Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

PETUNJUK PRAKTIKUM
FITOKIMIA

Oleh:

Dr. Ni Putu Eka Leliqia, M.Si., Apt.

Dr.rer.nat Ni Putu Ariantari, M.Farm., Apt.
Ni Kadek Warditiani, S.Farm., M.Sc., Apt
Ni Luh Putu Vidya Paramita, S.Farm., M.Sc., Apt
Putu Oka Samirana, S.Farm., M.Sc., Apt
Anak Agung Rai Yadnya Putra, S.Farm., M.Si., Apt

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2020

1
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

I. KATA PENGANTAR

Puji syukur penyusun panjatkan kehadirat Ida Sanghyang Widhi Wasa, Tuhan Yang Maha
Esa, yang telah memberikan kemudahan kepada kami sehingga Petunjuk Praktikum Fitokimia ini
dapat diselesaikan. Petunjuk Praktikum Fitokimia ini disusun untuk membantu mahasiswa/praktikan
dalam menjalankan praktikum Fitokimia.
Buku petunjuk praktikum ini disusun berdasarkan pada beberapa literatur sebagai bahan
acuan. Kami menyadari bahwa materi dalam buku ini masih belum sempurna. Teori-teori yang
mendasari percobaan masih harus dilengkapi oleh mahasiswa. Oleh karena itu, mahasiswa
diharapkan dapat mendalami dan mempertajam pemahaman terhadap materi-materi dalam buku ini
dengan membaca buku-buku lain seperti tercantum dalam daftar pustaka atau literatur lainnya.
Besar harapan kami buku ini dapat dimanfaatkan dengan sebaik-baiknya oleh praktikan untuk
kelancaran praktikum fitokimia. Akhir kata, segala masukan dan saran dari pembaca sangat kami
harapkan demi kesempurnaan penyusunan buku petunjuk praktikum ini.

Bukit Jimbaran, September 2020

Penyusun

2
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

II. TATA TERTIB PRAKTIKUM FITOKIMIA

1. Mahasiswa harus sudah berada di laboratorium 15 menit sebelum praktikum dimulai. Bagi yang
terlambat, tidak diperkenankan mengikuti praktikum.
2. Mahasiswa diharuskan mengenakan jas praktikum bersih dan warna putih.
3. Sebelum mengikuti praktikum, mahasiswa diwajibkan mengikuti pretest. Bagi mahasiswa yang
tidak lulus pretest (nilai kurang dari atau sama dengan 65), tidak diperkenankan mengikuti
praktikum.
4. Selama praktikum, mahasiswa tidak diperkenankan membawa makanan/minuman ke dalam
laboratorium, ngobrol/bertanya, meminjam alat/buku kepada sesama praktikan yang dapat
mengganggu jalannya praktikum.
5. Bekerjalah dengan bersih dan bahan-bahan praktikum diambil secukupnya. Setelah mengambil
bahan, botol/wadah tempat bahan dikembalikan ke tempat semula.
6. Mahasiswa diharapkan menyiapkan buku catatan / jurnal sesuai dengan format yang disiapkan
untuk mencatat semua pekerjaan selama praktikum. Cara Kerja dalam Jurnal harus dibuat
sebelum praktikum dimulai.
7. Bila berhalangan hadir, terlebih dahulu membuat surat izin kepada dosen pembimbing praktikum
pada hari yang bersangkutan.
8. Bila praktikan memecahkan atau merusakkan alat, maka praktikan harus mengganti alat tersebut
dengan spesifikasi alat yang sama disertai nota pembelian.
9. Semua peraturan diatas (no 1-8) untuk kegiatan praktikum off-line. Karena kondisi
pandemi COVID-19, maka praktikum Fitokimia akan diselenggarakan on-line
menggunakan media Oase, Webex, atau media lainnya.

Bukit Jimbaran, September 2020

Penyusun

3
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

III. ACARA PRAKTIKUM FITOKIMIA

PRAKTIKUM GOL. ACARA PRAKTIKUM

KE-
I
1 ASISTENSI
II
2 I
DEFATTING DAN EKSTRAKSI
II
3 I
PENGUAPAN PELARUT DAN SKRINING FITOKIMIA
II
4 I
EKSTRAKSI CAIR-CAIR DAN PENGUAPAN PELARUT
II
5 I
KLT DAN IDENTIFIKASI DENGAN PEREAKSI KIMIA
II
6 I KROMATOGRAFI KOLOM LAMBAT/KROMATOGRAFI
II CAIR VAKUM
7 I KROMATOGRAFI KOLOM LAMBAT/KROMATOGRAFI
II CAIR VAKUM
8 I
KLT HASIL FRAKSINASI
II
9 I
KROMATOGRAFI PREPARATIF
II
10 I
KROMATOGRAFI PREPARATIF
II
11 I
KLT HASIL SUBFRAKSINASI
II
12 I IDENTIFIKASI DENGAN KLT
II DENSITOMETER/GESERAN SPEKTRUM
13 I LAPORAN AKHIR
II
14 I
RESPONSI
II

