DDMP (TP - Semseter II)

BUKU KERJA PRAKTIK MAHASISWA
(BKPM)
DASAR-DASAR MIKROBIOLOGI PANGAN
SEMESTER II
Oleh :
Ir. Mutia Elida, M.Si
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PANGAN

(DIPLOMA III)
JURUSAN TEKNOLOGI PERTANIAN
POLITEKNIK PERTANIAN NEGERI PAYAKUMBUH
2019
ii
Kata Pengantar
Bismillahirrahmanirrahim,
Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, karena dengan

petunjuk dan hidayahNya penulisan‘Buku Kerja Praktek Mahasiswa (BKPM)
Mikrobiologi Pangan dapat diselesaikan. BKPM ini diperuntukkan bagi mahasiswa
semester II yang mengambil mata ajaran Mikrobiologi Pangan di lingkungan Politeknik
Pertanian Negeri Payakumbuh
Buku kerja praktek ini disusun untuk memberikan tambahan pengetahuan, dan
sekaligus menjadi buku pegangan dalam praktikum mata ajaran Mikrobiologi. BKPM ini
sudah mengalami revisi sesuai dengan perkembangan ilmu, topik, kritik dan saran dari
pembaca. Di dalam BKPM ini secara khusus disajikan tentang dasar-dasar parktikum
mikrobiologi, pengenalan alat, struktur morfologi sel bakteri, kapang dan khamir, serta
cara penghitungan mikroorganisme baik secara kualitatif dan kuantitaif.
Penulis berpendapat bahwa BKPM ini masih belum sempurna, dan karena itu
adanya saran dari pembaca untuk perbaikan sangat diharapkan. Akhirnya penulis
berharap semoga buku ini bermanfaat dan membantu dalam proses belajar mengajar,
khususnya pada mata ajaran yang terkait.
Payakumbuh, Desember 2017 Mutia Elida
iii
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN ………………………………………………………………………………….. ii

KATA PENGANTAR ………………………………………………………………………………….. iii
DAFTAR ISI ………………………………………………………………………………….. iv
DAFTAR TABEL …………………………………………………………………………………… v
DAFTAR GAMBAR …………………………………………………………………………………… vi
1 Tata Cara Penggunaan Peralatan dan Peraturan Laboratorium mikrobiologi….. 1
2 Mikroorganisme yang umum dijumpai di laboratorium dan manusia……………… 6
3 Penggunaan mikroskop medan terang ……………………………………………………… 10
4 Penyiapan preparat mikroba dengan metoda lekapan basah……………………..... 15
5 Pembuatan berbagai macam media dan larutan pengencer dan sterilisasi ..... 20
6 Teknik olesan bakteri, pewarnaan gram positif dan negative………………………. 29
7 Pewarnaan spora…………………………………………………………………………………….. 36
8 Teknik penyiapan dan pemindahan mikroba secara aseptik ………………………… 43
9 Teknik isolasi mikroba dengan metoda cawan dan metoda gores………………… 47
10,11 Pengaruh suhu dan pH terhadap pertumbuhan mikroba……………………………… 54
12 Hitungan mikroskopis langsung dengan hemasitometer………………………………. 58
13 Penghitungan jumlah mikroba dengan metoda turbidimetri…………………………. 65
14 Analisa kuantitatif mikroba dengan metoda plate count (Hitungan Cawan)…… 69
15 Analisa kuantitatif mikroba dengan metoda MPN (Most Probable Number)…… 77
Lampiran ………………………………………………………………………………………………………....
iv
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1 Nama peralatan lab mikro dan fungsinya………………………………………………….. 4

2 Pengamatan pertumbuhan mikroba dan ciri-cirinya…………………………………… 8
3 Waktu dan suhu yang digunakan untuk sterilisasi panas kering………………….. 21
4 Nama dan komposisi media untuk pertumbuhan mikroba…………………………… 26
5 Bagian-bagian autoclave …………….............................................................. 27
6 Nama alat dan cara sterilisasi …………………………………………………………………. 27
7 Pengamatan pertumbuhan mikroba pada berbagai media…………………………… 46
8 Data pertumbuhan bakteri pada berbagai suhu dan pH berbeda…………………. 57
9 Nilai OD hasil pengukuran dan setelah plating bakteri Lactobacillus…………….. 68
10 Nilai OD hasil pengukuran dan setelah plating bakteri pathogen…………………. 68
11 Jumlah dan total bakteri pada sampel makanan ……………………………………….. 75
12 Jumlah dan total bakteri pada sampel minuman………………………………………… 75
13 Jumlah tabung positif pada sampel air minum…………………………………………… 78
14 Total nilai MPN pada sampel air minum (Analisa kuantitatif)………………………. 80
15 Jumlah tabung positif pada sampel air minuman…………………………………….... 81
16 Total nilai MPN pada sampel minuman (Analisa kuantitatif)…………………….... 81
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1 Bentuk pertumbuhan koloni di atas agar cawan 9

2 Mikroskop medan terang dan bagiannya 14
3 Autoclave dan bagiannya 25
4 Penyiapan olesan bakteri dengan fiksasi 32
5 Tahapan pelaksanaan pewarnaan gra8m 33
6 Pemindahan biakan bakteri secara aseptik 43
7 Bentuk pertumbuhan mikroba pada permukaan media cair 44

8 Bentuk pertumbuhan mikroba pada 45
9 Langkah-langkah dalam metode cawan tuang untuk mengisolasi mikroba 51
10 Langkah-langkah dalam metode cawan gores untuk mengisolasi mikroba 52
11 Pembagian Neubauer pada hemasitometer 61

12 Analisa kuantitatif metoda pour plate 73
13 Analisa kuantitatif metoda pour plate 74
vi
POLITEKNIK PERTANIAN BUKU KERJA PRAKTEK
NEGERI PAYAKUMBUH
MAHASISWA (BKPM)
Latihan No. : 01 (Satu)

Pokok Bahasan : Peranan Mikroorganisme
Sub Pokok bahasan : Peranan mikroorganisme dalam kehidupan manusia
Judul Praktek : Tata Cara Penggunaan Peralatan dan Peraturan
Laboratorium Mikrobiologi
No. Kurikulum : 1.1.
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi
Alokasi Waktu : 4 x 50 menit
Dosen : Ir. Mutia Elida. M.Si
I. CAPAIAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH KHUSUS

Mahasiswa mampu mematuhi peraturan dan tata cara bekerja di lab mikrobiologi
dengan mengerti konsep-konsep dan teknik dasar mikrobiologi.
II. TEORI
Cara kerja dilaboratorium mikrobiologi berbeda dengan laboratorium laboratorium
lainnya. Di dalam praktikum mikrobiologi kita selalu bekerja dengan berbagai mikroba
diantaranya ada yang bersifat patogen (dapat menimbulkan penyakit atau keracunan)
dan non paten. Oleh karena itu semua pekerjaan harus dilakukan secara aseptik.
Setiap kultur mikroba yang tertetes di meja harus segera di bersihkan dengan
desinfektan, guna melindungi diri dan mencegah terkontaminasinya bahan yang anda
kerjakan. Setiap praktikan harus mematuhi peraturan dan tata tertib lab mikrobiologi.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa di bagi ke dalam 4 kelompok, tiap kelompok bekerja sesuai dengan rincian
tugas yang diberikan
b. Tiap orang dalam kelompok membuat laporan sementara hasil yang diperoleh saat
praktikum
IV. ALAT DAN BAHAN

4.1.Alat :
1. Lampu bunsen
2. Tabung reaksi ( bertutup )
3. Botol semprot
4. Pipet
5. Jarum ose
6. Rak tabung raksi
7. Petridish
8. Erlenmeyer
4.2. Bahan :
1. Kapas
2. Alkohol
3. Tissu gulung
4. Aluminium foil
5. Spritus
6. Kertas label
7. Lysol
8. Sabun cair
V. PELAKSANAAN
1. Praktikum dimulai dengan kuliah dan petunjuk secara singkat mengenai apa
yang akan dilakukan.
2. Praktikum tidak boleh dimulai sebelum diberikan petunjuk oleh dosen atau
asisten.
3. Jangan meletakkan tas atau benda-benda lain di atas meja praktek saudara!
Kenakan jas lab untuk melindungi diri dari kontaminasi dan dari zat warna atau
kimia.
4. Bersihkan meja lab saudara dengan desinfectan, tangan sebelum dan sesudah
praktek.
5. Tidak diperbolehkan makan dan minum untuk menghindari tertelannya
mikroba patogen, dan jauhkan tangan saudara dari mulut, telinga, hidung
selama saudara bekerja.
6. Tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikrooganisme apapun dari
ruangan lab, dan usahakan mikroba yang saudara tangani tidak tercecer dan
tidak bercampur dengan mikroorganisme lain.
7. Lup inokulasi dan jarum inokulasi harus disterilkan dengan jalan memijarkan
seluruh keranjang kawatnya sebelum dan sesudah setiap penggunaan.
2
8. Jika terjadi kecelakaan, tumpah, alat gelas pecah segera laporkan pada dosen
atau asisten
9. Lup inokulasi dan jarum inokulasi harus disterilkan dengan cara
memijarkan seluruh panjang kawatnya sebelum dan sesudah penggunaan,
sampai bewarna biru.
10. Biakan yang berbahaya dan tidak diperlukan lagi harus diletakkan dalam
tempatnya masing-masing :
- Cawan petri, labu, tabung reaksi diletakkan pada tempat yang telah
disediakan.
- Pipet diletakkan dalam wadah (Erlenmeyer)
- Kaca objek dan cover harus diletakkan ditempat khusus yang telah
diberi desinfectan.
- Sebelum saudara meninggalkan laboratorium bersihkan meja saudara,
dan cucilah tangan saudara dengan desinfectan.
TUGAS DAN PERTANYAAN
Tugas:
1. Masing–masing praktikum membuat laporan praktikum harian dalam bentuk
table pengamatan lanjutkan dengan pembuatan laporan.
2. Catat semua data dan penemuan yang saudara peroleh dan buatlah nama alat
dan peralatan lab mikro kemudian buat gambar dan fungsi masing-masingnya
(minimal 30 jenis peralatan)
3
VI. TABEL PENGAMATAN
Nama/No Bp Mahasiswa :
Mata ajaran :
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Tebel 1. Nama peralatan lab mikro dan fungsinya
No Nama Alat Gambar Fungsi
4
8
10
11
12
13
VII. DAFTAR PUSTAKA

Hadioetomo, RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT. Gramedia
Jakarta.
Harigan, W.F., and McCance, Margaert E. 1976. Laboratory Methods in

Food and Dairy Microbiology. Academic Press. London, Orlando,
Tokyo, New York.
5
Latihan No. : 02 (Dua)
Pokok Bahasan : Peranan Mikroorganisme
Sub Pokok Bahasan : Peranan mikroorganisme dalam kehidupan manusia
Judul Praktek : Mikroorganisme yang Umum Dijumpai di Laboratorium dan
Manusia

Mahasiswa mampu melakukan pengujian terhadap mikroorganisme yang umum
dijumpai di lab dan pada manusia.
II. TEORI
Mikroorganisme dapat ditemui dimana–mana, beberapa sumber utama
mikroorganisme antara lain : tanah dan air, tumbuh–tumbuhan dan produknya, alat –alat
pengolahan, saluran pencernaan manusia dan hewan, bahan pangan yang berasal dari
hewan, udara dan debu, serta permukaan tubuh manusia.
Begitu juga halnya dengan laboratorium dan lingkungan juga dihuni oleh banyak
mikroorganisme baik yang tersuspensikan di udara atau mengendap bersama debu pada
berbagai permukaan (pakaian, meja, lantai dll) karena ukurannya yang kecil sehingga
menyebabkan sel mikroba tersebar kemana –mana.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa di bagi ke dalam 4 kelompok
b. Mahasiswa bekerja sesuai dengan materi masing–masing kelompok
IV. ALAT DAN BAHAN

4.1. Alat :
1. Aluminium foil
2. Alkohol semprot
3. Lampu bursen
4. Tissu gulung
5. Kertas label
6. Spiritus
6
4.2. Bahan :
1. Cawan petri kecil yang berisi media NA ( Nutrient agar )
2. Cawan petri kecil yang berisi media PDA
3. Cawan petri kecil yang berisi media TSA
4. Pipet batang melengkung steril (Hockey stick)
5. Swab kapas
6. Tabung reaksi yang berisi aquades steril
V. PELAKSANAAN
1. Dengan spidol atau kertas label tuliskan nama sdr, kelompok, no kegiatan, serta
tanggal pada permukaan cawan petri ( jangan ditulis pada tutup cawan karena
akan menghalangi pengamatan.
2. Bukalah tutup cawan yang berisi media PDA, biarkan selama 30-60 menit
pada ruangan atau meja. Setelah itu tutup kembali dan inkubasi terbalik
pada inkubator suhu 370C (2– 5 hari).
3. Untuk cawan yang berisi media NA, celupkan swab steril, tekan pada pinggir
tabung kemudian oleskan pada permukaan meja praktek sdr. Buka tutup cawan
yang berisi media NA dan oleskan batang penyeka ke atas permukaan agar, dan
tutup. Inkubasi sama dengan di atas.
4. Hal yang sama juga dilakukan terhadap jari tangan sdr, batuk atau percikan bersin,
dan rambut sdr. Tutup kembali, inkubasi sama dengan di atas.
5. Setelah waktu inkubasi tercapai, periksa semua cawan dan catat hasil pada
tabel pengamatan.

