Bahan Ajar Medreg

Daftar Isi
Bab 1
Mikrobiologi.................................................................................................................2
Topik 1Media Kultur (Pembenihan).......................................................................3
Latihan.............................................................................................................5
Ringkasan........................................................................................................5
Tes 1................................................................................................................5
Topik 2 Pembuatan Media Uji................................................................................7
Latihan...........................................................................................................17
Ringkasan......................................................................................................17
Tes 2..............................................................................................................18
Topik 3 Reagen Mikrobiologi dan Pewarnaan Bakteri.........................................20
Latihan...........................................................................................................39
Ringkasan......................................................................................................39
Tes 3..............................................................................................................41
Daftar Pustaka................................................................................................43
Bab 2
Kimia Analitik Kualitatif...........................................................................................45
Topik 1 Unsur-unsur dalam Kimia Analitik Kualitatif.........................................46
Latihan...........................................................................................................50
Ringkasan......................................................................................................50
Tes 1..............................................................................................................52
Topik 2 Analisa Kualitatif Secara Kering.............................................................55
Latihan...........................................................................................................61
Ringkasan......................................................................................................61
Tes 2..............................................................................................................62
Topik 3 Analisa Kualitatif Secara Basah..............................................................64
Latihan...........................................................................................................76
Ringkasan......................................................................................................76
Tes 3..............................................................................................................78
Daftar Pustaka................................................................................................80
Bab 3
Kimia Analitik Kuantitatif........................................................................................82
Topik 1 Metode Titrametri....................................................................................84
Latihan.........................................................................................................101
Ringkasan....................................................................................................101
Tes 1............................................................................................................102
Daftar Pustaka..............................................................................................105
Kunci Jawaban.........................................................................................................107
Glosarium..................................................................................................................113
Bab 1
Mikrobiologi
Pendahuluan
D alam bab ini Anda akan mempelajari media dan reagen apa saja yang digunakan saat
melakukan praktikum mikrobiologi. Media adalah suatu campuran bahan yang
mengandung nutrisi untuk pembiakan/pertumbuhan, mempertahankan dan menyeleksi
bakteri yang dibiakkan secara invitro (diluar tubuh) sehingga dapat diketahui jenis bakterinya.
Media sebagai sumber makanan bagi bakteri maka disana banyak sekali bahan-bahan atau
komponen bahan yang ditambahkan dalam media. Adapun reagensia adalah suatu zat atau
senyawa atau larutan dalam konsentrasi tertentu yang digunakan untuk mengetahui penjelasan
dari suatu analisa. Misalnya : benedict, Kapur, Natrium Hidroksida (NaOH) Asam Sulfat
(H2SO4), dll.
Pembuatan media pertumbuhan untuk keperluan mikrobiologi bertujuan untuk

mempelajari tentang mikroorganisme. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi yang berupa
molekul – molekul yang ada di media untuk menyusun komponen sel-nya. Dengan media
pertumbuhan juga dapat digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme, mengidentifikasi, dan
kultur murni. Komposisi media dapat dimanipulasi untuk tujuan isolasi dan identifikasi
mikroorganisme tertentu sesuai dengan tujuan masing – masing pembuatan suatu media. Media
adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat – zat hara (nutrient) yang berguna untuk
membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan sifat – sifat fisiologis dan perhitungan jumlah
mikroba (Sutedjo,1996).
Media berfungsi sebagai tempat tinggal, sumber makanan, dan penyedia nutrisi bagi
mikroorganisme yang akan dibiakkan pada media, selain itu media juga berfungsi untuk
membeiakkan, mengasingkan, mengirimkan, dan menyimpan mikroorganisme dalam waktu
yang lama di laboratorium. Media juga dapat digunakkan untuk mempelajari sifat – sifat
koloni/pertumbuhan mikroorganisme, serta sifat – sifat biokimianya. Di dalam laboratorium
mikrobiologi kedokteran media juga dapat digunakan untuk pembuatan antigen, toksin, dan
untuk pasasi kuman dengan tujuan perubahan virulensi dan lain – lain.
Reagensia adalah suatu zat atau senyawa atau larutan dalam konsentrasi tertentu yang
digunakan untuk mengetahui penjelasan dari suatu analisa. Misalnya : benedict, Kapur, Natrium
Hidroksida (NaOH) Asam Sulfat (H2SO4), dll.
Seorang ATLM harus mengetahui media dan reagensia apa saja yang harus dilakukan
saat pengujian mikrobiologi. Umumnya media dan reagen yang digunakan dalam keperluan
mikrobiologi adalah yang steril. Untuk itu perlu seorang ATLM mempelajari proses – proses
pengujian mikrobiologi dengan baik.
Dalam bab ini diharapkan anda mampu
1. Memahami tentang media untuk uji mikrobiologi

2. Memahami cara pembuatan media dan reagensia dalam uji mikrobiologi
3. Memahami cara pembuatan media kultur dalam uji mikrobiologi
4. Memahami cat pewarnaan bakteri dalam uji mikrobiologi
Pada BAB I ini akan dijelaskan media dan reagensia yang digunakan dalam uji
mikrobiologi dan hal – hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan media.
Uraian dalam bab ini terdiri dari 3 topik, yaitu :
1. Topik 1 – Media Kultur (Pembenihan)

2. Topik 2 – Pembuatan Media Uji Cair dan Padat
3. Topic 3 – Reagen Mikrobiologi dan Pewarnaan Bakteri
Topik 1
Media Kultur (Pembenihan)
A. Pengantar
Media kultur atau pembenihan adalah suatu reagensia yang terdiri dari bahan-bahan
kimia, bahan-bahan makanan yang dengan pengolahan tertentu menjadi apa yang disebut
pembenihan untuk menanam (inokulasi) atau mengkultur bakteri, jamur, virus, dll.
Persyaratan suatu media kultur (pembenihan) adalah bahwa media tersebut harus
merupakan sumber karbon, sumber energy, dan sumber elemen-elemen seperti N.P.K. , dsb.
Sumber karbon dan elemen diperlukan untuk membentuk komponen sel. Oksidasi yang
menghasilkan energy (ATP), dan daya reduksi untuk biosintesis makromolekul.
Sumber karbon dan sumber energy mungkin berasal dari satu sumber, misalnya glukosa.
Atau dapat juga merupakan molekul yang berlainan misalnya CO2 sebagai sumber karbon
sedang NH3 sebagai sumber energi. Sumber karbon yang diperlukan oleh semua mikrobia
digunakan untuk sintesis bahan-bahan organic, dan selanjutnya untuk membangun protoplasma.
Beberapa mikrobia menggunakan sumber energy organic sebagai sumber karbon, tetapi
juga memerlukan CO2 untuk keperluan karboksilasi fosfoenolpiruvat dalam pembuatan zat
antara biosintetik, misalnya untuk biosintetik purin dan pirimidin. Oleh sebab itu biasanya pada
bakteri sernacain itu pertumbuhan tidak dapat dimulai tanpa adanya CO2 yang tinggi dinamakan
bakteri yang kapnolil.
Kadang-kadang media juga dilenkapi dengan faktor tumbuh (growth factor). Selain itu
suatu media kultur harus pula menyediakan bagi sel aseptor hidrogen terakhir, untuk
memungkinkan terjadinya oksidasi. Untuk mikrobia yang aerob aseptor H terakhir disebut
oksigen. Dan untuk mikrobia anaerob dapat berupa zat organic atau suatu hasil tambahan organic
dari sumber karbon yang dikatabolisme. Dengan demikian banyak bakteri yang tumbuh secara
fermentative dengan menggunakan glukosa sebagai sumber karbon, sebagai sumber energy, dan
sebagai aseptor hidrogen terakhir.
B. Medium Buatan untuk Mikrobia
Suatu media untuk pertumbuhan bakteri yang sesuai harus mengandung zat makanan
yang diperlukan oleh bakteri tersebut, agar dapat membiak dengan sempurna. Faktor-faktor
seperti pH, suhu, harus dipenuhi dengan baik. Untuk keperluan kultur bakteri biasanya
digunakan media cair, dimana media tersebut dapat diperkeras dengan tujuan-tujuan tertentu
dengan menambahkan agar atau silica gel.
Agar-agar adalah suatu ekstrak polisakarida dari suatu algae (ganggang) laut, sangat
cocok untuk pembiakan bakteri karena resisten terhadap aksi bakteri serta dapat larut dalam suhu
100°C dan tidak menjadi padat sebelum suhu turun dibawah 45°C. Sel-sel bakteri dapat
disuspensikan pada suhu 45°C, kemudian pembenihan didinginkan dengan cepat, sehingga
menjadi padat tanpa merusak sel-sel bakteri tersebut.
Susunan dan kadar nutrient dalam suatu media untuk mikrobia harus seimbang agar
pertumbuhannya dapat sebaik mungkin. Hal ini perlu dikemukakan mengingat banyak senyawa-
senyawa yang menjadi penghambat atau menjadi racun bagi mikrobia kalau kadarnya terlalu
tinggi (misalnya garam-garam dari asam lemak, dll) Banyak algae yang sangat peka terhadap
kadar fosfat anorganik. Disamping itu, dalam medium yang terlalu pekat aktivitas metabolisme
dan pertumbuhan mikrobia akan berubah, dengan perubaha faktor invironment akan
menyebabkan perubahan fisiologisnya dan mikrobia akan mati.
Untuk membuat medium bagi mikroba titik tolaknya harus dimulai dari medium dasar
mineral (mineral base medium) yaitu suatu medium yang mengandung unsur-unsur yang dapat
diberikan dalam bentuk senyawa anorganik. Medium dasar ini selanjutnya dapat ditambah
dengan senyawa-senyawa lain jika misalnya sumber karbon, sumber energy, sumber nitrogen,
faktor tumbuh dan faktor invironmen yang penting misalnya pH.
Medium dengan susunan tertentu yang dihadapkan pada faktor environment tertentu (pH,
temperature, cahaya) dan penggunaan inoculum yang tepat menjadi dasar kultur diperkaya
(“enrichment culture’) untuk mikrobia tertentu. Medium yang seluruh susunan kimia dan
jumlahnya telah diketahui dengan pasti disebut medium sintetik, sedangkan jika ada yang
susunan kimianya belum diketahui disebut medium kompleks.
Contoh medium dasar yang mempunyai medium dasar yang sama yaitu :
Air 1 liter
K2HPO4 1 gram
MgSO47H2O 200 mgram
FeSO47H2O 10 mgram
CaCl2 10 mgram
Mu, Mo, Cu, Co, Zn sebagai garam anorganik masing- masing 0,02-0,5 mg
1. Medium I
Terdiri dari medium dasar ditambah NH4Cl 1 gram, dan tidak mengandung sumber karbon.
Inkubasi dalam keadaan gelap dan aerob sebab CO2 udara diperlukan sebagai sumber
karbon.
Bakteri yang dapat tumbuh pada medium ini adalah Nitrosomonas. Bakteri ini memperoleh
energy dari oksidasi dari ammonium dan ammonium juga sebagai sumber nitrogen.
2. Medium II
Terdiri dari medium I ditambah glukosa 5 gram. Dalam keadaan aerob merupakan medium
untuk kebanyakan bakteri date fungi. Glukosa merupakan sumber karbon dan sumber
energy. Jika inkubasinya dalam keadaan anaerob dapat menumbuhkan bakteri fakultatif
anaerob dan obligat anaerob. Energinya diperoleh dari hasil fermentasi glukosa. Medium ini
tidak cocok untuk mikrobia yang pertumbuhannya memerlukan faktor tumbuh.
3. Medium III
Terdiri dari medium 2 ditambah asam nikotianat 0,1 mg sebagai vitamin dan faktor tumbuh.
Medium ini sangat cocok untuk menumbuhkan mikrobia yang dapat tumbuh dalam medium
2, dan yang , memerlukan asam nikotianat sebagai faktor tumbuh, misalnya Proleus wilpris.
4. Medium IV
Medium dasar ditambah glukosa 5 gram dan yeast extract 5 gram. Medium ini cocok untuk
menumbuhkan mikrobia khemoheterotrof yang aerob maupun anaerob yang memerlukan
faktor tumbuh atau tidak yeast extract mengandung faktor tumbuh yang diperlukan jasad.
Medium 1,2,3 merupakan contoh dari medium sintetik, sebab jumlah dan susunan kimianya
sudah tertentu, sedang medium 4 merupakan contoh medium komplek sebab susunan kimia
dari yeast extract belum diketahui dengan pasti.
Medium diperkaya
Adalah medium yang ditambah zat-zat tertentu. Medium ini digunakan untuk
mengisolaso mikrobia spesifik. Cara isolasinya adalah dengan memperhatikan faktor
environment, kebutuhan nutrisi spesifik dan sifat-sifat fisiologisnya.
C. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri pada media kultur