Catatan: Jadwal lebih detail terlampir

4
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

IV. PEMISAHAN, ISOLASI DAN IDENTIFIKASI FLAVONOID

1. TUJUAN PRAKTIKUM
a. Mengetahui prinsip-prinsip pemisahan dan isolasi Flavonoid dari matriks tumbuhan dengan
kromatografi
b. Mengetahui cara-cara identifikasi flavonoid baik dengan pereaksi kimia, KLT yang
dilanjutkan dengan pereaksi semprot dan dengan melihat pergeseran spektrum

2. TEORI
Flavonoid merupakan suatu golongan metabolit sekunder tanaman yang memiliki inti
fenilpropanoid (benzopiran) terdiri dari 15 C (C6-C3-C6), yang dapat dimodifikasi secara luas,
baik dengan penataan ulang (rearrangement), oksidasi, alkilasi dan glikosilasi. Berdasarkan
posisi gugus fenil yang terikat pada struktur inti benzopiran, flavonoid dibedakan menjadi 3
golongan utama yaitu: (1) 2-fenil benzopiran (flavonoid); (2) 3-fenil benzopiran (isoflavonoid)
dan (3) 4-fenil benzopiran (neoflavonoid) (Grotewold, E., 2006).

Gambar 1. Stuktur kimia (1) 2-fenil benzopiran (flavonoid); (2) 3-fenil benzopiran (isoflavonoid)
dan (3) 4-fenil benzopiran (neoflavonoid)

Flavonoid ditemukan hampir pada semua tumbuhan tinggi, antara lain dari suku
Polygonaceae, Rutaceae, Leguminosae, Umbelliferae dan Compositae. Berdasarkan
penyebarannya di alam, flavonoid dibagi menjadi 2 golongan utama yaitu flavonoid mayor dan
flavonoid minor. Flavonoid mayor, penyebarannya di alam sangat luas, mencakup golongan
flavon, flavonol, flavanonol. Flavonoid minor, penyebarannya di alam terbatas pada suku-suku
tanaman tertentu, mencakup golongan chalkon, auron, isoflavon dan flavanon (Harborne, 1996).

3. ALAT DAN BAHAN

a. ALAT: alat-alat gelas, soxhlet-manthel heater, Vacuum rotary evaporator, microcapiller,
bejana pengembang kromatografi, glass column for VLC, vakum, UV-Cabinet, sprayer,
hotplate

5
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

b. BAHAN: serbuk simplisia daun seledri (Apium graveolens), n-heksan, etanol, n-butanol,
aquadest, etil asetat, HCl, NH3, AlCl3, pereaksi NaOMe atau NaOH 2M, Al TLC Silika Gel
GF 254, silika gel 60

4. CARA KERJA
a. EKSTRAKSI
1. Maserasi: 100 gram serbuk daun seledri dimasukkan dalam bejana maserasi, ditambahkan
400 mL n-heksan, diaduk, dibiarkan selama semalam sambil diaduk sesekali. Selanjutnya
disaring, filtrat disimpan dan ampas diremaserasi dengan 250 mL metanol, diaduk,
dibiarkan selama 1 hari sambil diaduk sesekali. Selanjutnya disaring, filtrat dikumpulkan
dan ampas diremaserasi kembali dengan 250 mL metanol, diaduk, dibiarkan selama 1 hari
sambil diaduk sesekali. Selanjutnya disaring, filtrat dikumpulkan dan pelarut diuapkan
dengan vacuum rotary evaporator.
2. Digesti: 100 gram serbuk daun seledri dimasukkan dalam beker glass, ditambahkan 400
mL n-heksan, dipanaskan pada suhu 40 0C selama 30 menit (dalam keadaan tertutup)
sambil diaduk dengan bantuan magnetik strirer. Selanjutnya disaring, filtrat disimpan dan
ampas diremaserasi dengan 250 mL metanol, dipanaskan pada suhu 45 0C selama 1 jam
(dalam keadaan tertutup) sambil diaduk dengan bantuan magnetik strirer. Selanjutnya
disaring, filtrat dikumpulkan dan ampas diremaserasi kembali dengan 250 mL metanol,
dipanaskan pada suhu 45 0C selama 1 jam (dalam keadaan tertutup) sambil diaduk
dengan bantuan magnetik strirer. Selanjutnya disaring, filtrat dikumpulkan dan pelarut
diuapkan dengan vacuum rotary evaporator
3. Soxhletasi: 20 gram serbuk daun seledri dibungkus dalam kertas saring, dimasukkan
pada alat sokhlet.

