Journal Reading

Paternity Disputes – Importances of Y DNA Profiling

in Mutation Cases

Oleh:
Srikitta Danielia 1840312443
Anneira Amanda Putri 1840312753
Priyanka Prima Putri 1940312105

Preseptor :

dr. Taufik Hidayat, Sp. F

ILMU KEDOKTERAN FORENSIK DAN MEDIKOLEGAL

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ANDALAS
RSUP DR M. DJAMIL PADANG
2020
Ragu Ayah – Pentingnya Profil DNA Y dalam Kasus Mutasi
Deepak Y Kudekar, Vaishali B Mahajan, Bhausaheb P More and Khrishna V
Kulkarni

Abstrak
Saat ini, sidik jari DNA digunakan untuk menyelesaikan kasus ragu ayah.
Sejak penerapan sidik jari DNA dalam ilmu forensik, kami melihat banyak kasus
yang bekaitan dengan perselisihan paternitas (ragu ayah) dimana ayah
menyangkal keturunannya terhadap anak, baik dalam hubungan illegal atau dalam
kehamilan karena pemerkosaan. Ada satu skenario dimana pria yang sudah
menikah menolak untuk menerima anaknya sendiri untuk meminta cerai dari
istrinya dan menuduhnya selingkuh. Dalam masalah perdata seperti itu,
pengadilan memerintahkan untuk melakukan paternity test untuk verifikasi
kebenaran.
Pada profil DNA, mutasi adalah salah satu faktor yang kadang-kadang
ditemukan. Ketika melakukan observasi pada anak laki-laki dan mutasi, profiling
DNA Y adalah teknik yang berguna untuk menetapkan keturunan dan ayah karena
DNA Y hanya dibawa melalui pria ke pria dan itu sama untuk anak, ayah, paman,
saudara laki-laki yang berasal dari satu keturunan.
Dalam skenario ini, dua kasus seperti ini diterima di laboratorium sains
forensik, Nashik dimana dalam profiling DNA menggunakan
AmpFlSTR®Identifiler® PCR Seamplification kit, mutasi yang diamati dalam
satu alel antara ayah dan anak dan untuk anak laki-laki, kami melakukan Y STR
DNA analisis menggunakan AmpFlSTR®YfilerTM PCR amplification kit, yang
menyimpulkan bahwa keturunannya sama untuk anak dan ayah yang diduga.

Pendahuluan
Sidik jari DNA adalah teknologi yang digunakan di seluruh dunia dalam
bidang forensik untuk menyelesaikan kasus kejahatan. Ini adalah modalitas yang
tepat untuk menyeselesaikan kasus ragu ayah termasuk pada kasus hubungan
illegal, kehamilan karena pemerkosaan, kecurigaan pada anak sendiri dalam
masalah sipil dan untuk membuktikan kehamilan dimana membuang janin untuk
menyembunyikan hubungan illegal dari masyarakat. Jutaan sampel dianalisis
untuk tujuan paternity tes di berbagai negara setiap tahunnya. Saat melakukan
analisis DNA, adanya mutasi bisa dilihat. Ada beberapa kemungkinan terjadinya
mutasi. Pada tinjauan mutasi, paternitas tidak dapat ditetapkan karena
pengecualian pada lokus DNA tunggal. Secara umum, minimal 12 marker STR
autosomal yang terletak setidaknya sepuluh kromosom berbeda harus diperiksa,
karena cukup untuk mencapai probabilitas paternitas lebih dari 99,9% dalam
kasus paternitas normal atau untuk menemukan lebih dari tiga pengecualian[1].
Selanjutnya, aturan “dua pengecualian” menyatakan bahwa jika dua lokus genetic
tidak cocok antara ayah dan anak yang diduga, ayah yang diduga tidak dapat
dikecualikan sebagai ayah anak yang sebenarnya [2.3].
Sekarang secara rutin, 15 STR digunakan untuk menemukan pengecualian
atau probabilitas paternitas yang kuat. Dalam beberapa kasus, jumlah ini mungkin
tidak cukup untuk menyelesaaikan kasus terutama ketika sang ibu tidak bersedia
untuk melakukan tes atau ketika ayah biologis adalah close relative (kerabat) dari
yang legal (sah) atau dimana hanya ada satu atau dua pengecualian ditemukan [4].
Jumlah penanda kromosom Y yang berbeda dievaluasi untuk memperoleh peran
penting dalam paternity test dengan anak laki-laki [5,6]. Kami menganalisis dua
kasus seperti itu dimana analisis DNA Y menggunakan AmpFlSTR®YfilerTM
PCR amplification kit, sedangkan untuk membuktikan keturunan ayah yang sama
dari putra dan ayah meskipun ada mutasi dalam analisis DNA Nuklir
menggunakan AmpFlSTR®Identifiler® PCR amplification kit [7].
Dalam kasus nomor 1, terdakwa dan korban berada dalam hubungan “live in
(tinggal bersama)”. Korban tersebut melahirkan bayi laki-laki. Bayi itu baru
berusia 8 hari. Terdakwa mengatakan kepada korban bahwa bayinya sakit dan
akan membawanya ke dokter. Lalu terdakwa membawa, membunuh dan
membuang tubuh sang bayi ke sungai. Hal ini langsung dilaporkan oleh sang ibu
ke kantor polisi. Laboratorium kami menerima sternum, tulang paha, dan rambut
kulit kepla bayi termasuk sampel darah dari kedua orang tua. Analisis DNA
Nuklir menunjukkan ketidakcocokan ayah dengan putra di hanya satu lokus.
Pada kasus nomor 2, sebanyak lima orang dituduh mengambil kesempatan
dari gadis di desa mereka dan melakukan hubungan seksual dengannya beberapa
kali serta mengancamnya. Lalu gadis tersebut hamil dan melahirkan bayi laki-laki,
tetapi semua pria tersebut menyangkal perbuatan mereka. Awalnya korban
memberi tahu nama salah satu dari mereka dan kemudian dia memberi tahu nama
empat orang lainnya. Otoritas kepolisian mengirim sampel darah bayi dan ibunya
termasuk lima orang yang tertuduh ke laboratorium forensik. Dari lima, empat
terdakwa dikecualikan di beberapa lokus, tetapi satu terdakwa dikecualikan di
hanya satu lokus dari 15 lokus.
Dari dua kasus di atas, untuk memastikan keturunannya, kami melakukan
profiling DNA Y pada bayi dan ayah yang tertuduh. Profil DNA Y anak dan ayah
cocok dalam kedua kasus. Ini menegaskan bahwa mereka memiliki keturunan
ayah yang sama.

