A.

Pemilihan Fase Gerak

1. Menggunakan APD (jas lab, masker, face shield, dan sarung tangan).
2. Menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan, membersihkan alat yang akan
digunakan.
3. Menyiapkan 4 bejana KLT yang diisi dengan 4 fase gerak yang berbeda, kemudian
menjenuhkan (kejenuhan dapat dilihat dengan menggunakan kertas saring yang
terbasahi).
I. n- Heksana 100%
II. n- Heksana – kloroform (4:1)
III. n- Heksana – etil asetat (5:1)
IV. Etil asetat 100%
4. Menghitung indeks polaritas dari masing-masing campuran fase gerak.

5. Menyiapkan 4 plat KLT dengan ukuran 3x10 cm dengan batas bawah 1,5 cm dan
batas atas 0,5 cm.
6. Menyiapkan larutan baku EPMS dan larutan sampel ekstrak kencur.
7. Menotolkan larutan baku EPMS sebanyak 2 µL dan ekstrak rimpang kencur sebanyak
4 µL dengan bantuan mikropipet pada masing-masing plat KLT.
8. Memasukkan plat KLT ke dalam bejana yang sudah dijenuhkan. Melakukan eluasi
hingga batas atas KLT. Bejana KLT tidak boleh dibuka selama proses eluasi sedang
berlangsung.
9. Mengambil plat KLT dengan menggunakan pinset, mengipaskan secara perlahan
dengan tujuan untuk menguapkan sisa fase gerak.
10. Melakukan visualisasi KLT dibawah UV 254 nm.
11. Memberi tanda noda yang terlihat dan menghitung derajat keterpisahan (α) dari noda
yang sama dengan standar terhadap noda terdekat untuk menentukan eluen yang
terpilih.

B. Penyiapan Kolom
1. Menggunakan APD (jas lab, masker, face shield, dan sarung tangan).
2. Menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan, membersihkan alat yang akan
digunakan.
3. Menimbang silica gel sebanyak 50 gram dengan alas cawan porselen.
4. Memasukkan silica gel yang sudah ditimbang ke dalam labu erlenmeyer dengan
bantuan corong dan batang pengaduk.
5. Meyiapkan fase gerak terpilih sebanyak 300 mL kemudian memasukkan ke dalam
labu erlenmeyer.
6. Memasukkan fase gerak terpilih ke dalam labu erlenmeyer yang berisi silica gel
hingga semua silica gel terbasahi.
7. Mendiamkan sambil megaduk dengan bantuan batang pengaduk selama 15 menit.
8. Menutup labu erlenmeyer menggunakan aluminium foil.
9. Menggoyangkan labu erlenmeyer untuk membantu agar silica gel terbasahi secara
merata dengan eluen.
10. Menuangkan campuran silica gel dan eluen ke dalam kolom dengan bantuan corong
gelas.
11. Membuka stopper yang terdapat dibagian bawah kolom untuk mengeluarkan eluen.
12. Jika masih ada silica gel di dalam labu erlenmeyer,maka tambahkan eluen dan
masukkan ke dalam kolom dengan bantuan corong gelas.
13. Menutup stopper yang terdapat di bagian bawah kolom.
14. Menambahkan fase gerak ke dalam kolom hingga 2 cm dari batas atas kolom.
15. Menutup kolom dengan aluminium foil dan merekatkan dengan karet gelang. Hal ini
dilakukan untuk memastikan agar kolom tidak kering selama penyimpanan.
(Kolom yang sudah disiapkan akan digunakan seminggu kemudian,sehingga harus
dijaga agar kolom tidak kering, setiap hari harus ditambahkan fase gerak hingga 2 cm
dari batas atas kolom).

C. Pelaksanaan Kromatografi Kolom

1. Menggunakan APD (jas lab, masker, face shield, dan sarung tangan).
2. Menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan, membersihkan alat yang akan
digunakan.
3. Membuka penutup alumunium foil dari kolom.
4. Mengeluarkan eluen dari kolom dengan cara membuka stopper di bagian bawah
kolom.
5. Mengeluarkan eluen hingga batas 0,5 cm dari permukaan atas fase diam, kemudian
menututup stopper.
6. Memasukkan sampel kering ke dalam kolom dan memastikan sampel terdistribusi
merata di atas kolom.
7. Menyiapkan silika gel sebanyak 0,5 gram dan memasukkannya ke dalam kolom. Hal
ini bertujuan untuk melindungi ekstrak supaya tetap rata pada saat ditambahkan eluen.
8. Menambahkan eluen melalui dinding kolom dengan bantuan pipet pasteur.
9. Mengalirkan eluen dan menampung dalam beaker glass. Beberapa mL eluen yang
keluar pertama kali dari kolom belum mengandung senyawa kimia dari ekstrak
sehingga tampungan bisa dibuang. Umumnya sekitar 50% dari volume kolom, dimana
pada praktikum ini ditampung sekitar 70 mL sebelum ditampung pada vial.
10. Menampung fraksi pada vial yang sudah dikalibrasi 10 mL dan sudah ditandai dengan
nomor. Menampung fraksi sebanyak 30 vial.
11. Mengatur kecepatan alir kira-kira 1 tetes per detik.
12. Mengganti dengan vial berikutnya jika sudah penuh 10 mL.
13. Menutup vial dengan alumunium foil dan memberi lubang dengan bantuan jarum.
14. Membiarkan hingga sebagian besar eluen menguap. Pada praktikum ini, hasil
tampungan dibiarkan selama ± 7 hari.

D. Monitoring Hasil Kromatografi Kolom dengan KLT

1. Menggunakan APD (jas lab, masker, face shield, dan sarung tangan).
2. Menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan, membersihkan alat yang akan
digunakan.
3. Setelah beberapa hari, eluen dalam tampungan akan menguap. Jika tampungan
mengering maka perlu ditambah eluen beberapa tetes.
4. Menotolkan tampungan dari tiap vial paa plat KLT (30 vial pada 2 plat KLT).
5. Menjenuhkan bejana KLT dengan fase gerak terpilih yaitu n-heksana : etil asetat
(4:1).
6. Memasukkan plat KLT ke dalam bejana.
7. Melakukan eluasi hingga batas atas plat KLT.
8. Melakukan visualisasi noda dengan UV 254 nm.
9. Melakukan penggabungan terhadap fraksi-fraksi yang memiliki profil KLT yang
sama.
10. Mengamati profil KLT fraksi hasil gabungan dengan cara menotolkan fraksi yang
diperoleh dan standar pada pelat KLT, fase gerak yang digunakan sama dengan
kromatografi kolom. Selanjutnya melakukan pengamatan dengan UV 254 nm.
11. Menghitung nilai Rf standar dan Rf fraksi. Menentukan apakah fraksinasi telah
berhasil dilakukan untuk memperoleh isolat yang ditargetkan, yaitu senyawa yang
sama dengan standar.