b. SKRINING FITOKIMIA
1. Pembuatan Larutan Uji: 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 10 mL metanol
2. Uji untuk flavonoid: Sebanyak 1 mL larutan ekstrak uji, basahkan sisanya dengan aseton
P, tambahkan 20 mg serbuk halus asam borat P dan serbuk halus asam oksalat P,
panaskan hati-hati di atas tangas air dan hindari pemanasan berlebihan. Campur sisa yang
diperoleh dengan 5 mL eter P. Amati dengan sinar UV 366 nm; larutan berfluoresensi
kuning intensif, menunjukkan adanya flavonoid
3. Uji untuk steroid dan triterpenoid: Pemeriksaan steroid dan triterpenoid dilakukan
dengan reaksi Liebermann-Burchard. Sebanyak 2 mL larutan uji diuapkan dalam cawan

6
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

penguap. Residu dilarutkan dengan 5 mL kloroform, kemudian ditambahkan 2 mL asam

asetat anhidrat. Selanjutnya ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung.
Terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan menunjukkan adanya
triterpenoid, sedangkan bila muncul cincin biru kehijauan menunjukkan adanya steroid
4. Uji untuk Saponin: Sebanyak 10 mL larutan ekstrak uji dalam tabung reaksi dikocok
vertikal selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 detik. Pembentukan busa setinggi
1 - 10 cm yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit, menunjukkan adanya saponin.
Pada penambahan 1 tetes HCL 2N, busa tidak hilang
5. Uji untuk alkaloid: Sebanyak 2 mL larutan ekstrak uji diuapkan di atas cawan porselin
hingga di dapat residu. Residu kemudian dilarutkan dengan 5 mL HCl 2N. Larutan yang
didapat kemudian di bagi ke dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan dengan
asam encer yang berfungsi sebagai blanko. Tabung kedua ditambahkan pereaksi
Dragendorff sebanyak 3 tetes dan tabung ketiga ditambahkan pereaksi Mayer sebanyak 3
tetes. Terbentuknya endapan jingga pada tabung kedua dan endapan kuning pada tabung
ketiga menunjukkan adanya alkaloid

c. EKSTRAKSI CAIR-CAIR
Ekstrak kental yang telah ditimbang dibagi 2: 1 bagian, ditimbang 20 mg untuk KLT dan
sisanya dipisahkan dengan ekstraksi cair-cair. Pada ekstrak hasil ekstraksi ditambahkan
aquadest, metanol dan n-butanol dengan perbandingan (9:1:10 v/v) dan beberapa tetes HCl
10%, dipartisi dengan corong pisah, sehingga diperoleh fraksi air dan fraksi butanol. Sebelum
diuapkan pelarutnya, kedua fraksi dibagi 2: masing-masing diambil sebanyak 5 mL lalu
diuapkan pelarutnya kemudian masing-masing ditambahkan 2 mL metanol untuk identifikasi
dengan KLT dan sisanya digunakan untuk pemisahan lebih lanjut. Kedua fraksi harus
ditimbang. Selanjutnya, terhadap kedua fraksi dilakukan uji identifikasi flavonoid dengan
KLT menggunakan fase diam: Al Silika gel GF254 dan fase gerak: n-heksan:etilasetat (5:1
v/v), pengamatan: UV 254 nm, 366 nm dan sitroborat/UV366. Pada KLT ini, ada 3 sampel
yang ditotolkan pada lempeng KLT yaitu: ekstrak metanol, fraksi air dan fraksi butanol. Jarak
antar bercak = 0,6 cm, ukuran lempeng 2,4 cm X 5 cm.
Catatan: cara perhitungan dan pembuatan campuran pelarut dan pereaksi harus ditulis
dengan lengkap pada jurnal.

7
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

d. KROMATOGRAFI VAKUM CAIR

1. Penyiapan fraksi: Fraksi butanol kental (ditimbang terlebih dahulu), ditambahkan
dengan beberapa tetes metanol. Selanjutnya ditambahkan silika sama banyak dengan
jumlah fraksi.
2. Penyiapan kolom: Sejumlah tertentu silika ditimbang, dimasukkan ke dalam kolom
sambil digetar-getarkan. Pada bagian atas kolom diletakkan kertas saring. Kolom
diekuilibasi dengan 30 mL campuran n-heksan:EA (8:1 v/v).
3. Eluasi: fraksi ditaburkan dibagian atas kolom yang sudah dikemas. Selanjutnya dieluasi
secara gradien masing-masing dengan 30 mL campuran eluen n-heksan:EA (8:1; 7:2; 6:3;
5:4; 4;5; 3:6 v/v). Tiap fraksi ditampung dalam vial/erlenmeyer, sehingga diperoleh 6
fraksi. Selanjutnya tiap fraksi diuapkan pelarutnya, kemudian ditimbang.
4. Terhadap setiap fraksi dilakukan analisis dengan KLT: sejumlah tertentu fraksi
dilarutkan dalam campuran n-heksan:EA (5:1 v/v). Selanjutnya ditotolkan pada lempeng
KLT Al Silika gel GF254 dan dieluasi dengan fase gerak: n-heksan:etilasetat (5:1 v/v),
pengamatan: UV 254 nm, 366 nm dan sitroborat/UV366. Pada lempeng yang sama juga
ditotolkan ekstrak metanol dan fraksi butanol.
5. Fraksi yang positif mengandung flavonoid berdasarkan hasil KLT diatas, dipisahkan lebih
lanjut.
6. Catatan: cara perhitungan dan pembuatan campuran pelarut dan pereaksi harus ditulis
dengan lengkap pada jurnal.

