1.

Tahap awal persiapan pembuatan gel poliakrilamid

Ini adalah tahap persiapan awal dari rangkaian proses elektroforesis vertikal dengan
menggunakan gel poliakrilamid sebagai media pemisahan fragmen DNA. Pada tahap disiapkan
semua bahan dan alat yang diperlukan dalam pembuatan gel poliakrilamid. Selanjutnya kaca
yang akan digunakan sebagai tempat pencetakan gel dibersihkan dan dipasang pada bingkainya.
- membersihkan kaca cetakan gel dengan cara menyemprotkan alcohol 70% lalu mengelapnya
dengan tissue sampai kaca benar-benar bersih
- menyiapkan bingkai kaca
- kemudian memasangkan sepasang kaca cetakan gel dalam dan pastikan kedua kaca cetakan
sejajar
- memasangkan pasangan kaca cetakan gel ke bingkai cetakan gel akrilamid, pastikan kedua
pasangan kaca terpasang secara sejajar terutama bagian bawah kaca dan tidak ada celah atau
diantara kedua kaca agar tidak terjadi kebocoran
- memasang bingkai yang telah berisi kaca cetakan kepenyanggah bingkai kaca
- membersihkan kaca cetakan gel lainnya dengan cara menyemprotkan kaca dengan alcohol 70%
lalu mengelapnya dengan tissue sampai kaca benar-benar bersih tujuannya untuk membersihkan
debu-debu atau kotoran yang menempel dikaca pada saat penyimpanan kaca
- membersihkan kaca penutup perhatikan cara memegang kaca penutup harus berhati-hati saat
memegang kaca penutup karna sangat tipis dan mudah pecah
- kita memasangkan kedua kaca cetakan gel dan memastikan bahwa kedua kaca ini dalam posisi
sejajar
- memasang pasangan kaca cetakan gel ke bingkai kaca cetakan gel akrilamid pastikan kedua
kaca cetakan sudah terpasang secara sejajar ke bingkai kaca cetakan
- sedua kaca dijepit dengan jepitan bingkai kaca cetakan
- penyemprotan air destilasi kecelah diantara sepasang kaca dengan menggunakan labu semprot.
Tujuannya adalah untuk memastikan bahwa tidak terdapat kebocoran pada cetakan gel akrilamid
- dibiarkan sekitar 5 menit untuk mengetahui apakah ada kebocoran atau tidak
- siapkan beberapa lembar tissue untuk mengeluarkan air destilasi yang tadi disemprotkan ke
celah diantara pasangan kaca cetakan gel caranya dengan membalikan kaca cetakan pada bingkai
secara perlahan sampai semua air tedestilasi keluar dari celah diantara kaca cetakan.
-air yang terdestilasi yang keluar dari kaca akan diserap oleh tissue yang ditempelkan diujung
celah kaca harus dipastikan bahwa semua air terdestilasi yang tadi disemprotkan benar-benar
telah dikeluarkan dari celah kaca cetakan
- sisa-sisa air yang masih menempel diujung kaca dilap dengan tissue agar kaca cetakan benar-
benar kering

