TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER

DASAR

Rizki Nisfi Ramdhini, M.Si

Universitas Lampung
 Pendahuluan
• Membahas tentang:
– Struktur dan fungsi organisasi unit biologi pada
level seluler dan molekular
– Ekspresi genetik
– Prinsip-prinsip rekayasa genetika
 Tahapan Teknik Biologi Molekuler

 Ekstraksi Asam Nukleat

 PCR (Polymerase Chain Reaction)
 Elektroforesis
 Ekstraksi Asam Nukleat
• Asam Nukleat >> Molekul makro yang tersusun dari rantai
nukleotida monomerik:
– DNA (deoxyribonucleic acid)
– RNA (ribonucleic acid)

• Tujuan Ekstraksi:
– Memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya
sehingga cukup murni untuk dianalisis dan atau
dimodifikasi lebih lanjut.
 Ekstraksi DNA

1. Homogenisasi Sel
 Organ dan jaringan

 Peralatan steril Menghilangkan aktivitas

DNAse

 Suhu 4ºC Menghindari digesti asam nukleat

oleh enzim nuklease
 Ekstraksi DNA

2. Pelisisisan Sel
– Melisiskan sel tetapi mencegah fragmentasi DNA.
– Bahan yang dapat digunakan:
• EDTA  mengikat ion magnesium (kofaktor yang
dibutuhkan oleh enzim DNase).
• Detergen  lisis dinding bakteri. Contoh: Tween,
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), Nonidet, Laureth dan
Triton. Untuk dinding lebih tebal dapat digunakan
enzim lisosim
 Ekstraksi DNA

3. Pemisahan DNA dari komponen lain

Dapat menggunakan:
• Fenol (pelarut organik)  protein larut dalam pelarut organik
sedangkan DNA tidak.
• Proteinase  mendigesti protein.
• Garam kaotropik.
• Setelah itu, asam nukleat dipresipitasi. Dapat digunakan: etanol
100%, isopropanol, PEG (polyethylene glycol). Dapat pula digunakan
NaCl, sodium asetat, dan amonium asetat.
• Presipitasi etanol dan pencucian pelet dengan etanol 70% dapat
dengan efektif menghilangkan garam dari DNA.
 Ekstraksi RNA
1. Metode hampir sama dengan ekstraksi DNA

2. Namun, RNA sangat mudah didigesti oleh RNase oleh karena RNase
relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida yang
menyebabkan proses renaturasi ketika dingin. Kesulitan penanganan
RNase juga karena RNase tidak membutuhkan ion logam sebagai
kofaktor

3. Dapat dicegah dengan menggunakan sarung tangan, tip berfilter, dan

penggunaan medium yang mengandung detergen kuat (misalnya
DEPC/diethylpryrocarbonate)  mendenaturasi RNase. Reagen yang
sering digunakan adalah guanidium thiocyanate. Selain itu, suhu
inkubasi dan sentrifugasi di bawah suhu optimum RNase (37oC).

4. RNA tidak tahan terhadap suhu tinggi.

 PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Teknik amplifikasi DNA selektif in Vitro yang meniru fenomena
replikasi DNA in Vivo
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
– Denaturasi (Melting)
• Memisahkan DNA untai ganda menjadi komponen untai
tunggal Memungkinkan Hibridisasi primer untai ganda
pada sekuen targetnya

Target Sequence

Target Sequence
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
– Annealing
• Hibridisasi primer PCR pada sekuen target suhu annealing
berasal dari suhu annealing primer hasil kalkulasi matematis
dikurangi 5ºC.
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
– Elongasi
• Mengamplifikasi daerah yang sudah dihibridisasi oleh primer.
PCR (Polymerase
Chain Reaction)
.
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Pada fase eksponensial
(tengah) pertambahan produk
PCR sebesar 2n+1, maka dengan
mengetahui pertambahan produk
ini dapat dihitung konsentrasi
awal DNA target dalam sampel.

• Setelah siklus ke-30-an biasanya

mulai memasuki fase plateau
(bahan habis, hasil sudah
banyak).
 Elektroforesis
 Analisis asam nukleat dan mendeteksi keberadaan produk PCR
 Perpindahan molekul yang bermuatan sebagai respon terhadap
medan elektrik
 DNA bergerak dari kutub negatif (katoda) ke kutub positif (anoda).
 Kecepatan perpindahan dipengaruhi oleh:
 Ukuran dan bentuk molekul, makin berat makin lambat.
 Konsentrasi agarosa
 Tegangan listrik
 Kekuatan buffer
 Komponen
Elektroforesis
1. Medium
• Agarosa
– Paling mudah dengan gel agarosa horizontal.
– Digunakan untuk molekul >100bp.
– Konsentrasi rendah digunakan untuk molekul DNA besar,
begitu sebaliknya.
• Poliakrilamid
– Biasanya untuk molekul <100bp.
– Disarankan menggunakan poliakrilamid dari pada
menggunakan 3% agarosa
 Komponen
Elektroforesis
2. Buffer
• Buffer TAE (Tris-Asetat-EDTA) untuk fragmen asam nukleat berukuran >
4kb. Paling sering dipakai namun lebih mudah kehilangan fungsinya
pada elektroforesis tegangan tinggi atau pada proses yang berlangsung
lama/berulang.
• Buffer TBE (Tris-Base-EDTA) untuk fragmen asam nukleat berukuran
0,1-3 kb. Kapasitas buffering lebih besar, namun dihindari pada
purifikasi asam nukleat dari gel
 Komponen
Elektroforesis
3. Marker
• Dibuat dengan memotong-motong plasmid yang telah
diketahui ukuran dan urutan sekuensnya.
• atau dengan mencampur fragmen DNA yang telah
diketahui panjangnya
 Komponen
Elektroforesis
4. Visualisasi
• Pengecatan fluorescent intercalating
dye etidium bromida (EtBr). EtBr
mengikat DNA dengan menginsersi di
antara stacked base-pairs.
• EtBr merupakan mutagen yang sangat
kuat! Alternatif : SYBR Green atau Gelstar
lebih aman.
• Luminasi dilakukan dengan sinar UV.
Nukleotida menyerap UV karena ikatan
rangkap terkonjugasi turunan purin dan
pirimidin yang menyerap UV.
 Sekuensing

Agarose 2%, Marker φX174/HaeIII digest

(Toyobo), voltase 100 volt, 400 A, 30
menit
Terimakasih