MAKALAH KROMATOGRAFI EKSKLUSI

Disusun Oleh

Nama : Charina Pakpahan

NIM 061630400991

Kelas : 2KA

Nama Dosen : Anerasari, M.B.Eng.,M.Si.

JURUSAN TEKNIK KIMIA

POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA
PALEMBANG
2017
KATA PENGANTAR

.Puji syukur penulis panjatkan keharibaan Allah SWT, Tuhan seluruh Alam, Maha
Kasih dan Sayang, Arif dan Bijaksana, yang senantiasa menyelimuti Hikmahnya bagi
seluruh umat manusia untuk beraktifitas sebagai khalifah fill ardi, terutama nikmat yang
diberikan kepada penulis hingga dapat menyelasaikan makalah kimia analitik instrumen
dengan judul “KROMATOGRAFI EKSKLUSI” sesuai dengan waktu yang telah
ditentukan. Tak lupa pula salawat dan salam kami haturkan kepada junjungan Nabi Besar
kita Muhammad Rasullah SAW.
Terimakasih penulis sampaikan kepada dosen yang telah memberikan tugas karena
ini semua merupakan bekal bagi penulis dikemudian hari. Dan kawan-kawan yang telah
membantu hingga tugas ini rampung.Akhirnya, segala makna dan hakikah kesempurnaan
hanya milik yang Satu, untuk itu saran dan kritikan yang sifatnya membangun sangat
penulis harapkan demi kesempurnaan maklah ini kedepan.

Palembang,2 Juli 2017

Penulis
DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR............................................................................................................2
DAFTAR ISI...........................................................................................................................3
BAB I......................................................................................................................................4
PENDAHULUAN...............................................................................................................4
BAB II.....................................................................................................................................4
PEMBAHASAN.................................................................................................................5
BAB III..................................................................................Error! Bookmark not defined.
KESIMPULAN.................................................................................................................18
DAFTAR PUSTAKA...........................................................................................................20
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia Michael Tswett
pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara
perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCO3).
Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering
digunakan untuk bidang kimia analisis. Kromatografi dapat dimanfaatkan untuk melakukan
analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, maupun preparatif dalam bidang farmasi,
lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan
yang mengunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Gandjar,
2007). Teknik kromatografi sendiri telah dikembangkan dan telah digunakan untuk
memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang kompleks, baik
komponen organik maupun komponen anorganik. Kromatografi dapat dibedakan atas
berbagai macam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme
pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi (a) kromatografi adsorbsi; (b)
kromatografi partisi; (c) kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e)
kromatografi eksklusi ukuran; serta kromatografi afinitas (Gandjar, 2007).

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa yang dimaksud kromatografi eksklusif atau Size exclusion chromatography?

2. Bagaimana prinsip dan mekanisme kromatografi eksklusif?
3. Apa saja jenis dari kromatografi eksklusif berdasarkan pengelompokannya?
4. Apa saja komponen dari kromatografi eksklusif ?
5. Bagaimana prosedur pemisahan kromatografi eksklusif?
6. Apa saja keuntungan dan kerugian kromatografik eksklusif?

1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah tersebut,maka tujuan dari makalah ini adalah :
1. Mengetahui pengertian dari kromatografi eksklusif.
2. Memahami prinsip dan mekanisme kromatografi eksklusif.
3. Mengetahui jenis dari kromatogarfi eksklusif.
4. Mengetahui komponen dari kromatografi eksklusif
5. Mengetahui prosedur pengerjaan.
6. Mengetahui keuntungan serta kerugian kromatografi esklusif.
 BAB II

PEMBAHASAN

KROMATOGRAFI EKSKLUSI

Size exclusion chromatography (SEC) disebut juga gel permeation chromatography

(GPC), gel filtration chromatography (GFC), merupakan metode kromatografi yang
menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda.
Teknik SEC pertama kali ditemukan oleh Grant Henry Lathe dan Colin R Ruthven.