e. KLT PREPARATIF
1. Fase diam: lempeng Al Silika gel GF254, diberi tanda batas bawah kira-kira 1 cm dari
ujung lempeng
2. Fase gerak: bejana pengembang dijenuhkan dengan fase gerak campuran n-heksan:EA
(6:1 v/v)
3. Pembuatan larutan uji: sejumlah tertentu fraksi dilarutkan dalam sedikit campuran n-
heksan:EA (6:1 v/v) (larutan dibuat agak pekat). Larutan uji ditotolkan pada lempeng
dengan bantuan pipet dalam bentuk pita. Pelarut diuapkan kemudian lempeng dieluasi.
4. Pengamatan dan pengambilan bercak: lempeng yang telah dieluasi diamati dibawah
lampu UV, bercak yang positif flavonoid diambil. Flavonoid yang terikat pada silika
diekstraksi dengan campuran n-heksan:EA (6:1 v/v)
5. KLT hasil pemisahan: sejumlah tertentu subfraksi dilarutkan dalam campuran n-
heksan:EA (5:1 v/v). Selanjutnya ditotolkan pada lempeng KLT Al Silika gel GF254 dan

8
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

dieluasi dengan fase gerak: n-heksan:etilasetat (5:1 v/v), pengamatan: UV 254 nm, 366
nm dan NH3/UV366. Pada lempeng KLT juga ditotolkan ekstrak metanol, fraksi butanol
dan fraksi flavonoid hasil kromatografi cair vakum.
6. Catatan: cara perhitungan dan pembuatan campuran pelarut dan pereaksi harus ditulis
dengan lengkap pada jurnal.

f. IDENTIFIKASI DENGAN GESERAN SPEKTRUM

1. Pembuatan pereaksi geser:
NaOMe: 2,5 g logam Na (lebih baik ditangani dan ditimbang dalam keadaan terendam
dalam PE/n-heksan) atau gunakan NaOH 2 M, dipotong kecil-kecil dan ditambahkan ke
dalam 100 mL MeOH dengan hati-hati. Pereaksi pengganti yang cocok adalah NaOH 2 M
dalam air.
AlCl3: 5 g AlCl3 segar dan kering (bila dimasukkan ke dalam air harus berdesis)
ditambahkan dengan hati-hati ke dalam 100 mL MeOH.
2. Pembuatan spektrum MeOH: 0,1 mg isolat dilarutkan dalam 2 mL MeOH, dimasukkan
dalam kuvet 1 mL dan diamati dengan spektrofotometer. Cuplikan dapat diencerkan
sehingga rentang serapan berada dalam kisaran 0,2 – 0,8.
3. Pembuatan spektrum NaOMe: Cuplikan pada poin no.2 ditambahkan dengan 3 tetes
NaOMe/NaOH, dicampur dan diamati dengan spektrofotometer segera setelah
ditambahkan NaOMe/NaOH dan selang waktu 5 menit berikutnya.
4. Pembuatan spektrum AlCl3/HCl: Cuplikan pada poin no.2 ditambahkan dengan 6 tetes
AlCl3, dicampur dan diamati dengan spektrofotometer segera setelah ditambahkan AlCl3
dan selang waktu 5 menit berikutnya. Selanjutnya, ditambahkan 3 tetes HCl, dicampur
dan diamati dengan spektrofotometer segera setelah ditambahkan HCl dan selang waktu 5
menit berikutnya.
5. Catatan: cara perhitungan untuk pembuatan NaOH 2M dimasukkan dalam jurnal
6. Bandingkan spektrum yang Anda peroleh dengan pustaka.