Untuk mempelajari metabolisme mikroba biasanya perlu dibuat pembenihan yang
seluruhnya sintetis, dimana sifat-sifat dan konsentrasi semua bahan diketahui dengan cepat.
Dalam keadaan biasa lebih murah dan sederhana dari menggunakan bahan dari alam seperti
yeast extract, sari protein atau zat-zat yang sejenis. Sebagian besar bakteri dapat hidup bebas
dalam yeast extract, dan bakteri-bakteri khusus mungkin memerlukan zat-zat khusus yang hanya
terdapat dalam darah atau dalam ekstrakt jaringan binatang. Untuk banyak mikrobia senyawa
tertentu misalnya amino dapat berperan sebagai sumber energy, sumber karbon, dan sumber
nitrogen, akan tetapi bagi mikrobia yang lain memerlukan senyawa yang lain untuk tiap sumber.
Jika dalam pembenihan alamiah hal itu tidak terpenuhi, maka haruslah disediakan melalui
media-media sintetik.
Berdasarkan hal-hal seperti di atas, maka faktor-faktor yang harus dipenuhi dalam
pembuatan media kultur diantaranya adalah :
1. Faktor Tumbuh
Faktor pertumbuhan yaitu suatu senyawa organic yang harus ada di dalam sel agar dapat
tumbuh, tetapi zat ini tidak ada pada sel itu sendiri karena tidak dapat dibuat oleh sel
tersebut.
Banyak mikrobia yang diberi zat seperti tersebut di atas, sanggup untuk membentuk semua
bagian organic dari sel, termasuk asam amino, vitamin, asam nukleat, asam lemak dari
senyawa-senyawa lainnya.
Spesies mikroba berlainan sangat bervariasi dalam kebutuhannya akan faktor tumbuh
tersebut.
Beberapa spesies dari bakteri tidak memerlukan faktor tumbuh, sedang memerlukannya
dalam media pembenihannya. Misalnya gliserol merupakan faktor tumbuh dari bakteri TBC
yang parasite pada manusia, tetapi merupakan racun bagi TBC yang parasite pada burung.
2. Keasaman (pH)
Media kultur yang digunakan untuk mengkultur (menumbuhkan) bakteri kecuali harus
mengandung bahan-bahan yang dibutuhkan oleh bakteri sebagai nutriennya, harus
mempunyai pH tertentu. Hal ini berhubungan dengan sifat-sifat bakteri yang dapat hidup
pada kisaran pH tertentu. Dengan demikian maka dikenal adanya pH minimum , pH
maksimum dan pH optimum. pH minimum artinya kisaran pH terendah dimana bakteri
masih dapat hidup, walaupun tidak berkembang biak. pH maksimum adalah pH tertinggi
dimana bakteri masih dapat hidup dan pH yang optimum adalah pH dimana bakteri dapat
hidup dan berkembang biak dengan baik.
Penentuan pH optimum untuk tiap spesies bakteri harus ditentukan secara empiric. Sebagian
bakteri neutrophil tumbuh pada kisaran pH 6,0-8,0 meskipun ada pula bakteri asidofil yang
mampu tumbuh pada pH 3,0 dan bakteri yang alkalofil mempunyai pH optimum 10,5.
Mikroba mengatur pH internalnya melalui suatu deretan pH eksternal yang cukup luas.
Bakteri asidofil mempertahankan pH internalnya sekitar 6,5 dengan pH eksternalnya 1,0-5,0.
pH internal diatur oleh suatu sistem pengangkutan proton di dalam selaput sel, meliputi
pompa ATP penggerak proton dalam Na+ dan K+.
Untuk menentukan pH media kultur tersebut dapat dilakukan secara elektrometris dan
calonimetris dengan menggunakan indikator. Indikator adalah suatu zat warna yang pada
bermacam-macam pH dapat menunjukkan warna yang berbeda-beda. Warna yang
ditunjukkan oleh indikator mempunyai warna maksimal pada pH tertentu, dan warna
minimal pada pH tinggi tertentu. Hal ini disebut trayek perubahan warna indikator atau
trayek pH.
3. Suhu
Spesies mikroba yang berbeda sangat bervariasi suhu optimum untuk pertumbuhannya,
bentuk yang psikofilik tumbuh dengan baik pada suhu 15-20°C, bentuk mesofilik tumbuh
baik pada suhu sekitar 30-37°C dan bentuk yang thermofilik tumbuh baik pada suhu 50-
56°C. Sebagian besar bakteri berbentuk mesofilik, dengan demikian maka suhu 30°C
merupakan kisaran suhu optimum kebanyakan bakteri. Dengan demikian pemberian
perlakuan dengan suhu jauh di atas suhu optimum pertumbuhan suatu bakteri akan
menyebabkan kematian bakteri tersebut. Oleh sebab itu, sterilisasi media dengan pemanasan
yang dimaksudkan untuk membunuh mikrobia kontaminan, juga harus dijaga kemungkinan-
kemungkinan yang dapat merusak media itu sendiri.
4. Oksigen
Banyak mikrobia yang bersifat obligat aerob, memerlukan secara khusus oksigen sebagai
akseptor hidrogen. beberapa bersifat fakultatif, yang mana bakteri tersebut mampu hidup
dan kondisi aerob maupun anaerob. dan sebagian lagi bersifat obligat Anaerob yang
memerlukan zat lain selain oksigen sebagai aseptor hidrogen terakhir. Jasad ini sangat
peka terhadap hambatan yang ditimbulkan oleh oksigen. Toksisitas oksigen adalah akibat
reduksi oleh enzim di dalam sel ( seperti Misalnya flavoprotein) menjadi hidrogen peroksida
(H2O2) dan radikal yang bebas dan lebih beracun lagi yaitu super oksida (O2).
Bakteri yang aerob dan anaerob aerotoleran terlindung dari zat ini karena adanya
superoksida dismutase, ya itu suatu enzim yang mengkatalisis reaksi
2O2- + 2H+  O2 + H2O2
Dan adanya katalase yang mengkatalisis reaksi
2H2O2  2H2O + O2
Satu Kekeliruan dari yang tersebut di atas, adalah bakteri asam laktat, kuman anaerob yang
aerotoleran dan tidak dapat membentuk katalase. Kelompok ini justru
mengandalkan peroksidase yang mereduksi H2O menjadi H2O2, dengan mengorbankan
zat organik yang dioksidasi. Semua bakteri yang obligat anaerob tidak Mempunyai
superoksida dismutase ( enzim untuk tetap bertahan pada suasana aerob) dan katalase.
Sebagian toksisitas H2O2 adalah karena zat tersebut merusak DNA.
Penyediaan oksigen untuk biakan bakteri aerob merupakan masalah teknik yang utama.
tabung pembenihan biasanya dikocok secara mekanik agar udara dapat masuk ke dalam
pembenihan. Difusi oksigen seringkali menjadikan hambatan pertumbuhan jika kebutuhan
akan oksigen telah mencapai titik jenuh. Sehingga disfusi oksigen kedalam sel akan
membatasi laju pertumbuhan lebih lanjut. Bakteri yang obligat anerob justru sebaliknya,
meniadakan oksigen. Banyak cara untuk keadaan yang benar-benar anaerob misalnya
dengan zat pereduksi seperti natrium trioglikolat yang ditambahkan dalam media
pembenihan.
5. Kekuatan ion dan tekanan osmosa
Seperti tekanan osmosa dan kekuatan ion (konsentrasi garam) harus dapat dikendalikan.
Untuk sebagian besar bakteri faktor-faktor dalam media sudah memenuhi, tetapi untuk
bakteri yang tahan kadar garam tinggi (halofilik), atau tahan hidup pada larutan gula yang
pekat (osinefilik), hal ini haruslah diperhatikan.
Sebagian besar bakteri sanggup menahan tekanan osmosa luar dan kekuatan ion yang sangat
bervariasi karena kesanggupannya untuk mengatur osmolitas dalam konsentrasi ion.
Osmolalitas diatur melalui angkutan aktif ion-ion K+ dalam sel, dan ion dipertahankan agar
konstan dengan suatu ekskresi kompensasi dari putressin poliamin organic bermuatan
positif.
D. Klasifikasi Media
Media dapat diklasifikasikan berdasarkan atas susunan kimia, konsistensi dan fungsinya.
Berdasarkan susunan kimianya media dibagi menjadi :
1. Media Anorganik, yaitu media yang tersusun oleh bahan-bahan anorganik.
2. Media Organik/ media alamiah, yaitu media yang tersusun oleh bahan-bahan organic.
3. Media Sintetik/media buatan, yaitu media yang susunan kimianya dapat diketahui
dengan pasti. Media ini biasanya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan
mikrobia.
4. Media non sintetik, yaitu media yang susunan kimianya tidak dapat diketahui dengan
pasti. Media ini banyak digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi
mikrobia.
Menurut wujudnya / konsistensinya dikenal ada 4 jenis media, yaitu :
1. Media cair/ liquid media, yaitu media yang berbentuk cair seperti Alkali Pepton Water
(APW), Nutrient Broth (NB), Bran Heart Infusion (BHI), dll. Media cir ini dibuat dalam
tabung-tabung reaksi, Erlenmeyer, atau pada botol.
2. Solid media/media padat, yaitu media yang berbentuk padat, media ini dapat berupa
media organic, contohnya Blood Agar Plate (BAP), Mac Concey (MC), Salmonella
Shigella Agar (SSA), dll. Media padat dibuat dalam cawan petri (petridisk) atau pada
tabung reaksi yang dimiringkan. Media ini dapat berupa media alamiah seperti media
wortel yang dimiringkan pada tabung.
3. Semi solid media/ media setengah padat, media ini untuk uji motilitas, karena
teksturnya yang setengah padat akan memudahkan pergerakan dari bakteri. Media ini
dibuat pada tabung dengan posisi tegak.
4. Media padat yang dapat dicairkan, yaitu media yang dalam keadaan panas
(dipanaskan) berbentuk cair (biasanya media dalam tabung reaksi) dan pada keadaan
dingin (didinginkan) berbentuk padat (membeku), hal ini karena media tersebut
mengandung agar-agar atau gelatin. Berdasarkan atas keperluannya media ini dapat
dibuat tegak, miring, atau dituang pada cawan petri steril.
Menurut sifatnya / fungsinya, dikenal beberapa jenis media, yaitu :
1. Transport Media
Media yang digunakan untuk mengirim klinik specimen dari suatu tempat ke
laboratorium. Di alam media ini bakteri yang ada di dalam specimen tidak coati dan tidak
berkembang biak contohnya : Carry & Blair Media.
2. Entiment Media/ media diperkaya
Media yang digunakan untuk memperbanyak/ menumbuhkan bakteri untuk lebih banyak.
Media ini biasanya ditambah dengan zat-zat tertentu seprti serum, darah, ekstrak
tumbuhan, dll. Media ini ada ysng bersifat umum dan ada pula yang bersifat khusus.
Yang bersifat umum (dapat untuk menumbuhkan mikroba apa saja), misalnya zbroth,
Brain Heart Infusion Agar, Blood Agar, Plate, dsb. Sedangkan bersifat khusus (untuk
menumbuhkan mikrobia tertentu misalnya Air Pepton Water, Selenit Brota, Tellurit
Cystine Agar, Cooked Meat Medium Agar, dsb.
3. Selektif Media
Zat kimia tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mkroba lain,
selain mikroba yang dikehendaki. Media ini digunakan untuk memilih/memisahkan salah
satu jenis koloni bakteri tertentu dari koloni-koloni bakteri yang lain. Seringkali disebut
sebagai media isolasi, karena dapat digunakan untuk memisahkan koloni-koloni yang
berbeda. Misalnya media MC, untuk isolasi bakteri gram negative, karena pada media
tersebut ditambahkan Kristal violet dan garam empedu (bile) yang pada kadar tertentu
dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif, media Eosin Mrthylene Blue Agar
untuk isolasi bakteri Eschericia coli, karena pada media tersebut terdapat eosin, yaitu zat
warna yang mengandung logam, dan hanya Escherichia coli yang dapat memecah zat
warna eosin tersebut yaitu dengan menunjukkan koloni Eschericia coli yang berwarna
metalik pada media tersebut, media TCBS untuk isolasi bakteri vibrio cholera. Hal ini
karena pada media TCBS mengandung sukrosa yang hanya digunakan cholera. Yaitu
dengan berubahnya warna media dari hijau menjadi kuning jika ada pertumbuhan kuman
Vibrio cholera.
4. Universal Media
Media ini dapat ditambah hamper semua bakteri, baik gram positif maupun bakteri gram
negative. Misalnya Blood Agar Plate, Nutrient Agar, BHI Agar, dll.
5. Diferensia Media
Media ini ditambah dengan reagensia atau zat kimia tertentu yang menyebabkan suatu
mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan perubahan tertentu sehingga dapat
untuk membedakan tipe-tipenya. Misalnya medium Agar Darah (BAP) dapat dipakai
untuk membedakan tipe hemolitik dari bakteri, media MC untuk membedakan tipe
kemampuan bakteri dalam memfermentasi.
6. Identification Media
Media ini digunakan untuk mengidentifikasi spesies bakteri, yang biasanya dalam hal ini
digunakan beberapa jenis media secara bersama-sama, misalnya media tryptofan broth,
media MR-Vp, media simon citrate, Media Semi Solid, TSIA, dan gala-gala.
7. Media Penguji/Assay Medium
Media ini susunannya tertentu dan digunakan untuk pengujian vitamin-vitamin,
antibiotic, dsb.
8. Media Total Kuman

Media ini adalah spesifik, digunakan untuk menghitung jumlah mikrobia dalam bahan
tertentu. Misalnya yang digunakan untuk menghitung jumlah bakteri, achtinomyces,dll.
9. Media Khusus
Media ini digunakan menentukan tipe pertumbuhan mikrobia dan kemampuan untuk
mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu.
TABEL INDIKATOR
Perubahan Pemakaian per 10
No Nama Indikator Kisaran pH kadar
Warna ml cairan
1 Phenol Red 6,8 – 8,2 Kuning- merah 1- 4 tetes 0,04 %
2 Methyl Red 4,2 – 6,2 Pink - kuning 2- 4 tetes 0,04 %
Thymol Blue
3 8,0 – 9,6 Kuning - biru 1- 4 tetes 0,04 %
Alkaline
Bromo Thymol
4 6,0 – 7,6 Kuning- biru 1- 4 tetes 0,00 %
Blue
Tidak berwarna
5 Phenolphtaline 8,2 - 10 3 – 10 tetes 1%
merah
6 Methyl Orange 3,0 – 4,4 Pink - Kuning 2- 5 tetes 0,1 %
E. Media Kultur Cair
1. Nutrient Broth (NB)

No Bahan Jumla Volume
PH Jumlah media
h media
1 Pepton 5 gram
2 NaCl 5 gram 200 tabung
kecil atau 100
Ekstrak 7 500 ml
3 5 gram tabung
Daging tanggung.
4 Aquadest 500 ml
Semua bahan dicampur, diaduk sampai homogen, diukur PH = 7. Tuang dalam tabung dan
sumbat dengan kapas. Ikat 10 buah tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket
dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi tegak dan simpan dalam
refrigerator.
2. Brean Hearth Infusion Broth (BHI)
Jumla Volume
No Bahan PH Jumlah media
h media
Brean 200 tabung
Hearth kecil atau 100
1 Infusion 5 gram tabung
Broth 7 500 ml
tanggung atau
(serbuk) 20 erlenmeyer
2 Aquadest 500 ml kecil.
Semua bahan dicampur, diaduk sampai homogen, diukur PH = 7. Tuang dalam tabung dan
sumbat dengan kapas. Ikat 10 buah tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket
dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi tegak dan simpan dalam
refrigerator.
3. NaCl Fisiologis
No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah
Media Media
1 NaCl serbuk 4 gram
200 tabung
7 500 ml
2 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur, diaduk sampai homogen, diukur pH=7. Tuang dalam tabung dan sumbat
dengan kapas. Ikat setiap 10 buah tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan
sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi tegak, dan simpan dalam
refrigerator.
4. Alkali Pepton Water (APW) / Air Pepton
Media Media
1 Pepton 5 gram 200 tabung
kecil
2 NaCl 2,5 gram 7,2 – 7,4 500 ml Atau
100 tabung
3 Aquades 500 ml tanggung
Pepton dan NaCl dilarutkan dalam aquades sambil dipanaskan, kemudian disaring dengan kertas
saring. Ikat setiap 10 tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan sterilkan
dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi tegak dan simpan dalam refrigerator.
Media Media
1 Pepton 5 gram
20 tabung
2 Laktosa 5 gram 9 500 ml
nesler
3 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur, diaduk sampai homogen, diukur pH=7. Tuang dalam tabung nesler yang
dilengkapi dengan tabung Durham dan sumbat dengan kapas. Ikat setiap 1 atau 3 buah tabung
dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan
tabung dengan posisi tegak, dan simpan dalam refrigerator.
5. b. Laktosa Broth (LB) double strain

Media Media
1 Pepton 5 gram
20 tabung
2 Laktosa 10 gram 9 500 ml
nesler
3 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur, diaduk sampai homogen, diukur pH=7. Tuang dalam tabung nesler yang
dilengkapi dengan Durham dan sumbat dengan kapas. Ikat 2, 3, atau 5 buah tabung dengan karet,
bungkus dengan kertas, beri etiket dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan
posisi tegak, dan simpan dalam refrigerator.
F. Media Kultur Padat

1. a. Nutrient Agar (NA)
No Bahan Jumlah pH Volume Jumlah
. media media
1 Pepton 5 gram
2 NaCL 5 gram 7 500 ml 100
tabung
3 Ekstrak daging 2 gram
atau 20
4 Agar-agar 12 gram petri
5 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur dalam bekker glass, panaskan di atas api sambal terus diaduk sampai
homogen (mendidih dan bening). Ukur pH = 7. Tuang dalam Erlenmeyer 1000 ml (volume
bejana untuk sterilisasi media hendaknya 2x volume media yang akan disterilkan). Sumbat
dengan kapas, bungkus dengan kertas dan sterilkan pada autoclave. Tuang dalam cawan petri
steril secara aseptic begitu turun dari autoclave. Dinginkan, dan bungkus dengan kertas secara
terbalik, dan simpan dalam refrigerator dalam kantung plastik. Atau sebelum disterilkan media
dituang dalam tabung reaksi ukuran tanggung, dan setelah dikeluarkan dari autoclave, tabung
dibaringkan miring (bagian atas yang dekat dengan sumbat kapas dihanjal sehingga tabung
berbaring miring), biarkan membeku, ikat setiap tabung dan bungkus dengan kertas, simpan
dalam referigator.
Catatan : sumber karbon (C) sebagai sumber energi didapatkan dari pepton selain sumber
Nitrogen (N) sebagai sumber bahan pembangun. Media ini merupakan media universal yaitu
semua bakteri baik yang gram positif dan gram negative tumbuh.
Atau
2. b. MacConkey (MC)
Media Media
1 Pepton 8,5 gram
2 Protease Pepton 1,5 gram
3 Laktosa 5 gram
4 Bile Salt no. 3 0,75 gram 100 tabung
miring
5 NaCl 2,5 gram 7 500 ml
Atau
6 Agar-agar 5,75 gram 20 petri
7 Neutral Red 0,015 gram
8 Kristal Violet 0,00005 gram
9 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur dalam beker glass, panaskan di atas api sambil terus diaduk sampai
homogeny (edan bening). Ukur pH=7. Tuang dalam Erlenmeyer 1000 ml (volume bejana untuk
sterilisasi media hendaknya 2x volume media yang akan disterilkan), sumbat dengan kapas,
bungkus dengan kertas dan sterilkan pada autoclave. Tuang dalam cawan petri steril secara
aseptic begitu turun dari autoclave dan bungkus dengan kertas secara terbalik, dan simpan dalam
kantong plastic.
Catatan :
Media Mac.Conkey merupakan media selektif, yaitu untuk kultur/pembenihan bakteri gram
negative saja. Media ini dilengkapi dengan neutral red dan garam empedu/Bile sebagai bahan
penghambat pertumbuhan bakteri gram positif.
MacConkey juga merupakan media diferensial, yaitu digunakan untuk membedakan sifat bakteri
dalam hal kemampuannya memfermentasi laktosa, oleh sebab itu media ini juga dilengkapi
dengan laktosa.
3. a. Blood Agar Plate (BAP)
Media Media
1 Blood Agar Plate 20 gram
2 Aquades 500 ml 7 500 ml 20 petri
3 Darah domba/manusia 25 – 40 ml
Serbuk Blood agar base dicampur dengan aquades, panaskan di atas api sambil terus diaduk
sampai homogeny (mendidih dan bening). Ukur pH=7. Tuang dalam Erlenmeyer 1000 ml
(volume bejana untuk sterilisasi media hendaknya 2x volume media yang akan disterilkan),
sumbat dengan kapas, bungkus dengan kertas dan sterilkan pada autoclave.
Dinginkan sampai suhu 40 – 50 °C, tuang secara aseptic darah ke dalam media, gojok pelan-
pelan sampai merata, tuang dalam cawan petri steril, dinginkan sampai beku, bungkus dengan
kertas dengan posisi terbalik, dan simpan dalam refrigerator dalam kantung plastic.
Pada waktu menuang darah suhu media jangan terlalu panas, karena hemoglobin akan lisis,
darah hendaknya masih segar dan baru diambil dari tubuh, jika terpaksa gunakanlah EDTA / zat
antikoagulan agar darah tidak membeku. Pencampuran darah ke dalam media juga harus benar-
benar homogen / rata.
Atau
a. Blood Agar Plate (BAP)