2 tahap pembuatan gel poliakrilamid

1. letakkan tabung polipropilen ke dalam gelas baker
2. siapkan settingan mikro pipet untuk memasukkan 400 mikroliter TBE 5x pH 8 kedalam
tabung polipropilen, jangan lupa memeriksa larutan TBEnya masih bening atau sudah
terkontaminasi kemudian ambil larutan TBE dengan mikropipet dan masukkan kedalam tabung
polipropilen
3. pertama masukkan dulu 400 mikroliter TBE kedalam masing-masing tabung polipropilen
Kemudian ubah settingan mikropipet 1 mililiter lalu ambil dua mililiter larutan TBE dengan
mikropipet dan masukkan kedalam masing-masing tabung polipropilen sampai tabung terakhir
Jadi total kita menambhakan 2,4 mililiter larutan TBE kemasing-masing tabung polipropilen
Selanjutnya, kita ganti lagi settingan mikropipet menjadi 200 mikroliter karena kita akan
menambahkan 200 mikroliter larutan akrilamid 30% kedalam masing-masing tabung
polipropilen
Jangan lupa homogenkan terlebih dahulu larutan akrilamid dengan cara menggoyang botolnya
secara perlahan.
Kemudian, ambil 200 mikroliter larutan akrilamid dari botol secara hati-hati lalu, masukkan
larutan akrilamid kedalam tabung polipropilen
Saat bekerja dengan larutan akrilamid kita harus menggunakan sarung tangan dan berhati-hati
karena larutan ini bersifat karsinogenik
Kemudian, ubah lagi settingan mikropipet menjadi 1 mililiter karena kita akan menambahkan 3
mililiter larutan akrilamid kedalam masing-masing tabung polipropilen
Kemudian ambil 1 mililiter larutan akrilamid dari botol secara hati-hati
Kemudian, masukkan larutan akrilamid kedalam tabung polipropilen
Ulangi sampai 3 mililiter untuk masing-masing tabung polipropilen. Ketika mengambil larutan
perhatikan posisi tombol pada bagian atas mikropipet saat akan memasukkan ujung mikropipet
kedalam botol tombol bagian atas mikropipet harus dalam posisi ditekan lalu saat sudah dalam
botol lepas tombol secara perlahan sehingga larutan akan terisap kedalam mikropipet saat
memasukkan larutan dari mikropipet ke tabung polipropilen tekan tombol pada bagian atas
mikropipet sampai tekanan maksimal sehingga semua larutan masuk ke dalam tabung
Selanjutnya kita akan menghomogenkan larutan TBE dengan poliakrilamid yaitu dengan cara
menghisap dan melepaskan larutan beberapa kali tujuannya agar larutan TBE dan akrilamid
tercampur dengan sempurna
Selanjutnya kita akan menambahkan 6,4 mililiter aquades steril kedalam masing-masing tabung
polipropilen
Selanjutnya kita ganti lagi settingan mikropipet menjadi 200 mikroliter karena kita akan
menambahkan 200 mikroliter APS 10% kedalam masing-masing tabung polipropilen
Kita ambil larutan APS dari botol penyimpanannya lalu memasukkannya ke dalam tabung
polipropilen
Selanjutnya kita kan menambahkan 10 mikroliter TEMED sebelumnya kita setting mikropipet
pada volume 10 mikroliter
Ambil larutan TEMED dengan mikropipet lalu masukkan kedalam polipropilen yang telah berisi
larutan lainnya tadi
Selanjutnya langsung homogenkan campuran larutan ini dengan menggunakan mikropipet
sampai semua larutan tercampur dengan baik
Tahap ini adalah tahap paling penting dalam menentukan keberhasilan Poliakrilamid : Kalau
larutan tidak tercantum sempurna maka gel poliakrilamid akan gagal terbentuk
Kemudian masukkan campuran larutan ini kedalam celah diantara kedua kaca cetakan gel
poliakrilamid yang telah di siapkan sebelumnya, masukkan larutan secara hati-hati dan berulang
kali sampai campuran larutan mencapai volume maksimal di kaca cetakan gel
Kemudian pasangkan sisiran cetakan lubang poliakrilamid keatas celah kaca cetakan gel