Tugas:
1. Uatlah bagan alir proses kerja saudara dan dikumpulkan sebelum praktikum
dimulai
2. Gambar sketsa koloni yang tumbuh dengan berpedoman pada Gambar 1
disebelah dan sebutkan bentuk masing-masingnya.
Pertanyaan:
1. Bagaimana cara yang dapat kita lakukan untuk mengurangi cemaran pada
lingkungan khususnya ruang laboratorium.
2. Apakah dapat diprediksikan jenis mikroba apa yang paling banyak mencemari
udara atau lingkungan disekitar lab.
7
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Tabel 2. Pengamatan pertumbuhan mikroba dan cirri-cirinya

Sumber Derajat Jml/macam Dua macam
kontaminasi pertumbuhan koloni koloni>>ciri-ciri
1. Ruangan
-………………….
-…………………
-…………………..
-…………………
2. Meja
3. Tangan
4. Rambut
5. Batuk/bersin
Derajat pertumbuhan : Banyak, sedang, sedikit
VII. DAFTAR PUSTAKA

Jakarta.

Jenie, B.S.L., dan S. Fardiaz. 1989. Uji Sanitasi Dalam Industri Pangan.
[Petunjuk Laboratorium]. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan DIKTI PAU.
Institut Pertanian Bogor. Bogor.
8
Gambar 1. Bentuk pertumbuhan koloni di atas agar cawan
9
Latihan No. : 03 (Tiga)
Pokok Bahasan : Mikroskop
Sub Pokok Bahasan : Bagian-bagian mikroskop dan fungsinya
Judul Praktek : Penggunaan mikroskop medan terang
No. Kurikulum : 2.1

Mahasiswa mampu menggunakan mikroskop medan terang dan menyebutkan
kembali bagian-bagian dari mikroskop.
II. TEORI
Mikroskop adalah alat yang digunakan untuk melihat benda yang berukuran kecil
(mikroskopik). Berdasarkan sumber iluminasi (cahaya) yang dipakai mikroskop dapat
dibagi 2 yaitu :
1. Mikroskop cahaya
2. Mikroskop elektron
Mikroskop cahaya diantaranya adalah : mikroskop medan terang, mikroskop
medan gelap, mikroskop fase kontras, mikroskop fluorescens. Mikroskop medan
terang digunakan untuk melihat morfologi bakteri, khamir, kapang, ganggang dan
protozoa. Objek yang dilihat bisa diwarnai atau tidak dengan menggunakan perbesaran
1000 – 2000. Objek atau spesimen yang dilihat akan berwarna lebih gelap dengan latar
yang mengelilingi spesimen lebih terang.
Mikroskop medan terang disebut juga mikroskop majemuk karena mempunyai 2
sistem lensa yang terpisah yaitu : lensa objektif dan lensa okuler untuk menambah
perbesaran.
Umumnya lensa objektif terdiri dari 3 lensa dengan ukuran 16 mm (berkekuatan
rendah 10 x), lensa 4 mm (berkekuatan kering tinggi 40–45 x), lensa 1,8 mm (Lensa
celup minyak immersi 97–100 x). Untuk memperoleh perbesaran total adalah dengan
mengalikan perbesaran objektif dengan perbesaran okuler. Misalnya perbesaran objektif 4
mm ( 45 x ), dan okuler 10, maka perbesaran total = 45 x 10 = 450
10
III. ORGANISASI
 Mahasiswa di bagai atas 4 kelompok
 Perhatikan penjelasan dari dosen atau asisten
IV. ALAT DAN BAHAN

4.1 Alat :
1. Mikroskop medan terang
2. Objek gelas, cover gelas
3. Tissu gulung
4. Alkohol
5. Aquades steril
6. Botol semprot aquadest
4.2 Bahan :
1. Pewarna gram
2. Jarum ose
3. Preparat bakteri
4. Preparat khamir
V. PELAKSANAAN
1. Pasang mikroskop dan atur iluminasi
2. Ambil preparat yang telah disediakan dan letakkan di atas mikroskop.
3. Buka diafragma iris, naikkan kondensor sampai sama tinggi dengan pentas.
4. Mulailah pengamatan dengan lensa berkekuatan rendah 10 x.
Rendahkan lensa objektif atau naikkan pentas, dengan cara mengatur
pemfokus kasar.
5. Angkat lensa okuler, dan melalui tabung tubuh pandanglah permukaan
datar objektif.
6. Periksa agar preparat terletak di bawah objektif, dan fokuskan
mikroskop
7. Gerakan pengatur kasar berlawanan dengan jarum jam sampai preparat terlihat.
Ingatlah bahwa lensa objektif tak boleh menyentuh permukaan kaca objek /
spesimen agar kaca objek tak pecah.
8. Gerakan pengatur pentas sampai preparat terletak ditengah dan bersamaan
dengan penyetelan jarak vertikal. Kilasan bayangan yang melintasi medan
11
menunjukkan anda telah dekat ke titik fokus. Pertajam fokus dengan pengaturan
fokus halus
9. Gambarkan bentuk yang saudara lihat dengan skala yang sesuai untuk
perbesaran.

Tugas :
1. Amatilah mikroskop yang ada di depan saudara dan kemudian
gambarlah objek tersebut dan sebutkan bagian- bagiannya
Pertanyaan :
1. Apakah perbedaan yang nyata antara bakteri khamir dan kapang secara visual
2. Kenapa untuk melihat khamir tidak menggunakan pewarnaan?
12
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Bakteri: bentuk sel : Khamir : bentuk sel : perbesaran

: perbesaran :
Kapang : bentuk sel : Kapang : bentuk sel :

perbesaran : perbesaran :
13
Gambar 2. Mikroskop medan terang dan bagiannya.
VII. DAFTAR PUSTAKA

Jakarta.

Tokyo, New York.
14
Latihan No. : 04 (Empat
Pokok Bahasan : Mikroskop
Sub Pokok Bahasan : Teknik penyiapan preparat dan Pemakaian Mikroskop
Judul Praktek : Penyiapan Preparat Mikroba dengan Metoda Lekapan
Basah
No. Kurikulum : 2.2
Mahasiswa mampu menyiapkan preparat lekapan basah dan tetesan gantung serta
melihatnya dibawah mikroskop
II. T E O R I
Pengamatan mikroba dengan mikroskop dapat dilakukan dengan dua teknik
penyiapan preparat yaitu : yang bersifat basah dan olesan yang diwarnai. Pada preparat
yang bersifat basah kita dapat mengamati mikroorganisme yang hidup sedangkan
pada olesan yang diwarnai hanya diamati mikroorganisme yang mati.
Preparat basah ada dua yaitu : lekapan basah (wet mount) dan tetes gantung.
Penyiapan preparat diambil dari setetes cairan yang mengandung mikroorganisme hidup.
Preparat ini bertujuan untuk mengamati bentuk dan ukuran mikroorganisme hidup,
pengelompokkan sel – sel bakteri, apakah secara alamiah dapat bergerak (motil ) atau
tidak.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa di bagi atas 4 kelompok
b. Setiap kelompok bekerja sesuai dengan petunjuk dosen / Teknisi
IV. ALAT DAN BAHAN

4.1 Alat :
1. Kaca objek bersih
2. Kaca objek cekung
3. Cover gelas
4. Pinset / pisau bedah
15
5. Mikroskop
6. Alkohol
7. Pipet tetes
8. Jarum ose
4.2 Bahan :
1. Tissu gulung
2. Biakan suspensi Khamir
3. Minyak imersi
4. Kapang jagung
5. Air rendaman jerami
6. Lactobacillus
7. Staphylococous aureus
8. Larutan gliserol 10 %
V. PELAKSANAAN
5.1 Preparat Lekapan basah (dalam medium cair )
1. Letakkan setetes bakteri ditengah–tengah kaca objek.
2. Tutup dengan cover glas yang telah diolesi vaselin hindari terbentuknya
gelembung udara.
3. Amati dengan mikroskop dimulai dengan kekuatan rendah, gunakan juga lensa
dengan kekuatan tinggi dan mikroskop imersi.
5.2. Lekapan basah ( Dalam Medium Padat )

1. Untuk bakteri : Penyiapan medium diamati dengan menetesi objek gelas dengan
aquades steril, dilanjutkan dengan sedikit menggoreskan biakan mikroba dengan
lup inokulasi aduk rata. Lakukan pengamatan dengan mikroskop
2. Untuk kapang : Letakkan setetes gliserol 10 % atau laktofenol blue diatas gelas
objek.
3. Pegang pisau bedah / jarum ose letakan sedikit spesimen kapang ke atas tetesan
zat warna. Spesimen bisa juga diambil dengan menggunakan selotip dengan cara
menempelkan selotip pada bahan yang telah ditumbuhi kapang. Kemuian
langsung diletakkan diatas objek gelas. Lakukan pengamatan
4. Lakukan pengamatan seperti di atas
16
5.3 Penyiapan Preparat Tetes Gantung
1. Cover gelas diolesi pinggirnya dengan vaselin, dan pada bagian tengahnya tetesi
dengan preparat air rendaman jerami.
2. Objek gelas cekung dekatkan pada cover gelas dengan bagian melengkung
kebawah.
3. Kemudian balik dengan hati–hati , sebahagian air rendaman jerami seperti
mengantung dari cover gelas.
5.4. TUGAS DAN PERTANYAAN

Tugas :
1. Buatlah bagan alir langkah kerja saudara pada keras terpisah dan kumpulkan
sebelum praktikum berlangsung.
2. Gambarlah pengamatan saudara pada gambar yang telah disediakan (lekapan
basah ).
3. Gambar dan amati macam–macam organisme yang terlihat pada preparat tetes
gantung.
Pertanyaan :
1. Apa tujuan dilakukan pembuatan spesimen dengan metoda lekapan basah dan
tetes gantung
2. Sebutkan keuntungan masing-masingnya dan manakah yang terbaik
17
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Lengkapan basah :
Perbesaran :…………… Perbesaran :…………… Perbesaran :……………

Bentuk sel :………….. Bentuk sel :………….. Bentuk sel :…………..
Preparat tetes gantung
Perbesaran :…………… Perbesaran :…………… Perbesaran :……………

Bentuk sel :………….. Bentuk sel :………….. Bentuk sel :…………..
18
VII. DAFTAR PUSTAKA
Elida, M. 2004. Buku Kerja Praktek Mahasiswa (BKPM) Mikrobiologi Pangan.
Politeknik Pertanian Universitas Andalas.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan [Petunjuk Laboratorium]. Departemen

Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi.
Pusat Antar Universitas Pangan Dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.
Harigan, W.F., and McCance, Margaert E. 1976. Laboratory Methods in Food

and Dairy Microbiology. Academic Press. London, Orlando, Tokyo, New
York.

Jakarta.
19
Latihan No. : 05 (Lima)
Pokok Bahasan : Media Pertumbuhan mikroba
Sub Pokok Bahasan : Medium Dan Macam Medium Pertumbuhan Mikroba
Judul Praktek : Pembuatan Berbagai Macam Media, Larutan
Pengencer dan Sterilisasi
No. Kurikulum : 3.1