Material dan Metode

Instrumen:
a) Prep filer Express Kit (applied biosystem)
b) Prep filer Express BTA kit
c) Amp FlSTR Identifier kit (applied biosystem)
d) Amp FlSTR Y-filer kit (applied biosystem)
e) Forensic Buffer pH 8
f) Proteinase K
g) Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 100/100/4
h) Isopropanol

Mesin:
i. Automate Express Forensic DNA System
Instrumen yang digunakan – Prep filer Express
ii. PCR Thermal Cycler Machine, Capacity -96wel l x 0.2ml PCR Tubes
Mampu menguji Temperatur pada langkah denaturasi, proses pengokohan,
dan langkah lanjut Pemanasan / Pendinginan
Akurasi suhu berbasis Peltier - (+ -) 2 Akurasi suhu (+ -) 2
iii. Genetic analyser, Fragment size -600bp
Nomor marker : 16 for I- filer ; 17 For Y-filer, Polymer- POP4
 Suhu Oven -600C, Ukuran kolom-36cm
Software- Gene Mapper

Langkah yang digunakan dalam analisis

i. Ekstraksi DNA dari Darah
Ekstraksi organik rutin yaitu ekstraksi dengan Fenol/Kloroform adalah
metode yang sensitif untuk pemulihan DNA dari berbagai sampel forensik [8].
Metode ini digunakan untuk ekstraksi DNA dari sampel darah. Dalam metode ini,
sampel dilisis menggunakan Forensic Buffer (pH8), Proteinase K dan Sodium
Dodecyl Sulphate. Kemudian diinkubasi selama 2 jam pada 560C dan
ditambahkan Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol. Lapisan berair yang
mengandung DNA dipisahkan dan diolah dengan 2 M Sodium Acetate dan DNA
diendapkan menggunakan Isopropanol dingin. DNA yang diendapkan kemudian
dilarutkan dalam buffer TE (pH7). DNA ini selanjutnya digunakan untuk PCR
dan STR Genotyping. Amplifikasi simultan dari 16 STR Loci diselesaikan dan
dianalisis [9,10]. Profil DNA ditafsirkan dengan membandingkan satu sama lain.
Kami telah melihat mutasi pada satu alel di antara putra dan ayah pada
kedua kasus yang disebutkan sebelumnya. Untuk mengkonfirmasi ulang profil
ekstraksi dilakukan dengan mesin Automate Express menggunakan kit ekstraksi
DNA Prep Filer TM Express. Alat ekstraksi DNA Forensik Prep Filer TM
(Applied Biosystems, Foster City, CA) memungkinkan isolasi DNA dari berbagai
sampel biologis yang mengandung sejumlah kecil bahan biologis sedemikian rupa
sehingga zat yang mengganggu PCR dihilangkan. Prep Filer TMK dirancang
khusus untuk mendukung ekstraksi DNA manual dan otomatis dari sampel
forensik [11,12].
ii. Ekstraksi DNA dari Tulang
Ekstraksi DNA dari tulang dada dan tulang paha dilakukan dengan
Automate express Machine menggunakan kit Prep Filer Express BTA. Serbuk
lisis sternum dan tulang paha (50mg) dilakukan dengan menggunakan 220μl
buffer PrepFilerBTATM Lisis. Kemudian ditambahkan 1 M DTT dan 7 μl
Proteinase K. Campuran Lisis diinkubasi pada suhu 560C selama 18 jam pada
1100 rpm menggunakan thermoshaker. Setelah lisis, tabung yang berisi sampel
tulang disentrifugasi selama 2 menit pada 10.000 x g dan kemudian supernatan
dipindahkan ke tabung sampel PrepFilerTM. Kemudian DNA diekstraksi pada
mesin Automate Express menggunakan protokol instrumen Prep Filer BTATM.
iii. Kuantifikasi DNA
DNA yang diekstraksi dikuantifikasi menggunakan instrumen Quantifier
human DNA pada 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) sesuai
dengan protokol. Sampel DNA encer yang tepat digunakan untuk reaksi PCR
lebih lanjut.
iv. Polymerase Chain Reaction