SEC umumnya diaplikasikan untuk kompleks makromolekuler sperti protein dan

industri polimer terutama digunakan untuk memisahkan molekul biologis, untuk
menentukan bobot molekul dan distribusi bobot molekul dari polimer. Molekul yang lebih
kecil dari ukuran pori dapat memasuki partikel dan mempunyai jalur dan waktu transit yang
lebih panjang dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Semua
molekul yang lebih besar dari ukuran pori tidak tertahan dan terelusi bersama. Molekul
yang memasuki pori akan mempunyai waktu tinggal dalam partikel yang tergantung pada
ukuran dan bentuk molekul. Molekul yang berbeda mempunyai waktu transit yang berbeda
untuk melewati kolom.

Mekanisme SEC

Buffer dipompa melewati kolom oleh alat yang diatur oleh komputer. Saat
campuran molekul dan ion-ion yang terlarut dalam pelarut diaplikasikan pada ujung atas
kolom, molekul-molekul yang lebih kecil (dan ion) didistribusikan melalui volume pelarut
yang lebih besar daripada yang tersedia unutk molekul besar. Molekul yang lebih kecil dari
ukuran pori dapat masuk ke dalam partikel dan karenanya memiliki jalur yang lebih
panjang serta waktu transit yang lebih panjang dibandingkan molekul besar yang tidak
dapat memasuki partikel. Seluruh molekul yang lebih besar ukurannya dibandingkan
ukuran yang tidak tertahan dan akan dielusi bersamaan. Molekul yang dapat masuk ke
dalam pori akan memiliki waktu tinggal rata-rata dalam partikel, yang bergantung dari
bentuk serta ukuran molekulnya. Karena itu, molekul besar bergerak lebih cepat melewati
kolom, dan dengan inilah campuran tersebut dapat dipisahkan menjadi komponen-
komponennya.

Prinsip SEC

Prinsip dari kromatografi eksklusi adalah terjadinya pemisahan molekul polimer

sesuai dengan volume hidrodinamiknya ketika sampel diinjeksikan ke dalam kolom.
Volume hidrodinamik yang dihasilkan dari system kromatografi ini terbagi menjadi tiga
macam volume, yaitu:

•Volume interstisial (Vi) merupakan volume elusi yang diperoleh jika molekul polimer
memiliki ukuran yang lebih besar daripada ukuran pori-pori sehingga tidak mampu masuk
ke pori-pori.
•Volume interstisial dan Volume pori (Vi + Vp) merupakan volume elusi yang diperoleh
jika molekul polimer memiliki ukuran yang lebih kecil daripada ukuran pori-pori sehingga
mampu melewati dan masuk ke dalam pori-pori.
•Volume elusi (Ve) merupakan volume pori untuk molekul polimer yang memiliki ukuran
diantara kedua molekul polimer sebelumnya. Untuk volume ini, dapat dirumuskan dengan
persamaan: Ve = Vi + Ksec.Vp

Dimana Ksec adalah nilai konstan pada kromatografi eksklusi (0 < Ksec < 1)
Peralatan penting yang biasanya digunakan pada kromatografi eksklusi (size exclusion
chromatography), antara lain pompa untuk mempertahankan aliran yang konstan, kolom
dengan jenis molekul tertentu, dan detektor untuk hasil yang kuantitatif.
Berikut adalah skematis dari system kromatografi eksklusi.

Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaann ukuran dan geometri

molekul adalah dasar Kromatografi eksklusi. Peredaan ukuran menyebabkan beberapa
partikel bergerak lebih cepat dari yang lainya sehingga menimbulkaan perbedan permukaan
migrasi. Kromatografi eksklusi dapat dikelompokkan menjadi tiga kategori yaitu