Mahasiswa mampu membuat berbagai macam media dan larutan pengencer, serta
melakukan sterilisasi media dan peralatan
II. T E O R I
Medium adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme.
Sedangkan media bentuk jamak dari medium. Media dibedakan atas 3 yaitu media cair
yang digunakan untuk menumbuhkan atau membiakkan mikroba, fermentasi dan uji – uji
lainnya ( NB, MRSB, Lactose Broth) Media padat digunakan untuk menumbuhkan mikroba
pada permukaan sebagian membentuk koloni dan dapat dihitung atau diisolasi contohnya
PDA (Potato Dextrosa Agar), PCA (Plate Count Agar), NA (Nutrien Agar), MRSA, VRBA
(Violet Red Bile Agar), EMBA (Eosin Methylen Blue Agar). Media setengah padat (semi
solid) biasanya digunakan untuk mengawetkan atau menyimpan kultur mikroorganisme
dalam waktu tertentu biasanya ditambahkan agar dalam konsentrasi kecil, konsistensi
berada diantara media cair dan padat.
Berdasarkan komposisi kimia dikenal dengan dua medium : medium sintetik dan
medium non sintetik (komplek). Media sintetik dibuat dengan cara mencampurkan
komponen–komponen kimia murni dalam jumlah tertentu dan komposisi kimianya dapat
diketahui dengan pasti. Komposisi media non sintetik tidak tetap misalnya beef extract
dan pepton.
Bermacam–macam media telah diperdagangkan dalam bentuk campuran lengkap
sehingga kita tinggal menimbang dan mencampur dengan aquadest dan mensterilisasi.
Media padat mengandung agar, gelatin sebagian pemadat yang dicampurkan sebelum
sterilisasi dilakukan, yang ditambahkan sebanyak 1,5%. Jika media akan digunakan
untuk goresan agar ditambahkan 1,8 – 2,0%, sedangkan untuk agar semi solid sebanyak
0,5%. Agar tidak digunakan oleh mikroba sebagai makanan tetapi hanya sebagai
pemadat.
20
Agar miring adalah salah satu bentuk media yang digunakan untuk membiakan
mikroba, terutama yang bersifat aerob dan anaerobik fakultatif. Tetapi kebanyak
digunakan untuk menyimpan kultur mikroba dalam jangka waktu pendek dalam lemari es.
Sedangkan agar tegak sering digunakan untuk uji motilasi suatu mikroba, dan untuk
menyimpan dan mengawetkan kultur dalamjangka panjang dengan menambahkan
CaCO3. Agar tuang digunakan utnuk mengencerkan mikroba.
Larutan pengencer biasanya digunakan untuk mengencerkan contoh, bahan yang
sering digunakan adalah buffer fosfat yang berasal dari K2HP04 / KH2PO4, atau garam
fisiologis (NaCl) 0,8 %.
Semua media dan pengencer yang akan digunakan untuk inokulasi
mikroorganisme harus disterilisasi untuk mematikan semua mikroorganisme yang
terdapat dalam media. Ada dua cara sterilisasi yaitu secar basah dan kering, sterilisasi
basah dilakukan di dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit pada 1 atm. Cara
ini digunakan untuk medium biakan mikroba, larutan pengencer, peralatan labor, biakan
yang akan dibuang. Sterilisasi panas kering dengan menggunakan oven pada suhu 140oC
selama 3 jam atau 170oC selama 1 jam. Bahan-bahan yang biasa disterilisasi dengan cara
ini adalah pecah belah atau yang terbuat dari kaca atau gelas (pipet, tabung reaksi,
petridish, botol sampel). Sebelum digunakan media dan alat-alat setelah sterilisasi
didinginkan terlebih dahulu sampai T 45 – 47 0
C. Untuk media APDA ditambahan asam
tartarat 10% yang ditambahkan setelah sterilisasi.Suhu dan lama sterilisai dapat dilihat
pada Tabel 3
Tabel 3. Waktu dan suhu yang digunakan untuk sterilisasi panas kering
No Suhu (oC) Waktu (jam)
1 170 1,0
2 160 2,0
3 150 3,0
4 140 3,0
III. ORGANISASI
b. Setiap kelompok bekerja sesuai dengan petunjuk dosen / asisten
21
IV. ALAT DAN BAHAN
4.1 Alat :
1. Tabung rekasi bertutup
2. Botol semprot aquades
3. Tabung reaksi tak bertutup
4. Petridish
5. Erlenmeyer 250 ml, 500 ml
6. Mikro pipet, tip
7. Baker gelas 250, 500 ml, 1000 ml
8. Pipet ml 10 ml, 25 ml
9. Timbangan analitik
10. Rak tabung reaksi
11. Hot plate
12. Sendok spatula
13. Batang pengaduk kaca
14. pH meter
15. Gelas ukur 10 ml, 100 ml, 250 ml
16. Autoclave
17. Swab kapas
4.2 Bahan :
1. Kapas
2. Spiritus
3. Alkohol
4. Aluminium foil
5. Kertas label
6. Aquades
7. NA
8. NB
9. MRSA
10. MRSB
11. Agar
12. PDA/PCA
13. KH2PO4 / K2HPO4
14. Garam ( NaCl )
15. CaCO3
22
16. Asam tartarat 10%
17. Tip biru dan kuning
18. Tissu gulung
V. PELAKSANAAN
5.1. Pembuatan Larutan Pengencer
1. Larutan garam fisiologis 8,5 gr NaCl dilarutkan dalam 1 liter aquadest.
2. Aduk sampai larut dan masukan dalam tabung reaksi sebanyak 9 ml dan 45 ml
3. Tutup tabung reaksi dengan sumbat kapas dan sterilisasi 1210 C, 15 menit.
5.2. Membuat larutan Pengencer dari KH2PO4
1. Timbang KH2PO4 sebanyak 34 gr, larutkan dalam aquades 500 ml, atur pH 7,2
dengan menggunakan HCl atau NaOH (larutan stok)
2. Untuk membuat larutan pengencer ambil larutan stok sebanyak 1,25 ml dan
tambahkan 1 liter aquades.
3. Masukkan sebanyak 9 ml dalam tabung reaksi dan 45/90 ML ke dalam
erlenmeyer, dan lanjutkan dengan sterilisasi.
5.3. Pembuatan Media

1. Timbang media sesuai dengan etiket yang ada pada botol media hitung sesuai
dengan kebutuhan yang diperlukan masing – masing kelompok
2. Tambahkan aquadest dengan menggunakan gelas ukur masukkan dalam
erlenmeyer. Tambahkan agar jika akan digunakan untuk goresan bakteri.
3. Lakukan pemanasan diatas hot plate sambil diaduk dengan batang
pengaduk atau magnetik stirer. Ukur pH jika ada pH tertentu yang dikehendaki
dengan penambahan NaOH / HCl ( I N / 0,1 N )
4. Tutup erlenmeyer dengan sumbat kapas atau aluminium foil dan sterilisasi.
5. Untuk media cair / agar miring masukkan media ke dalam tabung reaksi
sebanyak 5 atau 4 ml tutup dengan sumbat kapas dan sterilisasi
6. Untuk membuat agar miring letakkan tabung reaksi yang telah berisi agar steril
dalam keadaan miring dan biarkan membeku.
7. Untuk membuat agar cawan setelah sterilisasi dan media agar mencapai suhu 450
C, masukkan dalam cawan petri steril sebanyak 12–15 ml setelah beku simpan
dalam lemari es sampai diperlukan.
8. Tulis nama media, nama kelompok tanggal pada cawan petri atau tabung reaksi
23
5.4. Sterilisasi media
1. Tuangkan air ke dalam tubuh saterilisator, hingga 2/3 dasar keranjang

2. Tatalah labu atau erlenmeyer yang berisi media, dan tabung reaksi
sehingga tersedia ruangan untuk pergerakan uap air disela wadah.
3. Letakkan tutup sterilisator dengan cara mempertemukan tanda-tanda panah
penunjuk atau lobang baut, sambil diputar untuk lebih rapat.
4. Bukalah klep pengatur pengaman, hidupkan api atau listrik.
Uap yang terbentuk pada dasr tubuh sterilisator akan mengalir ke atas
diseputar wadah yang disterilisasi.
5. Bila uap air mulai keluar (bunyi mendesis) tutup klep pengaman, maka
tekanan didalam akan naik yang dapat dibaca pada alat pengukur tekanan.
6. Jika sudah tercapai tekanan 1 atm (121oC) pertahankan selama 15 menit dengan
cara mengurangi panas dengan membuka klep pengukur tekanan.
7. Pada akhir proses matikan api dan tunggu tekana hingga nol (0), suhu turun
dibawah 100oC jika belum akan berbahay dan bisa meledak jika dibuka.
8. Keluarkan keranjang dan bahan dari dalam keranjang, kocok media, dan segera
disimpan pada inkubator suhu 650C jika tidak langsung digunakan.
9. Untuk sterilisasi kering cukup dengan menyalakan oven dan menyetel pada suhu
yang diinginkan.
5.4. TUGAS DAN PERTANYAAN

Tugas :
1. Setelah saudara isikan semuanya ke dalam wadah masing-masingnya,
lanjutkan dengan proses sterilisasi.
4. Pelajari bagian-bagian autovclave dengan membandingkan dengan Gambar 3
24
1. Tobol pengatur waktu mundur (timer)
2. Katup pengeluaran
3. Pengukur tekanan
4. Klep pengaman dan pengatur aliran uap
5. Tombol on off
6. Termometer
7. Lempeng pemansa
8. Air
9. Skrup pengaman
Gambar 3. Autoclave dan bagiannya
Pertanyaan :
1. Kenapa terdapat bermacam-macam bentuk media, jelaskan jawaban saudara.
2. Bisakah media yang sama digunakan untuk semua jenis mikroorganisme
3. Menurut sdr cawan yang telah digunakan untuk menumbuhkan mikroba setelah
dipakai, haruskah dilakukan proses sterilisasi sebelum dicuci. Jelaskan !
4. Kenapa media mikroorganisme harus steril, dan kenapa jika tidak dilakukan
sterilisasi.
5. Bagaimana memastikan media hasil sterilisasi tidak dikontaminasi oleh
mikroorganisme lain?
6. Mengapa sebelum dituangkan ke dalam cawan atau metoda pou plate, media
agar diturunkan suhunya dibawah 40oC.
7. Kenapa dalam pembuatan media APDA ditambahkan asam tartarat 10%.
25
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Tabel 4. Nama dan Komposisi Media untuk pertumbuhan Mikroba

No Media Komposisi Jumlah pemakaian/l
26
Tabel 5. Bagian-bagian autoclave
No Bagian Fungsi
Tabel 6. Nama alat dan cara sterilisasi

No Nama Alat Cara Sterilisasi
27
VII. DAFTAR PUSTAKA
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan [Petunjuk Laboratorium]. Departemen Pendidikan

dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas
Pangan Dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.
Fardiaz, S. 1993. Mikrobiologi Pengolahan Pangan [Penuntun Praktek). Program Studi

Ilmu Pangan Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor.

Ilmu Pangan Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor
Hadioetomo, RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT. Gramedia Jakarta.
Harigan, W.F., and McCance, Margaret E. 1976. Laboratory Methods in Food and Dairy
Microbiology. Academic Press. London, Orlando,
28
Latihan No. : 06 (Enam)
Pokok Bahasan : Struktur dan Morfologi Sel Mikroorganisme
Sub Pokok Bahasan : Perbedaan Struktur Sel Prokariot dan Eukariot
Judul Praktek : Teknik Olesan Bakteri, Pewarnaan Gram Positif
dan negatif
No. Kurikulum : 4.1

Mahasiswa mampu mengamati struktur dan morfologi sel mikroorganisme
II. T E O R I
Olesan bakteri yang baik merupakan prasarat keberhasilan suatu teknik
pewarnaan, olesan yang baik tidak tebal atau tipis dan bila difiksasi dengan panas akan
tahan pencucian selama terjadinya proses pewarnaan seharurnya tidak hilang tercuci atau
sel selnya tidak menyusut.
Kaca objek harus bersih dan tidak boleh tergores, berlemak atau berdebu,
pengambilan spesinen harus sedikit dan dioles tipis,jika tebal olesan akan menumpuk dan
sukar untuk menentukan bentuk sel dan jumlah cahaya yang lewat melalui spesimen
menjadi berkurang. bila organisme berasal dari medium padat, perlu ditaruh 1-2 lup
penuh agudest steril pada gelas objek. spesimen harus diratakan, dan dibiarkan kering
sebelum difiksasi Kemudian dilakukan pewarnaan (pewarnaan gram ) dengan 4 jenis
larutan yaitu:
1. zat warna basa (kristal violet),
2. mordant (yodium),
3. pencuci zat warna (alkohol ),
4. conterstrain ( safranin)
Dengan pewarnaan gram bakteri dapat dibedakan atas dua yaitu: gram positif dan
gram negatif. Sel-sel bakteri yang tidak dapat melepaskan warna dan tetap bewarna
seperti kristal violet (biru-unggu) disebut bakteri gram positif, sedangkan sel-sel bakteri
yang melepaskan nama kristal violet dan mengikat zat warna safranin sehingga bewarna
merah muda yang disebut : bakteri gram negatif.
29
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa dibagi kedalam 4 kelompok
b. Setiap kelompok bekerja sesuai dengan penjelasan dosen
IV. ALAT DAN BAHAN

4.1 Alat:
1. Objek gelas
2. Kotak preparat
3. Bunsen
4. Botol semprot aguadest
5. Jarum ose
6. Mikroskop
4.2 Bahan:
1. Biakan E. coli, S. aureus, B. cereus dalam NA miring
2. Biakan bakteri Lactobacillus
3. Dadih,susu segar,daging sapi, ayam, ikan, sayur berlendir.
4. Pewarnaan gram
5. Alkohol
6. Aguadest steril
7. Minyak immersi
8. Tissu gulung
V. PELAKSANAAN
1. Bersihkan gelas objek dari lemak dan debu dengan alkohol dan tissu peganglah
pada bagian pinggir jangan menyentuh permukaan gelas objek.
2. Beri etiket atau label yang berisikan nama bakteri dan bahan media
3. Buat olesan dari medium padat taruh 1 loup aguadest steril dan ratakan dengan
spesimen yang akan diamati biarkan mengering
4. Lakukan fiksasi dengan berulang pada lampu bunsen
5. Genangi olesan bakteri dengan pewarna primer ( kristal violet ) selama 1 menit,
kemudian miringkan dan bilas dengan botol pijit atau air mengalir.
6. Kering anginkan dan kemudian tetesi dengan lodium selama 2 menit, buang
sisa atau kelebihan zat warna dan bilas dengan air.
7. Lakukan pencucian dengan alkohol 95 %, bilas lagi dengan air sampai zat
warna ungu tidak terlihat lagi.
30
8. Genangi olesan bakteri dengan zat warna tandingan safranin 30 detik, bilas lagi
dengan air.
9. Tiriskan dan keringkan dengan kertas serap atau tissu (terutama bahagian
pingir gelas objek) kemudian kering anginkan.
10. Lakukan pengamatan dengan mikroskop yang dimulai dengan perbesaran
rendam sampai kuat. Teknik fiksasi dan langkah-langkah pewarnaan dapat
dilihat pada Gambar 4 dan 5.
TUGAS DAN PERTANYAAN :

Tugas :
1. Buatlah bagan alir cara kerja uji pewarnaan gram bakteri dan dikumpul
sebelum praktikum dimulai
2. Gambarkan pewarnaan gram dari bakteri yang saudara amati.
Pertanyaan :
1. Jelaskan kenapa suatu bakteri bisa bersifat gram negatif atau Positif
3. Dari sampel yang sdr amati manakah yang tergolong gram posisitf maupun
gram negatif
4. Sebutkan contoh lainnya dari bakteri golongan positif dan negatif (minimal 5
jenis)
31
Gambar 4. Penyiapan olesan bakteri dengan fiksasi
32
Gambar 5. Tahapan pelaksanaan pewarnaan gram
33
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
1. Reaksi gram : Bakteri 1 Bakteri 2 Bakteri 3

……….. ……….. …………
Bentuk sel ……….. ………... …………
- Besar sel besar/kecil/relatif besar/kecil/relatif besar/kecil/relatif
- Cara pengelompokkan …. ……. ………… …………
- Pembentukn spora : ya / tidak ya / tidak ya / tidak
2. Buatlah Gambar dari masing-masingnya
Perbesaran Perbesaran Perbesaran
3. Gambarlah pewarnaan gram dari bahan /makanan yang saudara amati (reaksi
gram/ bentuk sel)
makanan I makanan II makanan III
- gram positif( batang ) ………….% …………… % ……………%
- gram negatif (batng ) …………..% ……………..% ……………%
- gram positif (kokus) ………….. % ………………% …………..%
4. Berdasarkan hasil diatas, berikan kemungkinan bakteri apa yang

terdapat dalam makanan tersebut.
34
VII. DAFTAR PUSTAKA
Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat
Antar Universitas Pangan Dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.

lmu Pangan Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor.