Gambar 1. Protokol PCR untuk instrumen amplifikasi AmpFlSTR®Identifiler® PCR

DNA yang dikuantifikasi dari semua sampel darah dan tulang dari kedua
kasus diproses untuk PCR menggunakan instrumen amplifikasi PCR
AmpFlSTR®Identifiler® [13] dan instrumen amplifikasi PCR
AmpFlSTR®YfilerTM pada Veriti Thermal Cycler of Applied Biosystems
(Gambar 1 & 2). Primer AmpFlSTRTMIdentifiler menguatkan lokus STR
CSF1PO, D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539,
D18S51, D19S433, D21S11, FGA, THV, dan variabel gender. Yfiler
memungkinkan amplifikasi simultan dari 16 Loci pada kromosom Y, yaitu
DYS456, DYS3891, DYS390, DYS38911, DYS458, DYS19, DYS385a/b,
DYS393, DYS391, DYS439, DYS635, DYS392, Y GATA H4, DYS437,
DYS438, dan DYS 448.
 Gambar 2. Protokol PCR untuk instrumen amplifikasi AmpFlSTR®Yfiler® PCR
Master mix yang digunakan untuk Polymerase Chain Reaction antara lain :
a) AmpFISTR PCR reaction mix: 10.5 μl
b) AmpFISTR Primer Set: 5.5 μl
c) Polymerase: 0.55 μl and 0.8 μl untuk profiling Y-DNA
d) Volume master mix yang digunakan : 15 μl
e) Volume sampel : 10 μl
f) Setelah amplifikasi PCR, Denaturasi dilakukan dengan menggunakan
HiDi Formamide dan Liz 600 Standard.
v. STR Genotipe
PCR menghasilkan jutaan fragmen DNA dengan berbagai ukuran. Produk
yang telah diperkuat dipisahkan dan dideteksi menggunakan 3500 Genetic
Analyzer [14] dan dianalisis menggunakan GeneMapper® ID-X Software V 1.5
sesuai dengan prosedur yang direkomendasikan oleh petugas pabrik. Pemisahan
fragmen molekul DNA yang berbeda berdasarkan ukurannya dicapai dengan
elektroforesis kapiler. Amplifikasi simultan dari 16 STR Loci diselesaikan dan
dianalisis [9,10]. Profil DNA ditafsirkan dengan membandingkan satu sama lain.

Hasil dan Diskusi

Pada kasus pertama, DNA diekstraksi dari sampel darah dan tulang, lalu
diperiksa 15 lokus STR dan lokus Amleogenin spesifik gender menggunakan
teknik amplifikasi PCR.
 Tabel 1. Genotipe STR menggunakan identifier kit pada kasus ke-1

Tabel 1 menunjukkan profil DNA nuklear dari tersangka, korban dan tulang
femur bayi. Dari 15 sistem genetik berbeda yang dianalisis menggunakan PCR, 14
alel lokus STR dari 15 lokus yang diperiksa dari sampel dari tersangka cocok
dengan sampel tulang femur dari bayi, kecuali pada lokus ‘vWA’ yang
kemungkinan disebabkan oleh mutasi. Menurut aturan two exclusions pada uji
keturunan, peneliti tidak dapat mengeksklusi ayah dari bayi jika sampel dari ayah
menunjukkan hasil yang berbeda pada 2 lokus. Pada sampel yang didapat dari ibu,
15 STR yang diperiksa cocok.

Tabel 2. Genotipe STR menggunakan identifier kit pada kasus ke-2

 Pada tabel 2 (kasus ke-1), dari 15 gen berbeda yang dianilisis menggunakan
PCR dari sampel tersangka, 14 STR cocok dengan sampel dari bayi, kecuali pada
lokus ‘vWA’. Hal ini dapat disebabkan karena mutasi. Sampel dari ibu
menunjukkan hasil yang cocok pada 15 lokus yang diperiksa.
Pada kedua kasus di atas, untuk menyingkirkan kemungkinan hubungan
paternitas, peneliti harus melakukan pemeriksaan terhadap Y DNA profile untuk
membuktikan bahwa anak tersebut merupakan keturunan dari tersangka. Analisis
ini dapat menentukan keturunan paternal melalui mutasi yang dilihat pada profil
DNA nuklear. Pada kedua kasus (tabel 3 dan 4), Y DNA profile (male haplotypes)
didapatkan dari sampel biologis bayi yang cocok dengan Y DNA profile pada
sampel yang didapatkan dari tersangka.

Tabel 3. Profil Y DNA pada kasus ke-1

 Tabel 4. Profil Y DNA pada kasus ke-2
Pada kedua kasus, dilakukan pemeriksaan mutasi pada lokus yang sama dari
sampel bayi dan tersangka, yaitu pada lokus ‘vWA’ (tabel 1 dan 2), yang
menunjukkan hasil yang cocok. Bayi yang berjenis kelamin laki-laki
memungkinkan peneliti untuk melakukan pemeriksaan terhadap Y DNA Profile,
sehingga peneliti dapat menyimpulkan bahwa bayi merupakan bagian dari
progeny yang sama dengan tersangka (tabel 3 dan 4). Hal ini menunjukkan bahwa
tersangka tidak dapat dieksklusi dari kemungkinan ayah biologis dari bayi.
Analisis yang dilakukan pada 15 STR autosom mungkin tidak selalu cukup untuk
kasus lainnya. Oleh karena itu, analis dapat melakukan pemeriksaan lebih dari 15
lokus atau dapat juga melakukan pemeriksaan Y-STR untuk menentukan hasil.