9
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

V. PEMISAHAN, ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ALKALOID

1. TUJUAN PRAKTIKUM
a. Mengetahui prinsip-prinsip pemisahan dan isolasi Alkaloid dari matriks tumbuhan dengan
kromatografi
b. Mengetahui cara-cara identifikasi alkaloid baik dengan pereaksi kimia, KLT yang dilanjutkan
dengan pereaksi semprot dan menggunakan instrumen Densitometer

2. TEORI
Kata alkaloid dikenalkan pertama kali oleh W. Meisner pada awal abad 19 untuk senyawa
bahan alam yang beraksi seperti basa. Tidak ada definisi yang sederhana dan tepat untuk
alkaloid, kadang sulit untuk membedakan antara alkaloid dan metabolit yang mengandung
nitrogen. Alkaloid dapat digolongkan sebagai berikut:
1. Alkaloid sejati
Alkaloid sejati adalah senyawa yang mengandung nitrogen pada struktur heterosiklik,
struktur kompleks, distribusi terbatas yang menurut beberapa ahli hanya ada pada tumbuhan.
Alkaloid sejati ditemukan dalam bentuk garamnya dan dibentuk dari asam amino sebagai
bahan dasar biosintesis.
2. Pseudoalkaloid
Pseudoalkaloid memiliki sifat seperti alkaloid sejati tetapi tidak diturunkan dari asam amino.
Contoh: isoprenoid, alkaloid terpenoid (coniin) dan alkaloid steroidal (paravallarine)
3. Protoalkaloid
Protoalkaloid adalah senyawa amin sederhana dengan nitrpgen tidak berada pada cincin
heterosiklik. Contoh: mescaline, betanin dan serotonin
Alkaloid jarang ditemukan pada gymnospermae atau pteridophyta. Alkaloid banyak
ditemukan pada angiospermae (10-15%). Pada tanaman monokotil, alkaloid dapat ditemukan
pada famili Amaryllidaceae dan Liliaceae. Pada tanaman dikotil, alkaloid dapat ditemukan pada
famili Annonaceae, Apocynaceae, Fumariaceae, Lauraceae, Loganiceae, Magnoliaceae,
Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae, Rubiaceae, Rutaceae, dan Solanaceae.
Dalam memisahkan/mengisolasi suatu senyawa, karateristik sifat fisika dan kimia
senyawa tersebut memegang peranan penting. Berikut merupakan sifat fisika dan kimia dari
alkaloid:

10
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

1. Sifat fisika
Sebagian besar alkaloid di alam berbentuk kristal padat, beberapa berbentuk cair baik yang
bersifat mudah menguap (nikotin) atau tidak mudah menguap (pilokarpin), dan sebagian kecil
berbentuk padatan amorf (emetin). Alkaloid umumnya tidak berwarna, walaupun ada berepa
alkaloid yang berwarna seperti kolkisindan berberin (kuning). Umumnya alkaloid dalam
bentuk basanya larut dalam dalam pelarut organik dan alkaloid dalam bentuk garamnya larut
dalam pelarut berair.
2. Sifat kimia
Alkaloid merupakan senyawa yang mengandung nitrogen (N), letak N dapat sebagai amin
primer (norefedrin), amin sekunder (efedrin), amin tersier (atropine) maupun garam
ammonium kuartener (d-tubokurarin). Sifat basa amin sekunder lebih kuat daripada amin
primer dan amin tersier (R2-NH >R-NH2 > R3-N). Alkaloid dapat mengalami dekomposisi
dengan pemanasan kecuali kafein dan strihnin. Dengan penambahan asam, alkaloid basa akan
berubah menjadi bentuk garamnya.
Ekstraksi alkaloid umumnya menggunakan metode ekstraksi asam-basa. Kemudian
isolasinya dapat menggunakan metode koromatografi maupun fraksinasi (kristalisasi/fraksinasi
distilasi).

3. ALAT DAN BAHAN

a. ALAT: alat-alat gelas, soxhlet-manthel heater, Vacuum rotary evaporator, microcapiller,
bejana pengembang kromatografi, glass column for CC, UV-Cabinet, sprayer, hotplate
b. BAHAN: serbuk simplisia kulit batang kina (Cinchona succirubra), n-heksan, kloroform,
metanol, n-butanol, aquadest, etil asetat, H2SO4, HCl, Al TLC Silika Gel GF 254, silika gel
60

4. CARA KERJA
a. EKSTRAKSI
1. Maserasi: 100 gram serbuk kulit batang kina dimasukkan dalam bejana maserasi,
ditambahkan 400 mL n-heksan, diaduk, dibiarkan selama semalam sambil diaduk
sesekali. Selanjutnya disaring, filtrat disimpan dan ampas diremaserasi dengan 250 mL
metanol, diaduk, dibiarkan selama 1 hari sambil diaduk sesekali. Selanjutnya disaring,
filtrat dikumpulkan dan ampas diremaserasi kembali dengan 250 mL metanol, diaduk,