1. Teknik permeasi gel atau filtrasi gel

2. Eksklus dan reterdasi ion
3. Inorganic molecular sieves

A.Teknik Permeasi atau Filtrasi Gel

Teknik permeasi atau Filtrasi adalah suatu teknik yang menguraikan campuran zat-
zat sesuai dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasari atas inklusi dan eksklusi suatu zat
terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang terikat silang ddan
berpori heterogen. Dalam kromatografi eksklusi cair-padat pemisahan teradi antara vase
cair di dalam partike gel dan cairan diluar mengelilingi partikel gel. Sebagai penunjang fase
diam dalam pemisahan ini biasanya digunakan xerogel-xerogel. Xerogel adalah suatu gel
organik yang dapat bersifat hidrofilik (yaitu : agar dan dekstran yang terikat silang pada
poliakrilamida) ataupun hidrofobik (poistirena). Xerogel-xerogel ini tersedia di pasaran
dengan nama dagang biogel p-2 (poliakrilamida),sepadex G-10-200 (dekstran) juga
styrogel (gel polistirena yang dimodifikasi) dan agarose.Kolom yang digunakan adalah
kolom biaya
pengelusi (luent) dibiarkan mengalir karena grafitasinya. Laju aliran akan bertambah
dengan bertambahnya ukuran partikel seperti kromatografi pertukaran ion, laju aliran juga
dapat dipengaruhi oleh variasi porositas gel. Untuk suatu gel yang tidak padat, volume
interstisi dapat diturukan dengan pemberian tekanan, volume eluent berkisar antara 25 –
100 ml. sepertii juga metode kromatografi lainnya, konsekwensi efluaennya diukur melalui
sifat-sifat fisik yang sesuai.. seperti indeks refraksi, absorbansi,, intensitaa Spendar flour
atau sifat-sifat istriknya.Parameter-parameter kolom dapat dihubungkan secar matematik
dengan

Vb = Vo + Vi + Vr = Vo Vs
Vi = m Sr/ Ps
Vi =Vo + Kd Vi

Dimana :
– Vi = volume bagiana dalam gel,
– Vr= volume matriks gel,
– Vs= volume total face diam gel,
– m = berat gel,
– Sr = volume pelarut yang dipakai,
– Ps = kerapatan pelarut,
– Kd = koefisien distribusi,
– Pr = kerapatan gel,
– Vb= volume bed,
– Vo= volume di luar gel,

Pemisahann suatu tipe gel bergantung pada ukurran molekul dan sifat kimia dari
zat yang akan dipisahkan. Misalkan biogel 0 – 10 digunakan untuk zat-zat dengan berat
molekul berkisar antara 500-17000 satuan. Molekul dengan besar molekul diatas batas ini
yaitu limit eksklusif, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel. Di bawah limit eksklusi, zat
tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai dengan volume bed total. Untuk
bekerja dalam medium tidak berai, gel yang tepat digunakan adalah sephadex LH-
20.Pemakain Kromatografi permeasi gel digunakan untuk analisis campran molekul dengan
berat molkul yang berbeda seperti pemisahaan rafinosa, maltose, dengan menggunakan
sephadex pada pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam ddan H2O sebagai eluent. Pemisahan molekul-
molekul dengan berat molekul sama dapat juga dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe
gel dan tinggi kolomnya. Pengeluaran garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang
meliputi pembebasan garam dan senyawa berberat dengan molekul makro.
B. Eksklusi dan reterdarsi ion

Eksklusi ion adalah suatu proses untuk memisahkan materi ionic dari materi
nonionic didasari pada perbedaan distribusi pada ke dua tipe zat pelarut ini di antara vase
resin penukar ion dan larutan air. Jika suatu resin penukar ion diletakkan dalam larutan
elektrolit encer atau dalam air, konsentrasi elektrolit pada kesetimbangan dalam fase resin
akan lebih kecil dari pada larutan sekelilingnya yaitu fase luarnya, tetapi bila resin
diletakkan dalam suatu larutan nondielektrolit (dalam air), maka nonelektrolit ini akan
berubah untuk terdistribbusi secara merata pada kedua fase. Jadi sebenarnya tidak terjadi
penukaran ion dalam peristiwa absobsi elektrolit dan elektrolit tersebut. Karena ke dua tipe
zat terlarut ini dapat diekstraksi dari resin dengan hanya mengencerkan larutan laurnya
(sekelilingnya). Dengan air. Jiak suatu latutan yang mengandung baik materi-materi ionic
dan nonionic diletakkan pada bagian atas kolom berisi resin dan dicuci dengan air, materi
ionic akan mengalir mengelilingi partikel resin sedang materi nonionic berdifusi kedalam
pertikel- partikel resin dan masuk kedalam rongga-rongga kosong antara partikel resin.
Laju perpindahan materi nonionic akiabatnya akan lebih rendah dari pada komponen
ionicnya dan akan teramati komponen ionic muncul terlebih dahulu sebagai efluen.
Jelasbahwa resin penukaran ion digunakan sebagai fase diam, dank arena tidak terjadi
penukaran ion, resindapat dipakai terus-menerustanpa regenerasi.
1. Mekanisme Eksklusi Ion