Media Media
1 Beef Infusion 500 ml 7,2 – 7,4 500 ml 100 tabung
miring
2 Protease Pepton 5 gram
Atau
3 NaCl 2,5 gram 20 petri
4 Agar – agar 10 gram
5 Darah 25 – 40 ml
Pepton dan NaCl dilarutkan dalam beef infusion, sambil dipanaskan, ukur pH=7,4 masak
(panaskan) beberapa menit kemudian disaring dengan kertas saring (cairan ini disebut buillon).
Masukkan agar ke dalam buillon, rendam beberapa menit, lalu sterilisasi dengan autoclave.
Keluarkan media dari autoclave, sambil dikocok agar tidak membeku, dinginkan sampai suhunya
kurang lebih 40 – 50 °C. Masukkan darah secara aseptic dan sambil terus dikocok pelan-pelan.
Tuang dalam cawan petri. Tuang dalam cawan petri steril. Dinginkan sampai beku, dan simpan
dalam posisi terbalik dan bungkus rapat dengan kertas atau kantung plastic.
Sterilisasi dengan autoclave menggunakan suhu 121°C, tekanan 2 atmosfer dan waktunya 15 –
20 menit.
Catatan :
Media Blood Agar Plate (BAP) merupakan media universal, yaitu semua bakteri baik yang gram
positif dan gram negative dapat tumbuh. Media ini diperkaya dengan darah, sehingga semua
bakteri akan lebih subur tumbuh pada media ini.
Penambahan darah pada media ini juga menambah fungsi dari media ini, sebagai media
diferensial yaitu untuk membedakan tipe hemolisa / hemolisis dari bakteri. Hemolisa / hemolisis
adalah kemampuan bakteri untuk memecah haemoglobin, karena pengaruh enzim hemolisis yang
dihasilkan oleh bakteri.
4. Endo Agar

Media Media
1 Endo Agar 19,5 gram
7 500 ml 20 petri
2 Aquades 500 ml
homogen (mendidih dan bening). Ukur pH=7. Tuang dalam Erlenmeyer 1000 ml (volume bejana
untuk sterilisasi media hendaknya 2x volume media yang disterilkan), sumbat dengan kapas,
aseptic begitu turun dari autoclave. Dinginkan, dan bungkus dengan kertas secara terbalik dan
simpan dalam refrigerator dalam kantung plastic.
5. Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)

Media Media
1 Eosin Methylene Blue 18 gram
Agar 7 500 ml 20 petri
2 Aquades 500 ml
untuk sterilisasi media hendakanya 2x volume media yang sterilkan), sumbat dengan kapas,
aseptic begitu turun dari autoclave. Dinginkan, dan bungkus dengan kertas secara terbalik, dan
Catatan :
Pada media EMBA atau Endo Agar bakteri E. coli akan tumbuh dengan membentuk koloni yang
berwarna metalik (seperti kilat logam logam). Hal ini karena bakteri E. coli menghasilkan enzim,
yang dapat memecah zat warna Eosin yang mengandung logam, sehingga koloninya akan
berwarna metalik. Dengan demikian media EMBA dan media Endo Agar merupakan media
selektif (hanya bakteri E. coli saja yang koloninya berwarna metalik pada media EMBA dan
Endo Agar). Pada media EMBA koloni E. coli berwarna hijau metalik dan pada media Endo
Agar E. coli berwarna merah metalik.
6. A. Salmonella Shigella Agar (SSA)

Media Media
1 Agar - agar 2 gram
2 Aquades 500 ml
7 500 ml 20 petri
3 Salmonella Shigella 30 gram
Agar
Campur agar- agar dengan aquades dalam beker glass, panaskan di atas api sambil terus diaduk
sampai homogen (mendidih dan bening). Ukur pH=7. Tuang dalam Erlenmeyer 1000 ml
(volume bejana untuk sterilisasi media hendakanya 2x volume media yang sterilkan), sumbat
steril secara aseptic begitu turun dari autoclave. Masukkan serbuk SSA (salmonella Shigella
Agar) ke dalam media begitu keluar dari autoclave, gojok pelan-pelan sampai merata, tuang
secara aseptic dalam cawan petri steril, diamkan sampai membeku dan simpan dalam refrigerator
pada kantung plastic dengan posisi terbalik, atau bungkus dengan kertas dalam posisi terbalik.
B. Salmonella Shigella Agar (SSA)

Media Media
1 Pepton 5 gram
2 Laktosa 5 gram
3 Empedu Saps 4,25 gram
4 Na sitrat 5 gram
5 Na thiosulfate 4,25 gram
6 Ammonium erri sitrat 0,5 gram 7 500 ml 20 petri
7 Brilliant Green 0,00015

gram
8 Neutral Red 0,0125 gram
10 Aquades 500 ml
Campur semua bahan keculai laktosa, homogenkan dengan dipanaskan sampai bening dan
sterilkan pada autoclave pada Erlenmeyer yang volumenya 2x volume media. Keluarkan dari
autoclave dan campurkan laktosa, gojok pelan-pelan sampai rata. Tuang secara aseptic dalam
cawan petri steril, diamkan sampai membeku dan simpan dalam refrigerator pada kantung plastic
dengan posisi terbalik atau bungkus dengan kertas dalam posisi terbalik.
7. Vibrio Selektif Agar / Thiosulfat Bile Sukrosa Agar / TCBS

Media Media
1 Agar-agar 2 gram
2 Aquades 500 ml
7 500 ml 20 petri
3 Thiosulfate Bile 44 gram
Sukrosa Agar
Campur agar – agar dengan aquades dalam bekker glass, panaskan di atas api sambil terus
diaduk sampai homogeny (mendidih dan bening). Ukur pH=7. Tuang dalam Erlenmeyer 1000 ml
(volume bejana untuk sterilisasi media hendaknya 2x volume media yang sterilkan), sumbat
steril secara aseptic begitu turun dari autoclave. Masukkan serbuk TCBS ke dalam media begitu
keluar dari autoclave, gojok perlahan sampai merata, tuang secara aseptic dalam cawan petri
steril, diamkan sampai membeku dan simpan dalam refrigerator pada kantung plastic dengan
posisi terbalik atau bungkus dengan kertas dalam posisi terbalik.
Catatan :
Dalam media TCBS sumber karbon selain dari pepton juga dari sukrosa. Hal ini karena
kebanyakan bakteri yang tumbuh pada media ini (Vibrio sp.) menggunakan sumber karbon
berupa sukrosa. Media ini dilengkapi dengan indikator Bromo Thymol Blue sebagai petunjuk
jika terjadi fermentasi terhadap sukrosa menjadi asam organic maka indikator BTB yang semula
berwarna hijau berubah menjadi kuning setelah fermentasi selama 24 – 48 jam pada suhu 37°C.
8. Plate Count Agar

Media Media
1 Agar – agar 1,25 gram
2 Pepton 2,5 gram
3 Glukosa 0,5 gram 7 500 ml 20 petri
4 Agar-agar 7,5 gram
5 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur dalam bekker glass, panaskan di atas api sambil terus diaduk sampai
untuk sterilisasi media hendaknya 2x volume media yang sterilkan), sumbat dengan kapas,
aseptic begitu turun dari autoclave. Dinginkan dan bungkus dengan kertas secara terbalik dan
9. Media Cystine Tellurit Agar (CTA)

Media Media
1 BHI cair 400 gram
3 Kalium Tellurit 1 % 15 gram
(steril) 7 500 ml 20 petri
4 Cystine 4,4 % (steril) 0,4 – 0,8
gram
5 Darah domba steril 25 ml
Larutkan agar- agar dalam BHI, sterilkan dalam autoclave. Dinginkan kurang lebih sampai suhu
50°C, tambahkan Kalium Tellurik 1%, Cystine 4,4% dan darah domba. Tuangkan dalam cawan
petri steril, biarkan membeku, simpan dalam posisi terbalik dalam kantong plastic atau bungkus
dengan kertas dan simpan dalam refrigerator.
Catatan :
Media CTA ini dilengkapi dengan darah domba untuk mengetahui tipe hemolysis dari bakteri
familia Corynebacterium. Corynebacterium diphteriae bersifat menghemolisis hemoglobin
(hemolysis positif / hemolysis β), dan Cystine dan Tellurit untuk membedakan Corynebacterium
diphteriae ditandai dengan warna koloninya yang hitam karena mengendapkan tellurit.
10. Media Loffler / PAI

Media Media
1 Whole Egg (putih 1 liter (25
telur dan kuning telur) butir)
bebek
2 Glukosa 5 gram 7 500 ml 20 petri
3 Gliserol 120 ml
4 Nutrient Broth (NB) 500 ml
Telor + Nutrient Broth + glukosa dikocok sampai homogeny, disaring. Tambahkan gliserol,
tuang dalam tabung reaksi (tanggung), sumbat dengan kapas. Inspisasi dengan inspisator pada
suhu 90°C dengan posisi miring, selama 2 jam. Ulangi pada hari ke 2 dan hari ke 3 dengan cara
yang sama. Tutup sumbat kapas dengan paraffin padat yang dicairkan. Biarkan membeku,
bungkus dengan kertas, beri label dan simpan dalam refrigerator.
Catatan :
Media Loffler termasuk media kultur untuk bakteri Corynebacterium diphteriae. Maksud kultur
bakteri ini pada media Loffler adalah untuk memacu pembentukan granula metakhromatin /
granula vollutin yang merupakan cadangan makanan yang berisi pyrofosfat bakteri tersebut.
Media Loffler ini terbuat dari bahan dasar whole egg (telur itik kuning dan putihnya) karena
selain memerlukan albumin sebagai protein dasar pada putih telur, bakteri Corynebacterium
diphteriae juga memerlukan lesitin yaitu sejenis asam lemak yang mengandung fosfat dan gugus
kolin yang mengandung nitrogen. Lesitin sebenarnya terdapat pada dinding bagian dalam paru –
paru dan tenggorokan, yang fungsinya untuk mencegah perlekatan dinding tersebut akibat dari
tegangan muka. Media Loffler yang digunakan untuk kultur bakteri Corynebacterium diphteriae
yang habitat aslinya tenggorokan (saluran pernafasan bagian atas). Oleh sebab itu, media Loffler
dirancang mirip dengan habitat asli Corynebacterium diphteriae.
Latihan
Untuk dapat memperdalam pemahaman Anda mengenai materi di atas, kerjakanlah Latihan
berikut!
1. Apa yang dimaksud media kultur (Pembenihan)

2. Faktor apa saja yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri pada media kultur
3. Bagaimana klasifikasi media menurut sifat / fungsinya
4. Sebutkan apa saja media kultur cair
Ringkasan
1. Media kultur (pembenihan) adalah suatu reagensia yang terdiri dari bahan-bahan kimia,
bahan-bahan makanan yang dengan pengolahan tertentu menjadi apa yang disebut
2. Faktor – faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri pada media kultur adalah
faktor tumbuh seperti senyawa organic, keasaman (pH), suhu, oksigen, dan kekuatan ion
dan tekanan osmosa.
3. Media diklasifikasikan menurut wujud dan sifatnya. Menurut wujudnya, media dibagi
menjadi 4 yaitu : media cair (liquid), media padat (solid), dan media setengah padat (semi
solid), dan media padat yang dapat dicairkan.
Sedangkan media menurut sifatnya dibagi menjadi beberapa jenis yaitu : transport media,
entiment media/media diperkaya, selektif media, universal media, diferensia media,
identification media, media penguji / assay media, media total kuman, dan media khusus.
4. Media kultur dibagi menjadi 2, media kultur cair dan media kultur padat. Media kultur
cair dibagi menjadi beberapa jenis yaitu : Nutrient Broth (NB), Brean Heart Infusion
Broth (BHI), NaCl Fisiologis, Alkali Pepton Water (APW) / air pepton, dan Laktosa
Broth (LB).
Sedangkan media kultur padat dibagi menjadi beberapa jenis yaitu : Nutrient Agar (NA),
MacConkey (MC), Blood Agar Plate (BAP), Endo Agar, Eosin Methylene Blue Agar
(EMBA), Salmonella Shigella Agar (SSA), Vibrio Selektif Agar (TCBS), Plate Count
Agar, Cystine Tellurit Agar (CTA), dan Media Loffler (PAI).
Tes 1
Pilihlah salah satu jawaban yang paling benar!

1. Pada suhu berapa bakteri berbentuk psikrofilik tumbuh dengan baik…
a. 7 °C
b. 60 °C
c. 35 °C
d. 17 °C
e. 100 °C
2. Kisaran pH pada indikator Phenolphtalein adalah…
a. 6,8 – 8,2
b. 8,2 – 10
c. 3,0 – 4,4
d. 6,0 – 7,6
e. 4,2 – 6,2
3. Kadar dari indikator Bromo Thymol Blue adalah…
a. 1 %
b. 0,04 %
c. 0,01 %
d. 0 %
e. 0,02 %
4. Media yang digunakan untuk pengujian vitamin – vitamin dan antibiotic adalah…
a. Diferensia media
b. Universal media
c. Media penguji / assay media
d. Media khusus
e. Media total kuman
5. Pada pembuatan media Nutrient Agar (NA) sebanyak 500 ml, diperlukan ekstrak daging
sebanyak…
a. 5 gram
b. 12,5 gram
c. 7 gram
d. 50 gram
e. 10 gram
6. Kisaran pH dalam pembuatan Blood Agar Plate (BAP) adalah…
a. 2
b. 8
c. 5,5
d. 9
e. 7
7. NaCl serbuk yang ditambahkan dalam pembuatan NaCl Fisiologis adalah…
a. 4 gram
b. 5 gram
c. 10 gram
d. 12 gram
e. 15 gram
8. Sumber Nitrogen berfungsi sebagai bahan…
a. Sumber energy
b. Penguat
c. Pembangun
d. Metabolisme
e. Sintesis
9. Kultur bakteri menggunakan media Loffler adalah untuk memacu pembentukan
granulla…
a. Neutrophil
b. Amylopectin
c. Methakromatin
d. Oval
e. Elips
10. Endo agar yang ditambahkan dalam pembuatan 500 ml adalah…
a. 5 gram
b. 10 gram
c. 17 gram
d. 10,5 gram
e. 19,5 gram
Topik 2
Pembuatan Media Uji

