UJI AKTIVITAS BIOKIMIA

1. Hidrolisis Polisakarida
Uji hidrolisis polisakarida bertujuan untuk mengetahui apakah suatu bakteri
mampu menghasilkan enzim hidrolasse yang mampu mnehgidrolisis polisakarida
menjadi monosakarida. Uji ini menggunakan medium starch agar dengan
menggunakan iod sebagai indikator. Ketika medium ditetesi dengan iod maka akan
terbentuk kompleks biru sampai coklat, namun jika bakteri terrsebut memiliki
enzim hidrolase maka akan terbentuk zona bening.
Starch α-amylase
[Amylose + Amylopectin] Dextrin + Maltose +
glucose
(Large polysaccharide) H 2O (intermediate (disaccharides) (monosaccharides)
Polisaccharides)
2. Uji Fermentasi Karbohidrat
Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan suatu
bakteri dalam memfermentasikan karbohidrat. Medium yang digunakan adalah
Glocose Agar, Sucrose Agar, dan Lactosa Agar. Hasil positif ditandai dengan
adanya warna kuning dan munculnya gas CO2.
3. Uji Metil Merah
Uji metil merah bertujuan untuk mengetahui kemampuan suatu bakteri untuk
menghasilkan asam-asam campuran, sehingga dapat mngubah indikato metil
merah menjadi merah. Medium ang digunakan adalah Metin red yang
ditambahkan dengan metil merah, hasil positif ditandai dengan adanya warna
merah. Sebagai contoh beberapa jenis bakteri mampu membentuk asam tetapi
tidak cukup banyak untuk mengubah indikator dan penurunan pH sampai 5,0 ,
pada umumnya untuk menghambat kelangsungan hidup mikroorganisme.
Sedangkan bakteri seperti E. Coli dapat memberikan hasil pengujian positif
karena dapat menurunkan pengujian positif dan dapat menurunkan pH sampai di
bawah 4,5. Sebaliknya Klebsiella aerogenes mengadakan dekarboksilasi dan
kondensasi asam piruvat untuk membentuk asetilmetilkarbinol, sehingga pH
meningkat, dan bila ditambahkan metil merah warnanya menjadi kuning hal ini
berarti hasil pengujian negatif.

Methyl red indicator

 Methyl red (+) Methyl red (-)
(a) (b)
4. Uji Voges Posquer
Uji voges vosquer bertujuan untuk mengetahui apakah suatu bakteri mampu
menghasilkan asetoin atau tidak. Namun, keberadaan asetoin tidak dapat
diidentifikasi, yang dapat diidentifikasi hanyalah keberadaan 2,3 butanadiol.
Dalam uji ini digunakan medium MRVP ( Metil Red Voges Posquer), yang diikuti
dengan penambahan reagen berupa KOH dan α-naftol. Hasil positif ditandai
dengan adanya warna pink kemerahan. Asetoin merupakan senyawa antara yang
terbentukdalam pross metabolisme karboidrat. Asetoin dalam lingkungan yang
mengandung potasium hidroksida dan udara akan teroksidasi menjadi senyawa
2,3 butanadiol. Senyawa ini dengan alpha-naftol akan menghasilkan warna merah.
Reaksi biokimia oleh bakteri
CO2 CO2
2
Glucose + 1/2O 2 pyruvate acetolactate acetoin
2,3-butanediol

Mekanisme terbentuknya kompleks warna merah

40% KOH
Acetoin + alpha-naphthol diacetyl + creatine (pink
complex)
Alcohol absolute

5. Uji Oksidasi Fermentasi

Uji fermentasi oksidatif bertujuan untuk mengatahui apakah suatu bakteri
mampu melakukan fermentasi dan oksidasi, yang ditandai dengan munculnya
warna kuning pada medium OF.
6. Uji Indol
Uji indol bertujuan untuk mengatahui apakah suatu bakteri dapat menghasilkan
gugus indol dari triptofan. Suatu bakteri yang memiliki enzim tritofanase akan
mampu menghidrolisis triptofan mnjadi prodduk-produk metabolik seperti indol,
asam piruvat, dan ammonia. Keberadaan gugus indol dapat didteksi dengan
menggunakan reagent Kovacs. Indol yang bereaksi dengan reagen Kovacs akan
menghasilkan cincin warna merah pada permukaan medium.
7. Uji Penggunaan sitrat
Uji ini bertujuan untuk mengatahui penggunaan sitrat oleh bakteri sebagai salah
satu sumber karbon yang digunakan untuk kebutuhan energi. Medium yang
 digunakan adalah Simon Citrate Agar yang hasil positifnya ditandai dengan warna
biru.
8. Uji TSIA
Uji TSIA bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri yang berasal dari kelas
enterobacteriaceae. Uji ini biasa juga digunakan untuk membedakan gram
negatif antara yang mampu mengkatabolisme glukosa, laktosa, sukrosa, dan
mampu membebaskan asam sulfat. Uji ini menggunakan medium TSIA dan
indikator metil merah. Hasil positif ditandai dengan munculnya warna kuning dan
merah. Warna kuning muncul karena adanya fermentasi bakteri terhadap
glukosa, sukrosa, ataupun laktosa dalam konsentrasi tinggi sedangkan dalam
konsentrasi gula yang rendah hanya nampak warna merah. Sedangkan hasil positif
adanya H2S ditandai dengan adanya warna hitam.
9. Uji Deaminasi
Uji deaminasi bertujuan untuk membedakan bakteri enterik seperti E. coli dan P.
vulgaris. P. vulgaris. Mampu menghasilkan enzim Phenylalanine deaminase, yang
mampu mendeaminasi phenilalanine sehingga menghasilkan asam Phenilalanine
piruvat. Ketika ditambahkan ferric chloride ke medium maka akan terjadi reaksi
dengan phenylpyruvic acid yang menghasilkan kompleks warna kuning.