Lalu bersihkan sisa-sisa campuran larutan yang masih menempel pada permukaan kaca cetakan
gel
Terakhir diamkan poliakrilamid dalam cetakan gel akrilamid terbentuk yang ditandai dengan
perubahan fase larutan menjadi padatan
Persiapan dan Running Elektroforesis Vertikal dengan Gel Poliakrilamid
Pada Tahap ini gel poliakrilamid yang telah dibuat pada tahap sebelumnya akan dibersihkan dari
sisa-sisa gel yang menempel pada kaca cetakan gel. Selanjutnya, kaca cetakan yang berisi gel
poliakrilamid akan dipasangkan pada bingkainya dan dimasukkan ke chamber elektroforesis.
Setelah sisiran dilepas, loading dye dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran gel sebagai
penanda progres elektroforesis. Kemudian DNA hasil PCR yang telah dicampur dengan loading
dye dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran. Selain itu dimasukkan juga DNA marker ke
sumuran paling kiri dan gel poliakrilamid. Setalah chamber elekroforesis diisi TBE 1x dan kabel
power supply telah dipasang, maka voltasenya disetting pada 50 voltase dan terakhir tekan
tombol run.
1. kaca yang sudah gel akrilamid di semprot dengan aqua dan di lap dengan tisu hingga bersih
dari sisa sisa gel yang masih menempel . perhatikan sisa sisa gel yang masih menempel,
perlakuan yang sama dengan kaca lain dan perhatikan posisi tangan saat memegang kaca harus
berhati-hati karna kaca penutup mudah pecah dan sangat tipis. Hingga kaca ke 3 lakukan sampai
bersih agar saat pengamatan tidak terhalang oleh sisa-sisa gel.
2. siapkan bingkai kaca cetakan gel, 1 bingkai dapat dipasang 2 kaca. Saling punggung2an
posisinya dengan kaca 1 dan yg lainnya perhatikan pemasangan kaca harus tepat dan lurus
kemudian dipasang penjepitnya kiri dan kanan. Cek Kembali pemasangan kaca pd bingkai
3. memasukkan chamber elektrofaoresis dan siapkan bingkai kedua
Kita pasang kaca yang berisi gel akrilamid perhatikan posisi kaca harus benar-benar lurus dan
psang penjepitnya dan dimasukkan ke dalam chamber
4. memasukkan larutan TBE kedalam chamber elektroforesis proses memasukkan TBE harus
hati2 dan langsung disela2 kaca dan bingkai
5. sisir pada ccetakan gel dilepas sisiran ini akan membentuk sumuran sumuran kecil pada gel
poliakrilimid dan dibersihkan dengan tisu jika maish sisa2 gel
6. Memasukkan loading dey kedalam masing2 sumur poliakrilamid sebagai penanda dan
memasukkan magnetic stirel kedalam chambernya agar tbe nya tetap homogen
7. menyiapkan sampel dna hasil pcr pd proses sebelumnya dna diambil 4 mikrolit dr pcr dan kita
teteskan pada flat yang beisi sumuran kecil yang sudah diloading dey 1 mikrolit dan settingan
mikropipet menjadi 5 mikrolit karna sampel 4 dan tambah loading dey 1 jadi 5 mikrolit
kemuadian kita campurkan antar loading dey dengan dna kita agar homogen dan dimasukkan
kedalam sumur poliakrilamidnya sumur gel poliakrilamid berhati hati dan pelan2
Kita lanjutkan dengan sampel kedua diambil DNA hasil pcr (perlakuan sama seperti
sebelumnya)tetskan pd flat yg sudah dileading deynya setinggan mikropipet ganti lg menjadi 5
mikrolit kemudian dicampur dengan pemijatan perhatikan tombol pipet yang atas seperti
mencampur larutannya dan masukkan sumur poliakrilamid secara hati-hati
Sampel terakhir yang dimasukkan selanjutnya
8. masukkan kedalam dna leader atau marker sebagai penanda untuk menentukan nanti brp
ukuran benda yang kita dapatkan nanti berapa ?
9. kita tambahkan Kembali TBE 1x ke dalam chamber sampai batas yang ditentukan
10. letakkan chamber di atas happed stirrer(?) mskkan magnet dlm chamber tadi sudah, jd tinggal