Ucapan Terima Kasih

Peneliti berterima kasih pada Jenderal Direktor (Legal dan Teknik), Home
Department, Pemerintah Maharashtra, India atas bimbingan dan bantuan yang
diberikan kepada peneliti.
Daftar Pustaka
1. Junge A, Brinkmann B, Fimmers R, Madea B (2006) Mutations or ex-clusion:
an unusual case in paternity testing. Int J Legal Med 120(6): 360-363.
2. Brinkmann B, Pfeiffer H, Schürenkamp M, Hohoff C (2001) The evi-dential
value of STRs. An analysis of exclusion cases. Int J Legal Med 114(3):
173-177.
3. Thangaraj K, Reddy AG, Singh L (2004) Mutation in the STR locus D21S11
of father causing allele mismatch in the child J Forensic Sci 49(1) :1-5.
4. Ilaria Carboni, SaraIozzi, Anna Luci Nutini, Pasquale Giuseppe Macrì,
Francesca Torricelli (2011) 87 DNA markers for a paternity testing: Are they
sufficient? Forensic Science International Genetics Supple-ment Series 3(1):
e552-e553.
5. Kayser M, Caglià A, Corach D, Fretwell N, Gehrig C, et al. (1997)
Eval-uation on Y-chromosomal STRs: a multicenter study. Int J Legal Med
110(3): 125-133.
6. Rolf B, Keil W, Brinkmann B, Roewer L, Fimmers R (2001) Paternity testing
using Y-STR haplotypes: assigning a probability for paternity in cases of
mutations. Int J Legal Med 115(1): 12-15.
7. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, et al. (1986) Specific
enzy-matic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction. Cold
spring Harb Symp Quant Bio 51: 263-273.
8. Kochl S, Niederstatter H, Parson W (2005) DNA extraction and quan-titation
of forensic samples using the phenol-chloroform method and realtime PCR.
Methods Mol Biol 297: 13-30.
9. Budowle B, Allen RC (1998) Analysis of amplified fragment length
polymorphism (VNTR/STR Loci) for human identity testing. Methods Mol
Biol 98: 155-171.
10. Gill P, Kimpton CP, Urquhart A, Oldrod N, Millican ES, et al. (1995)
Au-tomated short tandem repeat (STR) Analysis in forensic casework-a
strategy for the future. Electrophoresis 16(9): 1543-1552.
11. Brevnov MG, Pawar HS, Mundt J, Calandro LM, Furtado MR, et al. (2009)
Developmental validation of the Prep Filer Forensic DNA Ex-traction Kit for
extraction of genomic DNA from biological samples. J Forensic Sci
54(3) :599-607.
12. Brevnov MG, Mundt J, Benfield J, Treat-Clemons L, Kalusche G (2009)
Automated extraction of DNA from forensic samples types using the Prep
Filer Automated Forensic DNA Extraction Kit. JALA 14: 294-302.
13. (2001) Applied Biosystems. AmpFlSTR®Identifiler® PCR amplification kit
user’s manual, part # 4323291 Rev. B. Foster City, CA: Applied Bio-systems.
14. Applied Biosystems 3500/3500XL Genetic Analyzer User Guide Ap-plied
Biosystems, Faster City CA.
 Telaah Kritis (Critical Appraisal) Jurnal Tabel

Check List Umum Struktur dan Isi Masalah

Ya Tidak TR
Judul Makalah
1. Tidak terlalu panjang atau terlalu pendek √
2. Menggambarkan isi utama penelitian √
3. Cukup menarik √
4. Tanpa singkatan, selain yang baku √
Pengarang & Institusi
5. Nama-nama dituliskan sesuai dengan aturan jurnal √
Abstrak
6. Abstrak satu paragraf atau terstruktur √
7. Mencakup komponen IMRAD √
8. Secara keseluruhan informatif √
9. Tanpa singkatan, selain yang baku √
10. Kurang dari 250 kata √
Pendahuluan
11. Ringkas, terdiri 2-3 paragraf √
12. Paragraf pertama mengemukakan alasan dilakukan √
penelitian
13. Paragraf berikut menyatakan hipotesis atau tujuan penelitian √
14. Didukung oleh pustaka yang relevan √
15. Kurang dari 1 halaman √
Metode
16. Disebutkan desain, tempat, dan waktu penelitian √
17. Disebutkan populasi sumber (populasi terjangkau) √
18. Dijelaskan kriteria inklusi dan eksklusi √
19. Disebutkan cara pemilihan subjek (teknik sampling) √
20. Disebutkan perkiraan besar sampel dan alasannya √
21. Besar sampel dihitung dengan rumus yang sesuai √
22. Komponen-komponen rumus besar sampel masuk akal √
23. Observasi, pengukuran, serta intervensi dirinci sehingga √
orang lain dapat mengulanginya
24. Ditulis rujukan bila teknik pengukuran tidak dirinci √
25. Pengukuran dilakukan secara tersamar √
26. Dilakukan uji keandalan pengukuran (kappa) √
27. Definisi istilah dan variabel penting dikemukakan √
28. Ethical clearance diperoleh √
29. Persetujuan subjek diperoleh √
30. Disebutkan rencana analisis, batas kemaknaan, dan power √
penelitian
31. Disebutkan program komputer yang dipakai √
Hasil
32. Disertakan tabel karakteristik subjek penelitian √
33. Karakteristik subjek sebelum intervensi dideskripsi √
 34. Tidak dilakukan uji hipotesis untuk kesetaraan pra-intervensi √
35. Disebutkan jumlah subjek yang diteliti √
36. Dijelaskan subjek yang dropout dengan alasannya √
37. Ketepatan numerik dijelaskan dengan benar √
38. Penulisan tabel dilakukan dengan tepat √
39. Tabel dan ilustrasi informatif dan memang diperlukan √
40. Tidak semua hasil didalam tabel disebutkan pada naskah √
41. Semua outcome yang penting disebutkan dalam hasil √
42. Subjek yang dropout diikutkan dalam analisis √
43. Analisis dilakukan dengan uji yang sesuai √
44. Ditulis hasil uji statistika, degree of freedom, dan nilai P √
45. Tidak dilakukan analisis yang semula tidak direncanakan √
46. Disertakan interval kepercayaan √
47. Dalam hasil tidak disertakan komentar atau pendapat √
Diskusi
48. Semua hal yang relevan dibahas √
49. Tidak sering diulang hal yang dikemukakan pada hasil √
50. Dibahas keterbatasan penelitian dan dampaknya terhadap hasil √
51. Disebut penyimpangan protokol dan dampaknya terhadap √
hasil
52. Diskusi dihubungkan dengan pertanyaan penelitian √
53. Dibahas hubungan hasil dengan teori/penelitian terdahulu √
54. Dibahas hubungan hasil dengan praktik klinis √
55. Efek samping dikemukakan dan dibahas √
56. Disebutkan hasil tambahan selama observasi √
57. Hasil tambahan tersebut tidak dianalisis secara statistika √
58. Disertakan simpulan utama penelitian √
59. Simpulan didasarkan pada data penelitian √
60. Simpulan tersebut sahih √
61. Disebutkan generalisasi hasil penelitian √
62. Disertakan saran penelitian selanjutnya
√
Ucapan Terima Kasih
63. Ucapan terima kasih ditujukan pada orang yang tepat √
64. Ucapan terima kasih dinyatakan secara wajar √
Daftar Pustaka
65. Daftar pustaka disusun sesuai dengan aturan jurnal √
66. Kesesuaian sitasi pada nas dan daftar pustaka √
 Case Report J Forensic Sci & Criminal Inves
Volume 12 Issue 1 - July 2019
Copyright © All rights are reserved by Deepak Y Kudekar
DOI: 10.19080/JFSCI.2019.12.555829

