PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROTEKNIK HEWAN

Lab. Biologi Struktur dan Fungsi Hewan

Departemen Biologi
Fakutas Sains dan Matematika
Universitas Diponegoro
2019
1. PEMBUATAN LARUTAN FIKSATIF BNF 10%

Fiksasi merupakan suatu proses yang dilakukan untuk mengawetkan sampel

jaringan dengan tujuan mengurangi kerusakan struktur dan komponen aktif jaringan.
Potongan jaringan harus diperlakuka dengan cepat setelah dikeluarkan dari tubuh
hewan. Zat kimia yang digunakan untuk memfisasi adalah larutan fiksatif.
Bahan : Formalin, aquades, NaH2PO4.H2O, Na2HPO4.2H2O
Alat : gelas ukur 250 ml; erlenmeyer, pengaduk,, timbangan
Cara membuat lrt BNF 10% (0.5 liter)
NaH2PO4.H2O sebanyak 2 g, dan Na2HPO4.2H2O sebanyak 3,25 g dilarutkan
dalam aquades 0.5 liter dan tambahkan 50 ml formaldehyde (37%-40%) aduk rata

2. PENGENCERAN ALKOHOL 30-90% :

Alkohol merupakan larutan yang paling banyak digunakan dalam proses
dehidrasi. Proses dehidrasi dilakukan dengan alkohol bertingkat, mulai dengan alkohol
prosentase rendah (30%), sampai alkohol absolut. Alkohol absolut sebenarnya tidak
terbebas dari air, tetapi air telah dikurangi sebanyak mungkin sampai batas yang dapat
dikerjakan. Alkohol absolut mempunyai kemampuan memperkeras jaringan, oleh
karena itu jaringan tidak boleh ditinggal terlalu lama dalam alkohol absolut/ alkohol
prosentase tinggi.
Bahan : Aquades, Alkohol 70% dan alkohol 96%
Alat : gelas ukur 250 ml, erlenmeyer, pengaduk
Cara Kerja
Pengenceran alkohol 30% dari alkohol 70% ( sebanyak 500 ml )
V1xM1=V2xM2
V1 x 70% = 500 x 30%
V1 =214,29
Alkohol 70% =214.29 ml
Aquades = 500 -214.29 = 285.71 ml
Pengenceran alkohol 40% dari alkohol 70% ( sebanyak 500 ml )
Alkohol 70% =285.71 ml
Aquades = 214.29 ml
 Pengenceran alkohol 50% dari alkohol 70% ( sebanyak 500 ml )
Alkohol 70% = 357.14 ml
Aquades = 142.86 ml
Pengenceran alkohol 60% dari alkohol 70% ( sebanyak 500 ml )
Alkohol 70% = 428.57 ml
Aquades = 71.43 ml
Pengenceran alkohol 80% dari alkohol 96% ( sebanyak 500 ml )
Alkohol 96% = 416.67 ml
Aquades = 83.33 ml
Pengenceran alkohol 90% dari alkohol 96% ( sebanyak 500 ml )
Alkohol 96% = 468.75ml
Aquades = 31.25 ml

3. PEMBUATAN LARUTAN GARAM FISIOLOGIS 0.9 %

Larutan garam fisiologi merupakan larutan isotonis yang memiliki banyak kegunaan
dalam bidang medis dan laboratorium, dan umumnya larutan garam fisiologi memiliki
kisaran konsentrasi 0.9%
Bahan dan alat : garam dapur, aluminium foil, timbangan, aquades
Cara kerja : 0,9 g NaCl dilarutkan dalam aquades hingga volume 100 ml, diaduk

4. PEMBUATAN PREPARAT SMEAR DARAH (METODE OLES/METODE

SMEAR
Metode oles adalah suatu metode pembuatan preparat dengan cara mengoleskan atau
membuat selaput (film) dari substansi yang berupa cairan atau bukan cairan di atas
objek glas yang bersih bebas lemak. Metode ini sangat baik untuk mengamati sitologi
darah. Film darah tipis dibuat untuk mempelajari struktur komponen seluler jaringan.
Bahan dan alat :
Objek glas, deg glass, pipet tetes, alkohol 70% ,Metanol, kapas, larutan Giemsa,
Canada alsam , nampan, pewarna untuk smear darah, jarum frankle, Mikroskop Cara
kerja : Metode Romanowsky
A. Buat preparat smear darah :
- Sediakan 2 buah gelas benda bersih
- Ambil darah dari jari tangan dengan cara menusuknya dengan jaarum lancet
(sebelumnya dibersihkan dengan akohol 70%)
 - Buang darah yang menetes pertama, darah diteteskan pada sisi kanan salah
satu gelasbenda, kira kira 2,5 cm dari tepi sebelah kanan.
- Ambil gelas enda ke dua dan lertakkan secara vertikal di atas gelas benda
pertama tepat disebelah tetesan darah tadi, lalu tariklah gelas benda tsb
sedikit kebelakang sampai menyentuh tetesan darah hingga terjadi kapilaritas.
Dengan kekuatan dan kecepatan yang sama doronglah gelas benda kedua ke
arah menjauhi sisi kanan gelas benda sehingga akan terbentuk film darah
yang tipis dan rata
- Keringkan film yg telah terbentuk dalam suhu kamar
- Celupkan dalam larutan fiksatif metanol selama 3-5 menit, keringkan sampa
saat pewarnaan