Food and Dairy Microbiology. Academic Press. London, Orlando, Tokyo, New
York.
35
Latihan No. : 07 (Tujuh)
Judul Praktek : Pewarnaan Spora
No. Kurikulum : 4.2
Mahasiswa mampu melakukan pewarnaan spora dan letak spora dibawah

mikroskop.
II. TEORI
Bakteri pembentuk spora tergolong pada spesies Bacillaceae dan dapat
digolonglan atas tiga jenis yaitu : Bacillus, Clostridium, Desulfamatoculum. Di dalam
selnya bakteri ini akan memproduksi endospora, jika sel semakin tua maka sel vegetatif
akan semakin tua dan pecah sehingga endospora akan terlepas menjadi spora bebas.
Spora ini akan tahan pada kondisi ekstrim kering, panas, dingin, antibiotika dan
zat kimia beracun jika dibandingkan dengan sel vegetatifnya. Spora ini juga lebih tahan
terhadap pewarnaan dan sekali berhasil diwarnai spora sangat sukar untuk melepaskan
zat warna, sehingga sangat sukar untuk mengikat zat warna yang diberikan kemudian
(Counterstain).
Zat warna yang paling sering digunakanadalah malachite green yang akan tetap
diikat oleh spora setelah dicuci dengan air dan sebagai counterstrain adalah safranin.
Endopspora yang terdapat bebas di dalam sel vegetatif dan spora bebas akan bewarna
hijau-biru, sedangkan sel vegetatif akan bewarna merah muda.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa di bagi ke dalam 4 kelompoK
b. Tiap kelompok bertanggung jawab atas kebersihan meja dan peralatan yang
digunakan
36
IV. ALAT DAN BAHAN
4.1 Alat :
1. Lampu bunsen
2. Objek gelas
3. Botol semprot
4. Pipet tetes
5. Jarum ose
6. Kotak preparat
7. Mikroskop
4.2 Bahan :
1. Biakan B. cereus dalam NA miring
2. Sayur berlendir
3. Rempah kadaluarsa
4. Malachite green
5. safranin
6. Alkohol
7. Aquadest steril
8. Minyak immersi
9. Tissu
V. PELAKSANAAN
5.1 Pewarnaan spora cara 1:
1. Bersihkan objek gelas dengan alkohol, kemudian tetesi dengan air steril, dan
lakukan fiksasi.
2. Setelah f1ksasi genangi gelas objek dengan malachite green dan panasi dengan
api bunsen. Pegang gelas objek dengan pinset/penjepit. Pemanasan sampai
mendidih sambil terus ditambahi dengan zat warna Malachite green selama 10
menit .
3. Setiap kali pewarnaan menjadi kering teteskan lagi pewarna yang baru
4. Biarkan sampai dingin, kemudian kelebihan warna di cuci dengan air mengalir.
5. Genangi lagi dengan safranin selama 1 menit, selanjutnya kelebihan safranin
dicuci, dan tiriskan sampai kering.
6. Lakukan pengamatan dengan mikroskop dengan menggunakan lensa pebesaran
kuat (minyak immersi). Amati juga apakah sel vegetatif membengkak atau sudah
pecah.
37
5.2. Pewarnaan spora cara 2:
1. Setelah faksasi genangi gelas objek dengan malachise green dan panasi
dengan api bansen. Pegang gelas objek dengan pinset. Pemanasan sampai
mendidih sambil terus ditambahi dengan zat warna Malachite green selama 10
menit.
2. Biarkan sampai dingin, kemudian kelebihan warna di cuci dengan air mengalir.
3. Genangi lagi dengan safranin selama 1 menit, selanjutnya kelebihan
safranin dicuci, dan tiriskan sampai kering.
4. Periksa dibawah mikroskop dengan menggunakan lensa obyektif minyak immersi.
5. Kemudian amati bentuk spora dan besar spora serta letak spora dalam sel. Amati
juga apakah sel vegetatif membengkak dengan adanya spora

Tugas :
1. Amati pewarnaan spora dari makanan, tanah, rempah, bakteri yang saudara
amati: Buat gambar dan beri keterangan mengenai :
 bentuk sel vegetatif
 bentuk spora
 letak spora dalam sel
 pembengkakan sel dengan adanya spora
 besar spora jika dibanding dengan sel vegetatif.
Pertanyaan:
1. Buatlah bagan alir cara kerja uji pewarnaan spora bakteri dan dikumpul sebelum
praktikum dimulai
2. Sebutkan golongan bakteri penghasil spora dan berikan contohnya
38
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
1. Bakteri sayur berlendir

a. Bentuk spora .............................
b. Letak spora dalam sel .................
c. Pembengkakan sel dengan adanya spora....
...................................................
d. Besarnya spora jika dibandingkan dengan sel vegetatif..........
e. Bentuk sel vegetatif ...........................................................
2. Bakteri rempah
a. Bentuk spora .............................
...................................................

3. Bakteri B. cereus
a. Bentuk spora .............................
...................................................

39
VII. DAFTAR PUSTAKA


Harigan, W.F., and McCance, Margaert E. 1976. Laboratory Methods in Food and Dairy
Microbiology. Academic Press. London, Orlando, Tokyo, New York.
40
Latihan No. : 08 (Delapan)
Judul Praktek : Teknik Penyiapan & Pemindahan Mikroba Secara
Aseptik
No. Kurikulum : 4.3

Mahasiswa mampu melakukan pemindahannya mikroba secara aseptik ke dalam
berbagai media
II. T E O R I
Secara alamiah mikroba terdapat dalam bentuk campuran berbagai jenis. Mikroba
yang sudah dipisahkan dan hanya terdiri dari 1 species tunggal disebut Biakan Murni .
Untuk mengamati sifat pertumbuhan dan morfologi serta perbanyakannya maka biakan
murni harus kita pindah–pindahkan ke dalam medium lain yang telah di sterilisasi, baik
itu ke dalam medium cair atau padat dengan teknik pemindahan yang aseptik , untuk
mencegah kontaminasi.
Untuk pemindahan sel –sel bakteri / kapang / khamir dari satu medium ke
medium lain digunakan jarum ose atau loop. Jarum ose sebelum pemakaian harus
dipijarkan terlebih dahulu (sterilisasi) sampai ujungnya bewarna merah.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa di bagi dalam 4 kelompok
b. Mahasiswa bekerja dengan memperhatikan penjelasan dari dosen atau asisten
IV. ALAT DAN BAHAN

4.1. Alat :
1. Jarum ose
2. Sumbat kapas
3. Lampu bunsen
5. Tabung reaksi bertutup
41
4.2 Bahan :
1. Alkohol
2. Tissu gulung
3. 4 tabung berisi nutrient broth ( NB )
4. 4 tabung berisi nutrient agar ( NA )
5. 4 tabung berisi MRSB Lactobacillus
6. Biakan agar miring Salmonella, S. aureus, E. coli, B. cereus
7. Botol semprot
8. Spiritus
9. Tabung berisi MRSA
10. CaCO3
11. Biakan agar miring Rhyzophus olygosporus
12. Biakan agar miring Sacharomyces cereviseae
13. Biakan agar miring Lb. brevis, Lb. plantarum, S. raffinolactis
V. PELAKSANAAN
1. Pijarkan seluruh kawat atau jarum ose diatas pembakaran bunsen
2. Pegang tabung reaksi dengan tangan kiri, angkat sumbat tabung dengan tangan
kanan dengan jari kelingking, jari manis dengan gerakan berputar.
3. Panaskan mulut kedua tabung diatas api dengan jalan memiringkan tabung
(450C).
4. Inokulasikan sejumlah kecil bakteri dari tabung 1 ke tabung 2 dengan ose yang
telah didinginkan.
5. Panaskan mulut tabung reaksi dan pasang kapas sumbat mulai dari tabung yang
terdekat dengan tangan.
6. Pijarkan kembali lup inokulasi, sebelum diletakkan pada tempatnya.
Perhatikan Gambar 6.
7. Ulangi pemindahan aseptik ini pada.2 tabung yang berisi NB ( NB1, NB2) dan
MRSB (MRSB1, MRSB2)  Inkubasi pada suhu 370 C ( 24–48 jam).
8. Pemindahan aseptik dilakukan lagi jika bakteri telah tumbuh, ke dalam NA miring
dan MRSA miring untuk pengawetan kultur.
9. Inkubasi T 370 C ( 24 – 48 jam ).
10. Berilah etiket pada sebuah tabung reaksi yang telah dikerjakan :
Nama, Tanggal inokulasi, Nama bakteri, Nama media
42
Gambar 6. Pemindahan biakan bakteri secara aseptik

Tugas :
1. Buatlah bagan alir cara kerja uji pewarnaan gram bakteri dan dikumpul
2. Amati pertumbuhan pada media cair, dengan ditandai dengan adanya
kekeruhan, cocokkan dengan Gambar 7 dan 8 .
43
Pertanyaan :
1. Apa yang dimaksud dengan biakan murni dan campuran. Berikan masing-
masing contohnya
2. Apa yang dimaksud dengan inokulum dan aseptik
Gambar 7. Bentuk pertumbuhan mikroba pada permukaan media cair
(a)
44
(b)
Gambar 8. Bentuk pertumbuhan mikroba pada

(a) agar tegak . (b) agar miring
45
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Tabel 7. Pengamatan pertumbuhan mikroba pada berbagai media

No Sampel Media cair Media tegak
1 Lb. paracasei ssp
paracasei
2 Lb. brevis
3 S. raffinolactis
4 S. thyphimurium
5 S. aureus
6 E. coli
7 B. cereus
8 R. olygosporus
9 Sacharomyces
cereviseae
VII. DAFTAR PUSTAKA
Elida, M. 2004. Buku Kerja Praktek Mahasiswa (BKPM) Mikrobiologi Pangan. Politeknik
Pertanian Universitas Andalas.


46
Latihan No. : 9 (Sembilan)
Judul Praktek : Teknik Isolasi Mikroba dengan metoda cawan dan
metoda gores
No .Kurikulum : 5.4

Mahasiswa mampu mempraktekk isolasi mikroba dengan cara teknik agar tuang
dan teknik cawan gores.
II. T E O R I
Mikroba terdapat dalam bentuk campuran dari berbagai jenis. Untuk mencirikan
dan mengidentifikasi spesies mikroorrganisme tersebut harus dipisahkan, lalu
ditumbuhkan jadi biakan murni. Cara memperoleh biakan murni tersebut adalah dengan
cara :1. teknik cawan gores dan 2. teknik cawan tuang.
Prinsipnya adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga spesies dapat
dipisahkan dari yang lainya. Metode cawan gores ada 3 cara : (a) goresan lansung, (b)
goresan kwadran, (c) goresan radian. Setelah goresan pertama dan kedua, ketiga loop
(ose ) harus dipijarkan di atas bunsen, kemudian dinginkan dengan cara menusukkan ke
pinggir agar cawan.
Koloni yang tumbuh pada agar cawan dibedakan atas besar koloni, warna,
penampakan, bentuk penyebaran dan kemunculan pada agar (diatas atau dibawah).
Metode agar tuang: digunakan untuk mengencerkan mikroorganisme terdapat
dalam contoh. Agar cair heril didinginkan sampai Temperatur 47oC. Konsentrasi sel
mikoorganisme dalam contoh tidak diketahui, maka perlu dilakukan pengenceran
beberapa tahap, sehingga didapatkan nantinya koloni yang terpisah di atas atau
permukaan agar.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa dibagi kedalam 4 kelompok.
b. Setiap kelompok bekerja sesuai dengan petunjuk dosen
47
IV. ALAT DAN BAHAN
4.1 Alat :
1. loop inokulasi atau jarum ose
2. Inkubator
3. bunsen
4. Oven
5. label
6. Tabung reaksi
4.2 Bahan :
1. NB, NA dalam cawan petri, NA miring
2. Dadih
3. MRSB,MRSA, MRSA miring dan tegak
4. Yakult
5. Ragi roti
6. Agar cair (Broth)
7. Tempe
V. PELAKSANAAN
5.1. Metode Cawan Tuang (Pour plate)
1. Beri etiket pada cawan petri dengan nama bahan, media, tgl, pada tiga cawan
steril.
2. Ambil tiga tabung reaksi yang berisi larutan Broth (NB atau MRSB),
dengan menggunakan lup atau ose steril ambil sebanyak 1-2 ose suspensi
bakteri, kocok hingga homogen dengan jalan memutar tabung. Pindahkan 1- 2
ose ke dalam larutan broth yang kedua, kocok hingga homogen dan ambil lagi
1-2 ose pindahkan kealam tabung ke tiga (Gambar 9.)
3. Tuangkan secara aseptik dari ketiga tabung tadi kedalam tiga cawan yang
berbeda juga sesuai dengan nomor tabung reaksi. Inkubasi pada suhu 37oC
selama 1-2 hari.
4. Lakukan pengamatan terhadap koloni yang tumbuh.
5.2. Metode Cawan Gores (streak Plate) :

1. Tulis nama bahan, media, tgl pada tutup cawan, balikkan cawan petri
dan bagi atas 4 sektor yaitu; 0. I, II, III,
2. Pijarkan lup atau ose kemudian dinginkan pada tepi cawan. Ambil satu
48
ose suspensi contoh bakteri goreskan kuadran pada sektor 0, pijarkan
ose lagi dan dinginkan kemudian goreskan pada sektor I. Begitu
selanjutnya sampai sektor IV (Gambar 10).
3. Terakhir pijarkan ose untuk membunuh sisa-sisa mikrorganisme yang
tersisa.
4. Lakukan cara tersebut untuk biakan bakteri dari suspensi lainnya
5. Inkubasi pada suhu 37oC selama 2-3 hari secara terbalik.
6. Selanjutnya terhadap koloni yang tumbuh lakukan lagi goresan kuadran
dengan mengambil satu dari setiap koloni yang berbeda baik bentuk,
ukuran dan warna. Hal ini dilakukan sampai didapat koloni yang betul-
betul seragam dan sama.
7. Setelah didapatkan koloni yang seragam, selanjutnya ditanamkan atau
digores pada agar miring, dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2
hari.
8. Koloni yang tumbuh disimpan sebagai kultur murni dan dilakukan uji-
uji untuk identifikasi.
9. Goresan dapat juga diambil dari koloni yang tumbuh dari metode agar tuang.