di putar dan dipasang tutup chambernya
Kemudian kita pasang kabel power perhatikan pemasangan kabel harus sesuai kabel hitam pd
lobang hitam begitu jg dengan kabel merah, nyalakan powernya kita setting protase hingga 50
kita nyalakan magnetix strirelnya agar magnetnya berputar lalu kita simpan dalam chamber
perhatikan apakah magnet sekitarnya berputar dan tekan tombol run
Pewarnaan DNA di Gel Poliakrilamid
Pada tahap ini disiapkan semua bahan dan peralatan yang diperlukan untuk pewarnan DNA yang
telah dirunning di gel poliakrilamid. Pewarnaan DNA menggunakan senyawa EtBr. Setelah
diinkubasi, sisa EtBr dibilas dengan aquades.
Siapkan box dan beri label, box ini untuk menyimpan gen. kemudian kita siapkan ETBR sebagai
pewarna DNA
Warna loading dey di bawah maka siapkan labu semprot jika sudah selesai dikeluarkan bingkai
kacanya dan keluarkan etbrnya di sela-sela kacanya secara pelan-pelan.
Lepaskan cetakan gel dr bingkainya kita buka boxnya kemudian masing-masing kaca isi gel
dimasukkan kedalam box. Bingkai kedua dikeluarkan dr chamber dan etbr dituang kedalam gelas
baker (etbr dituang hati-hati) lepaskan kaca cetakan gel dari bingkainya
Masukkan kedalam box yang sudah disediakan (hasil running dna) 1 kotak berisi 1 gel siapkan
etbr yang baru 1x sebanyak 10 mililiter siapkan labu semprot dan bersihkan kaca cetakan gel
yang dipake tadi dan dilembabkan agar nanti gelnya tidak kering dan dengan menggunakan
lempeng plastic kita buka kaca penutup dari cetakan gelnya harus hati-hati kemudian gelnya
semprot Kembali dengan aquades
Lepaskan gel dari kaca secara hati-hati kemudian lepas dari pinggir gel dan semprot Kembali
agar tetap lembab jadi di bawah kanan gel dijepit dan masukkan ke dalam box dan lanjutkan ke
sempel yg kedua dan ketiga
Buang sisa etbr yang masih menempel di gel poliakrilamid kemudian di lap dengan tisu agar
bersih dr sisa etbr tadi
Siapkan etbr 1x sebanyak 10 mililiter ke agar gel poliakrilamid dan buang lagi dan bersihkan
dengan tissue perlakuan ke 3 gel nya itu
Siapkan tip putih manambahkan 10 mikrolit etbr untuk masing-masing gel agarose kemudian
ditutup diambil lagi etbe 10 mikrolit dan lakukan ke semua gel agarose
Box ditutup rapat di goyangkan secara perlahan box 2 dan 3 seperti itu
Box dibawa ke ruang pewarnaan dan taruh di atas alat platformsekeroking untuk inkubasi gel
yang mengandung dna tadi yang suka di running stlh 10 mnt keluarkan dan dibuang larutan sisa
etbr dan tahan dengan tangan agar gel tidak lepas dari box lalu bilas jg dengan aquades. Hingga
gelnya terendam menghapus sisa2 etbr
Disetting Kembali inkubasi 10 menit

Perekaman Gel Poliakrilamid di Chemical Doc

Ini adalah tahap akhir dari elektroforesis vertikal dengan gel poliakrilamid. Pada tahap ini, gel
berisi DNA hasil PCR yang telah dirunning akan direkam hasilnya. Pertama-tama meja
Chemical Doc disemprot dengan alkohol, kemudian dilap dengan tisu. Selanjutnya, gel
poliakrilamid diletakkan di meja dan diatur posisinya agar pas. Kemudian mesin chemical doc
dinyalakan. Selanjutnya, hasil perekaman bisa dilihat dilayar komputer dan diprint.

Buka meja chemical gel doc dan disemprot dengan alcohol dan dilap dengan tisu bersih
Gel poliakrilamid tadi diletakkan pada meja gel doc kemudian pastikan posisi gel
poliakrilamidnya lurus dan tutup meja gel docnya
Nyalakan alatnya dan kita lihat di monitar (alatnya terhubung dengan computer) di setting
pencahayaannya dari computer
Dilihat bend2nya atau pita dna? Selanjutnya gambar ini bisa di print