Paternity Disputes – Importance of Y DNA

Profiling in Mutation Cases
Deepak Y Kudekar1*, Vaishali B Mahajan2*, Bhausaheb P More3 and Krishna V Kulkarni4
1,2
Assistant Chemical Analyser, India
1,2,3
Deputy Director of Regional Forensic Science Laboratory,Nashik
4
Director of Forensic Science Laboratory ,Maharashtra, India
Submission: May 22, 2019; Published: July 03, 2019
*Corresponding author: Deepak Y Kudekar, Assistant Chemical Analyser, Regional Forensic Science Laboratory, Maharashtra, India

Abstract
Now a day’s DNA fingerprinting is widely used to solve the paternal disputes. Since the application of DNA fingerprinting in forensic science,
we see many cases related to paternity disputes where father denies his parentage towards child either in illegal relationship or in pregnancy
due to rape. There is one more scenario where married man declines to accept his own child to seek divorce from his wife alleging her cheating
on him. In such civil matters, court orders to do paternity testing for verification of the truth.

While DNA profiling, mutation is one factor that sometimes encounters. When there is a male child and mutation observes, Y DNA profiling
is useful technique to establish the progeny and paternity as the Y DNA is only carried through male to male and it is same for child, father, uncle,
brother which are from the same progeny.

In present scenario, two such cases received at forensic science laboratory, Nashik where in nuclear DNA profiling using AmpFlSTR®Identifiler®
PCR amplification kit, mutation observed in one allele between father and child and as the child was male, we carried out Y STR DNA analysis
using AmpFlSTR®YfilerTM PCR amplification kit, that resulted to the conclusion that the progeny was same for child and suspected Father.

Keywords: PCR; Short tandem repeat; Identifier kit; Y-filer kit; Mutation; Paternity Dispute; Progeny

Introduction
DNA fingerprinting is worldwide used technology in the field
of forensic to solve crimes. It is valuable tool to solve paternity
disputes including illegal relationships, pregnancy due to rape,
suspicion on own child in civil matter and to prove maternity
in which mother throws foetus to hide illegal relationship from
society. Few million samples are run for purpose of paternity
testing in country every year. While performing DNA analysis,
mutation can be seen. There are several reasons for mutation.
In view of mutation, paternity could not be established due to
exclusion at single DNA locus. Generally, minimum 12 autosomal
STR markers situated at least ten different chromosomes have to
be examined, which is enough to reach a paternity probability of
more than 99.9% in normal paternity cases or to find out more
than three exclusions [1]. Further, ‘two exclusion’ rule stated
that if two genetic loci do not match between an alleged father
and child, the alleged father cannot be excluded as being true
father of child [2,3].
Now, routinely, 15 STRs are used to obtain exclusion or
strong probability of paternity. In few cases, this number can
be inadequate to solve the case particularly when the mother is
unavailable for the test or when the biological father is a close
relative of the legal one or where only one or two exclusions are
found [4]. The number of different Y-chromosome markers were
evaluated which gained a significant role in paternity testing
with male children [5,6]. We analysed two such cases in which
Y DNA analysis using AmpFlSTR®YfilerTM PCR amplification kit,
proved the same paternal progeny of son and father in spite of
mutation in Nuclear DNA analysis using AmpFlSTR®Identifiler®
PCR amplification kit [7].
In case number 1, accused and victim were in ‘live- in’
relationship. Victim gave birth to male baby. Baby was only 8
days old. Accused father of the baby told victim that baby is ill. I
will show him to Doctor. He took the baby and killed him, thrown
his body in the river. Complaint was lodged by mother of baby
in Police station. Our laboratory received sternum, femur bone
and scalp hair of baby including blood sample of both parents.
Nuclear DNA analysis shows mismatch of father with son at only
one locus.
In case number 2, five accused persons took advantage of
girl in their village and established sexual relationship with her