B. Pewarnaan (Romanowsky)
- Letakkan preparat pada penyangga gelas benda, tetesi asupan dengan
larutan Giemsa sampai seluruh film tertutup selama 30 menit
- Buanglah larutan warna dan bilas dengan aquades
- Kering anginkan, kemudian tetesi dengan canada balsam, tutup dengan
gelas penutup

5. PEMBUATAN PREPARAT DENGAN METODE RENTANG

Metode rentang adalah suatu metode pembuatan preparat dengan cara
merentangkan suatu jaringan pada suatu permukaan gelas benda sehingga dapat
diamati diawah mikroskop. Preparat dapat dibuat dari jaringan jaringan yang tipis,
yaitu jaringan ikat longgar, misalnya jaringan sub kutan, mesemterium, peritoneum,
pleura. Karena jaringan bersifat tipis, maka prepaat rentang dapat langsung diamati.
Agar preparat tahan lama, maka sebelumnya preparat harus difiksasi dan diwarnai
terlebih dahulu.
Bahan dan alat : Ayam ( femur), Objek glas, deg glas,pipet tetes, Acid Fuchsin,
aquades, metanol, PMA, Mallory, alkohol
30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,96%, kertas hisap, xylol, canada balsam
Cara kerja :
A. Pembuatan preparat rentang
- Potong jaringan ikat , letakkan di atas gelas benda
- Rentangkan potongan jaringan dengan bantuan sonde
 - Setelah kering fiksasi preparat dengan metanol 3-4 menit
- Bilas dengan aquades. Setelah itu lakukan pewarnaan
B. Pewarnaan MAF (Mallory Acid Fuchsin)
- Celupkan preparat ke dalam larutan acid fuchsin selama 3-5 menit
- Bilas dengan aquades
- Amati dengan mikroskop. Bila inti telah berwarna merah, lanjutkan ke
tahap berikutnya. Tetapi jika pewarnaan belum sempurna celupkan
kembali ke larutan acid fuchsin
- Celupkan preparat ke dalam larutan PMA (Phosphomolibdic Acid )
selama 5 menit, kemudian dibilas dengan aquades
- Celupkan preparat ke dalam larutan Malory selama 5 menit,kemudian
dibilas dengan aquades
- Lakukan dehidrasi dengan cara mencelupkan preparat ke dalam alkohol
bertingkat mulai dengan konsentrasi 30% sampai denngan 96%, setiap
tingkat 3-5 adukan
- Amati dengan mikroskop
- Keringkan dengan kertas hisap
- Masukkan prepaat ke dalam xylol over night, tetesi dengan canada balsam,
tutup dengan gelas penutup

6. ISOLASI DAN FIKSASI ORGAN (HEPAR, USUS, TESTIS, DLL) :

Bahan dan alat: tikus. Botol jam, dissecting , kertas minyak, timbangan organ,

kloroform, kapas, stoples, bak parafin, jarum pentul, cutter, larutan

fiksatif BNF 10%

Cara kerja :

Hewan yang akan diisolasi jaringan ataupun organ organ dalamnya, harus dibius

terlebih dahulu. Pembiusan dapat dilakukan dengan menggunakan kloroform hingga

hewan pingsan. Hewan yang sudah terbius diletakkan pada bak parafin untuk

dilakukan pembedahan dan pengambilan sampel. Keseluruhan proses tersebut harus

dilakukan dengan cepat dan tepat setrusnya sampel yang di dapat sesegera mungkin
 difiksasi. Jika organ tercampur dengan kotoran ataupun darah, maka terlebih dahulu

dicuci dengan larutan garam fisiologis kemudian difiksasi.