A. Pengantar
Media dapat berfungsi untuk membiakkan, mengasingkan dan menyimpan

mikroorganisme dalam waktu yang lama di laboratorium. Media juga berfungsi untuk
mempelajari sifat-sifat koloni/pertumbuhan, sifat-sifat biokimiawi mikroorganisme. Selain itu
dalam labora-torium mikrobiologi kedokteran dapat berfungsi untuk pembuatan antigen, toksin,
dan untuk pasasi kuman dengan tujuan perubahan virulensi dan lain-lain.
Syarat-syarat membuat media yang perlu diperhatikan ialah media harus mengandung
semua unsur makanan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan
mikroorganisme, media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang
sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme dan media harus dalam keadaan steril sebelum
ditanami mikroorganisme yang dimaksud, jadi tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme lain yang
tidak diharapkan.
Media dapat diklasifikasi berdasarkan atas susunan kimia, konsistensi dan fungsinya.
Klasifikasi media berdasarkan susunan kimia. media anorganik, yaitu media yang tersusun atas
bahan-bahan anorganik, media organik, yaitu media yang tersusun atas bahan-bahan organik,
media sintetik, yaitu media yang susunan kimianya dapat diketahui dengan pasti, media ini
biasanya digunakan untuk mempelajari kebutuhan nutrisi mikroba, media non sintetik, yaitu
media yang susunan kimianya tidak dapat ditentukan dengan pasti, media ini banyak digunakan
untuk menumbuhkan dan untuk mempelajari taksonomi mikroba.
Formula baku dan bahan penunjang untuk membuat media adalah :
1. Nutrient yang terdiri dari proven, pepton, asam amino, dsb.
2. Sumber energy, yaitu karbohidrat
3. Logam atau mineral/trace element, seperti calcium, magnesium, ferro, pospat, sulfat,
nitrat, dll.
4. Buffer yang terdiri dari pospat dan asetat. Indikator, Phenol Red, Bromo Thymol Blue,
Bromo Cresol Purple, dsb.
5. Bahan selektif dapat berupa bahan eumia, antibiotika.
6. Bahan pemadat : agar-agar, protein, serum, gelatin, whole egg.
B. Syarat – syarat suatu media
Agar supaya mikrobia dapat tumbuh dengan baik pada suatu media, maka perlu dipenuhi
syarat-syarat sebagai berikut :
1. Media harus mengandung semua nutrient/bahan makanan yang dibutuhkan oleh mikroba
2. Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan muka, dan pH yang sesuai.
3. Media tidak boleh mengandung zat-zat penghambat
4. Media harus steril
C. Hal – hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan media

a. Mencampur media
Pembuatan media, selalu diawali dengan penimbangan bahan-bahan yang akan
digunakan untuk pembuatan media sesuai dengan resep media. Selanjutnya dilakukan
pelarutan garam-garam atau bahan-bahan lain dalam aquades. Larutan tersebut, lalu
dipanaskan (dihomogenkan) dengan cara memanaskan di atas kompor atau waterbath
sampai benar-benar larut dan homogeny. Biasanya jika dilakukan perebusan harus
dengan cara diaduk sampai media mendidih dan berwarna jernih.
b. Menyaring media
Beberapa jenis media kadang-kadang perlu disaring. Sebagai penyaring dapat digunakan
kertas filter, kapas atau kain kassa. Untuk media agar atau gelatin, penyaringan harus
dilakukan sewaktu media masih pants, agar tidak menjedal.
c. Menetukan dan mengatur pH (derajat keasaman) media
Pengukurang pH media wajib dilakukan, dan pH memang harus tepat, karena pH akan
sangat mempengaruhi pertumbuhan bakteri. Bakteri jyga mempunyai kisaran pH
optimum untuk dapat hidup dan berkembang, yang disebut pH optimum, pH optimum ini
beberapa diantara pH minimum dan pH maksimum, yaitu kisaran pH yang menyebabkan
bakteri masih dapat hidup dan berkembang. Dalam hal ini maka perlu diketahui cara-cara
mengukur pH media.
1. Mengukur pH dengan kertas pH Universal / koforimetri.
Cara ini hanya untuk mengukur pH media cair atau media yang dapat dicairkan dan
yang tidak berwarna. Caranya adalah dengan mencelupkan kertas pH Universal pada
media (cair) dan mencocokkan dengan warna pada standart warna pada bungkus
kertas pH, untuk menentukan pH-nya.
2. Mengukur pH dengan pH meter elektrik.
Penggunaan pH meter elektrik, yang paling penting diperlukan adalah cara
penyimpanan elektroda pH, yaitu harus selalu dalam keadaan bersih dan basah.
Cara pengukuran pH, setelah pH meter distel / disiapkan elektroda yang sudah
dikeringkan dengan kertas tissue, dicelupkan dan diadukan ke dalam media yang akan
diperiksa. Kemudian dipegang (stabil) dalam keadaan tercelup, dan dibaca pada
monitor, berapa pH-nya. Elektroda dicuci bersih, disimpan dalam keadaan basah.
Sebelum dipakai, sebaiknya pH meter di test dulu ketepatannya dengan cairan buffer
yang sudah diketahui berapa pHnya.
Catatan :
Untuk media-media padat yang reaksinya asam, penambahan asam dilakukan setelah
media disterilkan akan dapat dipakai. Caranya adalah asam yang jumlahnya telah
ditentukan dengan titrasi, dimasukkan dalam cawan petri steril. Media padat dicairkan
terlebih dahulu dan langsung dituang pada cawan petri yang telah diisi dengan asam
secara aseptik. Setelah padat dapat diinokulasikan bakteri dengan cara goresan.
3. Memasukkan media dalam tempat media
Sebelum steril, media harus dimasukkan kedalam wadah sesuai dengn kebutuhan.
Untuk media cair, biasanya dimasukkan pada tabung-tabung reaksi berukuran kecil,
tanggung atau besar (Nessler), dengan atau tanpa tabung durham. Media pasti dapat
juga dimasukkan pada tabung reaksi dan setelah media steril, dimiringkan atau
ditegakkan.
Media plate (Media dalam cawan petri) sebelum dibersihkan dituang dalam
erlenmeyer yang volumenya 2x volume media. Hal ini untuk menghindari
berkurangnya media yang meluap pada waktu disterilkan dan media dapat menempel
pada kapas penutup erlenmeyer.
Semua tabung maupun erlenmeyer yang berisi media yang akan disterilkan harus
ditutup rapat. Tutup tersebut dapat berupa kapas yang disusun sedemikian rupa
sehingga tutup benar-benar rapat atau dapat juga dengan tutup ulir. Selanjutnya ada
bagian mulut tabung/erlenmeyer yang telah ditutup dibungkus dengan kertas, baru
dilakukan sterilisasi.
4. Sterilisasi media
Biasanya sterilisasi media dilakukan dengan menggunakan autoclave. Untuk
mensterilkan media dengan bahan dasar whole egg (telor secara keseluruhan, yaitu
kuning dan putih telor ) disterilkan dengan inspisator.
Cara sterilisasi media dengan autoclave (pangs basah bertekanan). Suhu sterilisasi
dengan autoclave ini mencapai 121°C dan tekanannya 2 atmosfer selama 15-20
menit.
Adapun caranya sebagai berikut:
1. Isi tempat air dengan air sampai dekat angsang, kemudian api dinyalakan.
2. Media yang akan disterilkan dimasukkan ke dalamnya (diatas angsang). Perlu
diperhatikan bahwa media yang disterilkan di dalam erlenmeyer atau tabung-tabung perlu
ditutup rapat dengan kapas, kemudian dibungkus lagi dengan kertas ferkanmen atau
parafilm. Selanjutnya tutup dipasang dan sekrup-sekrup dikeraskan.
3. Kran pengatur tempat keluarnya uap, air dibiarkan terbuka sampai uap air banyak yang
keluar. Hal ini dimaksudkan agar di dalam bejana hanya ada uap air saja dan semua udara
terdesak keluar. Dengan demikian di dalam bejana hanya ada tekanan uap air murni.
4. Kran pengatur tempat keluarnya uap air ditutup, sehingga tekanan uap di dalam
Autoclave naik sampai 2 atmosfer dan suhu menjadi 121°C (dapat dilihat pada
manometer dan thermometer).
5. Setelah tekanan dan suhu yang dimaksud sudaH dicapai (Jarurn manometer menunjuk
angka 15 lb., api dikecilkan dan ditunggu sampai 15 20 menit (suhu bertahan sampai
121°C dan tekanan bertahan sampai 2 atmosfer). Matikan api dan tunggu sampai jurum
manometer menunjuk angka 0, buka kran tempat keluar uap air, tunggu sampai uap habis
dan Autoclave dingin, baru sekrup Autoclave dibuka perlahan-lahan.
6. Media dituang pada cawan petri stern, secara aseptik (untuk media plate) dari erlenmeyer,
dan media dalam tabung reaksi dimiringkan (untuk media agar miring) atau ditegakkan
(untuk media cair dan media tegak).
D. Media Uji Padat

1. Manitol Salt Agar (MSA)
Media Media
2 Pepton 5 gram
3 Aquades 500 ml
9 500 ml 20 petri
4 NaCl 37,5 gram
5 Manitol 5 gram
6 Phenol Red secukupnya
Semua bahan dicampur dalam bekker glass kecuali manitol dan NaCl, panaskan di atas api
sambil terus diaduk sampai homogeny (mendidih dan bening). Ukur pH=9. Tuang dalam
Erlenmeyer 1000 ml (volume bejana untuk sterilisasi media hendaknya 2x volume media yang
dterilkan), sumbat dengan kapas, bungkus dengan kertas dan sterilkan pada autoclave. Masukkan
manitol dan NaCl ke dalam media begitu keluar dari autoclave, gojok pelan – pelan sampai
merata, tuang secara aseptic ke dalam cawan petri steril, diamkan sampai membeku dan simpan
dalam refrigerator pada kantung plastic dengan posisi terbalik, atau bungkus dengan kertas
dalam posisi terbalik.
Catatan :
Media uji MSA mengandung garam (NaCl 75%, hanya bakteri halofilik yang dapat tumbuh pada
media ini, contohnya Staphylococcus aureus. Media ini juga dilengkapi dengan manitol sebagai
sumber karbon yang dipakai oleh Staphylococcus aureus, yang nantinya akan difermentasi
menjadi asam organic. Indikator pada media ini adalah phenol red (merah) dari akan berwarna
kuning dalam suasana asam.
2. A. Muller Hinton Agar (MHA)

Media Media
1 Mueller – Hinton 17 gram
Agar 7 500 ml 20 petri
2 Aquades 500 ml
Atau
B. Muller Hinton Agar (MHA)

Media Media
1 Beef Infusion 150 gram
2 Casamino acid 8,75 gram
(technical)
7 500 ml 20 petri
3 Amilum 0,75 gram
5 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur dalam bekker glass kecuali manitol dan NaCl, panaskan di atas api
sambil terus diaduk sampai homogeny (mendidih dan bening). Ukur pH=7. Tuang dalam
dterilkan), sumbat dengan kapas, bungkus dengan kertas dan sterilkan pada autoclave. Tuang
dalam cawan petri steril secara aseptic begitu turun dari autoclave. Dinginkan,dan bungkus
dengan kertas secara terbalik, dan simpan dalam refrigerator dalam kantung plastic.
Catatan :
Media ini digunakan untuk uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotic. Dengan metoda diffusion
(rembesan) suatu disk antibiotic yang diletakkan pada koloni bakteri uji pada media tersebut
(metoda Kirby Bouerr). Zat antibiotic pada disk antibiotic tersebut akan merembes ke sekitarnya.
Sebagai akibatnya bakteri yang tumbuh pada sekitar disk antibiotic mati. Dengan demikian,
terjadi zone penghambat (tidak terjadi pertumbuhan koloni) pada daerah sekitar disk.
3. A. Media ELEK (diphteri)

Media Media
1 Pepton 4 gram 7,8 1200 ml
2 Maltose 0,6 gram
3 Asam laktat 0,14 gram
4 Aquades 100 ml
Atau
B. Media ELEK (diphteri)

Media Media
2 NaCl 1 gram 7,8 100 ml 20 petri
3 Aquades 100 ml
Resep a dan resep b dicampur, dibagi pada tabung reaksi @10 ml, sumbat dengan kapas,
bungkus dengan kertas dan sterilkan dengan autoclave selama 30 menit. Setiap kali akan dipakai
untuk tes, setiap tabung media harus ditambah serum kuda steril 2 ml. Media dipanaskan dulu
sampai cair, dingininkan kira – kira suhunya 45 – 50 °C baru ditambah dengan serum kuda,
gojok pelan – pelan sampai merata. Tuang dalam cawan petri steril, sebelum membeku
tempelkan kertas stik steril yang telah dicelup dalam larutan antitoksin diphteri 100 unit dan
biarkan membeku.
4. Media Probisher (diphteri)

Media Media
1 Proteose Pepton 2 gram
2 Bacto Agar 2 gram
3 NaCl 0,25 gram
10 tabung /
4 Potassium Tellurit 0,3 5 ml 7,8 100 ml
10 petri
% (steril)
5 Serum kuda (steril) 20 ml
6 Apaecs 100 ml
Semua bahan dicampur kecuali K Tellurit dan serum kuda, tuang ke dalam tabung reaksi masing
– masing 10 ml, sumbat dengan kapas dan sterilkan dalam autoclave selama 15 menit. Simpan
dalam almari es. Jika akan dipakai, media dicairkan dulu kurang lebih suhunya 50 °C, kemudian
tambahkan 0,5 ml K. Tellurit 0,3% dan 2 ml serum kuda. Tuang dalam cawan petri steril dan
sebelum membeku tempelkan kertas steril yang telah dicelup dalam larutan antitoksin diphteri
1000 unit dan biarkan membeku.
Catatan :
Media ELEK dan Probisher digunakan untuk pengujian kekuatan zat antitoksin terhadap
reaksinya dengan toksin yang dihasilkan oleh bakteri Corynebacterium diphteriae. Jika terjadi
presipitasi disekitar koloni yang dikenakan dengan antitoksin tersebut, maka bakteri uji adalah
Corynebacterium diphteriae.
5. Semi Solid Agar

Media Media
1 Pepton 2,5 gram
2 NaCl 2,5 gram
3 Agar – agar 2 gram 7 500 ml 200 tabung
4 Aquades 500 ml
5 Pepton 2,5 gram
dengan kapas. Ikat setiap 10 buah tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan
sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi tegak, sampai media membeku dan
simpan dalam refrigerator.
Catatan :
Media ini setengah padat, dan digunakan untuk melihat pergerakan bakteri. Bakteri yang
mempunyai flagella sebagai alat gerak, akan bergerak menuju makanan atau oksigen yang
gerakannya dapat dilihat membekas pada media yang setengah padat, berupa tanda guratan /
gambaran putih di sekitan tusukkan.
6. A. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Media Media
1 Pepton 10 gram
2 NaCl 2,5 gram
3 Laktosa 5 gram
4 Sukrosa 5 gram
5 Glukosa 0,5 gram
6 Ammonium Fero 0,1 gram 7 500 ml 200 tabung
Sulfat
7 Na Thiosulfat 0,1 gram
8 Phenol Red 0,0125 gram
10 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur kecuali sukrosa, laktosa, glukosa, ammonium ferrosulfat dan Na
thiosulfate (dicampurkan setelah media disterilisasi). Media diaduk sampai homogeny, diukur
pH=7. Masukkan ke dalam Erlenmeyer 1000 ml, sumbat dengan kapas dan bungkus dengan
kertas, sterilkan dengan autoclave. Keluarkan media dari autoclave, masukkan sukrosa, laktosa,
glukosa, ammonium ferrosulfat dan Na thiosulfate dan sterilkan lagi pada suhu 110 °C selama 10
menit, tuang dalam tabung steril, sumbat dengan kapas dan miringkan, biarkan membeku. Ikat
setiap 10 tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan simpan pada refrigerator.
B. Triple Agar Iron Sulfat (TSIA)

Media Media
1 Triple Sugar Iron 32,5 gram
Agar 7 500 ml 200 tabung
2 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur, diaduk sampai homoegen, diukur pH=7. Tuang dalam tabung dan
sumbat dengan kapas. Ikat setiap 10 tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan
sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi miring, sampai media membeku dan
Catatan :
Media TSIA mengandung 3 macam gula yaitu sukrosa dan laktosa di bagian lereng dan glukosa
di bagian dasar. Hal ini karena berat molekul glukosa lebih rendah dari pada sukrosa dan laktosa
sehingga berada di dasar media. Gula – gula tersebut digunakan untuk pengujian kemampuan
bakteri memfermentasi karbohidrat (gula) menjadi asam organic, dengan disertai pembentukan
gas CO2 atau pun tidak.
Media TSIA juga mengandung logam berat Fe (besi) yang dapat digunakan untuk uji
kemampuan memproduksi H2S pada bakteri uji (lihat pada media SSA).
7. A. Simon Citrat

Media Media
1 Simon Citrat Agar 11,25 gram
7 500 ml 200 tabung
2 Aquades 500 ml
dengan kapas. Ikat setiap 10 tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan
sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi miring, sampai media membeku dan
Atau
B. Simon Citrat

Media Media
1 Magnesium Sulfat 0,1 gram 7 500 ml 200 tabung
(MgSO4)
2 Mono Ammonium 0,5 gram
Pospat (NH4H2PO4)
3 Di Potassium Pospat 0,5 gram
(K2HPO4)
4 Na sitrat 1 gram
5 NaCl 2,5 gram
7 Brom Thymol Blue 0,004 gram
8 Aquades 500 ml
Larutkan dalam aquades MgSO4, NH4H2PO4, K2HPO4, dan NaCl. Masukkan agar – agar,
selanjutnya panaskan sampai mendidih. Tambahkan larutan Bromo Thymol Blue 0,4 % (0,4
gram dalam 10 ml aquades) dan setelah pH=7. Tambahkan Na sitrat dan sterilkan dalam tabung
reaksi kecil (setiap tabung diisi 3 ml media), sumbat dengan kapas. Ikat setiap 10 tabung dengan
karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung
dengan posisi miring, sampai media membeku dan simpan dalam refrigerator.
Catatan :
Media ini digunakan untuk penujian citrate sebagai sumber karbon utama bagi bakteri. Jika sitrat
digunakan / difermentasi akan mengubah indicator Bromo Thymol Blue yang semula hijau
menjadi biru. Hal ini biasanya digunakan oleh bakteri yang tidak mampu menggunakan laktosa
atau sukrosa sebagai sumber karbonnya.
8. A. Urea Agar

Media Media
1 Urea Broth 16,25 gram
2 Agar – agar 6 gram 7 500 ml 200 tabung
3 Aquades 500 ml
Aquades dan agar – agar dicampur, diaduk sampai homogen, diukur pH=7. Tuang dalam
akan sterilkan), sumbat dengan kapas, bungkus dengan kertas dan sterilkan pada autoclave.
Masukkan serbuk urea broth secara aseptic ke dalam media yang baru dikeluarkan dari
autoclave, gojok pelan sampai merata. Tuang dalam tabung steril dan sumbat dengan kapas
miringkan sampai beku. Ikat setiap 10 tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket
dan simpan dalam refrigerator.
B. Urea Agar