Tugas :
1. Buatlah bagan alir cara kerja isolasi mikroba menggunakan cawan gores dan
cawan tuang dan dikumpul sebelum praktikum dimulai
2. Setelah inkubasi, gambarlah bentuk pertumbuhan koloni yang tumbuh dari
metode agar tuang, baik dari atas, pinggir, penonjolan serta warnanya.
3. Dengan spidol lingkari koloni yang terpisah dan berlainan warna permukaan,
gores lagi sampai didapat koloni yang seragam.
3. Segera pindahkan dengan cara menggores pada agar tusuk atau miring, setelah
inkubasi simpan dalam refrigerator (beri label yang sesuai).
Pertanyaan:
1. Apa tujuan kita membagi media pada agar cawan atas 4 sektor, dan bagaimana
kalau tidak dilakukan.
2. Dari dua metoda di atas menurut saudara cara mana yang paling
mudah dan cepat untuk dilakukan
3. Sebutkan kelemahan-kelemahan dari metoda cawan gores dan cawan tuang!
49
Lampiran : Lembar Kerja
Mata ajaran :
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Sampel A : …………………….. ………………………

…………………….. ………………………
…………………… ………………………
…………………… ………………………
Sampel B : …………………….. ………………………
…………………….. ………………………
…………………… ………………………
…………………… ………………………
Sampel C : …………………… ………………………
…………………….. ………………………
…………………… ………………………
…………………… ………………………
Sampel D : …………………… ………………………
…………………….. ………………………
…………………… ………………………
…………………… ………………………
2. Gambarlah bentuk mikroba yang sdr isolasi jika dilihat dibawah mikroskop
Bakteri
50
Kapang Kapang
Khamir Khamir
Gambar 9. Langkah-langkah dalam metode cawan tuang untuk mengisolasi mikroba
51
Gambar 10. Langkah-langkah dalam metode cawan gores untuk mengisolasi mikroba
52
VII. DAFTAR PUSTAKA
Elida, M. 2004. Buku Kerja Praktek Mahasiswa (BKPM) Mikrobiologi Pangan .

Politeknik Pertanian Universitas Andalas.


53
Latihan No. : 10, 11 (Sepuluh dan Sebelas)
Pokok Bahasan : Pertumbuhan Mikroorganisme
Sub Pokok Bahasan : Faktor-faktor yang Mempengaruhi pertumbuhan
Judul Praktek : Pengaruh Suhu dan pH Terhadap Pertumbuhan
Mikroba
No .Kurikulum : 5.1
Mahasiswa mampu membandingkan pertumbuhan mikroorganisme pada berbagai

suhu dan pH pertumbuhan
II. T E O R I
Untuk pertumbuhan yang baik, mikroba memerlukan suhu tertentu. Dalam hal ini
dikenal adanya 3 suhu pertumbuhan yaitu suhu optimum, suhu maksimum, suhu
minimum.
Suhu optimum yaitu suhu dimana mikroba dapat tumbuh sangat baik, cepat dan
menghasilkan jumlah sel yang maksimal. Suhu maksimum yaitu : suhu tertinggi diatas,
mana mikroba tidak dapat tumbuh, sedangkan suhu minimum adalah suhu terendah
dibawah mana mikroba tidak dapat tumbuh. Berdasarkan suhu pertumbuhannya bakteri
di bagi atas 3 yaitu : bakteri termofil suhu optimumnya diatas 45o C, bakteri mesofil
yang mempunyai suhu optimum 20 – 45o C dan bakteri psikhrofil yang dapat tumbuh
pada suhu rendah 5 – 10o C.
Begitu juga dengan pH, setiap mikroba mempunyai pH minimum, pH optimum,
dan pH maksimum untuk pertumbuhannya. Bakteri tumbuh baik pada kisaran pH 6,5 –
7,5, khamir 4,0 – 4,5 sedangkan kapang dengan selang yang lebih luas.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa di bagi atas 4 kelompok
b. Tiap kelompok bekerja sesuai dengan petunjuk dosen atau asisten
54
IV. ALAT DAN BAHAN
4.1. Alat :
1.Tabung reaksi biasa
2. pH meter
3. Refrigerator
4. Cawan petri
5. Jarum ose
7. Inkubator
8. Lampu bunsen
9. Pipet 1 ml
4.2. Bahan :
1. MRS A
2. NB
3. NaCl
4. HCL 0,1 N
5. NaOH 0,1 N
6. Biakan E. coli ( 18 jam )
7. Biakan Lactobacillus brevis (18 jam)
8. Biakan Bacillus. cereus (18 jam
9. Spiritus
10. Alkohol
11. Tissu gulung
12. Kapas gulung
V. PELAKSANAAN
Praktikum dilakukan 4 jam pertama dan dilanjutkan 4 jam pada minggu berikutnya
untuk melakukan pengamatan pada suhu dan pH yang berbeda
5.1 Pengaruh Suhu terhadap pertumbuhan :

1. Isi tabung reaksi dengan 3 ml ( sebanyak 4 bh ), untuk masing media /
biakan bakteri, kemudian di sterilisasi.
3. Dinginkan sampai T 40o C, dan inokulasi masing – masing tabung dengan
biakan E coli. B cereus L. brevis (0,1 ml /2 ose ).
4. Vortek atau aduk hingga homogen dan inkubasi pada T 5o C, 25o C
55
(suhu ruang), 37o C, 45o C.
4. Amati pertumbuhan pada tiap–tiap tabung setelah inkubasi 2 – 7 hari.
5. Buat tabel pengamatan dengan menggunakan tanda untuk pertumbuhan
+++ = tumbuh luar biasa ++ : tumbuh baik + = tumbuh sedikit
- = tidak ada tumbuhan ( kekeruhan ). Buat kesimpulan
5.2 Pengaruh pH :
1. Isi tabung 4 cawan steril dengan media MRSA / NA yang sudah diatur pHnya
hingga 3, 5, 7, 9. Biarkan membeku.
2. Bagi cawan atas 3 daerah kuadran, dengan menggunakan ose steril inokulasikan
setiap cawan petri dengan biakan bakteri.
3. Beri nama tiap–tiap cawan dengan nama mikroba yang diinokulasikan.
4. Inokubasi terbalik pada T 37o C, amati pertumbuhan setelah 2–7 hari.
5. Buat tabel pengamatan sama dengan diatas
6. Buat kesimpulan dari hasil pengamatan saudara

Tugas :
1. Buatlah bagan alir cara kerja uji pertumbuhan mikroba pada suhu dan pH
berbeda dan dikumpul sebelum praktikum dimulai
2. Lakukan pengamatan setelah 2 hari inkubasi, 3 hari 5 hari, 7 hari dan 15 hari.
Catat hasil pengamatan sdr dalm buku log book.
Pertanyaan :
1. Buatlah kelompok bakteri berdasarkan suhu dan pH dan berikan tiga
contoh masing-masingnya.
2. Untuk apa dilakukan pengelompokkan bakteri dan apa hubungannya
dengan pengolahan makanan dan pengawetan
56
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Tabel 8. Data pertumbuhan bakteri pada berbagai suhu dan pH Berbeda
No Pengamatan E. coli Lactobacillus Bacillus cereus

1 Suhu ( o C) 5
25
37
45
2 pH
3
5
7
9
VII. DAFTAR PUSTAKA



York.
57
Latihan No. : 12 (Dua belas)
Pokok Bahasan : Analisa Kuantitatif Mikroba
Sub Pokok Bahasan : Penghitungan massa Sel Secara Langsung
Judul Praktek : Hitungan Mikroskopis Langsung dengan
Hemasitometer
No .Kurikulum : 6.1

Mahasiswa mampu mempraktekkan cara penentuan jumlah bakteri dengan
metoda langsung dan penentuan jumlah spora kapang dan kamir dengan hemasitometer
II. TE O R I
Pengukuran kuantitatif mikroba terdiri dari dua pengukuran dasar yaitu :
penentuan jumlah jumlah sel dan penentuan massa sel. penentuan jumlah sel dilakukan
dengan metode hitungan cawan (plate count ), hitungan mikroskopis langsung (DMC)
atau dengan bantuan “Coloni counter “. metode MPN.
Penghitungan dengan metode DMC atau Breed sering digunakan untuk
menghitung mikroba pada susu yang mengandung mikroba dalam jumlah tinggi
khususnya susu yang berasal dari sapi yang mastitis. Metoda ini tidak bisa diterapkan
untuk susu yang telah dipasteurisasi karena sulit membedakan bakteri yang masih hiduap
atau mati. Luas areal pandang mikroskop harus ditentukan terlebih dahulu menggunakan
mikrometer yang dilihat melalui lensa minyak immersi.
Metoda hitungan langsung dapat juga digunakan untuk menghitung spora kapang
atau jumlah sel khamir dengan menggunakan Hemasitometer dengan bantuan mikroskop.
keuntungannya : pekerjaan cepat tidak membutuhkan banyak peralatan. Kelemahannya:
tidak bisa dibedakan antara sel hidup dan sel mati hasil yang diperoleh adalah berupa
total jumlah sel yang ada dalam populasi, kelemahan lain adalah sulit untuk menghitung
sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri, kadang–kadang sel sering bergerombol
dan sukar membedakan sel-sel individu.
Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung
terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi
25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16
kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari
58
ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume
ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa dibagi atas 4 kelompok.
b. Tiap kelompok bekerja sesuai dengan petunjuk dosen atau asisten.
IV. ALAT DAN BAHAN

4.1. Alat :
1. Hemasitometer
2. Pipet pasteur
3. Bunsen
4.2 Bahan :
1. Suspensi khamir
2. Suspensi kapang
3. Tissu gulung
4. Alkohol
V. PELAKSANAAN
a. Menghitung jumlah spora atau sel dalam media padat
1. Sel spora dipanen dengan cara menuang 5 ml aquades ke dalam cawan biakan sambil
digosokan batang gelas bentuk L, kemudian suspensi sel dipipet dan masukkan ke
dalam gelas erlenmeyer 50 ml. Pemanenan diulangi sampai didapatkan 20 ml
suspense.
2. Haemocytometer dibersihkan dengan menggunakan alcohol sampai benar-benar
bersih, kemudian dikeringkan.
3. Suspensi spora dikocok kemudian dipipet dan diteteskan pada haemocytometer tepat
pada ruang hitungnya, sebanyak satu tetes.
4. Tetesan suspensi ditutup menggunakan gelas penutup dan dijaga agar tidak menjadi
gelembung udara dalam kotak-kotak haemocytometer
5. Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop dan dihitung jumlah sel dalam
setiap kotak. Jika antar kotak jumlahnya tidak seragam, ulangi langkah ke3 (dikocok
lagi)
6. Pada praktikum dihitung dari 3-9 (ganjil) kotak ruang hitung, kemudian dirata-rata
dan dihitung jumlah sel setiap koloninya.(Gambar 13)
59
b. Penghitungan sel kamir
1. Bersihkan permukaan hitung hemasitometer dengan kertas lensa yang telah

dibasahi dengan aquades steril. Begitu juga dengan cara penutup
2. Letakkan kaca tutup hemasitometer diatas permukaan hitung hemasitometer
3. Kocoklah suspensi khamir dan dengan menggunakan pipet pasteur ambil suspensi
sebanyak 0,1 ml – 0,5 ml
4. Kemudian ujung pipet pasteur pada lekukan berbentuk V pada tipe kaca penutup
hemasitometer. Usahakan tidak ada cairan masuk diantara kaca tutup dan
penyangga. Kedalaman cairan harus tepat 0,1 mm
5. Letakkan hemasitometer diatas pentas mikroskop. Amati dengan objektif
berkekuatan rendah dan hitung jumlah sel yang terdapat pada 80 buah kotak
kecil yang terletak didalam kotak bagian tengah.
6. Penghitungan mikroskopis dilakukan dengan pertolongan kotak-kotak skala
seperti pada gambar berikut dan gambar lengka hemasitometer dan skalanya
pada Gambar 11
7.
60
Gambar 11. Pembagian Neubauer pada hemasitometer memperlihatkan garis-
garis pembagian pada kotak tengah yang berukuran 1 mm2
(keempat sisi dibatasi oleh garis ganda)
Semua dari 25 kotak besar dapat dihitung, atau suatu pola penghitungan dengan
menggunakan jumlah kotak yang lebih sedikit dapat digunakan sepeti pada gambar di
atas
Contoh perhitungan
Kotak 1= 6 sel
Kotak 2= 4 sel
Kotak 3= 6 sel
Kotak 4= 10 sel
Kotak 5= 8 sel
Kotak 6= 3 sel
Kotak 7= 5 sel
Kotak 8= 5 sel
Kotak 9= 5 sel
Perhitungan :52/9=5,77 sel
Jumlah spora dalam satu cawan=416,6 juta sel
1.Perhitungan
Menghitung Spora Atau Sel
Rata-rata kotak kecil berisi =5,77 sel
Volume satu kotak kecil =0,05mm x 0,05mm x 0,1mm
0,05mm x 0,05mm x 0,1mm =5,77 sel