FeCI3

Mekanisme terjadinya warna hijau-kuning

Phenylpyruvic acid + ferric chloride green complex
(FeCI3)

Aktivitas biokimia bakteri

Pnenilalanin deaminase
Phenylalanine phenylpiruvic acid + ion
ammonium + air
½ O2

10. Uji Motility

Uji motility bertujuan untuk mengetahui ada atau tidak pergerakan bakteri. Uji
ini menggunakan medium SIM. Motilitas bakteri terlihat ketika adanya
pertumbuhan pada medium yaang tidak terbatas pada stab line inokulasi,
sedangkan pertumbuhan bakteri nonmotil terbatas pada garis inokulasi.
 Pergerakan bakteri ini terlihat dengan adanya pemisahan agar yang ditandai
dengan adanya warna hitam. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri bermigrasi dari
garis inokulasi ke bentuk kekeruhan padat medium.
11. Uji Katalase
Uji katalase bertujuan untuk mengetahui adanya enzim katalase yang dihasilkan
oleh suatu bakteri untuk memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Peroksida
merupakan senyawa yang sangat berbahaya bagi bakteri karena merupakan gas
yang bersifat toksik yang menyebabkan rusaknya sel-sel bakteri. Enzim katalase
pada bakteri dapat dideteksi dengan penambahan substrat H2O2. Hasil positif
dari aktivitas katalase positif ditandai dengan adanya gelembung gas O2.
2H2O2 catalase or 2H2O + O2
peroxidase
Water Free oxygen

Catalase Test on Slides. A positive catalase reaction (left slide) shows gas bubbles; a negative catalase reactio
reveals an absence of gas bubbles (right slide).
12. Uji Pencairan gelatin
Uji bertujuan untuk mengetahui apakah suatu bakteri memiliki enzim gelatinase
yang mampu mengidrolisis gelatin. Hasil positif ditandai dengan adanya pencairan
gelatin.
13. Uji Proteolitik
Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah suatu bakteri memilik enzim protease
yang mampu menghidrolisis protein menjadi asam-asam amino. Hal ini ditandai
dengan terbentuknya zona bening.

Metil Red dan Voges Proskauer ( MR VP )

 TTujuan : membedakan antara organisme yang mampu mengubah glukosa menjadi pyrufat.
1. Melalui jalur asam campur , hasilkan poduk asam lactat, acetic dan asam asam formiat (asam
campur) yang stabil dan akan tetap asam.
2. Melalui jalur butilena glikol, hasilkan produk akhir netral termasuk acetoin dan 2,3 – butanadiol.
 M MR – VP : media kaldu yang mengandung pepton, buffer, dan glukosa.
 F Fungsi uji MR : mendeteksi bakteri menggunakan jalur asam campur , hasil akhir asam maka tidak terjadi
perubahan warna methyl red ( merah ).
Prinsip : Uji Methyl Red + Indikator methyl red pada media pepton yang ditanami bakteri →Tes positif (merah )
Cara kerja :
 - Air pepton dalam tabung ditambahkan dalam biakan bakteri,diinkubasi 24 jam.
- Ditambahkam reagen Metil Red, dikocok. Jika terjadi warna merah maka MR →
positif , warna kuning → negative.
 P Perbedaan Methyl red dan Fenol red dalam suasana asam.
Metil red : Merah
Fenol red: Kuning
F F Fungsi uji VP : mendeteksi bakteri bakteri yang menggunakan jalur fermentasi butilena glikol, hasilkan acetoin
(netral).
Prinsip : reagen VP + pada media yang ditanamami bakteri, hasil akhir fermentasi →acetoin yang mengandung
KOH akan teroksidasi menjadi diacetyl warna merah karena adanya creatin sebagai katalisator.
Cara kerja :
- Air pepton pada tabung + reagen alfa naftol 0,5% 0,2 ml dikocok + KOH 40% 0,2 ml dikocok.
- Jika bagian atas media berwarna merah → uji VP positif, Jika media berubah coklat → negative.
- Catatan : Produksi acetoin dipengarui lamanya inkubasi , sehingga kemungkinan hasil negative palsu.