J Forensic Sci & Criminal Inves 12(1): JFSCI.MS.ID.555829 (2019) 001

 Journal of Forensic Sciences & Criminal Investigation
at various times threatening to her. She became pregnant and
gave birth to baby boy, but everyone denied their crime. Initially
victim told name of one of them and later on she told names of
another four who took advantage of her. Police authority sent
the blood samples of baby and his mother including five accused
to forensic Laboratory. Out of five, four accused excluded at
multiple loci, but one accused excluded at only one locus out of
15 loci.
In above both cases, to ascertain the progeny, we performed
Y DNA profiling of baby and accused father. Y DNA profile of both
son and father matched in both cases. This confirmed that they
belonged to same paternal progeny.
Materials and Methods
a) Prep filer Express Kit (applied biosystem)
b) Prep filer Express BTA kit
c) Amp FlSTR Identifier kit (applied biosystem)
d) Amp FlSTR Y-filer kit (applied biosystem)
e) Forensic Buffer pH 8
f) Proteinase K
g) Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 100/100/4
h) Isopropanol
i. Automate Express Forensic DNA System
Kit Used – Prep filer Express
ii. PCR Thermal Cycler Machine, Capacity -96wel l x
0.2ml PCR Tubes
Capable of testing Temperatures - Denaturation, anneling
and extension steps
Heating/ Cooling – Peltier based Temperature accuracy-(+-)2
Temperature accuracy+(+-)2
iii. Genetic analyser, Fragment size -600bp
Number of markers – 16 for I- filer 17 For Y-filer, Polymer-
POP4
Oven Temp -600C, Column Size-36cm
Software- Gene Mapper
Steps used in analysis
Extraction of DNA from Blood: Routine organic extraction
i.e. Phenol/Chloroform extraction approach is a sensitive method
for the recovery of DNA from wide variety of forensic samples [8].
This method was used for extraction of DNA from blood samples.
In this method, samples were lysed using Forensic Buffer (pH8),
Proteinase K and Sodium Dodecyl Sulphate. It was incubated for
2 hrs at 560C and Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol added.
The aqueous layer containing DNA separated and treated with
How to cite this article: Deepak Y K, Vaishali B M, Bhausaheb P M, Krishna V K. Paternity Disputes – Importance of Y DNA Profiling in Mutation Cases.
002 J Forensic Sci & Criminal Inves. 2019; 12(1): 555829. DOI: 10.19080/JFSCI.2019.12.555829
2 M Sodium Acetate and the DNA was precipitated using chilled
Isopropanol. Precipitated DNA finally dissolved in TE buffer
(pH7). This DNA was further used for PCR and STR Genotyping.
Simultaneous amplification of 16 STR Loci was completed and
analyzed [9,10]. DNA profiles were interpreted by comparing
with each other.
We had seen mutation at one allele among son and father in
above mentioned both cases. To confirm profiles re-extraction
carried on Automate Express machine using Prep Filer TM
Express DNA extraction kit. The Prep Filer TM Forensic DNA
extraction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) enables
the isolation of DNA from a variety of biological samples that
contain small quantities of biological mater4ial in such a way
that substances that interfere with PCR are removed. The Prep
Filer TMK it was designed specifically to support both manual
and automated extraction of DNA from forensic samples [11,12].
Extraction of DNA from Bone: Extraction of DNA from
sternum and femur bone was carried out on Automate express
Machine using Prep Filer Express BTA kit. Lysis of sternum
and femur bone powder (50mg) was performed using 220µl of
PrepFilerBTATM Lysis buffer. Then 1 M DTT and 7 µl Proteinase
K is added. The Lysis mixture was incubated at 560C for 18 hrs
at 1100 rpm using thermoshaker. After lysis the tube containing
bone sample was centrifuged for 2 min at 10,000 x g and then
the supernatant was transferred to the PrepFilerTM sample tube.
Then DNA was extracted on Automate Express machine using
the Prep Filer BTATM instrument protocol.
Quantification of DNA
Extracted DNA was quantified using Quantifier human
DNA kit on 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems)
according to the protocol. Proper diluted DNA sample was used
for further PCR reaction.
Polymerase chain reaction
Figure 1: PCR Protocol for AmpFlSTR®Yfiler® PCR
amplification kit.
Quantified DNA of all the blood and bone samples from both
the cases was processed for PCR using AmpFlSTR®Identifiler®
PCR amplification kit [13] and AmpFlSTR®YfilerTM PCR
amplification kit on Veriti Thermal Cycler of Applied Biosystems
(Figure 1 & 2). AmpFlSTRTMIdentifilerTM primers amplify
 Journal of Forensic Sciences & Criminal Investigation

the STR loci CSF1PO, D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, b) AmpFISTR Primer Set: 5.5 µl
D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, FGA,
c) Polymerase: 0.55 µl and 0.8 µl for Y DNA profiling.
TH01, TPOX, vWA and gender marker Amelogenin. Yfiler enables
simultaneous amplification of 16 Loci on the Y-chromosome, d) Volume of Master mix used: 15 µl
namely DYS456, DYS3891, DYS390, DYS38911, DYS458, DYS19,
e) Volume of sample: 10 µl
DYS385a/b, DYS393, DYS391, DYS439, DYS635, DYS392, Y GATA
H4, DYS437, DYS438 and DYS448. f) After PCR amplification Denaturation carried out using
HiDi Formamide and Liz 600 size Standard.