7. PEMBUATAN PREPARAT DENGAN METODE PARAFIN

Metode parafin merupakan metode irisan yang paling banyak digumakan, karena

hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik jika menggunakan metode

ini. Beberapa keuntungan metode parafin :

- Irisan yang di dapat jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau

seloidin

- Merupakan metode yang tepat untuk pembuatan irisan irisan yang bersifat seri

Pembuatan preparat dengan metode parafin meliputi serangkaian proses yang

berurutan, yaitu : fiksasi, washing ( pencucian), dehidrasi, clearing (penjernihan),

infiltrasi parafin, embedding (penanaman), section ( penyayatan), affixing

(penempelan), staining (pewarnaan), mounting (penutupan), labelling ( pemberian

label).

a. Membuat kotak untuk blok parafin : Bahan : kertas karton

Bahan dan alat : kertas karton dengan panjang 4x 6 cm

Cara kerja :

- Tepi dari panjang karton dipertemukan di tengah

- Tepi tepi dari lebar karton dilipat sedikit, tidak sampai bertemu di tengah

- Setiap sudut dilipat ke dalam

- Tepi tepi darilipatan dilipat kembali ke belakang sehingga menutupi lipatan

sudut tadi

- Kotak kotak dibuka dengan sudut yang terjepit

b. Metode parafin
Bahan : BNF 10%, alkohol 30%,50%,60%,70%,80%,90%, 96%, alkohol bsolut,

xylol, toluol, parafin murni, Haematoxylin, Eosin, aquades, mayers

albumin, canada balsam.

Alat : Oven, staining jar, objek gls , deg glas, disssecting set, bunsen, korek api,

set alat microtom, botol jam, kapas, krtas hisap

Cara kerja :

-. Fiksasi organ

- pencucian dengan alkohol 70% selama 30 menit (2-3 x), untuk menghilangkan

larutan fiksatif

- dehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol 70%, 80%, 90%, 96%

masin-masing selama 30 menit. Dehidrasi secara bertahap agar tidak terjadi

perubahan yang mendadak pada sel ataupun jaringan

- penjernihan (dealkoholisasi yaitu proses penarikan alkohol dari dalam jaringan

agar dapat digantikan oleh prafin). Penjernihan dengan toluol, Toluol: parafin 1:1,

toluol :parafin 1:2. Dilakukan di dalam oven (masing masing 10-30 menit)

- Infiltrasi parafin yaitu mengisi ruang ruang antar sel yang telah kososng dengan

parafin murni I,II,III. Infiltrasi parafin dilakukan dalam oven dengan temperatur

56oC dan parafin yang dipakai yang mempunyai titik cair 50-60oC. Waktu yang

diperlukan harus cepat 30-60 menit tergantung besar kecilnya jaringan

- Embedding (penanaman): Bunsen dinyalakan disamping. Mencairkan parafin

Tuangkan parafin cair ke dalam kotak karton hingga penuh. Jaringan segera

diambil dari parafin III dengan pinset kecil, dimasukkan pada kotak karton yang

diisi parafin cair

- Section. Blok parafin depasang pada holder

 - Blok parafin dibuat berbentuk piramid. Sisa parafin untuk menempel parafin ke

holder

- Lampu spiritus dinyalakan

- Permukaan holder dibalur dengan potongan sisa parafin. Dipanaskan hingga

mencair. Blok parafinditempelkan pada holder.

- Section dilakukan denga mikrotom putar dengan tebal 5-6 µ

- Affixig (penempelan )

Persiapkan gelas benda tetesi dengan albumin meyer, diratakan, tetesi dengan

aquades. Letakkan 3-4 pita parafin. Letakkn objek glas diatas hot plate sampai

pita mengembang. Atur letak pita sekitar 2 cm dari ujung objek glas

Setelah mengembang, hisap sisa air sengan pipet. Dikering anginkan

- Masukkan objek glas dalam xylol overnight

c. Pewarnaan Haematoxylin – Eosin (H&E)

- Pindahkan objek glas ke alkohol 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30%, aquades

masing masing 3-5 kali celupan

- Kerungkan dengan kertas hisap

- Celupkan preparat ke larutan haematoxylin 5-10 detik

- Bilas dengan air mengalir 10 menit untuk menghilangkan zat warna dari bagian

bagian yang tidak terwarnai

- Lakukan dehidrasi dengan mencelupkan preparat ke dalam alkohol bertingkat

mulai dengan konsentrasi 30%, 50%, 60%, 70% masing masing 3-5 celupan.

Dilap.

- Celupkan preparat ke dalam larutan Eosin 5-10 meni. Kemudian di lap

- Bilas dengan alkohol70% bekas

- Dehidrasi dengan alkohol 70%,80%,90%,96% masing masing 3-5 celupan.

Keringkan dengan kertas hisap

- Msukkan preparat dalam xylol overnight

- Tutupdengan Canada Balsam

- Amati dengan mikroskop