11
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

dibiarkan selama 1 hari sambil diaduk sesekali. Selanjutnya disaring, filtrat dikumpulkan
dan pelarut diuapkan dengan vacuum rotary evaporator.
2. Digesti: 100 gram serbuk kulit batang kina dimasukkan dalam beker glass, ditambahkan
400 mL n-heksan, dipanaskan pada suhu 40 0C selama 30 menit (dalam keadaan
tertutup) sambil diaduk dengan bantuan magnetik strirer. Selanjutnya disaring, filtrat
disimpan dan ampas diremaserasi dengan 250 mL metanol, dipanaskan pada suhu 45 0C
selama 1 jam (dalam keadaan tertutup) sambil diaduk dengan bantuan magnetik strirer.
Selanjutnya disaring, filtrat dikumpulkan dan ampas diremaserasi kembali dengan 250
mL metanol, dipanaskan pada suhu 45 0C selama 1 jam (dalam keadaan tertutup)
sambil diaduk dengan bantuan magnetik strirer. Selanjutnya disaring, filtrat dikumpulkan
dan pelarut diuapkan dengan vacuum rotary evaporator
3. Soxhletasi: 20 gram serbuk kulit batang kina dibungkus dalam kertas saring, dimasukkan
pada alat sokhlet.

b. SKRINING FITOKIMIA
1. Pembuatan Larutan Uji: 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 10 mL metanol
2. Uji untuk flavonoid: Sebanyak 1 mL larutan ekstrak uji, basahkan sisanya dengan aseton
P, tambahkan 20 mg serbuk halus asam borat P dan serbuk halus asam oksalat P,
panaskan hati-hati di atas tangas air dan hindari pemanasan berlebihan. Campur sisa yang
diperoleh dengan 5 mL eter P. Amati dengan sinar UV 366 nm; larutan berfluoresensi
kuning intensif, menunjukkan adanya flavonoid
3. Uji untuk steroid dan triterpenoid: Pemeriksaan steroid dan triterpenoid dilakukan
dengan reaksi Liebermann-Burchard. Sebanyak 2 mL larutan uji diuapkan dalam cawan
penguap. Residu dilarutkan dengan 5 mL kloroform, kemudian ditambahkan 2 mL asam
asetat anhidrat. Selanjutnya ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung.
Terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan menunjukkan adanya
triterpenoid, sedangkan bila muncul cincin biru kehijauan menunjukkan adanya steroid
4. Uji untuk Saponin: Sebanyak 10 mL larutan ekstrak uji dalam tabung reaksi dikocok
vertikal selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 detik. Pembentukan busa setinggi
1 - 10 cm yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit, menunjukkan adanya saponin.
Pada penambahan 1 tetes HCL 2N, busa tidak hilang
5. Uji untuk alkaloid: Sebanyak 2 mL larutan ekstrak uji diuapkan di atas cawan porselin
hingga di dapat residu. Residu kemudian dilarutkan dengan 5 mL HCl 2N. Larutan yang
didapat kemudian di bagi ke dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan dengan

12
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

asam encer yang berfungsi sebagai blanko. Tabung kedua ditambahkan pereaksi
Dragendorff sebanyak 3 tetes dan tabung ketiga ditambahkan pereaksi Mayer sebanyak 3
tetes. Terbentuknya endapan jingga pada tabung kedua dan endapan kuning pada tabung
ketiga menunjukkan adanya alkaloid

c. EKSTRAKSI CAIR-CAIR
Ekstrak kental yang telah ditimbang dibagi 2: 1 bagian, ditimbang 20 mg untuk KLT (10 mg
untuk analisis dengan KLT dan 10 mg untuk penetapan kadar) dan sisanya dipisahkan dengan
ekstraksi cair-cair. Pada ekstrak yang telah diuapkan/dipekatkan ditambahkan 10 mL larutan
asam sulfat 10%. Selanjutnya dipartisi dengan corong pisah menggunakan 20 mL etil asetat
sebanyak 3 kali. Fase air dan fase etil asetat I yang diperoleh kemudian ditampung. Fase air
yang diperoleh kemudian ditambahkan beberapa tetes amonia cair. Selanjutnya dipartisi
kembali dengan 20 mL etil asetat sebanyak 3 kali. Fase air dan fase etil asetat II yang
diperoleh kemudian ditampung. Ketiga fraksi hasil partisi (fase air, fase etil asetat I, fase etil
asetat II) kemudian masing-masing diambil sebanyak 5 mL lalu diuapkan pelarutnya
kemudian masing-masing ditambahkan 2 mL metanol untuk identifikasi dengan KLT dan
sisanya digunakan untuk pemisahan lebih lanjut. Semua fraksi yang diperoleh harus
ditimbang. Selanjutnya, terhadap ketiga fraksi dilakukan uji identifikasi alkaloid kuinin
dengan KLT menggunakan fase diam: Al Silika gel GF254 dan fase gerak: campuran CHCl3-
MeOH (9:1 v/v), pengamatan: UV 254 nm, 366 nm dan pereaksi semprot H2SO4 10%, jarak
antar bercak = 0,6 cm, tinggi lempeng 5 cm.
Catatan: cara perhitungan dan pembuatan campuran pelarut dan pereaksi harus ditulis
dengan lengkap pada jurnal.