STR genotyping
PCR produces millions of DNA fragments of different sizes.
Amplified products were separated and detected using 3500
Genetic Analyzer [14] and analyzed using GeneMapper®
ID-X Software V 1.5 according to manufacturer recommended
procedure. The separation of different fragments of DNA
molecules on the basis of their size was achieved by capillary
electrophoresis. Simultaneous amplification of 16 STR Loci was
completed and analyzed [9,10]. DNA profiles were interpreted
by comparing with each other.
Figure 2: PCR Protocol for AmpFlSTR®Yfiler® PCR
amplification kit. Results and Discussion
Master mix used for Polymerase Chain Reaction was- In case one The DNA extracted from blood sample and bone
was typed at 15 STR LOCI and gender specific Amleogenin locus
a) AmpFISTR PCR reaction mix: 10.5 µl using PCR Amplification technique.

Table 1: STR Genotyping by using Identifier kit in case number 1.

Genotype
STR LOCUS
Blood Mother/ Victim Femur bone of Baby of Victim Blood Accused (Putative Father)
D8S1179 13,16 13,13 13,13
D21S11 29,30 29,29 29,32.2
D7S820 10,11 11,12 11,12
CSF1PO 7,12 7,12 12,12
D3S1358 15,18 15,16 15,16
THO1 9,9 9,9.3 9.3,9.3
D13S317 9,12 9,10 10,13
D16S539 8,13 8,11 11,13
D2S1338 19,22 18,19 18,23
D19S433 12,15 15,15.2 12,15.2
vWA 15,17 15,16** 18,19**
TPOX 8,9 8,9 9,11
D18S51 16,17 16,17 14,16
AMELOGENIN X, X X, Y X, Y
D5S818 11,11 11,12 11,12
FGA 19,25 19,24 24,25

Table 1 Shows the Nuclear DNA profile of accused, victim and
femur bone of baby. Out of 15 different genetic systems analyzed
with PCR, accused matched the obligate paternal alleles present
in femur bone of baby at 14 STR loci except one locus ‘vWA’ which
may be due to mutation. As per two exclusion rules in parentage
testing, we cannot exclude father of child as true father if he
excludes at two genetic loci. However, for mother matched at all
15 STR Loci.
In Table 2, case number 2, out of 15 different genetic systems
analyzed with PCR accused matched the paternal alleles with
baby at 14 STR Loci except ‘vWA’. Here also chances of mutation
cannot be ruled out. Mother matched maternal alleles at all 15
STR Loci.
In above both cases, to rule out the paternity, we had taken
support of Y DNA profiling to prove whether the progeny of child

How to cite this article: Deepak Y K, Vaishali B M, Bhausaheb P M, Krishna V K. Paternity Disputes – Importance of Y DNA Profiling in Mutation Cases.
003 J Forensic Sci & Criminal Inves. 2019; 12(1): 555829. DOI: 10.19080/JFSCI.2019.12.555829
 Journal of Forensic Sciences & Criminal Investigation

and father is same. This type of analysis can establish paternal obtained from biological sample of baby matched with Y DNA
lineage though mutation observed in nuclear DNA profile. In profile (male haplotypes) obtained from blood sample of father.
both the cases (Table 3 & 4) Y DNA profile (male haplotypes)
Table 2: STR Genotyping by using Identifier kit in case number 2.
Genotype
STR LOCUS
Blood Victim Blood of Baby Blood Accused (Putative Father)
D8S1179 10,14 12,14 9,12
D21S11 28,29 29,31.2 28,31.2
D7S820 11,12 12,12 10,12
CSF1PO 10,12 10,12 12,12
D3S1358 15,15 15,15 15,16
THO1 7,9.3 7,9 8,9
D13S317 13,14 11,13 8,11
D16S539 10,12 10,10 10,11
D2S1338 18,19 19,23 18,23
D19S433 12,15.2 15.2,16.2 14.2,16.2
vWA 14,16 14,18** 17,19**
TPOX 8,8 8,8 8,8
D18S51 12,18 12,16 13,16
AMELOGENIN X, X X, Y X, Y
D5S818 11,13 11,11 10,11
FGA 19,23 19,21 20,21

Conclusion baby belongs to same progeny of the father (Table 3 & 4). It
Table 3: Y DNA profile in case number 1.
means the father cannot be excluded as biological father of baby.
Analysis of 15 autosomal STR markers in parentage issues may
Haplotypes
YSTR LOCUS not be sufficient for conclusive results in all the cases. So, the
Femur Bone of Baby Blood (Putative Father) analyst should either take the support of kits having more than
B_DYS456 16 16 15 Loci or should use the kits like Y-STRs to ascertain the results.
B_DYS3891 13 13 Table 4: Y DNA profile in case number 2.
B_DYS390 22 22
Halotypes
B_DYS38911 31 31 YSTR LOCUS Blood Baby
Blood (Putative Father)
G_DYS458 17 17 (DNAnk-175/18
G_DYS19 13 13 B_DYS456 15 15
G_DYS385 11,18 11,18 B_DYS3891 14 14
Y_DYS393 14 14 B_DYS390 23 23
Y_DYS391 10 10 B_DYS38911 31 31
Y_DYS439 12 12 G_DYS458 18 18
Y_DYS635 23 23 G_DYS19 14 14
Y_DYS392 14 14 G_DYS385 14,16 14,16
R_Y_GATA_H4 12 12 Y_DYS393 14 14
R_DYS437 14 14 Y_DYS391 10 10
R_DYS438 11 11 Y_DYS439 12 12
R_DYS448 19 19 Y_DYS635 Off ladder Off ladder