Triple Sugar Iron Agar

TSIA → media differensial yang mengandung lactose, sucrose, dan glukosa dalam jumlah kecil, ferrro
sulfat (untuk memperlihatkan pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam.[) ,
dan indicator phenol red. (Laktose:Sukrose:Glukose perbandingan 10:10:10)
Fungsi : membedakan bakteri enteric yang dapat mereduksi sulfur dan memfermentasi karbohidrat.
Hasil Uji :
- Bakteri memfermentasikan satu dari jenis karbohidrat + Indikator fanol red
→ Perubahan warna menjadi kuning ( suasana asam )
→hanya memfermentasikan glukosa dalam waktu 10 jam pertama , baru terjadi perubahan kuning
→Produksi asam pada lingkungan aerobic :
Daerah miring ( slant ) menjadi kuning , daerah tengah ( median ) menjadi merah ( basa).
→ Produksi asam pada lingkungan anaerobic :
Daerah miring ( slant ) sampai dasar ( butt) menjadi kuning
- Bakteri dapat mereduksi sulfur
→ Gas hydrogen sulfida yang terbentuk akan bereaksi dengan besi membentuk besi sulfida
sebagai endapan hitam.( dapat menutupi hasil asam / basa)
→ reduksi sulfur butuh lingkungan asam , endapan hitam menunjukkan fermentasi berlangsung.
→ Jika slant dikaburkan oleh endapan , lihat bagian atas kemiringan ,untuk menentukan terjadi
fermentasi glukosa ( merah )/ laktosa / sukrosa ( kuning ).
→jika fermentasi yang dihasilkan gas : adanya celah dalam medium atau seluruh bagian akan
terangkat.

SIM MEDIUM
SIM merupakan media untuk membedakan tiga parameter yaitu
- Reduksi Sulfur→ untuk membedakan bakteri enterik
 - Uji Indol →bagian dari uji IMViC, untuk membedakan family Enterobacteriaceae
- Uji Motilitas →untuk membedakan jenis bakteri secara umum.
Tujuan utama : untuk membedakan Salmonella dan Shigella.
Kandungan Media SIM : Nutrisi ( salah satunya pepton yang mengandung asam amino termasuk
Triptofan), Iron, dan Natrium thiosulfat.
Prinsip Reduksi Sulfur :
Bakteri dapat mereduksi sulfur menjadi hydrogen sulfide, maka hydrogen sulfide akan bereaksi dengan
zat besi ( Iron) menjadi ferric sulfide yang mengendap berwana hitam.
Uji Reduksi Sulfur Positif → Warna hitam pada media
Urutan tes : Tes Reduksi Sulfur → Tes Motilitas →Uji Indol.
Prinsip Uji Indol :
Beberapa bakteri menghasilkan enzim tryptophase yang dapat menghidrolisis tryptophan. Hasilnya
Indol, Asam Piruvat dan Amonia dengan cara deaminasi.
Cara kerja :
Menambahkan reagen Kovac yang mengandung HCl, n – amyl alcohol dan p-
dimethylaminobenzaldehyde (DMABA) kedalam medium SIM, maka DMABA akan bereaksi dengan
indol , hasilkan senyawa Quinoidal merah
Uji Indol Positif → pereaksi berubah menjadi merah

Urease Test
Urease broth → media differensial yang dapat membedakan bakteri penghasil eksoenzim yaitu enzim
urease ( untuk menghidrolisa urea →amonia karbodioksida)
Fungsi Urease broth : untuk membedakan bakteri genus Proteus terutama Proteus morganella dan Proteus
providential dari golongan bakteri enteric lain.
Kandungan Urease broth : Buffer, Urea, sedikit nutrient, indicator phenol red.
Phenol red berubah jadi kuning →lingkungan asam , berubah fuchsia →lingkungan basa.
Prinsip Urease test
Media urea terdegradasi menjadi amoniak menyebabkan lingkungan basa, maka media menjadi pink .
Sebagian besar bakteri golongan enteric dapat mendegrasi urea, tetapi lambat.
Fungsi Uji Urease : mendeteksi bakteri yang dapat mendegradasi dengan cepat “rapid urease-
positive”,contoh ; genus Proteus