REVIEW

MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON KONJUGASI

Konjugasi merupakan transfer materi genetik antarbakteri dengan menggunakan

jembatan pilus (terjadi kontak antarsel). Materi genetik yang umumnya ditransfer adalah
plasmid, tapi juga bisa kromosom (ada faktor F berintegrasi di kromosom). Faktor F adalah
plasmid berukuran 94.5 kb yang dapat bereplikasi sendiri atau berintegrasi ke kromosom
inang (episom).
Transfer terjadi dari donor (F+) menuju resipien (F-). Resipien yang menerima materi
genetik dari donor disebut transkonjugan. Kata trans pada transkonjugan berasal dari
transposon. Konjugasi terjadi saat donor dan resipien ditumbuhkan secara bersama-sama.
Setelah inkubasi pada waktu dan suhu tertentu, dilakukan seleksi dengan cara
menumbuhkan transkonjugan di media yang tidak menunjang pertumbuhan donor dan
resipien, yaitu media yang mengandung antibiotik.

Gen-gen yang diperlukan untuk konjugasi adalah sebagai berikut :

1. Gen tra atau operon tra
Kata tra berasal dari kata transfer. Operon tra akan menyandikan dua komponen yang
terlibat dalam proses transfer gen, yaitu
mpf (mating pair formation) dan dtr (DNA transfer & replication).
·Mpf menyebabkan terjadinya kontak antarsel dan terdiri dari 3 komponen :
 Jembatan pilus : monomernya berupa pilin dan dikodekan oleh gen traA.
 Channel : merupakan saluran dalam jembatan pilus.
 Coupling protein : protein yang memberi sinyal ketika kontak sel telah terjadi
dan materi genetic siap ditransfer.
·Dtr terdiri dari 3 komponen, yaitu :
 Relaksase : enzim yang menginisiasi nicking pada oriT.
 Helicase : enzim yang dapat memutus ikatan hydrogen dan mengubah
dsDNA menjadi ssDNA.
 Primase : enzim untuk membentuk primer RNA, sehingga replikasi DNA
dapat berlangsung.
2. Gen oriT (origin of transfer) : merupakan situs inisiasi transfer.

Bakteri Donor:
1. Escherichia coli S17-1 λpir (pUTmini-Tn5 Kmr)
Strain ini memiliki fungsi transfer konjugal yang terintegrasi kromosom, yakni fungsi
transfer RP4, sehingga ketika digunakan sebagai donor spesifik (transposon dimasukkan ke
vektor), proses transfer berlangsung secara diparental mating (strain pembantu/ketiga tidak
diperlukan). E. coli strain ini memiliki gen pir (λpir) yangmengkodekan protein π. Protein π
berfungsi dalam menjaga transposon tetap pada plasmid dan tidak lompat ke genom E.coli.
Selain itu, protein π berfungsi untuk menjaga stabilitas plasmid dan mendukung replikasi
plasmid. Jika tidak ada protein π, pUTmini-Tn5 Km r akan terdegradasi seiring replikasi sel
resipien atau disebut suicide plasmid (plasmid bunuh diri) karena membutuhkan protein π
untuk replikasi.
Transposon pada plasmid ialah mini-Tn5 Kmr. Pada praktikum, diharapkan transposon
loncat atau berpindah ke genom resipien, sehingga resipien dapat bertahan hidup
(sebelumnya tidak ada resistensi kanamisin). Jika plasmid saja, tidak bisa bertahan karena
tidak bisa bereplikasi kalau tidak ada protein π.
Bakteri Resipien
1. Rhodobacter sphaeroides 2.4.1
● Tergolong dalam α-proteobacteria, yakni subgrup α-3 proteobacteria
● Gram-negatif
● Termasuk dalam purple non sulfur photosynthetic bacteria yang dapat melakukan
fotosintesis anoksik.
● Memiliki 2 kromosom sirkular (I: ~3.2 Mb dan II: ~0.9 Mb) dan 5 plasmid (ukuran
bervariasi antara 37-114 kb) yang membawa gen resistensi terhadap rifampisin,
spektinomisin, ampisilin, streptomisin, penisilin & turunannya, dan sefalosporin.
● Kelebihan organisme ini:
 Mengandung genom yang sudah disekuens
 Metabolismenya sudah diketahui
 Salah satu tools dalam rekayasa genetika
● Konjugasi antara E. coli S17-1 dengan R. sphaeroides 2.4.1 bersifat diparental
mating

Bahan dan Metode

1. LB + Kan : menjaga plasmid tetap berada dalam donor
2. Inkubasi 16 jam untuk Escherichia coli serta 48 jam untuk Rhodobacter sphaeroides
2.4.1: waktu optimum setiap bakteri mencapai fase log
3. Sel diresuspensi LB: mempertahankan sel agar tetap hidup dan mengurangi
konsentrasi antibiotik di media
4. Resuspensi dengan garam fisiologis: untuk hilangkan sisa media
5. LA vial: agar luas permukaan lebih kecil sehingga peluang donor dan resipien
bertemu lebih besar
6. LA filter: pori filter yang sangat kecil akan menahan sel bakteri tapi cukup besar
untuk melewatkan media cair. Mating terjadi di atas filter paper
7. Tidak boleh berbusa: supaya sel tidak terperangkap dalam gelembung
8. LA + Kan + Rif: untuk seleksi transkonjugan
9. Mating dilakukan dibawah cahaya selama overnight, yaitu waktu optimum untuk
mating.