3.

3 Real Time PCR merupakan pengembangan metode PCR yang hasil

amplifikasinya dianalisis selama proses amplifikasi dengan menggunakan
pewarna DNA atau pelacak berfluoresensi. Analisis data dilakukan dalam
instrumen yang sama, tanpa pemindahan sampel, tanpa penambahan sampel dan
tanpa pemisahan dengan elektroforesis. Metode ini dapat digunakan untuk analisis
secara kuantitatif jumlah awal sehingga dapat digunakan pengukuran secara
kuantitatif (Sudjadi, 2008). Terdapat beberapa jenis format deteksi pada metode
Real Time PCR di antaranya:

a) SYBR Green I
Dalam real-time PCR, diperlukan pewarna DNA yang
berfluoresensi. Sebagian besar digunakan fluoresen (SYBR Green
dye-based assays) atau deteksi hydrolysis probe based solution
(Taqman or Perfect Probe). Proses SYBR Green Fluorescent DNA
Binding Dye yaitu SYBR. Senyawa ini berikatan dengan DNA
untai ganda dan menyebabkan fluoresensi, tetapi senyawa ini tidak
berikatan dengan DNA untai nggal. Intensitas fluoresensi
tergantung pada jumlah DNA untai ganda hasil amplifikasi.
Senyawa SYBR Green I merupakan pelacak yang berikatan dengan
semua jenis DNA untai ganda (tidak spesifik) tetapi tidak berikatan
dengan DNA untai tunggal. Pelacak SYBR Green memberikan
fluoresensi dengan intensitas yang cukup tinggi (lebih dari 1000
kali lipat) saat berinteraksi dengan DNA untai ganda (Pestana dkk.,
2010).
Selanjutnya mari kita menyimak ilustrasi pemeriksaan Real
Time PCR dengan pendekatan mekanisme SYBR Green 1 secara
sederhana dan lengkap ditunjukkan masing-masing pada Gambar
8.12 dan 8.13. Sedangkan ilustrasi hasil pemeriksaan Real Time
PCR dapat Anda simak pada Gambar 8.14
b) Hidrolisis pelacak
Metode ini menggunakan aktivitas eksonuklease 5'-3' dari
DNA polymerase. Pelacak membawa molekul reporter fluoresen
dan molekul pemadam yang jika molekul tersebut dalam keadaan
utuh tidak akan terjadi fluoresensi. Jika pelacak menempel pada
hasil PCR dan DNA połymerase pada waktu sintesis DNA
menjumpai pelacak yang menempel di depannya, maka aktivitas
maka aktivitas eksonuklease 5'-3' akan menghidrolisis pelacak
sehingga reporter berfluoresensi. Selanjutnya mari kita menyimak
Ilustrasi pemeriksaan Real Time PCR dengan pendekatan
mekanisme hidrolisis pelacak yang ditunjukkan pada Gambar 8.14
A dan 8.14 B, sedangkan ilustrasi hasil pemeriksaan Real Time
PCR mari kita simak bersama pada Gambar 8.15.
 RT-PCR dapat dibedakan menjadi dua metode yaitu one-step RT-PCR dan
two-steps RT PCR. One step RT-PCR merupakan metode yang lebih umum
dilakukan karena reaksi RT dan reaksi siklus PCR dilakukan dalam satu langkah.
Akan tetapi pada two-steps RRT-PCR, reaksi RT dan reaksi siklus PCR dilakukan
secara terpisah.. Two-step RRT-PCR juga menggunakan primer yang berbeda
pada masing-masing reaksi. Umumnya primer yang digunakan pada reaksi RT
adalah oligo-dT kemudian dilanjutkan menggunakan primer Urutan Nukleotida
Spesifik pada reaksi siklus PCR. Sedangkan One-step RRT-PCR hanya
memerlukan satu primer yang spesifik terhadap kedua reaksi tersebut (Qiagen,
2007). RT-PCR yang dilakukan dengan metode One step dapat menurunkan
resiko terjadinya kontaminasi silang dan waktu yang dibutuhkan lebih cepat
dibandingkan dengan two-steps RRT-PCR. Meskipun demikian One step RRT-
PCR kurang sensitif jika dibandingkan dengan two-step RRT-PCR (Trani, 2005).

Interpretasi hasil

Dafus

Yudi, 2016. RT PCR . https://ahamad22.blogspot.com/2016/11/makalah-rt-pcr-ahmad-

binhus.html. Diakses pada 7 desember 2020