d. KROMATOGRAFI KOLOM LAMBAT/TERBUKA

1. Penyiapan fraksi: Fraksi butanol kental (ditimbang terlebih dahulu), ditambahkan
dengan beberapa tetes campuran CHCl3-MeOH (9:1 v/v). Larutan dibuat sepekat
mungkin.
2. Penyiapan kolom: Bagian bawah kolom diisi dengan glass wool kemudian diisi dengan
kloroform (kira-kira 10 cm). Sejumlah tertentu silika ditimbang, dibuat menjadi bubur
silika dengan kloroform. Bubur silika dimasukkan ke dalam kolom dengan hati-hati,
secara kontinyu untuk mencegah terbentuknya lapisan-lapisan dan kran pada bagian
bawah kolom dibuka. Fase gerak kloroform ditampung dan dapat dipergunakan lagi untuk
menyiapkan kolom. Setelah semua bubur silika dimasukkan ke dalam kolom, kolom

13
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

diekuilibrasi dengan campuran CHCl3-MeOH (9:1 v/v) sebanyak 50 mL dan didiamkan

semalam.
3. Eluasi: larutan fraksi dimasukkan ke bagian atas kolom secara hati-hati dengan bantuan
pipet, melalui dinding kolom agar tidak merusak kolom silika yang telah dibuat. Dieluasi
dengan pelarut gradien campuran CHCl3-MeOH (dari 9:1 v/v sampai 5:5 v/v) masing-
masing sebanyak 20 mL. Fraksi ditampung dengan vial setiap 5 mL.
4. Analisis dengan KLT: Fraksi yang terkumpul kemudian dianalisis dengan KLT
menggunakan fase diam: Al Silika gel GF254 dan fase gerak: campuran CHCl 3-MeOH
(9:1 v/v), pengamatan: UV 254 nm, 366 nm dan pereaksi semprot H2SO4 10%, jarak antar
bercak = 0,6 cm, tinggi lempeng 5 cm. Fraksi yang mempunyai profil sama digabungkan
menjadi satu, diuapkan dan ditimbang.
5. Catatan: cara perhitungan dan pembuatan campuran pelarut dan pereaksi harus ditulis
dengan lengkap pada jurnal.

e. KLT PREPARATIF
1. Fase diam: lempeng Al Silika gel GF254, diberi tanda batas bawah kira-kira 1 cm dari
ujung lempeng
2. Fase gerak: bejana pengembang dijenuhkan dengan fase gerak campuran CHCl3-MeOH
(9:1 v/v)
3. Pembuatan larutan uji: sejumlah tertentu fraksi dilarutkan dalam sedikit campuran
CHCl3-MeOH (9:1 v/v) (larutan dibuat agak pekat). Larutan uji ditotolkan pada lempeng
dengan bantuan pipet dalam bentuk pita. Pelarut diuapkan kemudian lempeng dieluasi.
4. Pengamatan dan pengambilan bercak: lempeng yang telah dieluasi diamati dibawah
lampu UV, bercak yang positif alkaloid kuinin diambil. Alkaloid kuinin yang terikat pada
silika, diekstraksi dengan campuran CHCl3-MeOH (9:1 v/v)
5. KLT hasil pemisahan: sejumlah tertentu subfraksi dilarutkan dalam campuran CHCl3-
MeOH (9:1 v/v). Selanjutnya ditotolkan pada lempeng KLT Al Silika gel GF254 dan
dieluasi dengan fase gerak: campuran CHCl3-MeOH (9:1 v/v), pengamatan: UV 254 nm,
366 nm dan H2SO4 10%, jarak antar bercak = 0,6 cm, tinggi lempeng 5 cm. Pada lempeng
yang sama juga ditotolkan ekstrak metanol, fraksi kuinin hasil partisi dan kolom lambat
serta standar kuinin sulfat.
6. Catatan: cara perhitungan dan pembuatan campuran pelarut dan pereaksi harus ditulis
dengan lengkap pada jurnal.