As in both the cases, mutation was observed at one locus Y_DYS392 11 11

between baby and father, that locus was same in both cases R_Y_GATA_H4 12 12
which was ‘vWA’ (Table 1 & 2). Being baby was male, we had R_DYS437 14 14
an option of Y-DNA profiling to confirm the mutation and it was R_DYS438 10 10
found valuable technique to come over the conclusion that the R_DYS448 19 19

How to cite this article: Deepak Y K, Vaishali B M, Bhausaheb P M, Krishna V K. Paternity Disputes – Importance of Y DNA Profiling in Mutation Cases.
004 J Forensic Sci & Criminal Inves. 2019; 12(1): 555829. DOI: 10.19080/JFSCI.2019.12.555829
 Journal of Forensic Sciences & Criminal Investigation
Acknowledgement
We are thankful to our Director General (Legal and Technical),
Home Department, Government of Maharashtra, India for his
guidance and encouragement all the time extended to us.
References
1. Junge A, Brinkmann B, Fimmers R, Madea B (2006) Mutations or ex-
clusion: an unusual case in paternity testing. Int J Legal Med 120(6):
360-363.
2. Brinkmann B, Pfeiffer H, Schürenkamp M, Hohoff C (2001) The evi-
dential value of STRs. An analysis of exclusion cases. Int J Legal Med
114(3): 173-177.
3. Thangaraj K, Reddy AG, Singh L (2004) Mutation in the STR locus
D21S11 of father causing allele mismatch in the child J Forensic Sci
49(1) :1-5.
4. Ilaria Carboni, SaraIozzi, Anna Luci Nutini, Pasquale Giuseppe Macrì,
Francesca Torricelli (2011) 87 DNA markers for a paternity testing:
Are they sufficient? Forensic Science International Genetics Supple-
ment Series 3(1): e552-e553.
5. Kayser M, Caglià A, Corach D, Fretwell N, Gehrig C, et al. (1997) Eval-
uation on Y-chromosomal STRs: a multicenter study. Int J Legal Med
110(3): 125-133.
6. Rolf B, Keil W, Brinkmann B, Roewer L, Fimmers R (2001) Paternity
testing using Y-STR haplotypes: assigning a probability for paternity in
cases of mutations. Int J Legal Med 115(1): 12-15.
This work is licensed under Creative
Commons Attribution 4.0 License
DOI­: 10.19080/JFSCI.2019.12.555829
How to cite this article: Deepak Y K, Vaishali B M, Bhausaheb P M, Krishna V K. Paternity Disputes – Importance of Y DNA Profiling in Mutation Cases.
005 J Forensic Sci & Criminal Inves. 2019; 12(1): 555829. DOI: 10.19080/JFSCI.2019.12.555829
7. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, et al. (1986) Specific enzy-
matic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction. Cold
spring Harb Symp Quant Bio 51: 263-273.
8. Kochl S, Niederstatter H, Parson W (2005) DNA extraction and quan-
titation of forensic samples using the phenol-chloroform method and
realtime PCR. Methods Mol Biol 297: 13-30.
9. Budowle B, Allen RC (1998) Analysis of amplified fragment length
polymorphism (VNTR/STR Loci) for human identity testing. Methods
Mol Biol 98: 155-171.
10. Gill P, Kimpton CP, Urquhart A, Oldrod N, Millican ES, et al. (1995) Au-
tomated short tandem repeat (STR) Analysis in forensic casework-a
strategy for the future. Electrophoresis 16(9): 1543-1552.
11. Brevnov MG, Pawar HS, Mundt J, Calandro LM, Furtado MR, et al.
(2009) Developmental validation of the Prep Filer Forensic DNA Ex-
traction Kit for extraction of genomic DNA from biological samples. J
Forensic Sci 54(3) :599-607.
12. Brevnov MG, Mundt J, Benfield J, Treat-Clemons L, Kalusche G (2009)
Automated extraction of DNA from forensic samples types using the
Prep Filer Automated Forensic DNA Extraction Kit. JALA 14: 294-302.
13. (2001) Applied Biosystems. AmpFlSTR®Identifiler® PCR amplification
kit user’s manual, part # 4323291 Rev. B. Foster City, CA: Applied Bio-
systems.
14. Applied Biosystems 3500/3500XL Genetic Analyzer User Guide Ap-
plied Biosystems, Faster City CA.
Your next submission with Juniper Publishers
will reach you the below assets
• Quality Editorial service
• Swift Peer Review
• Reprints availability
• E-prints Service
• Manuscript Podcast for convenient understanding
• Global attainment for your research
• Manuscript accessibility in different formats
( Pdf, E-pub, Full Text, Audio)
• Unceasing customer service
Track the below URL for one-step submission
https://juniperpublishers.com/online-submission.php