25 x 10-5 mm3 =5,77 sel
1 mm3 =5,77 sel/25x10-5
=5,77 x 105/25 sel
1 mm 3
= 23080 sel
61
Jadi dalam 1 ml suspensi =1 cm3x23080 sel
=10 mm x 10 mm x 10 mm x23080 sel
=23.080.000 sel
=23,08 juta sel
=23,08x106 sel
Maka pada hasil panen 20 ml suspensi atau dalam satu cawan berisi
20 x 23,08.106 sel =461,6 . 106
=46,16 . 107
=461,6 juta sel

Tugas :
1. Buatlah bagan alir kerja sesuai judul parktikum saudara dan dikumpulkan sebelum
praktikum dimulai.
2. Lakukan pengamatan terhadap sampel yang disediakan, untuk 1 sampel dihitung oleh
semua anggota kelompok kemudian dirata-ratakan. Catat hasil pengamatan sdr
hitung sebagai laporan sementara dan dikumpulkan seteah selesai praktikum.
Pertanyaan :
1. Apakah sel yang mati bisa juga dihitung jumlahnya, berikan alasan sdr !
2. Apa keuntungan dan kerugian metoda ini!
62
VI. LEMBARAN PENGAMATAN
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
1. Jumlah sel khamir rata-rata
- khamir I :
- khamir II :
2. Spora kapang
- Kapang 1 :
- kapang II :
63
VII. DAFTAR PUSTAKA


Harigan, W.F., and McCance, Margaret E. 1976. Laboratory Methods in Food and Dairy
Kusumaningrum, HD., Suliantari, S. Nurjanah, RD-Hariyadi, dan CC Nurwitri. 2009.

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Departemen Ilmu dan Teknologi
Pangan. Fakultas Teknologi Pertanian. IPB.
64
Latihan No : 13 (Tiga Belas)
Pokok Bahasan : Analisa kuantitatif mikroba
Sub Pokok Bahasan : Penghitungan Massa Sel Secara Langsung
Judul Praktikum : Penghitungan Jumlah Mikroba Dengan Metoda
Turbidimetri
Alokasi Waktu : 4 X 50 menit
Mahasiswa mampu mempraktekkan Analisa Kuantitatif mikroba dengan melihat

kekeruhan pada alat spektrofotometer dan membandingkannya dengan metoda hitungan
cawan.
II. T E O R I
Metode ini biasa digunakan untuk mengukur massa sel. Prinsipnya adalah bahwa
sesuatu populasi sel dalam medium cair akan menahan atau memancarkan cahaya
sebanding dengan total massanya (konsentrasi sel) dalam biakan. Dengan metode ini kita
mengukur persen sinar yang diabsorpsi oleh suspensi bakteri. Jumlah sel yang
dipantulkan atau diteruskan pada saat diukur. Alat yang sering digunakan adalah
spektrofotometer.
Jumlah sinar yang diabsorpsi dinyatakan dalam OD (Opical Density). OD
berbanding lurus dengan konsentrasi sel. Sebelum alat tersebut digunakan untuk
mengukur sampel, terlebih dahulu dikalibrasi dengan cairan yang sama dengan untuk
menumbuhkan organisme yang bersangkutan.
Untuk memperoleh korelasi antara konsentrasi sel dengan OD suatu biakan
tertentu, dapat digunakan metode hitungan cawan atau menghitung konsentrasi sel
dalam biakan tersebut. Contoh biasanya di encerkan terlebih dahulu, kemudian dihitung
nilai OD kemudian dibuat kurva hubungan antara nilai OD dan jumlah mikroorganisme.
III. ORGANISASI
a. Mahasiswa di bagi dalam 5 kelompok
b. Tiap kelompok memperhatikan demonstrasi dan penjelasan dari dosen atau asisten
65
IV. ALAT DAN BAHAN
4.1 Alat :
2. Petridish steril
3. Sprektofotometer
4. Cuvet spektro disposible
5. Pipet 5 ml
6. Tabung reaksi tak bertutup
7. Lampu bunsen
4.2 Bahan :
1. Biakan E. coli umur 18 jam
2. Nutrien broth (NB)
3. Tissu gulung
4. Keras label
5. Biakan Lactobacillus
6. MRS broth
7. Alkohol
8. N A
9. NaCl
10. Kertas grafik
V. PELAKSANAAN
1. Hidupkan spektrofotometer dan tetapkan OD 620 nm
2. Lakukan pengenceran biakan bakteri dengan cara :
Siapkan tabung reaksi dan isi dengan NA dan MRSB steril masing – masing
sebanyak 3 ml kedalam 4 tabung reaksi. Beri tanda tabung reaksi 1: 2, 1 : 2,
1:8, 1:16
3. Kocok suspensi bakteri dengan pipet yang sama pindahkan 3 ml ke dalam
tabung 1 : 1 ( tanpa pengenceran ) 1 : 2 ( 1:4 1:8 1:16 )
4. Campurkan isi tabung hingga homogen, pindahkan sebanyak 3 ml dari tabung
1:2 ke tabung 1:4 dan seterusnya sampai 1:16
5. Lakukan kalibrasi dengan menggunakan larutan yang sama, untuk blanko
66
6. Keluarkan kawat dan 1 kawat diisi dengan biakan bakteri 1:2, lakukan
pengukuran OD secara bergantian.
7. Setiap selesai pengukuran masing pengenceran, larutan dibuang dan di bilas
dengan larutan yang digunakan untuk menumbuhkan mokroorganisme )
8. Catat hasil pengukuran saudara
9. Tanam biakan hasil pengenceran pada media NA / MRS, dengan metode tuang
pada cawan petri steril, inkubasi T 37oC, 24 – 28 jam

Tugas :
1. Buatlah bagan alir kerja sesuai judul praktikum saudara dan dikumpulkan
2. Untuk mendapatkan hasil yang akurat setiap sampel yang diukur harus
ditanamkan pada media agar cawan.
3. Kemudian bandingkan hasil dari ke dua pengamatan tersebut nyatakan hasil
penghitungan secara Stándar Plate Count (SPC), (Lihat Praktikum 14)
Pertanyaan :
1. Menurut pendapat saudara manakah yang paling akurat dari ke dua cara
penghitungan mikroba yang telah saudara bandingkan tersebut?
2. Dapatkah cara ini diterapkan untuk produk makanan sehingga hasilnya dapat
diketahui dengan pasti dan cepat.
67
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Tabel 9. Nilai OD hasil pengukuran dan setelah plating bakteri Lactobacillus
Pengenceran/sampel OD Jumlah mikroorganisme / ml 
1:1
1:2
1:3
1:6

Hasil dari hitungan metode cawan
Tabel 10. Nilai OD hasil pengukuran dan setelah plating bakteri patogen
Pengenceran/sampel OD Jumlah mikroorganisme / ml 
1:1
1:2
1:3
1:6
VII. DAFTAR PUSTAKA
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan [Petunjuk Laboratorium].

Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat
Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Pangan Dan Gizi. Institut
Pertanian Bogor.
Fardiaz, S. 1993. Mikrobiologi Pengolahan Pangan [Penuntun Praktek).

Program Studi Ilmu Pangan Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian
Bogor.
Harigan, W.F., and McCance, Margaret E. 1976. Laboratory Methods in

York.

Jakarta.
68
Latihan No : 14 (Empat Belas)
Sub Pokok Bahasan : Penghitungan Massa Sel Secara Tidak langsung
Judul Praktikum : Analisa Kuantitatif Mikroba Dengan Metode
Plate Count (Hitungan Cawan)
Mahasiswa mampu melakukan analisa kuantitatif mikroba dengan metoda

hitungan cawan serta cara pelaporannya.
II. T E O R I
Prinsip metode penghitungan dengan “Plate Count “ adalah menumbuhkan sel
mikroba yang masih hidup pada media tertentu sebahagian membentuk koloni yang dapat
dilihat dengan mata atau mikroskop selain untuk penghitungan jumlah sel
mikoorganisme, dapat juga digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikoorganisme.
Metode Plate Count ada 2 yaitu : Metode tuang (pour plate) dan metode
permukaan (Spread Plate). Jumlah mikoorganisme yang ada dalam sampel tidak diketahui
dengan pasti, maka harus dilakukan sederet pengenceran dan pencawanan. Untuk
memperoleh syarat statistik, jumlah koloni pada cawan yang di hitung antara 30 – 300
koloni. Menurut FDA Baccteriological Analytical Manual/BAM (1998) merekomendasikan
25-250 koloni/cawan sebagai kisaran hitung secara keseluruhan. Jumlah organisme yang
terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan jalan mengalikan jumlah koloni yang
terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Pelaporan batas
atas kisaran hitung disebut juga TNTC (Too Numerous To Count) sebagai lebi besar dari
batas atas, misalnya >250 CFU dari cawan pengenceran 1/10 maka pelaporannya adalah
>2500 CFU/ml (g) dan untuk batas bawah ditulis <250 CFU/ml (g), dan jika tidak ada
yang tumbuh pada pengenceran 1/10 dilaporkan <10 CFU/ml (g). CFU=Colony Forming
Unit Untuk data yang TNTC dibuat jumlah yang diperkirakan EAPC= Estimated Aerobic
Plate Count untuk angka hasil penghitungan.
Metode pour plate dilakukan dengan mengambil 0,1 / 1 ml sampel yang telah
diencerkan ke dalam cawan steril, kemudian diikuti dengan penuangan medium yang
bersuhu 45 – 47o C sebanyak 12 – 15 ml sedangkan metode spread plate agar steril
dituangkan ke dalam cawan steril biarkan membeku, kemudian masukkan 0,1 ml sampel
69
yang telah diencerkan dan diratakan dengan hockey stick atau pipet melengkung steril.
Inkubasi 24 – 48 jam pada suhu 37oC setelah inkubasi lakukan penghitungan jumlah
koloni dengan cara yang telah ditetapkan
III. ORGANISASI
IV. ALAT DAN BAHAN
4.1 Alat :
1. Cawan petri steril
2. Tabung reaksi biasa & bertutup
3. Erlenmeyer 250 ml/ 125 ml
4. Gelas piala 250 / 500 ml
5. Pipet mikro 1 ml
7. Lampu bunsen
8. Inkubator
9. Oven
10. Autoclave
4.2 Bahan :
1. 4 jenis makanan jajanan
2. 4 Jenis minuman jajanan
3. NaOH
4. PDA
5. As tartarat 10 %
6. KH2 PO4
7. PCA
8. Nutrient agar ( NA )
9. Tissu gulung
10. Aluminium foil
11. Label
12. Aquades
13. Kapas gulung
14. Alkohol
70
V. PELAKSANAAN
5.1. Metode Pour Plate
1. Siapkan tabung reaksi berisi larutan pengencer steril dengan volume 9 ml, atau
45 ml, atau 99 ml dan atau 90 ml
2. Timbang bahan/sampel sebanyak 1 gr : 9 ml pengencer, 5 gr ke dalam 45 ml
atau / 10 gr : 90 ml pengencer ( pengenceran 10-1 ).
3. Kocok hingga homogen, kemudian ambil 1 ml dari 10-1 masukkan ke dalam 9 ml
pengencer sehingga di dapat pengenceran 10-2
4. Lakukan proses ini sampai pengenceran 10-6, jika di duga jumlah
mikroorganisme dalam sampel banyak (atau sesuaikan dengan kondisi sampel)
5. Kemudian pipet 1 ml dari masing–masing dari dua pengenceran terakhir
masukkan ke dalam cawan petri steril. Untuk menghemat penggunaan larutan
pengencer dan pipet, contoh yang akan dipipet sebagai pengenceran terakhir
(tertinggi) diambil sebanyak 0.1 ml dari pengenceran satu desmal dibawahnya
(10-5) dengan menggunakan pipet yang sama juga.
6. Kemudian tuangkan media agar PCA sebanyak 12 – 15 ml yang sudah
didinginkan hingga mencapai suhu 45 OC ± 1 oC ke dalam masing-masing cawan
yang sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur sempurna
lakukan pemutaran cawan ke depan ke belakang dan ke kiri-ke kanan
goyangkan diatas meja atau seperti angka delapan.
7. Setelah agar mengeras, cawan diinkubasi selama 24 – 48 jam ± 2 jam pada
suhu 35o C, inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisis terbalik dalam
inkubator.
8. Untuk bahan cair dengan sebanyak 1 ml sampel dimasukkan dalam pengencer
steril 99 ml atau 10 ml sampel dengan pengencer, atau 5 ml ke dalam
pengencer steril 45 ml (disebut sebagai pengenceran 10-1), aduk hingga
homogen.
9. Lakukan pengenceran sesuai dengan kondisi sampel, dengan melakukan
pengenceran sebanyak 1 ml dari pengencer 10-1 dimasukkan dalam pengencer 9
ml, aduk hingga homogen (disebut pengenceran 10-2)
10. Lakukan langkah diatas untuk mendapatkan pengenceran 10-3, 10-4
11. 1 ml dari dua pengenceran terakhir pengenceran 10-3 dan 10-4 tanamkan ke
dalam cawan petri steril
71
12. Kemudian tuangkan media agar yang sesuai sebanyak 12 – 15 ml, goyangkan
diatas meja.
13. Setelah agar mengeras, cawan diinkubasi selama 24 – 48 jam pada T 37o C
(cara pengeneran dapat dilihat pada Gambar 12)
14. Kemudian hitung cawan-cawan yang mempunyai jumlah koloni 25-250, lakukan
penghitungan mikroorganisme dengan banntuan "colony counter"
15. Perhitungan mikroorganisme dilakukan menurut ketentuan SPC (lihat lampiran)
16. Kemudian masukan ke dalam rumus perhitungan
Jumlah koloni/gr/ml = jumlah mikroba pada cawan (sesuai SPC) x 1