Media Media
1 Pepton 0,5 gram
2 Dekstrosa 0,5 gram
3 NaCl 2,5 gram
4 Mono Potasium 1 gram
7 500 ml 200 tabung
Pospat
5 Phenol Red 0,006 gram
7 Aquades 500 ml
Bahan – bahan di atas dilarutkan dalam aquades, dipanaskan sampai mendidih sehingga agar –
agar larut dengan sempurna. Ditambahkan dengan phenol red, pH distel =7. Tuang dalam tabung
dan sumbat dengan kapas. Ikat setiap 10 tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket
dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi miring, sampai media membeku
dan simpan dalam refrigerator.
Catatan :
Media ini digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri menguraikan urea oleh enzim urease
yang dihasilkan bakteri. Dalam peruraian urea ini menghasilkan residu berupa ammonia yang
mengubah indicator neutral red menjadi lebih ungu.
9. Media Kudoh

Media Media
1 KH2PO4 0,75 gram 7 100 ml 20 tabung
2 Na glutamate 1,5 gram
3 Aquades 75 ml
4 Glyseril 4,5 ml
5 Malacyte Green 4 % 1 ml
6 Whole Egg (putih dan 175 ml (5
kuning telur) butir)
Dibuat larutan garam, yaitu semua bahan kecuali telur dan malacyte green dicampur dan
dimasukkan dalam Erlenmeyer. Dipanaskan dalam waterbath 90 °C selama 30 menit, dinginkan.
Telur yang sudah dicuci bersih direndam dalam alcohol 96% selama 10 menit. Pecahkan telur
satu persatu dan ukur volumenya dalam gelas ukur. Telur dikocok dengan mixer sampai
homogeny. Larutan garam yang sudah dingin ditambah malacyte green, campur sampai rata.
Campur telur kocok dan saring dengan kain kasa. Diamkan selama 30 menit, dibagi dalam
tabung @5 ml. Masukkan dalam isnspisator suhu 90 °C selama 2 jam hari berikutnya panaskan
lagi pada suhu 90 °C selama 1 jam.
Catatan :
Media ini dibuat dari whole egg, seperti pada media Loffler karena Basil Tahan Asam (BTA)
yaitu Mycobacterium tuberculosis, juga mempunyai habitat asli paru-paru yang dinding
dalamnya mengandung lesitin. (lihat media Loffler).
Media kudoh juga dilengkapi dengan Na glutamate dan gliserol sebagai factor tumbuh (growth
factor) kuman Mycobacterium tuberculosis.
Pada media kudoh terdapat Malacyte green yang bukan berperan sebagai indicator, tetapi
berperan sebagai penghambat pertumbuhan kuman / bakteri lain selain Mycobacterium
tuberculosis yang dikenal sebagai kuman penyebab TBC itu.
E. Media Uji Cair

1. Media gula – gula (glukosa, laktosa, sukrosa, maltose, dan manitol)

Media Media
1 Pepton 5 gram 7 100 ml 200 tabung
2 Glukosa /Sukrosa 5 gram
/Laktosa /Maltosa
/Manitol
3 Phenol red 0,0005 gram
4 Aquades 500 ml
Semua bahan dicampur (salah satu gula – gula), diaduk sampai homogen, ditambah indicator dan
diukur pH=7. Tuang dalam tabung yang telah diisi dengan tabung durham dengan posisi terbalik
dan sumbat dengan kapas. Ikat setiap 10 tabung dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket
dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi tegak, dan simpan dalam
refrigerator.
Catatan :
Media gula – gula ini dilengkapi dengan indicator phenol red sebagai petunjuk kalau terjadi
fermentasi gula akan terbentuk asam yang mengubah indicator phenol red yang berwarna merah
menjadi kuning. Tabung durham yang disertakan pada media gula – gula berfungsi untuk
menampung gas CO2 sebagai hasil samping dari fermentasi gula menjadi asam.
2. Media Tryptofan Broth (Indol)

Media Media
1 Dipotasium pospat 2,5 gram
(KH2PO4)
9 500 ml 200 tabung
2 Pepton 2,5 gram
3 Aquades 500 ml
refrigerator.
Catatan :
Media ini digunakan untuk mengetahui adanya produksi enzim triptofanase dari bakteri yang
memecah triptofan menjadi asam piruvat dan hasil dari bakteri yang memecah triptofan menjadi
asam piruvat dan hasil sampingnya berupa ammonia dan indol. Media ini dilengkapi dengan
asam amino triptofan.
Indol adalah senyawa yang berbau khas faeses yang dapat dideteksi dengan meneteskan perlahan
– lahan dengan kovacs atau reagen erlich yang mengandung Para Amino Benzoic Acid (PABA)
lewat dinding tabung. Indol akan diikat oleh PABA membentuk cincin merah.
3. Media Methyl Red dan Voges – Proskauer (MR – Vp)

Media Media
1 Dipotasium pospat 2,5 gram
(KH2PO4)
2 Pepton 2,5 gram 9 500 ml 200 tabung
3 Glukosa 2,5 gram
4 Aquades 500 ml
refrigerator.
Catatan :
Media untuk uji MR – Vp mengandung glukosa sebagai bahan uji kemampuan bakteri dalam
mengubah glukosa tersebut menjadi asam organic atau alcohol.
4. Media gula –gula untuk diphteri

Media Media
1 Glukosa /Sukrosa 3 gram
/Amilum
2 Pepton 5 gram
9 500 ml 200 tabung
3 Bromo cresol purple 5 ml
4 Aquades 500 ml
5 Serum kuda steril 50 ml
Panaskan serum kuda pada suhu 56 °C pada waterbath selama 30 menit. Gula – gula, pepton, dan
aquades dicampur sampai homogen, masukkan Bromo Cresol Purple dan ukur pH=9. Tuang
dalam Erlenmeyer 1000 ml (volume bejana untuk sterilisasi media hendaknya 2x volume media
yang akan disterilkan),sumbat dengan kapas, bungkus dengan kertas dan sterilkan pada
autoclave. Dinginkan sampai suhu 45°C-50°C dan tambahkan serum kuda.gojok perlahan
sampai homogeny, tuang dalam tabung dan sumbat dengan kapas. Ikat setiap 10 buah tabung
dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etiket dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan
5. Media Loffler Serum

Media Media
1 Dekstosa 1 gram
2 Aquades 300 ml 7 400 ml 100 tabung
3 Serum kuda steril 100 ml
Dekstrose dilarutkan dalam 100 ml aquades, ditambahkan serum kuda dan dituang dalam tabung
reaksi dan sumbat dengan kapas. Ikat setiap 10 buah tabung dengan karet, bungkus dengan
kertas, beri etiket dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan tabung dengan posisi tegak, dan
6. A. Brillian Green Laktosa Bile (BGLB) single strain

Media Media
1 Brilliant Green 20 gram
Laktosa Agar 7 500 ml 200 tabung
2 Aquades 500 ml
B. Brilliant Green Laktosa Bile (BGLB) double strain

Media Media
1 Brilliant Green 20 gram 7 500 ml 200 tabung
Laktosa Agar
2 Aquades 500 ml
3 Laktosa 5 gram
Semua bahan dicampur, diaduk sampai homogen, diukur pH = 7. Tuang dalam tabung yang telah
diisi tabung durham dengan posisi terbalik dan sumbat dengan kapas. Ikat setiap 10 buah tabung
dengan karet, bungkus dengan kertas, beri etikat dan sterilkan dengan autoclave. Dinginkan
Latihan
berikut!
1. Apa saja syarat – syarat dalam pembuatan suatu media

2. Sebutkan formula baku dan bahan penunjang untuk membuat media
3. Bagaimana cara untuk sterilisasi media
4. Sebutkan media uji padat
Ringkasan
1. Formula baku atau bahan penunjang harus ada di setiap media yang akan dilakukan
untuk uji coba. Hal ini dikarenakan untuk menguji sebuah mikroorganisme maka
harus mengetahui kebiasaan yang dilakukan oleh mikroorganisme tersebut. Seperti
keperluan nutrisi, mineral, dan sumber energy yang digunakan untuk
mengidentifikasi suatu mikroorganisme.
2. Dalam pembuatan suatu media, harus mengikuti syarat – syarat yaitu selalu bekerja
secara aseptic, tidak boleh adanya zat penghambat pada media, kesesuaian tekanan
osmosa, pH, dan konsentrasi pada media dan lain sebagainya.
3. Sebelum dilakukan uji dengan suatu mikroorganisme, media juga harus disterilisasi.
Sterilisasi adalah proses pembersihan media agar saat proses uji, mikroorganisme
yang sedang di uji tidak terkontaminasi oleh zat lain.
4. Media uji padat terdiri dari : Manitol Salt Agar (MSA), Muller Hinton Agar (MHA),
ELEK (diphteri), Media Probisher, Semi Solid Agar (SSA), Triple Sugar Iron Agar
(TSIA), Simon Citrat, Urea Agar, dan Media Kudoh.
5. Media uji cair terdiri dari : Media gula – gula, Tryptofan Broth (Indol), Methyl Red
dan Voges Proskauer (MR – Vp), Media gula – gula untuk diphteri, Loffler Serum,
dan Brilliant Green Laktose Bile (BGLB).
Tes 2

1. Proses sterilisasi pada media TSIA berbeda dengan media pada umumnya. TSIA
disterilkan pada autoclave berapa lama…
a. 5 menit
b. 20 menit
c. 60 menit
d. 10 menit
e. 120 menit
2. Pada media padat yang bereaksi dengan asam, penambahan asam dilakukan saat…
a. Sebelum sterilisasi
b. Setelah sterilisasi
c. Sebelum dilarutkan
d. Setelah dilarutkan
e. Tepat sebelum disimpan
3. Alat yang biasa digunakan untuk sterilisasi media adalah…
a. Waterbath
b. Beaker glass
c. Inspisator
d. Incubator
e. Autoclave
4. Media yang 75 % mengandung garam dan hanya bakteri halofilik yang tumbuh
adalah…
a. Semi Solid Agar (SSA)
b. Manitol Salt Agar
c. Media Kudoh
d. Media Elek
e. Nutrient Broth
5. Indikator phenol red di media gula – gula berfungsi untuk mengetahui adanya
fermentasi yang ditandai dengan berubahnya warna merah menjadi…
a. Kuning
b. Hijau
c. Biru
d. Hitam
e. Putih
6. Pembuatan media Indol sebanyak 500 ml memerlukan…. tabung
a. 100 tabung
b. 150 tabung
c. 200 tabung
d. 250 tabung
e. 300 tabung
7. Penambahan pepton pada proses pembuatan Media Methyl Red sebanyak…
a. 1 gram
b. 1,5 gram
c. 2 gram
d. 2,5 gram
e. 3 gram
8. Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan
urea adalah media…
a. Urea Agar
b. Simon Citrat
c. Media gula – gula
d. Media Kudoh
e. Manitol Salt Agar (MSA)
9. Media yang digunakan untuk pengujian kekuatan zat antitoksin terhadap reaksinya
dengan toksin yang dihasilkan bakteri adalah…
a. Simon Citrat
b. Semi Solid Agar
c. Media Probisher
d. Muller Hinton Agar
e. Urea Agar
10. Kisaran pH dalam pembuatan media Muller Hinton Agar adalah…
a. 7
b. 8
c. 9
d. 10
e. 2
Topik 3
Reagen Mikrobiologi dan Pewarnaan Bakteri

A. Pengantar
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal
suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau
bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan
struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari
sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan
kapsul.(waluyo,2010)
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya.
Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat
warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya
dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora,
flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri
itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling
utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).
B. Reagen Mikrobiologi
1. Reagen Kovacs
No. Bahan Jumlah Cara Pembuatan

1 Paradimethyl – amino 5 gram Paradimethyle-amino benzaldehid
benzaldehid dilarutkan dalam amil alcohol,
kemudian ditambahkan HCl pekat,
2 Amil alcohol 75 gram lalu disimpan dalam botol coklat
3 HCl pekat 25 ml Pencampuran reagen ini sebaiknya
dilakukan pada suhu 40 °C (dalam
refrigerator)
2. Reagen Voges – Proskeur

a. Reagen A

1 Alfa (α) Naftol 5 gram Alfa naftol dilarutkan dalam etil
alcohol absolut, kemudian dibubuhi
2 Etil Alkohol 75 gram sedikit kristal NaNO2 atau NaNO3
3 NaNO2 atau NaNO3 sedikit untuk menghindari terjadinya
oksidasi. Selanjutnya reagen ini
disimpan dalam botol coklat
b. Reagen B

1 Kristal KOH 40 gram Kristal KOH dilarutkan dalam
aquades kemudian disimpan dalam
2 Aquades 100 gram botol reagen
3. Reaegn Methyl – red

1 Methyl – red 0,1 gram Methyl – red dilarutkan dalam
etanol, kemudian ditambahkan
2 Etanol 300 gram aquades, simpan dalam botol coklat
3 Aquades 200 ml
4. Reagen Oksidase

1 Dimethyl – para 1 gram Reagen ini paling baik disiapkan
phenyl diamin – “segar” yaitu pada hari akan
hydro clorid digunakan atau dapat dibuat hari
sebelumnya dan disimpan di lemari
2 Aquades 100 ml es kurang dari satu minggu.
Tetramethyl – para phenyldiamin
hidroclorid 1 & sebetulnya lebih
sensitive namun harganya mahal.
5. Reagen Katalase

1 Hydrogen Peroksida 3 ml Larutan hydrogen peroksida
(H2O2) dilarutkan dalam aquades,
2 Aquades 100 ml dihomogenkan dan disimpan dalam
botol coklat
6. Reagen Uji Nitrit

a. Reagen A

1 Sulfanilic Acid 3 ml Larutkan acid dalam 5 N asetik acid
sampai homogeny dan simpan
2 5 N asetic (1 bagian 1000 ml dalam botol coklat
asetik dalam 2,5
bagian air)
b. Reagen B

1 Dimethyl – α 5 ml Larutkan Dimethyl – α
naphtylamine naphtylamine dalam 5 N asetik
acid, sampai homogeny dan simpan
2 5N – asetik acid 1000 ml dalam botol coklat
C. Cat / Pewarnaan Bakteri
Bakteri dan mikroba lainnya dapat dilihat di bawah mikroskop dengan atau tanpa
pengecatan. Untuk pengamatan mikroskopis tanpa pengecatan biasanya sangat sulit, karena
bakteri maupun mikrobia lainnya tidak berwarna/transparans. Oleh sebab itu, dengan pengecatan
akan didapatkan bentuk dan struktur sel bakteri dengan seksama. Dengan demikian fungsi dari
pengecatan adalah terutama memberi warna pada sel bagian-bagiannya sehingga menambah
kontras sel sehingga sel akan tampak lebih jelas. Selain itu, pengecatan dapat juga untuk
menunjukkan bagian-bagian struktur sel, menujukkan distribusi dan susunan kimia bagian-
bagian (konstituen) sel, membedakan mikrobia yang satu dengan yang lainnya, menentukan pH
dan potensial oksidas-reduksi ekstra dan intraseluler.
Cat Bakteri/Cat Biologi
Yang disebut cat bakteri/cat biologi adalah suatu persenyawaan organik yang mempunyai
gugus Khromofor dan gugus Auxokrhom yang terikat dalam suatu benzena.
Gugus khromofor merupakan gugus yang dapat memberikn warna pada molekul cat,
sedangkan gugus auxokhrom adalah gugus yang dapat memberikan disosiasi elektrolit-elektrolit
molekul cat, sehingga cat bersifat lebih mudah bereaksi.
Gugus khromofor yang mempunyai kemampuan menghasilkan warna adalah gugus Azo
( -N = N- ); Nitrozo ( -N = 0); Tio ( =C=S ); Nitro ( -NO2 ). Dan gugus auxokhrom misalnya
-NR2, -NHR2, NH2 ; -OH ; -OCH3 ; Br, -Cl.
Molekul benzena bukan merupakan cat dan molekul ini tidak berwarna. Apabila 3 atom
H dari molekul benzena ini diganti dengan gugus nitro (-NO 2), maka akan terbentuk senyawa
benzena yang berwarna kuning. Oleh karena senyawa Trinitro benzena tidak mengandung gugus
auxokhrom, maka senyawa ini belum memenuhi syarat sebagai cat biologi.
Benzena
Akan tetapi jika suatu atom H pada trinitro benzene diganti dengan gugus auxokhrom (-OH)
maka akan terbentuk senyawa asam pikrat yang dapat mengalami disosiasi elektrolit sebagai
berikut :
 + H+
Trinitro Benzena Asam Pikrat
Cat Biologi/cat Benzena
Asam pikrat tersebut mempuriya, gugus auxokhrom (-OH) dan gugus khro mofor (-NO 2)
dan asam pikrat dapat berfungsi sebagai cat. Pada umumnya cat yang digunakan untuk
pengecatan bakteri berupa senyawa garam. Dalam hal ini pengecatan bakteri dibagi menjadi 2
macam yaitu cat basis dan cat asam, tergantung dari muatan listrik dari cat.
a. Cat basis, yaitu garam-garam cat yang ion cat (khromofor)nya adalah berupa kation
(bermuatan listrik positif) misalnya Methylene Blue, Safranin, Neutral Red, sedangkan
anionnya (yang bermuatan listrik negative) adalah Cl-, asetat dan oksalat.
b. Cat asam, yaitu cat yang ion catnya (kliromofor)nya adalah anion-anion dan kation-
kationnya Na+, K+, Ca++, NH4+. Misalnya Natrium Eosinat, Eosin Fuchsin, Acid Fuchsin,
Kongo Red, dll.
Selain cat-cat yang tersebut di atas, terdapat cat-cat yang bersifat netral dan indiferen.
Misalnya cat Sudan III, Dimethylamide azobenzol (cat indiferen) dan cat Eosin Methylene Blue
(cat netral).
Sifat cat asam pada umumnya dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel,
sedangkan cat basis mudah bereaksi dengan bagian inti sel.
Pada dasarnya mekanisme pengecatan bakteri adalah adanya pengikatan secara kimia dan
fisika antara cat dengan sel bakteri. Pengikatan kimia ini dapat terjadi karena adanya bagian-
bagian sel yang bersifat asam maupun bersifat basa, yang akan bereaksi dengan gugus asam
maupun basa dari cat. Hal ini karena konstituen-konstituen sel merupakan protein atau asam-
asam amino merupakan senyawa amphoter (dapat bersifat asam dan dapat pula bersifat basa).
Pengikatan secara fisika antara cat dengan sel bakteri, dasarnya adalah bahwa peristiwa
pengikatan cat pada sel bakteri merupakan proses absorbs oat pada konstituen sel.
D. Faktor – faktor yang mempengaruhi pengecatan
Proses pengecatan bakteri pada umumnya menggunakan lebih dari satu pengecatan, dan hasil
pengecatan sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti fiksasi, substrat peluntur cat
(decolorizer) dan lain-lainnya.
1. Fiksasi
Sebelum bakteri dicat, harus dilakukan fiksasi terlebih dahulu. Pada waktu
memilih cara fiksasi harus diingat agar tidak menyebabkan hal-hal yang tidak
dikehendaki seperti sel menjadi lisis, konstituen sel larut dan lain-lainnya.
Cara fiksasi yang paling banyak dilakukan dalam pengecatan bakteri adalah
dengan cara fiksasi fisik, yaitu dengan pemanasan / freeze drying.
Yaitu membuat smear bakteri pada gelas benda (object glass), kemudian dikering
anginkan dan dilewatkan beberapa kali diatas nyala api spirtus.
Fiksasi juga dapat dilakukan dengan memberikan reagen kimia seperti campuran asam
cuka dengan asam pikrat, alkohol dengan asefon, atau asam khromat dengan asam
osmiat. Fiksasi dengan reagen kimia ini akan tetapi hal ini sangat jarang dilakukan.
Fungsi fiksasi adalah :
a. Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel

b. Mempertinggi sifat reaktif gugus-gugus karboksil, amino primer, surfidril
c. Merubah afinitas cat
d. Mencegah terjadinya otolisis pada sel
e. dapat membunuh bakteri secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan dan
struktur sel bakteri
f. Merekatkan bakteri pada gelas benda
g. Membuat sel-sel bakteri menjadi lebih kuat / keras
2. Substrat organik dari sel
Setiap cat bass atau cat asam dapat bereaksi dengan konstituen sel tertentu. Oleh
karena itu substrat organik dari sel seperti lipda, protein, asam nukleat dan karbohidrat
dari sel juga akan mempengaruhi pengecatan biologi / bakteri.
Atas dasar macam cat yang diserap oleh sel bakteri, maka dapat dibedakan :
a. Sel-sel yang basofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat cat basa
b. Sel-sel asidofil / oksifil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat cat asam
c. Sel-sel sudanqfil, yaiti sel-sel yang dapat mengikat cat-cat yang larut dalam
minyak
3. Peluntur cat (Decolizer)
Peluntur cat / decolerisasi diperlukan terutama untuk mendapatkan kontras yang

baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya sel-sel yang, Sukar dicat akan lebih sulit
untuk didekolorisasi(misalnya pada pengecatan acid fast pada Mycobacterium pengecatan
spora). Sebaliknya sel-sel yang mudah dicat lebih muda pula dekolorisasi.
Ada beberapa macam peluntur cat, misalnya
a. Peluntur cat yang lemah, alkohol, air, minyak, cengkeh, aseton, dan gliserin
b. Peluntur cat asam, HCl, H2SO4, HNO3, dan campuran asam-asam tersebut dengan
alkohol
c. Peluntur cat basis, KOH, NaOH, sabun dan garam-garam basa
d. Garam-garam logam berat, AgNO3, CuSO4, dll
e. Garam-garam logam ringan, seperti Na2SO4, MgSO4,dll

Jika suatu cat telah diikat kuat oleh suatu bagian set bakteri, misalnya kristal
violet oleh dinding set bakteri gram positif, maka cat tersebut tidak dapat dicolorisasi
oleh alkohol, dan hal tersbut dinamakan alcohol fast. Analog dengan hal tesebut, dikenal
adanya bakteri yang acid fast dan water fast.
4. Intensiftikasi Pengecatan
Untuk mengintensifkan cat, dapat dilakukan beberapa cat misalnya dengan

mempertinggi kadar cat, mempertinggi kadar cat, mempertinggi temperatur pengecatan
(60oC-90oC) atau menambahkan suatu mordan. Moedan adalah suatu zat kimi yang dapat
menyebabkan sel-sel bakteri dapat dicat dengan lebih intensif atau dapat menyebabkan
cat terikat lebih kuat pada bagian sel.
Ada beberapa jenis mordan, antara lain
a. Mordan basa, yaitu mordan yang bereaksi dengan anion cat asam yang berwarna,
misalnya alum, FeSO4, kalium antimonium tartrat, dan asetil piridinium klorida
b. Mordan asam, yaitu mordan yang bereaksi dengan cat-cat basa, misalnya asam tannim,
asam pikrat, jordin/lugol.
5. Cat penutup/cat lawan
Pada pengecatan secara bertingkat, seperti pada pengecatan Gram atau Ziehl-
Neelsen, untuk memberi kontras pada sel-sel yang tidak menyerap cat utama, pada akhir
pengecetan dilakukan pengecetan lagi, dan cat yang diberikan terakhir inilah yang disebut
dengan cat penutup.
Sebagai cat penutup yang banyak digunakan adalah: Methylene Blue, Safranin ,
Erythrosin dan lain-lainnya tergantung pada macam (cara) pengecetan.
E. Cara Pengecatan
Pengecetan / pewarnaan bekteri ada 3 macam,yaitu
A. Pengecetan progresif atau pengecetan direct , atau pengecetan monochromatic

Yaitu pengecetan yang menggunakan satu jenis / macam cat saja, misalnya pengecetan
sederhana. Perbedaan warna sel-sel atau bagian-bagian dari set, tergantung pada besar
kecilnya kemampuan sea atau bagian set dalam menyerap cat yang digunakan. Cat yang
dapat digunakan misalnya Methylene Blue, Safranin, Kristal violet,dsb.
1. Pengecetan negative
Pengecetan ini merupakan cara pengecetan tidak langsung, karena yang dicat
adalah latar belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pengecetan.
Pada pengecetan ini tidak dilakukan fiksasi,oleh sebab itu Pengecetan ini dapat
digunakan untuk melihat bentuk bentuk/ bagian sel yang sesungguhnya dan untuk
menentukan ukuran sel, karena dalam hal ini sel tidak mengalami perubahan. Cat yang
sering digunakan dalam pengecetan ini adalah Nigrosin, dan tinta cat.
2. Pengecetan sederhana
Pengecetan ini hanya menggunakan satu macam saja. Sebelum dicat dilakukan
fiksasi terlebih dahulu , Pengecetan ini digunakan untuk melihat bentuk bakteri. Cat
yang digunakan biasanya , Methylene Blue, Gentiam violet, basic fuchsin atau safranin.
Sebagai contoh , ada beberapa resep cat yang dapat dibuat sendiri, yaitu solution
methylene blue, Loefler Methylene Blue dan Manzon Methylene blue. Selain itu
pengecatan sederhana ini juga dapat digunakan cat Gram A ( Gentian/kristal violet) atau
Zirh-Neelsen A (karbol Fuchin)
Solution/ Larutan Methylene Blue
Volume Lama
No Bahan Jumlah Cara Pengecatan
Cat pengecatan
1 Methylene Blue 1 gram 100 ml 2 menit Sediaan/Smear yang sudah
kering anginkan difiksasi, lalu
digenangi dengan cat dan
biarkan 1 menit. Cat dibuang,
dicuci dengan air mengalir
2 Aquades 100 ml
Loefler Methylene Blue
Volume Lama
Cat pengecatan
1 Larutan 1 gram 100 ml 1 menit Sediaan/smear yang sudah
Metylene blue kering anginkan dan difiksasi,
lalu biarkam 1 menit, cat
dibuang dicuci dengan air
mengalir
2 Kalium 1 ml
hydroksida
(KOH) 1%
Manson Methylene Blue
Volume Lama
Cat pengecatan
1 Methylene Blue 0,2 100 ml 1 menit Sediaan/smear yang sudah
gram kering anginkan difiksasi, lalu
digenangi dengan cat dan
biarkan 1 menit. Cat dibuang,
dicuci dengan air mengalir
2 Borax 0,5 gram
3 aquades 100 ml
Hasil Pengecatan:
Bakteri dan sel lain akan bewarna biru violet atau tergantung cat yang digunakan.
B. Pengecatan regresif/ pengecatan contrast/ pengecatan inderect
Adalah pengecatan yang menggunakan lebih dari satu macam cat, dalam hal ini
digunakan juga bahan-bahan peluntur (decololizer). Cat dan bahan peluntur harus dipilih
dengan tepat, agar supaya diperoleh hasil pengecatan yang baik, antara badan sel bakteri
dan bagian-bagian dari sel bakteri seperti spora, kapsul serta sel-sel yang lain yang
warnanya berbeda jelas. Contohnya pengecatan : gram, Ziehl – Neelseen, klein, Burry-
gins, dsb.
1. Pengecatan gram
Pengecatan ini mula-mula dikembangkan oleh seorang ahli histologi Christian Gram
(1884) yang kemudian disempurnakan oleh ahli-ahli lain. Pengecatan gram meliputi 4
tingkatan, yaitu :
a. Pemberian cat utama / cat Gram A (Kristal Violet yang berwarna ungu), dengan
cara menggenangi smear dengan cat utama (Gram A), selama 4 menit, kemudian
cuci dengan air mengalir.
b. Pengintensifan utama dengan menambahkan larutan mordan / cat Gram B (larutan
lugol / Iodin) selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir.
c. Pencucian (decolorisasi) dengan cat Gram C yang terdiri dari larutan alkohol
asam / alkohol absolut / aseton, selama 1 menit dan seterusnya dicuci dengan air
mengalir.
d. Pemberian cat penutup cat lawan / counterstain / cat Gram D yaitu larutan
safranin, selama 4 menit, lalu dicuci dengan air mengalir.
Atau
a. Pemberian cat utama / cat Gram A (Kristal Violet yang berwarna ungu), dengan
cara menggenangi smear dengan cat utama (Gram A), selama 1 menit, kemudian
cuci dengan air mengalir.
b. Pengintensifan utama dengan menambahkan larutan mordan / cat Gram B (larutan
lugol / Iodin) selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir.
c. Pencucian (decolorisasi) dengan cat Gram C yang terdiri dari larutan alkohol asam
/ alkohol absolut / aseton, selama 0,5 menit dan seterusnya dicuci dengan air
mengalir.
d. Pemberian cat penutup cat lawan / counterstain / cat Gram D yaitu larutan
safranin, selama 2 menit, lalu dicuci dengan air mengalir.
Pengecatan gram termasuk pengecetan diferersial 9untuk membedakan) yaitu untuk

membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negative, sebgai berikut;
a. Bakteri Gram Positif, adalah bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat, sehingga
tidak dapat dilunturkan oleh peluntur, dan tidak dapat diwarnai oleh cat penutup /cat
lawan. Pada pengamatan mikroskopis, sel bakteri ini tampak berwarna biru ungu (violet)
b. Bakteri gram negative, bakteri ini daya pengikatan terhadap cat utama tidak kuat,
sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur yang berupa alkohol dan dapat dengan dengan
mudah diwarnai oleh cat penutup/ cat lawan. Pada pengamatan mikroskopis, sel bakteri
ini tampak berwarna merah jambu pink karena terjadi percampuran warna cat utama
(ungu) dan cat lawan (merah) menjadi merah keunguan/merah jambu/pink.
c. Bakteri gram variable, bakteri ini mempunyai sifat intermediate, antara gram positif dan
gram negative. Bakteri ini kadang-kadang bersifat gram positif, kadang-kadang bersifat
gram negative, atau ada yang bersifat gram positif dan gram negative.
Pada sifat gram positif dari gram negative tidak mutlak tegas dan spesifik, tetapi masih
tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan gram.
Faktor-faktor tersebut antara lain;
a. Perubahan keasaman
Jika Ph lingkungan turun, kemungkinan bakteri gram positif dapat berubah menjadi gram
negative. Sebaliknya apabila ph lingkungan naik, maka bakteri gram negative dapat
berubah menjadi gram positif
b. Penyimpanan
Cara pengecatan, misalnya cara pencucian (decolorisasi) yang terlalu lama, dapat
menyebabkan bakteri gram positif memberikan hasil seperti gram negative.
c. Media
Media kultur bakteri juga mempengaruhi dalam pengecetan ini, misalnya bakteri gram
positif, jika terlalu lama ditumbuhkan pada media yang mengandung bahan-bahan yang
mudah mengalami fermentasi, akan berubah menjadi seperti bakteri gram negatif.
d. Umur bakteri
Bakteri gram positif yang telah tug (kekurangan makanan) atau terlalu lama pada media
tanpa dipindah ke media lain yang segar, dapat berubah menjadi gram negatif.
e. Perlakuan khusus
Bakteri gram positif yang bagian-bagian selnya (macam-macam lemak, protein dan
karbohidrat) dihilangkan dengan melarutkannya dalam air panas, eter atau larutan
ribonuklease, dapat berubah menjadi gram negatif bakteri gram, negatif apabila ditambah
dengan larutan pekat DNA, dapat berubah menjadi gram positif contoh : Escherichia
colli.
Mekanisme Pengecetan Gram
Sifat gram, terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran
sitoplasmanya. Dinding sel dan membran sitoplasma bakteri gram positif mempunyai afinitas
yang besar terhadap kompleks cat kristal violet dan iodin. Sedang bakteri gram negatif
afinitasnya sangat rendah. Perbedaan sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasma
ini memegang peranan penting dalam menentukan sifat gram, akan tetapi seberapa jauh
pengaruh tersebut sampai sekarang belum diketahui.
Pada waktu pengecetan, larutan kristal violet dan iodin atau lugol menembus dinding sel-
sel bakteri gram positif maupun sel bakteri gram negatif. Pada sel bakteri gram positif zat-zat ini
membentuk suatu senyawa yang sukar larut, dan tidak larut oleh peluntur alkohol. Dinding sel
(dinding luar sel) bakteri gram positif yang berupa peptidoglikan yaitu campuran antara peptida
dan glikan atau polisakarida, dengan peluntur alkohol asam tidak larut dan justru mengikat. Hal
ini tidak terjadi pada sel bakteri gram negatif, yang akibatnya pada bakteri gram positif cat tidak
dapat dilunturkan. Pada pemberian cat penutup, sel bakteri gam positif tidak terwarnai, sehingga
bakteri gram positif akan bewarna ungu.
Bakteri gram negative, pada waktu dilakukan decolorisasi/pelunturan dengan alcohol

asam, cat luntur sehingga kristal violet berkurang. Oleh karena dinding sel (dinding luar sel)
bakteri gram negative berupa lipoprotein (lipid dan protein), maka lipidnya akan larut oleh
alcohol asam tersebut. Akibatnya pada dinding tersebut terbentuk pori, sehingga dengan
pemberian cat penutup terjadi aliran cat Safranin yang berwarna merah melalui pori-pori, ke
sitoplasma sel bakteri. Sisa cat kristal violet bercampur dengan safranin menjadi merah ke
unguan /merah janmbu/ pink.
Komposisi Cat Gram
Cat gram ini terdiri dari 4 cat, yaitu cat gram A yang terdiri dari Kristal Violet, dan di
sebut sebagau cat utama.Cat Gram B adalah lugol atau iodie yang berfungsi sebagai Mordant,
yaitu penguat ikatan cat utama dengan dinding sel bakteri. Cat gram Ca adalah peluntur
(decolorizer) yang biasanya terdiri dari alcohol absolut, alcohol asam atau asetat dan cat Gram D
adalah Safranin sebagai cat penutup.
Jenis Cat Bahan Cat Jumlah Volume Cat Cara Membuat Cat
Cat Gram A Kristal Violet 2-3 gram Kristal Violet digerus dan dilarutkan
Alkohol absolut 20 ml 100 ml dalam alcohol absolut, saring dengan
Amonium oksalat 0,8 gram kertas saring.
Aquadest s/d 80 ml Amonium oksalt dilarutkan dengan
Cat Gram B I2 ( Iodium) 5 gram
aquades, saring dengan kertas saring.
KI (Kalium Iodida) 0,2 gram
Campurkan dengan larutan kristal
100 ml
violet, campur hingga homogen dan
simpan pada botol coklat.
Campurkan I2 dan KI dalam mortir
dan haluskan
Tambahkan aquades sedikit-sedikit
samapi rata, tambahkan aquades terus
Aquades s/d 100 ml sampai volumenya 100 ml, dan
simpan dalam botol coklat.
Campurkan I2 dan KI dalam mortir

dan haluskan. Tambahkan aquades
Atau sedikit-sedikit sampai rata, tambahkan
aquades terus sampai volumenya 100
I2 (Iodium) 1 gram ml, dan simpan dalam botol coklat.
KI (Kalium Iodida) 2 gram 300 ml
Aquades 300 ml
Cat Gram C HCl 3% 2 ml 100 ml Tambahkan aquades sedikit-sedikit
dan campur sampai rata, tambahkan
Alkohol absolut s/d 100 ml awuades terus sampai volumenya 100
ml, simpan dalam botol coklat.
Campurkan hingga homogen dan
simpan pada botol coklat.
Atau Aseton 30 ml 100 ml Campurkan hingga homogen dan
Alkohol absolut 70 ml simpan dalam botol coklat.
Atau Aseton 50 ml 100 ml

