dan dimasukkan
kedalam sumur 2 dan 3. Pada sumur 2 ditambahkan 75 µL Control Cell dan
pada sumur 3 ditambahkan 75 µL Test Cell lalu dihomogenkan. Diinkubasi
pada suhu ruang (15 – 30o C) selama 45 – 60 menit. Control positif dan
negative selalu disertakan pada setiap pengujian. Kemudian diamati
hemaglutinasi yang terjadi. Apabila terjadi hemaglutinasi berarti hasil tes
tersebut positif dan dilanjutkan ke uji semikuantitatif. Sedangkan apabila
tidak terjadi hemaglutinasi dengan sel mengelompok membentuk titik
merah pada tengah mikroplate berarti hasil tes tersebut negative.

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pemeriksaan TPHA

sebagai berikut :

1. Menggunakan yellow tip secara disposable pada

pencampuran atau pemipetan sampel yang berbeda
agar tidak terjadi kontaminasi.

2. Penolakan sampel apabila sampel hemolisis dan

terkontaminasi bakteri.

3. Pemipetan atau penetesan sampel dilakukan secara

tegak lurus dan terhindar dari gelembung.

4. Diperhatikan waktu inkubasi yang ditentukan yaitu

selama 45-60 menit.

5. Penggunaan reagen yang masih baik dan belum

masuk masa kadaluarsa.
 Penggunaan tes treponemal untuk skrining tes memberikan sebagian
kecil hasil positif palsu, tes ini memberikan hasil positif palsu pada infeksi
spirochetal lainnya, seperti infeksi borrelial dan infeksi dari mikroorganisme
komensal . Reaksi positif palsu juga terjadi pada nontreponemal test yaitu
reaksi positif palsu akut dapat terjadi pada penyakit demam, imunisasi, dan
kehamilan. Sedangkan reaksi positif palsu kronis berhubungan dengan
infeksi virus hepatitis C, penyakit jaringan ikat, penggunaan obat intravena,
malaria, penyakit Chagas, tuberkulosis, dan kusta (Muhammad G Morshed .
2015).

Dari praktikum pemeriksaan TPHA yang dilakukan pada sampel

dengan kode J didapatkan hasil negatif (tidak terdapat antibodi spesifik
Treponema palidum) yang ditunjukkan dengan tidak terjadinya
hemaglutinasi (sel mengelompok menjadi satu membentuk titik merah) di
tengah mikroplate.

X. Kesimpulan
Dari hasil prakikum pemeriksaan VDRL yang dilakukan pada sampel
pasien dengan kode J didapatkan hasil negatif (-) karena tidak terjadi reaksi
hemaglutinasi yang menandakan tidak terdapatnya antibodi Treponema
pallidum dalam serum pasien.

XI. Daftar Pustaka

Adisesh, Mangala. 2015. Significance Of Tpha Test. [online]. Tersedia :

http://jermm.com/latest-articles.php?at_id=6 [Diakses 16 September
2016].

Gagandeep Kaur and Paramjit Kaur. 2015. Syphilis testing in blood donors: an
update. [Online]. Tersedia: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC4385067/. [Diakses: 16 September 2016].
Insertkit. 2014. TPHA Test Kit. United Kingdom.

Islay Rodríguez., dkk. 2015. Considerations on the use and interpretation of

Treponema pallidum hemagglutination test for diagnosis of syphilis.
[online]. Tersedia : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC4660574/ [Diakses 16 September 2016].

Lin, Zhu, dkk. 2014. Comparison of the Cerebrospinal Fluid (CSF) Toluidine Red
Unheated Serum Test and the CSF Rapid Plasma Reagin Test with the
CSF Venereal Disease Research Laboratory Test for Diagnosis of
Neurosyphilis among HIV-Negative Syphilis Patients in China.
[online]. Tersedia: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC3957747/ [Diakses 12 April 2016].

Lorenzo Giacani,dkk. 2014.The Endemic Treponematoses. [online] Tersedia :

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3910905/ [diakses pada
17 September 2016].

Morshed, Muhammad G, dkk. 2015. Recent Trends in the Serologic Diagnosis of

Syphilis. [online]. tersedia: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC4308867/. [diakses: 16 September 2016].

Naidu, Narinder Kaur, dkk. 2012. Comparative study of Treponemal and non-
Treponemal test for screening of blood donated at a blood center.
[online]. Tersedia: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC3353627/ [Diakses 17 September 2016].

Neerja, Jindal.2012. VDRL Test and its Interpretation. [online]. Tersedia :

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3482816/ [ Diakses : 9
April 2016 ]
Peter l. Mattei. 2012. Syphilis: A Reemerging Infection. [online]. Tersedia :
http://www.aafp.org/afp/2012/0901/p433.html [ Diakses : 9 April
2016]

Sunil K Gupta, Aarti Bhattacharya, RR Singh, dan Vivek K

Agarwal.2012.Syphilis D’ Emblee. [online]. Tersedia: http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3401849/. [diakses: 16
September 2016].