Fp
Fp = faktor pengenceran
Perhitungan Angka Lempeng Total sebagai berikut (Metoda BAM):
∑C
N = -------------------------------------
[(1 x n1) + (0,1 x n2)] x (d)
Dengan :
N adalah jumlah koloni produk, dinyatakan dalam koloni per ml atau koloni per g.
∑C adalah jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung
n1 adalah jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung
n2 adalah jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung
d adalah pengenceran pertama yang dihitung.
Contoh perhitungan pada Lampiran
72
Gambar 12. Analisa kuantitatif metoda pour plate
II. Metode Spread Plate ( permukaan )

1. Terlebih dahulu cawan petri steril diisi dengan media agar dan dibiarkan sampai
beku. Gunakan cawan duplo untuk setiap pengenceran
2. Buatlah pengenceran seperti Gambar 12 dengan jumlah engenceran yang sudah
ditetapkan.
3. Pipet 0.1 ml contoh yang telah diencerkan masing-masing ke dalam dua cawan
agar, dimulai dari pengenceran terndah yang telah ditetapkan.
4. Celupkan batang gelas melengkung ( hockey stick ) ke dalam alkohol lalu
pipijarkan dan didinginkan ratakan sampel diatas Media agar dalam cawan.
3. Inkubasi semua cawan dalam inkubator selama 24-48 jama pada suhu
37o C secara terbalik (cara keja dapat dilihat pada Gambar 13)
4. Lakukan penghitungan jumlah bakteri dalam “ total count “
73
dengan syarat jumlah mikroorganisme dalam cawan 30 – 300 koloni atau 25-250
koloni dengan menggunakan standar plate count (SPC). Lakukan juga
penghitungan dan laporkan jika koloni kurang dari 30 koloni atau lebih dari 300
koloni atau <25 atau >250. Kemudian dikalikan dengan 10 karena nyang
ditanamkan 0.1 ml.
Gambar 13. Analisa kuantitatif metoda pour plate
TUGAS
1. Lakukan pewarnaan gram untuk setiap cawan yang ditanam, dimana sampel
boleh diambil 1 koloni dalm 1 cawan.
2. Kira-kira mikroba apa yang terkandung pada setiap produk yang telah saudara
amati. Laporkan hasil sdr.
3. Buat bagan alir cara kerja yang saudara lakukan untuk satu sampel dan
dikumpulkan sebelum praktikum dimulai
Pertanyaan :
1. Kenapa kita harus melakukan pengenceran terhadap sampel yang akan diuji,
dan bagaimana cara sdr untuk memperkirakan banyaknya
pengenceran yang akan sdr lakukan.
2. Sampel telur yang dibungkus oleh kulit, atau bahan pangan yang sudah dikemas
kenapa masih terdapat mikroba? Dan dari manakah asalnya.
3. Kenapa sampel sari buah lebih banyak mengandung khamir dari pada
bakteri.
74
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Tabel 11. Jumlah dan total bakteri pada sampel makanan
Pengenceran
Sampel Jumlah mikroorganisme (CFU/g)
10-4 10-5
A
Tabel 12. Jumlah dan total bakteri pada sampel minuman
Pengenceran
Sampel Jumlah mikroorganisme (CFU/ml)
10-4 10-5
A
75
VII. DAFTAR PUSTAKA

Program Studi Ilmu Pangan Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian
Bogor.
Harigan, W.F., and McCance, Margaret E. 1996. Laboratory Methods in

Food and Dairy Microbiology. 2rd Ed Academic Press. London, Orlando, Tokyo,
New York.
Yousef, A.E. and C. Carlstrom. 2003. Food Microbiology A Laboratory Manual. John
Wiley & Sons, New Jersey
76
Latihan No : 15 (Lima Belas)
Sub Pokok Bahasan : Penghitungan Massa Sel Secara Tidak langsung
Judul Praktikum : Analisa Kuantitatif Mikroba dengan Metoda MPN
(Most Probable Number)

Mahasiswa mampu mempraktekkan analisa kuantitatif mikroba dengan metoda MPN
untuk bahan cair atau air.
II. T E O R I
Metoda MPN (Most Probable Number) atau dikenal juga dengan ANgka Paling
Mungkiin (APM) merupakan salah satu cara menentukan banyaknya mikroba secara tidak
langsng. Dalam metoda ini digunakan medium cair ( broth ) di dalam tabung reaksi,
dimana perhitungan didasarkan pada jumlah tabung yang positif yaitu tabung yang sudah
ditumbuhi mikroba setelah dilakukan inkubasi. Pada setiap tahap pengenceran digunakan
3 atau 5 seri tabung semakin banyak tabung maka semakin tinggi ketelitian. Lakukan
pengenceran sehingga di harapkan ada tabung yang mengandung satu sel mikroba dan
setelah inkubasi terjadi pertumbuhan (positif), sedangkan tabung lainnya negatif
Untuk setiap tahap pengenceran digunakan tiga (3) seri tabung. Setelah inkubasi
terlihat pertumbuhan mikroba yang ditandai dengan kekeruhan, perubahan warna dan
adanya gas dalam tabung Durham untuk mikroba pembentuk gas. Kombinasi
pengenceran yang di pilih dimulai dari pengenceran terakhir dimana semua tabung
menghasilkan reaksi positif, kemudian diambil 2 pengenceran berikutnya. Jika pada
pengenceran ke 4 masih didapatkan tabung yang positif, maka jumlah tabung yang positif
tersebut harus ditambahkan pada nilai kombinasi yang ke 3 (terakhir). Kombinasi nilai
MPN untuk mencari nilai MPN menggunakan tabel untuk masing–masing seri yang
digunakan.
Metoda MPN digunakan untuk uji kualitas air atau produk pangan baik yang
berbentuk cair atau padat dengan terebih dahulu membuat suspense 1:10 dari contoh.
Jika diprediksi jumlah mikroba pada sampel sangat rendah maka jumlah contoh yang
diambil dari sampel (pengenceran 100 = tanpa pengenceran) adalah 10 ml dan 1 ml, dan
untuk pengenceran selanuutnya (10-1) adalah 1 ml dan seterusnyajuga 1 ml. Media yang
digunakan untuk uji ini adalah LB atau BGLBB.
77
III. ORGANISASI
IV. ALAT DAN BAHAN

4.1. Alat :
2. Lampu bunsen
4. Tabung reaksi tidak bertutup
5. Pipet mikro 1 ml
6. Tabung durham
4.2 Bahan :
1. Es campur
2. Es tebu atau serut
3. Jus sirsak/pokat
4. Air minum
5. Air sumur
6. Lactose broth (LB)
7. Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)
8. Kapas gulung
9. Spiritus
10. Alkohol
11. Tissu gulung
V. PELAKSANAAN
1. Setiap kelompok menyediakan tabung reaksi yang telah berisi media steril
Lactose broth 9 tabung atau BGLBB 12 tabung
2. Untuk air minum pipet sampel 10 ml masukkan ke dalam 3 seri tabung LB.
3. Kemudian di pipet 1 ml sampel dandimasukkan ke dalam 3 tabung LB
4. Pipet 1 ml sampel masukkan kedalam pengenceran 9 ml , kemudian inokulasikan
ke dalam 3 seri tabung dengan contoh sebanyak 1 ml
5. Untuk minuman, lakukan pengenceran sampel sampai 10-5 dengan
memindahkan sebanyak 1 ml aduk hingga homogen.
78
6. Selanjutnya pipet sebanyak 1 ml ke dalam 3 seri tabung tabung BGLB untuk
masing – masing pengenceran mulai dari pengenceran 10-2. 10-3. 10-4. 10-5.
7. Semua tabung dinkubasi pada T 35 – 37o C selama 24 – 48 jam.
8. Catat jumlah tabung yang positif dari masing–masing pengenceran 10o, 10-1, 10-
2
, 10-3, 10-42. 10-5. yang ditandai dengan timbulnya gas, perubahan warna atau
kekeruhan pada media. Cocokkan dengan tabel MPN, dan laporkan MPN count
per 100 ml contoh menggunakan rumus :
Nilai MPN x 1
Fp ditengah

Tugas :
1. Buatlah bagan alir uji MPN dan dikumpulan sebelum praktek dimulai
2. Buatlah pembahasan yang lengkap dari data yang saudara peroleh
Pertanyaan :
1. Jelaskan kenapa pada pengujian sampel minuman pada minuman digunakan
medium BGLB, jelaskan jawaban sdr. Bagaimana jika digunakan LB?
2. Bagiamana menurut sdr sampel minuman isi ulang yang sekarang banyak
beredar, apakah sudah terjamin keamanannya? Jelaskan jawaban sdr!
79
Judul praktikum :
Tanggal praktikum :
Paraf Pembimbing :
Tabel 13. Jumlah tabung positif pada sampel air minum
Seri 1 Seri 2 Seri 3

Sampel
100 10-1 10-2 100 10-1 10-2 100 10-2 10-2
A
B
C
D
E
Tabel 14. Total Nilai MPN pada sampel air minum ( Analisa kualitatif)
Nilai MPN
Sampel Total Nilai MPN/ 100 ml
A
B
C
D
E
80
Tabel 15. Jumlah tabung positif pada sampel minuman
Seri 1 Seri 2 Seri 3

Sampel
10-2
10- 2
10- 3
10-4
10
-2
10- 2
10- 3
10
-4
10
-2
10-2 10-3 10-4
A
B
C
D
E
Tabel 16. Total Nilai MPN pada sampel minuman ( Analisa kualitatif)
Nilai MPN
Sampel Total Nilai MPN/ 100 ml
A
B
C
D
E
VII. DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan [Petunjuk Laboratorium].
Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat
Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Pangan Dan Gizi. Institut
Pertanian Bogor.

Program Studi Ilmu Pangan Program Pasca Sarjana.
Institut Pertanian Bogor.

Food and Dairy Microbiology. 2rd Ed. Academic Press. London, Orlando, Tokyo,
New York.
Hadioetomo, RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT.

Gramedia Jakarta.
Jenie, BSl., S. Fardiaz. 1989. Uji sanitasi dalam Industri Pangan.

Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral
Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Bogor:
IPB.
Yousef, A.E. and C. Carlstrom. 2003. Food Microbiology A Laboratory Manual. John
Wiley & Sons, New Jersey
81
Lampiran 1. Tata cara penghitungan mikroorganisme Plate Count (hitungan
cawan)/ Angka Lempeng Total (ALT)
A.Plate Count (hitungan cawan)/Angka Lempeng Total (ALT)
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut :

- Satu koloni dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2
koloni.
- Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidak
dihitung
- Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1
koloni.
Catatan : Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel
mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu
cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal
tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml.
CFU / ml (g) = jumlah koloni X 1/faktor pengenceran
A.Standard Plate Count (SPC)
Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat sebagai berikut
:
1. Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni.

> 300 = TNTC (Too Numerous To Count) atau TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung).
< 30 = TFTC (Too Few To Count).
10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan

234 28 5 2,3 x 104 28 dan 5 <
30
658 125 15 1,3 x 105 658,> 300
TNTC TNTC 135 1,4 x 106 TNTC>300
2. Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan angka
sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial), misal 2,3 x 104
bukan 2,34 X 104. pembulatan keatas dilakukan pada angka seperseratus yang sama
atau lebih besar dari lima, missal 2,35 X 104 menjadi 2,4 X 104, atau 2,34 X 104
menjadi 2,3 X 104.
82
3. Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran, maka hanya dari
pengenceran terendah yang dilaporkan.

23 15 5 2,3 x 103 semua < 30
4. Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran, maka laporannya adalah
300 dikali 1/ faktor pengenceran dengan menuliskan hasil yang sebenarnya dalam
tanda kurung. (hasil yang sebenarnya diperoleh dari pengenceran tertinggi).