Alkohol absolut 50 ml
(96%)
Cat Gram D Safranin 0,5 gram 100 ml Larutkan safranin dalam alkohol
Alkohol absolut 10 ml absolut, tambahkan aquades sampai
Aquades s/d 100 ml volume 100 ml dan saring dengan
kertas saring.
Larutkan safranin dalam alkohol
absolut, tambahkan aquades, saring
Atau Safranin O 0,25 gram 100 ml dan tempatkan dalam botol coklat.
Aquades 90 ml
2. Pengecatan Basil Tahan Asam (BTA)/Acid Fast
Pengecatan acid fast ini mula-mula dikembangkan oleh EHRLICH pada tahun 1882.
Sebagai cat utama digunakan aniline oil methyl violet, pelunturnya HCl, dan cat penutup/cat
lawan digunakan Bismark Brown Y. Kemudian ZIEHL pada tahun yang sama, mengganti anilin
dengan fenol, dan NELSSEN tahun 1883, menggunakan karbol fuchsin sebagai pengganti dan
H2SO4 sebagai pengganti HCl. Dalam perkembangan selanjutnya sebagai peluntur adalah alkohol
asam dan sebagai cat lawan digunakan Methylene Blue. Selanjutnya pengecatan dengan bahan-
bahan ini disebut metoda pengecatan ZIEHL – NELSSEN.
Pengecatan acid fast ini termasuk pengecatan diferensial, karena dapat digunakan untuk
membedakan bakteri yang acid fast (Basil Non Tahan Asam BTA+) dengan bakteri yang non
acid fast (Basil Non Tahan Asam / bukan BTA). Bakteri acid fast (BTA) adalah bakteri yang
tahan terhadap pelunturan alkohol asam (alkohol absolut dan asam kuat).
Bakteri yang tergolong genus Mycobacterium (M. Tuberculosis dan M. Leprae) dan
beberapa Actinomycetes, dinding selnya diliputi bahan semacam lemak (asam mikolat) dan lilin
(waks). Bakteri-bakteri ini sebenarnya bersifat gram positif, akan tetapi sangat sulit untuk dicat
gram atau cat lainnya, karena adanya lapisan lilin tersebut. Jika bakteri ini dicat dengan carbol
fuchsin sambil dipanaskan 90°C di atas penangas air selama 4 menit, atau smear bakteri
digenangi dengan carbol fuchsin, gelas benda dipegang dengan penjepit, lain dipanaskan sambil
digoyang-goyang di atas nyala api spirtus selama kurang lebih 4 menit, maka lapisan lilinnya
menjadi lunak / meleleh yang menyebabkan cat masuk menembus ke dalam sel. Setelah dingin,
cat tersebut telah terikat erat dengan dinding sel, sehingga tidak luntur pada pencucian dengan
alkohol asam (alkohol 96% yang mengandung 5-10 % HCl), dan oleh sebab itu, bakteri tersebut
dinamakan bersifat fast acid. Pada pemberian cat lawan / cat penutup methylene blue / brilliant
green) bakteri ini akan berwarna merah dengan latar belakang biru / hijau.
Bakteri-bakteri yang non acid fast acid (non BTA), cat utama yang melekat adanya akan luntur
dengan pencucian menggunakan alkohol asam, sehingga dengan demikian cat lawannya dapat
memberi warna pada sel.
Mekanisme pengecetan acid fast (BTA)

Basic / karbol fuchsin yang berwarna merah ini lebih mudah larut dalam fenol dari pada
dalam air atau dalam alkohol asam. Fenol lebih mudah larut dalam lemak atau lilin, dari pada
dalam air. Dengan demikian, bakteri acid fast (BTA) yang banyak mengandung lemak dan lilin
dalam keadaan panas lebih mudah menyerap basic/ karbol fuchsin yang larut dalam fenol.
Pada pencucian dengan alkohol asam, basic/ karbol fuchsin dan fenol sangat tahan
terhadap senyawa tersebut. Jika lemak atau lilin ini dihilangkan , misalnya bakteri dilarutkan
dalam pelarut lemak/ lilin yang kuat, maka bakteri acid fast dapat berubah menjadi nin acid fast.
Cara pengecetan Basil Tahan Asam ini dapat dilakukan berbagai macam cara,
diantaranya dengan pengecetan Zielh-Neelsen, pengecetan cara Kinyom-Gabbet, dan pengecetan
Fluorchrome. Akan tetapi sampai sekarang yang lazim dipakai adalah cara Ziehl- Neelsen,
Karena hasilnya lebih baik, murah dan mudah pengerjaanya.
Pengecetan cara Kinyoun-Gabbett, Sebenarnya hampir sama dengan pengecetan Ziehl-
Neelse, perbedaanya adalah, bahwa pada pengecetan cara Kinyoun-Gabbett, phenol yang
digunakan lebih tinggi (8%) sedangkan pada pengecetan cara Ziehl – Neelsen 5%. Dengan
pemakaian kadar phenol cara tinggi ini, maka pengecetan cara kinyoun – Gabbert tidak perlu
dengan pemanasan. Akan tetapi, phenol dengan konsentrasi tinggi dapat melarutkan lemak /
fillin pada dinding sel BTA ini, juga menyebabkan sel bakteri rusak. Dengan demikian pada
pengecetan cara ini seringkali didapati sel BTA yang terputus-putus. Pengecetan dengan cara
Floulorchrome, selain bahannya mahal juga pengamatan BTA mikroskop khusus yaitu
mikroskop fluorescen.
1. Pengecatan BTA menurut Zichl-Neelsen (Z-N)
Cat yang digunakan dalam pengecatan ini adalah Cat Ziehl-Neelsen
No. Cat Bahan Jumlah Volume cat
1 Cat Z-N : A Alkohol/basic/karbol fuchsin 10 ml 100 ml
3%
90 ml
Phenol 5 C%
2 Cat Z-N : B HCl pekat (37%) 3 ml 100 ml
3 Cat Z-N : C Methylene Blue 0,1 gram 100 ml
Aquades 100 ml
Cara Pengecatan Ziehl-Neelsen / Z-N

1. Smear / sediaan yang telah kering angin di fiksasi, diletakkan pada rak pengecatan,
lalu genangi dengan larutan Cat Z-N : A, jepit gelas preparat dengan penjepit,
lewatkan beberapa kali di atas nyala Spiritus / selama 5 menit, sampai keluar uapnya,
tetapi jangan sampai mendidih atau kering.
2. Cat dibuang, dan cuci dengan air mengalir
3. Larutkan warna merah pada smear dengan Cat Z-N : B, sampai bersih
4. Cuci dengan air mengalir
5. Genangi sediaan / smear dengan Cat Z-N : C, biarkan selama 20-30 detik
6. Cuci dengan air mengalir, kering anginkan.
Hasil pengecatan :
BTA + : Basil Tahan Asam positif, berwarna merah
BTA - : Basil Tahan Asam negatif / non BTA / bukan Basil
Tahan Asam, berwarna biru
Latar belakang : berwarna biru
Pada pengecatan ini smear digenangi karbol fuchsin dan dipanaskan, menyebabkan
selubung lemak pada sel BTA terbuka, dan cat masuk ke dalam, badan, sel bakteri. Bakteri yang
tidak tahan asam / non BTA, dalam hal ini dengan mudah menyerap cat tersebut, baik dengan
pemanasan atau tidak, dan semuanya (BTA dan Non BTA) berwarna merah.
Pada waktu dicuci dengan air mengalir, selubung lemak pada BTA tertutup kembali,
sehingga pada waktu dilarutkan dengan alcohol asam BTA tetap berwarna merah, sedangkan
bakteri non BTA berwarna pucat/transparan (karena cat fuchsin yang melekat pada selnya luntur
oleh alkohol asam). Pada pengecatan dengan cat lawan/cat penutup methylene blue, BTA tetap
berwarna merah (karena methylene blue tidak dapat menembus lapisan lilin) dan Bakteri Non
BTA berwarna biru.
2. Pengecatan BTA menurut Kinyoun – Gabbett
Cat yang digunakan dalam pengecatan ini adalah
a. Cat Kinyoun
No. Bahan Jumlah Volume Cat

1 Basic Fuchsin 4 gram
2 Larutan Phenol 8 ml
3 Alkohol Absolut 20 ml 100 ml
4 Aquades s/d 10 ml
b. Cat Gabbett
No. Bahan Jumlah Volume Cat
1 Methylene Blue 1 gram
2 Asam Sulfas p.a. 20 ml
3 Alkohol Absolut 30 ml 100 ml
4 Aquades 50 ml
Cara pengecatan BTA menurut Kinyoun-Gebbet
1. Sediaan/smear yang sudah difiksasi digenangi dengan cat Kinyoun selama 3 menit.
2. Cuci dengan air mengalir sampai bersih.
3. Genangi dengan cat Gabbet selama 1 menit.
4. Cuci dengan air mengalir sampai bersih, keringkan.
Hasilnya: BTA berwarna merah, sedangkan bakteri non BTA berwarna biru.
Pada pengecatan dengan cat Kinyoun bakteri tercat dan berwarna merah. Masuknya cat
fuchsin ke dalam badan sel bakteri (BTA) dipengaruhi oleh phenol;alcohol dan tingginya
kadar cat. Pengecatan dengan cat Gabbert, terjadi dua proses yaitu :
a. Terjadi pelarutan warna merah dart fuchsin, yang ads, pada bakteri non BTA, sehingga
bakteri berwarna pucat/ transparan.
b. Dengan pemberian cat Gabbert, bakteri non BTA berwarna biru, karena menyerap zat
warna methylene blue, Bakteri yang tahan asam (BTA) tidak terpengaruh oleh zat
Gabbert (Methylene Blue), sehingga tetap berwarna merah.
3. Pengecatan BTA dengan Flucrochrome

Cat yang digunakan dalam pengecatan ini adalah : Cat Flucrochrome
No. Cat Bahan Jumlah Volume cat Cara Membuat

Flucrochrom
e
1. Cat Larutan phenol 3% s/d 100 ml Campurkan,dikocok
Auramine (dihangatkan) 100ml bolak balik sampai
Phenol Auramine O homogen dan disaring
0,3 g
2. Asam HCl Pekat(37%) 1ml 100 ml Campurkan, kocok
Alkohol bolak balik sampai
Alkohol absolut 99ml
homogeny dan
disaring
3. Kalium Kalium Permanganat 0,1 gram 100 ml
Permanganat
Aquades 100ml
Cara Pengecatan BTA dengan Flucrochrome.
1. Sediaan atau smear yang telah difikasasi digenangi dengan Auramine Phenol selama 10
menit
2. Cuci dengan air mengalir
3. Genangi dengan asam alcohol selama 5 menit
4. Genangi dengan air mengalir
5. Genangi dengan kalium permanganate selama 30 detik
6. Cuci dengan air mengalir, keringkan.
Hasil Pengecatan
Sediaan atau smear yang sudah dicat dan sudah kering diamati dengan menggunakan
mikroskop Fluorescen dengan perbesaran 100x (perbesaran kuat).
Basil Tahan Asam (BTA) berwarna kuning berpendar (fluorescensi) bakteri yang tidak
asam (Non BTA) tidak kelihatan.
Pada pengecatan dengan auramine phenol, semua bakteri berwarna kuning oleh zat warna
auramine. Pada proses pelarutan dengan alcohol asam, BTA tidak melepaskan warna kuning
dari auramine, sehingga warnanya pucat / transparan. Sehingga dengan pengecatan
menggunakan kalium permanganat, senyawa ini tidak mewarnai BTA maupun non BTA.
Senyawa ini memberi warna latar belakang smear, sehingga warna kuning dari BTA semakin
lebih jelas.
C. Pengecatan Majemuk
Adalah suatu pengecatan yang dilakukan dengan suatu campuran cat yang terdiri dari 2
atau 3 jenis cat yang terlarut. Pada pengecatan ini bermacam-macam cat bekerja bersamaan
terhadap sel, jaringan atau bagian-bagian sel, sesuai dengan afinitasnya, sehingga diperoleh
hasil yang berbeda-beda. Contoh cat Wright, Giemsa, Kiewiet de Yong, dsb.
Bagian-bagian dari sel bakteri, seperti granula intravital, granula metachromatine, kapsul,
spora, flagella, tidak dapat terlihat dengan jelas. Jika dicat dengan cara pengecatan yang
umum dilakukan, karena struktur fisik maupun kimiawi dari bagian sel tersebut sangat
berbeda-beda. Bagian-bagian tersebut hanya dapat dilihat dan diamati dengan pewarnaan
khusus.
Granulla intravital (granula di dalam sel bakteri) sukar dilihat pada sel bakteri yang telah
mati. Denga menggunakan cat yang sangat encer, untuk mencegah jasad keracunan /
kematian jasad / sel dapat diperiksa dan dipelajari dengan teliti. Protoplasma sel yang masih
muda, pada pengecatan ini tampak homogeny, semakin tua selnya, maka akan semakin besar
dari jelas granula intravitalnya. Granula intravital ini akan semakin jelas pada saat menjelang
pembelahan sel.
Granula metachromatin atau granula volutin, yang merupakan cadangan makanan yang
terdiri dan metapospat, sangat mudah menyerap cat basis seperti basic fuchsin, kristal violet
atau methyl violet. Umumnya granula metachromatin ini banyak terdapat pada sel-sel yang
telah tea dan telah berhenti pertumbuhannya. Adanya granula metachromatin ini digunakan
untuk membantu identifikasi atau determinasi bakteri tertentu, misalnya Corynebacterium
diphteriae.
Semua bakteri membentuk kapsula, akan tetapi hanya beberapa spesies bakteri yang
kapsulnya cukup tebal sehingga dapat dengan mudah diamati dengan Mikroskop, setelah
dilakukan pengecatan khusus. Pengecatan kapsula ini tidak sulit, walaupun kapsula tidak
mempunyai afinitas yang besar terhadap cat. Oleh sebab itu pengamatan kapsula biasanya
dilakukan dengan pengecatan negatif, yaitu pewarnaan terhadap latar belakang dan kapsula
terlihat kosong (tidak terwarnai) dan warnanya transparan. Pengecatan negatif diantaranya
adalah pengecatan cara Burryi-Gins, Pengecatan Welch, pengecatan Anthony dengan
pengamatan pada mikroskop Dark Field Illumination.
Spora bakteri sifatnya tahan terhadap khemikalia, oleh sebab itu spora sangat sulit dicat.
Spora tidak dapat dicat dengan pengecatan biasa. Bakteri bentuk batang yang membentuk
spora, jika dicat dengan pengecatan biasa (pengecatan Gram, pengecatan sederhana) akan
terlihat adanya bagian yang kosong / tidak tercat / transparent, dan ternyata bagian tersebut
adalah spora. Pengecatan spora diantaranya dapat dilakukan menurut Schaeffer-Fulton, Klein
dan Wirtz-Conklin, serta Batholomiew-Mittwer. Dengan pengecatan-pengecatan tersebut
bagian terluar spora yang bebas tampak seperti cincin kecil berwarna biru, merah atau hijau,
tergantung cara pengecatan yang dipakai. Tidak semua bakteri membentuk spora. Beberapa
bakteri dapat membentuk satu spora di dalam sel vegetatifnya (endospore). Diameter spora
dapat sama atau lebih kecil atau lebih besar dari Vegetatifnya letak spora dalam sel bakteri
dapat di tengah (Central), sub (terminal) / para sentral atau di ujung (terminal) sel.
Flagella merupakan filamen-filamen protein yang halus oleh sebab itu sangat sulit
diamati dengan pengecatan yang umum. Flagella dapat diamati dengan mikroskop dark field
illumination atau dengan pengecatan khusus pengecatan flagella ini sulit dilakukan
Prinsipnya adalah untuk lebih mudahnya flagella ini dapat diamati maka diameternya harus
diperbesar dengan memberikan mordan, kemudian dicat dengan adanya mordan tersebut,
memungkinkan cat dapat diikat dengan lebih intensif kadang-kadang cat dan mordan
diberikan bersama-sama tapi dapat juga sendiri-sendiri.
Cara pengecatan yang lain adalah ah pengecatan Bailey, dan pengecatan Muir dengan
pengecatan ini sel bakteri berwarna tua dan flagella berwarna lebih muda berdasarkan letak
dan flagella sel bakteri dibedakan menjadi atrik (tanpa flagella), monotrik (flagella satu di
ujung sel), lofotrik (flagella banyak bergerombol di salah satu ujung sel), amfitrik (flagella
berada di kedua ujung sel), peritrik (flagella banyak menyebar di seluruh badan sel).
Inti Bakteri merupakan inti yang belum sempurna perkembangannya, karena inti tersebut
belum mempunyai membran inti (sel prokariotik). Inti bakteri dapat dilihat dengan
mikroskop electron. Dalam elektron micrograph inti ini merupakan daerah yang elektron
dense, yaitu daerah yang tidak dapat ditembus oleh sinar elektron. Pada pengamatan dengan
mikroskop biasa, bakteri dapat diamati setelah dilakukan pengecatan khusus misalnya
dengan pengecatan Feulgen dan pengecatan Giemsa. Cat Feulgen dibuat dengan cara
mereduksi warna basic fuchsin dengan asam sulfat atau asam sulfit larutan ini disebut
sebagai reagensia Schiff. Inti bakteri mengandung DNA, yang jika DNA inti ini dihidrolisa
dengan HCL, maka akan dibebaskan gugus gugus aldehid sebagai hasil perantara adanya
aldehid ini akan membebaskan basic fuchsin sehingga warna basic fuchsin akan tampak
kembali. Warna yang timbul ini lebih Merah violet, dibandingkan dengan warna basic
fuchin yang asli (merah). Reaksi Feulgen dengan DNA sangat spesifik, sehingga dapat
menunjukkan letak bahan-bahan inti di dalam sel. Reaksi Feulgen dengan DNA tidak
menunjukkan reaksi positif.
Pada pengecatan Giemsa, sel bakteri mula-mula difiksasi dengan osmium tetraoksida,
kemudian dihidrolisa dengan HCl atau larutan ribonuklease sehingga RNA bakteri akan
rusak, sedangkan DNA bakteri tidak terpengaruh. Pemberian cat Giemsa akan menyebabkan
DNA berwarna hitam, sehingga dapat menunjukkan letak dan bahan inti di dalam sitoplasma,
yang sama halnya dengan DNA yang terdapat di dalam inti, yang mempunyai afinitas yang
besar terhadap cat basis. Jika RNA, tidak dihidrolisa terlebih dahulu, maka pemberian cat
Giemsa akan mewarnai seluruh RNA dan DNA sehingga struktur inti tidak akan tampak
jelas.
Pengecatan Granula Metachromatin
1. Pengecatan Granula Metachromatin menurut Neisser
Pada pengecatan ini, granula metachromatin yang berada di ujung badan sel bakteri akan
berwarna biru oleh methylene blue, sedangkan badan sel bakteri berwarna kuning atau
coklat.
Kombinasi cat Neisser
No Cat Bahan Jumlah Volume cat
1. Cat Neisser A Methylene blue 0,1 gram 100 ml
Asam asetat 5 ml
pekat
95 ml
Aquades
2. Cat Neisser B Bismarck brown 0,2 gram 100 ml
Aquades 100 ml
Cara pengecatan granula metachromatik menurut Neisser
2. Sediaan digenangi dengan cat Neisser A selama 1 menit.
3. Cuci dengan air mengalir.
4. Genangi dengan cat Neisser B selama 10 detik.
5. Cuci dengan air mengalir, keringkan dan periksa di bawah mikroskop dengan perbesaran
kuat (menggunakan minyak imersi).
Pada pengecatan dengan cat Neisser A, granula metachromatik berwarna biru tua dan badan
sel bakteri berwarna biru muda. Pada waktu dicuci dengan air mengalir, granulla
metachromatik menjadi berwarna biru muda sedang badan sel bakteri tidak berwarna.
Dengan pemberian cat Neisser B, cat Bismarck Brown memberikan warna kuning coklat
pada badan sel bakteri.
2. Pengecatan granula metachromatik menurut Loeffer
Hasil pengecatan granula metachromatik dengan cat Loeffer ini menunjukkan bahwa
granulla metachromatik berwarna biru tua dan badan sel bakteri berwarna biru muda.
Komposisi cat Loeffer
No Bahan Jumlah Volume cat
1. Methylene Blue 0,3 gram
2. Alkohol Absolut 30 ml 100 ml
3. Potasium hidroksida (KOH) 0,1 ml
10%
4. Aquades 100 ml
Latihan
berikut!
1. Sebutkan apa saja reagen mikrobiologi