14
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

f. PENETAPAN KADAR KUININ DALAM EKSTRAK DENGAN KLT-

DENSITOMETER
1. Fase diam: lempeng Al Silika gel GF254, diberi tanda batas bawah kira-kira 1 cm dari
ujung lempeng, jarak antar bercak 1 cm dan tinggi lempeng 10 cm.
2. Fase gerak: bejana pengembang dijenuhkan dengan fase gerak campuran CHCl3-MeOH
(9:1 v/v)
3. Penyiapan larutan uji:
Standar Kuinin
Disiapkan standar kuinin dengan konsentrasi 5.000 ng/µL, ditotolkan sebanyak 2, 4, 6, 8
dan 10 µL.
Larutan ekstrak
Ditimbang 10 mg ekstrak metanol kina dan dilarukan dalam 1 mL metanol, ditotolkan
sebanyak 6 µL, dengan 2 kali pengulangan.
4. Lempeng KLT dieluasi, kemudian di analisis dengan densitometer pada panjang
gelombang maksimum kuinin (dicari sendiri oleh praktikan).
5. Dibuat kurva kalibrasi dari standar kuinin, selanjutnya dihitung kadar kuinin dalam
ekstrak metanol kina

DAFTAR PUSTAKA

Ciulei, J. 1984. Metodology for Analysis of Vegetables and Drugs. Faculty of Pharmacy, Bucharest
Rumania. Hl. 11-26.
Grotewold, E., 2006. The Science of Flavonoid, Springer, USA
Harborne, J. B. 1996. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Terbitan
Kedua. Bandung: Penerbit ITB. Hl. 102-245.
Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung: Penerbit ITB. Hl. 18-19.
Mabry, T.J., K.R. Markham and M.B. Thomas. 1970. The Systematic Identification of Flavonoids.
USA: Springer-Verlag New York Inc. Hl 177
Reich, E. and A. Blatter. 2003. Modern TLC : A Key Technique of Identification and Quality
Control of Botanical and Dietary Supplements. Journal of Planar Chromatography – Modern
TLC (18). Hl. 34-37.
Robinson, T. 1991. Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi. Bandung: Penerbit ITB. Hl. 284-
285.

15
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

Lampiran 1. Penilaian Praktikum

No Jenis Penilaian Bobot (%)
1 Pretest, posttest atau kuis 20
2 Praktikum 30
- Jurnal 10
- Keaktifan praktikum online 10
- Kehadiran praktikum online 10
3 Laporan akhir praktikum (naratif 30
review)
4 Responsi 20

Standar Penilaian Akhir:

Angka Mutu (0-100) Skala Huruf
≥ 80 – 100 A
≥ 71 – 79 B+
≥ 65 – 70 B
≥ 60 – 64 C+
≥ 55 – 59 C
≥ 50 - 55 D+
≥ 40 – 49 D
≥ 0 - 39 E

Lampiran 2. Format review artikel

Pembuatan laporan:
1. review artikel dibuat berkelompok
2. Dibuat dengan kertas HVS folio, diketik dengan font Times New Roman 12 pt

Format review artikel

(5) Cover (contoh di bawah, boleh diketik, kertas HVS ukuran folio)
(10) Abstrak
(10) Pendahuluan (Latar Belakang dan Tujuan)
(15) Metode (Alat, Bahan dan Cara kerja)
(10) Hasil (Jurnal) (lengkap/tidak)
(30) Pembahasan
(10) Kesimpulan (selaras dengan tujuan)
(10) Daftar Pustaka
Contoh penulisan daftar pustaka:
1. Buku: Pengarang, tahun. Judul (underline/italic). Penerbit, kota penerbit, halaman
2. Jurnal: Pengarang (disebutkan semua), tahun. Judul artikel, Nama Jurnal (underline/Italic),
Volume (no.), halaman

Daftar peserta praktikum Fitokimia

16
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

Contoh cover review artikel:

PRAKTIKUM FITOKIMIA
JUDUL REVIEW ARTIKEL

GOLONGAN PRAKTIKUM:
HARI/TGL PRAKTIKUM

DISUSUN OLEH
NAMA (NIM)

Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia

Program Studi Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Udayana
Tahun 2020

17
 Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Program Studi Farmasi

Lampiran 3. Format Jurnal

Jurnal dibuat menggunakan kertas HVS ukuran Folio, ditulis tangan dan dibuat perorangan

Format Jurnal untuk Praktikum Fitokimia

Nama, NIM dan TTD mahasiswa (Pojok kanan)

Judul Praktikum : ….....................................
Tujuan : …....................................
Alat dan Bahan : …....................................

Tabel pengamatan dibawah ini:

No Cara kerja (kalimat pasif, Hasil Paraf

skematis) Pustaka* Pengamatan dan dosen/assistent
interpretasi
1
2
3
4
5 dst
Catatan:
*: Kolom pustaka diisi apabila hasil pengamatan nanti akam mengacu pada pustaka tertentu untuk
interpretasi data pengamatan, misalnya: pada praktikum skrining fitokimia dan KLT, harus ada hasil
positif menurut pustaka.
* File disimpan dengan nama : NIM_Judul Praktikum_Nama (contoh: 18085xxx_Ekstraksi
dan deffating_Nama)

18