TNTC TNTC 358 3,0 x 106 Pengenceran tertinggi (
(3,6 x 106) 104)
TNTC 328 5 3,3 x 105 Pengenceran tertinggi (
(3,3 x 105) 103)
6. Bila ada 2 cawan, masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang berurutan
dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni pengenceran tertinggi
dan terendah ≤ 2, maka jumlah yang dilaporkan adalah nilai rata-rata. Jika hasil bagi
dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2 maka jumlah yang dilaporkan adalah dari
cawan dengan pengenceran terendah.
7. Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo), maka jumlah angka yang
digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah masing-masing tingkat pengenceran
setelah diperhitungkan. Untuk lebih mudahnya dihitung vertikal (dalam satu tingkat
pengenceran) dahulu kemudian horisontal (antar pengenceran). Jika dalam satu
tingkat pengenceran dijumpai hanya salah satu yang masuk dalam kisaran 30-300,
maka nilai yang tidak masuk tetap diperhitungkan
83
Bagan untuk mempersingkat syarat SPC
B.Standard Plate Count (SPC) Metoda BAM
a). Cawan yang mengandung jumlah 25 koloni-250 koloni dan bebas spreader.
Catat pengenceran yang digunakan dan hitung jumlah total koloni. Perhitungan Angka
Lempeng Total sebagai berikut :
∑C
N = -------------------------------------
[(1 x n1) + (0,1 x n2)] x (d)
Dengan :
N adalah jumlah koloni produk, dinyatakan dalam koloni per ml atau koloni per g.
∑C adalah jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung
n1 adalah jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung
n2 adalah jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung
d adalah pengenceran pertama yang dihitung.
CONTOH :
Pengenceran 1:100 1:1000
Jumlah Koloni 232 dan 244 33 dan 28
(232 + 244 + 33 + 28)

N = -------------------------------------
[(1 x 2) + (0,1 x 2)] x (10-2)
= 537 / [(2 + 0,2)] x (0,01)

= 537 / (2,2 x 0,01)
= 537 / 0,022
= 24.409
84
= 24.000
= 2.4 x 104 kol/g
b) Jumlah koloni semua cawan kurang dari 25 koloni atau cawan tanpa koloni.
Bila cawan duplo dari pengenceran terendah menghasilkan koloni kurang dari 25, hitung
jumlah yang ada pada cawan dari tiap pengenceran. Rata-ratakan jumlah koloni per
cawan dan kalikan dengan faktor pengenceran untuk menentukan ALT yang
diperkirakan. Tandai ALT dengan tanda bintang ( pada Tabel no. 3) untuk menandai
bahwa penghitungan diluar 25-250 koloni per cawan.
c) Cawan dengan jumlah koloni lebih besar dari 250

Bila jumlah koloni per cawan lebih besar dari 250 pada seluruh pengenceran, hitung
koloni-koloni pada cawan untuk memberikan gambaran penyebaran koloni secara
representative. Tandai penghitungan ALT dengan tanda bintang untuk menandai bahwa
penghitungannya diluar 25-250 koloni per cawan (Tabel no. 4).
d) Spreaders
Penyebaran koloni biasanya dibagi dalam 3 bentuk :
1. Rantai koloni, tidak terlalu kelihatan terpisah, karena disintegrasi rumpun bakteri.
2. Terbentuk lapisan air antara agar dan dasar cawan.
3. Terbentuk lapisan air pada air sisi atau permukaan agar
Bila cawan yang disiapkan untuk contoh lebih banyak ditumbuhi oleh spreader seperti (1)
area ditutupi oleh spreader, termasuk total area yang melebihi 50% pertumbuhannya
lebih dari 25% laporkan cawan spreader.
Rata-rata jumlahnya untuk pengenceran, laporkan jumlahnya sebagai ALT aerob (Tabel
no.5). Jika perlu menghitung cawan yang berisi spreader yang tidak dibatasi oleh (1) dan
(2) dapat dihitung tiga bentuk spreader sebagai satu pertumbuhan. Untuk tipe pertama,
bila hanya terdapat satu rantai, hitunglah sebagai koloni tunggal. Bila ada satu atau lebih
rantai yang terlihat dari sumber lain, hitung tiap sumber itu sebagai satu koloni. Jangan
menghitung tiap individu dalam rantai sebagai koloni yang terpisah. Tipe 2 dan 3
biasanya dihasilkan dalam bentuk koloni dan dihitung sebagai koloni. Gabungkan
perhitungan koloni dan penghitungan spreader untuk menghitung ALT.
e) Cawan tanpa koloni

Bila cawan dari semua pengenceran tidak menghasilkan koloni, laporkan ALT sebagai
kurang dari 1 kali pengenceran terendah yang digunakan. Tandai ALT dengan tanda
bintang bahwa penghitungannya diluar 25-250 koloni (Table no.6).
f). Cawan duplo satu dengan 25-250 koloni dan yang lain lebih dari 250 koloni.
Hitung kedua cawan termasuk yang lebih dari 250 koloni dalam penghitungan ALT (Tabel
no.7).
g). Cawan duplo satu cawan dari tiap pengenceran dengan 25-250 koloni.
Bila 1 cawan dari tiap pengenceran menghasilkan 25-250 koloni dan cawan lain
menghasilkan lebih dari 250 koloni atau kurang 25 koloni, hitung keempat (4) cawan yang
termasuk cawan yang lebih dari 250 koloni atau kurang dari 25 koloni dalam
penghitungan ALT (Tabel no.8).
85
h).Cawan duplo kedua cawan dari satu pengenceran dengan 25-250
koloni hanya 1 cawan dari pengenceran yang lain dengan 25-250 koloni.
Bila kedua cawan dari satu pengenceran menghasilkan 25-250 koloni, hitung keempat
(4) cawan yang termasuk cawan yang kurang 25 koloni atau lebih dari 250 koloni dalam
penghitungan ALT (Tabel no. 9).
Pelaporan
1). Bulatkan angka menjadi 2 angka yang sesuai, bila angka ketiga 6 atau diatasnya,
maka angka ketiga menjadi 0 dan dan angka kedua naik 1, misal 456 menjadi 460.
2). Bila angka ketiga 4 atau dibawahnya, maka angka ketiga menjadi 0 ada angka kedua
tetap, misal 454 menjadi 450
3) Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dibulatkan menjadi 0 dan angka kedua
adalah genap, misal 445 menjadi 440.
4) Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dibulatkan menjadi 0 dan angka kedua naik
1 angka misal 455 menjadi 460.
Lampiran 1.
PETUNJUK PENGHITUNGAN ALT
No 10 -2 10 -3 10 -4 ALT/ gram Keterangan
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
Bila hanya 1 pengenceran yang
1  175 16 190.000
berada dalam batas yang sesuai,
 208 17 hitung jumlah rata-rata dari
pengenceran tersebut.
Bila ada 2 pengenceran yang
2  224 25 250.000
berada dalam batas yang sesuai,
 225 30 hitung jumlah masing-masing dari
pengenceran sebelum merata-
ratakan jumlah sebenarnya.
3 18 2 0 1.600 Koloni < 25 : Pengenceran
terendah kurang dari 25, hitung
14 0 0 jumlahnya dan kalikan dengan
faktor pengencerannya. Beri tanda
* (diluar 25-250)
Koloni > 25: hitung koloni yang
4   523 5.100.000
ada/ dapat dihitung
  487 (representatif). Beri tanda * (diluar
25-250)
Bila ada 2 pengenceran diantara
5  245 35 290.000
(25-250) tetapi ada spreader,
 230 Spreader hitung jumlahnya dan kalikan
dengan faktor pengenceran
namun untuk spreader tidak
dihitung.
86
PETUNJUK PENGHITUNGAN ALT
No 10 -2 10 -3 10 -4 ALT/ gram Keterangan
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
6 0 0 0 100 Tanpa koloni: Jumlah ALT adalah
kurang dari 1 kali pengenceran
0 0 0 terendah. Beri tanda * (diluar 25-
250)
Koloni dgn 25-250 koloni dan yang
7  245 23 260.000
lain > 250: Hitung kedua cawan
 278 20 termasuk yang lebih dari 250.
Rata-ratakan Jumlahnya.
Salah satu plate dengan 25-250
8  225 21 270.000
koloni dari tiap pengenceran:
 255 40 Hitung jumlah dari tiap
pengenceran termasuk yang < 25,
lalu rata-rata jumlah yang
sebenarnya.
Hanya satu plate yang
9  220 18 230.000
menyimpang dari tiap
 240 28 pengenceran: Hitung jumlah dari
 260 30 tiap pengencer termasuk yang <
25 atau >250, kemudian rata-rata
 230 28
dari jumlah yang sebenarnya.
Catatan :
1. Koloni yang dihitung dalam batas 25-250 koloni.
2. Perhitungan angka:
a. Bila angka ketiga dari kiri ≥ 5, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua naik 1
angka.
b. Bila angka ketiga dari kiri ≤ 4, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua tetap.
87
Lampiran 2. Penghitungan mikroba dengan Most Probable Number (MPN) atau
Angka Paling Mungkin (APM)
Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air
khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama
sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak
membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam
waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3
atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3,
dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri.
Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan
ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk
sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth)
yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan
Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada
media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar
laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr.
Berdasarkan sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa

menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung
durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas)
tiap serinya setelah diinkubasi. (tanpa pengenceran contoh)
Cara kerja :
1· Sediakan 3 tabung berisi LB/BGLB (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung
berisi LB/BGLB (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham.
Atur ke sembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar).
2. Kocok botol yang berisi air sampel.
88
3. Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama
(3 tabung LB/BGLB), secara aseptis.
4· Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua
5· Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 0,1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga
6· Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam.
7· Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung
positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1).
Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga
diperoleh jumlah mikroba sebenarnya/100ml.
89
Misal :
Didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah
150 sel/100 ml.
90

DDMP (TP - Semseter II)

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

DDMP (TP - Semseter II)

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

BUKU KERJA PRAKTIK MAHASISWA

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PANGAN

Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, karena dengan

Payakumbuh, Desember 2017 Mutia Elida

LEMBAR PENGESAHAN ………………………………………………………………………………….. ii

1 Nama peralatan lab mikro dan fungsinya………………………………………………….. 4

1 Bentuk pertumbuhan koloni di atas agar cawan 9

5 Tahapan pelaksanaan pewarnaan gra8m 33

6 Pemindahan biakan bakteri secara aseptik 43

7 Bentuk pertumbuhan mikroba pada permukaan media cair 44

11 Pembagian Neubauer pada hemasitometer 61

Latihan No. : 01 (Satu)

I. CAPAIAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH KHUSUS

IV. ALAT DAN BAHAN

VII. DAFTAR PUSTAKA

Harigan, W.F., and McCance, Margaert E. 1976. Laboratory Methods in

I. CAPAIAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH KHUSUS

IV. ALAT DAN BAHAN

TUGAS DAN PERTANYAAN

Tabel 2. Pengamatan pertumbuhan mikroba dan cirri-cirinya

VII. DAFTAR PUSTAKA

Harigan, W.F., and McCance, Margaert E. 1976. Laboratory Methods in

I. CAPAIAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH KHUSUS

IV. ALAT DAN BAHAN

TUGAS DAN PERTANYAAN

Bakteri: bentuk sel : Khamir : bentuk sel : perbesaran

Kapang : bentuk sel : Kapang : bentuk sel :

VII. DAFTAR PUSTAKA

Harigan, W.F., and McCance, Margaert E. 1976. Laboratory Methods in

I. CAPAIAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH KHUSUS

IV. ALAT DAN BAHAN

5.2. Lekapan basah ( Dalam Medium Padat )

5.4. TUGAS DAN PERTANYAAN

Perbesaran :…………… Perbesaran :…………… Perbesaran :……………

Preparat tetes gantung

Perbesaran :…………… Perbesaran :…………… Perbesaran :……………

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan [Petunjuk Laboratorium]. Departemen

Harigan, W.F., and McCance, Margaert E. 1976. Laboratory Methods in Food

Hadioetomo, RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT. Gramedia

I. CAPAIAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH KHUSUS

5.3. Pembuatan Media

1. Tuangkan air ke dalam tubuh saterilisator, hingga 2/3 dasar keranjang

5.4. TUGAS DAN PERTANYAAN

Gambar 3. Autoclave dan bagiannya

Tabel 4. Nama dan Komposisi Media untuk pertumbuhan Mikroba

Tabel 6. Nama alat dan cara sterilisasi

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan [Petunjuk Laboratorium]. Departemen Pendidikan

Fardiaz, S. 1993. Mikrobiologi Pengolahan Pangan [Penuntun Praktek). Program Studi

Fardiaz, S. 1993. Mikrobiologi Pengolahan Pangan [Penuntun Praktek). Program Studi

I. CAPAIAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH KHUSUS

IV. ALAT DAN BAHAN

TUGAS DAN PERTANYAAN :

1. Reaksi gram : Bakteri 1 Bakteri 2 Bakteri 3

2. Buatlah Gambar dari masing-masingnya

Perbesaran Perbesaran Perbesaran

4. Berdasarkan hasil diatas, berikan kemungkinan bakteri apa yang

Fardiaz, S. 1993. Mikrobiologi Pengolahan Pangan [Penuntun Praktek). Program Studi

Harigan, W.F., and McCance, Margaert E. 1976. Laboratory Methods in

I. CAPAIAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH KHUSUS

Mahasiswa mampu melakukan pewarnaan spora dan letak spora dibawah

TUGAS DAN PERTANYAAN

1. Bakteri sayur berlendir

d. Besarnya spora jika dibandingkan dengan sel vegetatif..........