2. Faktor –faktor apa saja yang mempengaruhi pengecatan
3. Apa saja komposisi cat gram
4. Sebutkan cara – cara pengecatan
Ringkasan
1. Reagen mikrobiologi adalah reagen yang digunakan untuk penunjang dalam uji
mikrobiologi. Dibagi menjadi beberapa jenis yaitu : reagen Kovac’s, reagen Vogen –
Proskeur, reagen Methyl red, reagen Oksidase, reagen Katalase, dan reagen uji nitrit.
2. Cat / pewarnaan bakteri berfungsi untuk mempermudah pengamatan bakteri di bawah
mikroskop untuk keperluan identifikasi. Pemberian warna pada bakteri terutama pada sel
dan bagian – bagiannya akan mempermudah dalam proses pengamatan dan identifikasi.
3. Adapula faktor – faktor yang dapat mempengaruhi pengecatan yaitu fiksasi, substrat organic
dari sel, peluntur cat (Decolorizer), Intensifikasi pengecatan, cat penutup/lawan.
4. Cara pengecatan dibagi menjadi 3 yaitu pengecatan progresif atau pengecatan direct atau
pengecatan monocromate, pengecatan regresif atau pengecatan contrast atau pengecatan
indirect, dan pengecatan majemuk.
5. Pengecatan progresif adalah pengecatan yang hanya menggunakan satu jenis cat saja. Dibagi
menjadi beberapa jenis yaitu pengecatan negative dan pengecatan sederhana.
6. Pengecatan regresif adalah pengecatan yang menggunakan lebih dari satu macam cat. Dibagi
menjadi beberapa jenis yaitu pengecatan gram dan pengecatan BTA.
7. Pengecatan majemuk adalah pengecatan yang dilakukan dengan suatu campuran cat yang
terdiri dari 2 atau 3 jenis cat yang terlarut.
Tes 3
1. Pengecatan gram awal mula dikembangkan oleh…

a. Loffler
b. Albert Einstein
c. Christian Gram
d. Michael Gram
e. Thomas A. Edison
2. Komposisi utama cat gram A adalah…
a. Kristal violet
b. Safranin
c. Alkohol
d. Malachite green
e. Methyl red
3. Warna latar belakang dari pengecatan BTA menurut Ziehl Neelsen adalah..
a. Merah
b. Hitam
c. Ungu
d. Biru
e. Hijau
4. Jumlah methylene blue dalam pembuatan 100 ml cat Neisser A adalah…
a. 1 gram
b. 0,1 gram
c. 3 gram
d. 2 gram
e. 5 gram
5. Berikut komposisi cat loeffler kecuali…
a. Methylene blue
b. Potassium hidroksida
c. Alkohol absolut
d. HCl
e. Aquades
6. Bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh
peluntur adalah…
a. Bakteri pathogen
b. Bakteri gram positif
c. Bakteri gram negative
d. Bakteri variable
e. Bakteri halofil
7. Gugus yang dapat memberikan warna pada molekul cat adalah..
a. Gugus alkil
b. Gugus amida
c. Gugus aldehid
d. Gugus keton
e. Gugus khromofor
8. Berapa jumlah Kristal violet dalam pembuatan cat gram A 100 ml…
a. 5 gram
b. 2 gram
c. 10 gram
d. 15 gram
e. 8 gram
9. Berapa jumlah HCl dalam pembuatan cat gram C 100 ml…
a. 2 ml
b. 3 ml
c. 4 ml
d. 5 ml
e. 6 ml
10. Berapa jumlah safranin dalam pembuatan cat gram D 100 ml…
a. 3 gram
b. 2 gram
c. 1,5 gram
d. 1 gram
e. 0,5 gram
Daftar Pustaka
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta
Pelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
2018.“Bakteri” .diakses di http://www.pusdik.kkp.go.id/elearning/index.php/modul/read/181219-

013917uraian-c-materi. Pada 25 Mei 2020
Yohana.,2014,diakses di
https://www.academia.edu/20623378/LAPORAN_AKHIR_PRAKTIKUM_MEDIA_REA
GENSIA_II pada 25 Mei 2020.
Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan
Kunci Jawaban
BAB 1
Latihan 1
1. Media kultur (pembenihan) adalah suatu reagensia yang terdiri dari bahan-bahan kimia,
bahan-bahan makanan yang dengan pengolahan tertentu menjadi apa yang disebut
2. Faktor – faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri pada media kultur adalah
faktor tumbuh seperti senyawa organic, keasaman (pH), suhu, oksigen, dan kekuatan ion
dan tekanan osmosa.
3. media menurut sifatnya dibagi menjadi beberapa jenis yaitu : transport media, entiment
media/media diperkaya, selektif media, universal media, diferensia media, identification
media, media penguji / assay media, media total kuman, dan media khusus.
4. Media kultur cair dibagi menjadi beberapa jenis yaitu : Nutrient Broth (NB), Brean Heart
Infusion Broth (BHI), NaCl Fisiologis, Alkali Pepton Water (APW) / air pepton, dan
Laktosa Broth (LB).
Tes 1
1. D 6. E
2. B 7. A
3. D 8. C
4. C 9. C
5. A 10. E
Latihan 2
1. a. Media harus mengandung semua nutrient/bahan makanan yang dibutuhkan oleh
mikroba
b. Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan muka, dan pH yang sesuai.
c. Media tidak boleh mengandung zat-zat penghambat
d. Media harus steril
2. Formula baku / bahan penunjang :
a. Nutrient yang terdiri dari proven, pepton, asam amino, dsb.
b. Sumber energy, yaitu karbohidrat
c. Logam atau mineral/trace element, seperti calcium, magnesium, ferro, pospat, sulfat,
nitrat, dll.
d. Buffer yang terdiri dari pospat dan asetat. Indikator, Phenol Red, Bromo Thymol Blue,
Bromo Cresol Purple, dsb.
e. Bahan selektif dapat berupa bahan eumia, antibiotika.
f. Bahan pemadat : agar-agar, protein, serum, gelatin, whole egg.
3. Cara Sterilisasi :
a. Isi tempat air dengan air sampai dekat angsang, kemudian api dinyalakan.
b. Media yang akan disterilkan dimasukkan ke dalamnya (diatas angsang). Perlu
diperhatikan bahwa media yang disterilkan di dalam erlenmeyer atau tabung-tabung
perlu ditutup rapat dengan kapas, kemudian dibungkus lagi dengan kertas ferkanmen
atau parafilm. Selanjutnya tutup dipasang dan sekrup-sekrup dikeraskan.
c. Kran pengatur tempat keluarnya uap, air dibiarkan terbuka sampai uap air banyak yang
keluar. Hal ini dimaksudkan agar di dalam bejana hanya ada uap air saja dan semua
udara terdesak keluar. Dengan demikian di dalam bejana hanya ada tekanan uap air
murni.
d. Kran pengatur tempat keluarnya uap air ditutup, sehingga tekanan uap di dalam
Autoclave naik sampai 2 atmosfer dan suhu menjadi 121°C (dapat dilihat pada
manometer dan thermometer).
e. Setelah tekanan dan suhu yang dimaksud sudaH dicapai (Jarurn manometer menunjuk
angka 15 lb., api dikecilkan dan ditunggu sampai 15 20 menit (suhu bertahan sampai
121°C dan tekanan bertahan sampai 2 atmosfer). Matikan api dan tunggu sampai
jurum manometer menunjuk angka 0, buka kran tempat keluar uap air, tunggu sampai
uap habis dan Autoclave dingin, baru sekrup Autoclave dibuka perlahan-lahan.
f. Media dituang pada cawan petri stern, secara aseptik (untuk media plate) dari
erlenmeyer, dan media dalam tabung reaksi dimiringkan (untuk media agar miring)
atau ditegakkan (untuk media cair dan media tegak).
4. Media uji padat terdiri dari : Manitol Salt Agar (MSA), Muller Hinton Agar (MHA),
ELEK (diphteri), Media Probisher, Semi Solid Agar (SSA), Triple Sugar Iron Agar
(TSIA), Simon Citrat, Urea Agar, dan Media Kudoh.
Tes 2
1. D 6. C
2. B 7. D
3. E 8. A
4. B 9. C
5. A 10. A
Latihan 3
1. Reagen Kovac’s, reagen Vogen – Proskeur, reagen Methyl red, reagen Oksidase, reagen
Katalase, dan reagen uji nitrit.
2. Faktor – faktor yang dapat mempengaruhi pengecatan yaitu fiksasi, substrat organic dari
sel, peluntur cat (Decolorizer), Intensifikasi pengecatan, cat penutup/lawan.
3. Komposisi cat gram :
a. Cat gram A : Kristal violet, Alkohol Absolut, Ammonium Oksalat, Aquades
b. Cat gram B : Iodium, KI, Aquades
c. Cat gram C : HCl, Alkohol Absolut
d. Cat gram D : Safranin, Alkohol Absolut, Aquades
4. Cara – cara pengecatan :
a. Pengecatan progresif atau pengecatan direct atau pengecatan monocromate
b. Pengecatan regresif atau pengecatan contrast atau pengecatan indirect
c. Pengecatan majemuk.
Tes 3
1. C 6. B
2. A 7. E
3. D 8. B
4. A 9. A
5. D 10. E

Bahan Ajar Medreg

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Bahan Ajar Medreg

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Daftar Isi

Topik 1Media Kultur (Pembenihan).......................................................................3

Topik 2 Pembuatan Media Uji................................................................................7

Topik 3 Reagen Mikrobiologi dan Pewarnaan Bakteri.........................................20

Kimia Analitik Kualitatif...........................................................................................45

Topik 1 Unsur-unsur dalam Kimia Analitik Kualitatif.........................................46

Topik 2 Analisa Kualitatif Secara Kering.............................................................55

Topik 3 Analisa Kualitatif Secara Basah..............................................................64

Kimia Analitik Kuantitatif........................................................................................82

Topik 1 Metode Titrametri....................................................................................84

Pembuatan media pertumbuhan untuk keperluan mikrobiologi bertujuan untuk

Dalam bab ini diharapkan anda mampu

1. Memahami tentang media untuk uji mikrobiologi

Uraian dalam bab ini terdiri dari 3 topik, yaitu :

1. Topik 1 – Media Kultur (Pembenihan)

Media Kultur (Pembenihan)

B. Medium Buatan untuk Mikrobia

C. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri pada media kultur

Menurut wujudnya / konsistensinya dikenal ada 4 jenis media, yaitu :

Menurut sifatnya / fungsinya, dikenal beberapa jenis media, yaitu :

8. Media Total Kuman

1 Phenol Red 6,8 – 8,2 Kuning- merah 1- 4 tetes 0,04 %

2 Methyl Red 4,2 – 6,2 Pink - kuning 2- 4 tetes 0,04 %

6 Methyl Orange 3,0 – 4,4 Pink - Kuning 2- 5 tetes 0,1 %

E. Media Kultur Cair

1. Nutrient Broth (NB)

5. b. Laktosa Broth (LB) double strain

F. Media Kultur Padat

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

5. Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)

6. A. Salmonella Shigella Agar (SSA)

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

B. Salmonella Shigella Agar (SSA)

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

7 Brilliant Green 0,00015

7. Vibrio Selektif Agar / Thiosulfat Bile Sukrosa Agar / TCBS

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

8. Plate Count Agar

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

10. Media Loffler / PAI

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

1. Apa yang dimaksud media kultur (Pembenihan)

Pilihlah salah satu jawaban yang paling benar!

Pembuatan Media Uji

Media dapat berfungsi untuk membiakkan, mengasingkan dan menyimpan

Formula baku dan bahan penunjang untuk membuat media adalah :

1. Nutrient yang terdiri dari proven, pepton, asam amino, dsb.

2. Sumber energy, yaitu karbohidrat

5. Bahan selektif dapat berupa bahan eumia, antibiotika.

6. Bahan pemadat : agar-agar, protein, serum, gelatin, whole egg.

B. Syarat – syarat suatu media

C. Hal – hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan media

D. Media Uji Padat

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

3. A. Media ELEK (diphteri)

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

4. Media Probisher (diphteri)

No. Bahan Jumlah pH Volume Jumlah

5. Semi Solid Agar