Suatu resin penukaran ion tidaklah sama dengan absobsi biasa. Dengan mengatur
jaringan muatan suatu resin, dapat diperoleh keadaan dimana hanya satu macam ion
elektrolit yang dieksklusikan. Jumlah total elektrolit yang berdifusi kedalam resin dibatasi
eloh prinsip elektronetralitas. Makin kuat terionisasi suatu resin penukaran makin efesien
untuk eksklusi ion. Banyaknya garam yang erdifusi kedalam resin berkurang dengan
bertamnbahnya kapasitas penukar ion suatu resin. Sebagian besar ion elektrolit berberat
elektrolit rendah yang mudah larut dalam air, bebas berdifusi kedalam dan keluar resin
tidak peduli besarnya kapasitas resin, sehingga cenderung berkonsentrasi sama dengan ke
dua fase saat kesetimbangan tercapai.

2. Aplikasi Metode Ion Eksklusi

Gula dan garam tidak dapat dipisahkan dengan metode ini karena ukuran dan
ketidakmampuanya relative dari molekul sukrosa dan glukosa untuk berdifusi secara cepat
kedalam fase resin. Pemisahan elektrolit kuat dan molekul netral paling baik dicapai dengan
metode eksklusi ion, misalnya pemisahan NaCl dan etilen glikol, HCl dan HC 3COOH,
CH3COOH; NaCl dan etano. Riechenberg telah menggunakan teknik ini untuk pemisahan
anggota deret Homolog, misalkan pemisahan asam asetat dan asam n- butirat. Gugusan
sulfanat yang bersiafat asam pada resin penukaran ion, dapat menghasilkan efek garam
pada materi organic dan cenderung untuk menehan efek absorbsi matriks resin. Oleh karena
itu rieman menggunakan larutan garam sebagai pengganti larutan H2O untuk eluen dalam
memisahkan methanol, etanol dan propanol. Efek yang menguntungkan adanya garam
dalam eluen adalah efek garam selektif terhadap komponen nonionic dari fase larutannya.

C. Molekular sieve anorganic – Zeolit

 Zeolit alam dan sintesis membentuk suatu saringan molekul untuk pemisahan gas-
gas dan molekul organic berukuran organic berukuran kecil. Volume suatu zeolit terbentuk
dari suatu rongga-romgga yang saling dihungbungkan dengan saluran-saluran (channels).
Penyaringan dan aksi penghambatan dari saluran dikombinasikan dengan aktifitas adsobsi
permukaan matriks Kristal sehingga memungkinkan digunakannya zeolit untuk
memisahkan molekul—molekul yang lebih kecil dari ukuran saluran ini dari molekul yang
lebih besar ukurannya dari ukuran saluran. Aktifitas permukaan dan geometris molecular
berperanan dalam pemisahan ini.Secara structural zeolit adalah rangka tetrahedral yang
bersatu membetuk struktur sarang tawon dengan rongga-rongga besar yang saling
berhubungan melalui saluran-saluran kecil. Penampang lintang dari saluran inilah yang
menentukan ukuran molekul yang dapat masuk ke dalam rongga-rongga.

Ukuran dari posisi ion logam (misal Na, Ca) dalam Kristal zeolite , dan tipe
struktur jaringan rangka tetra hedral alumina silica zeolit menentukan diameter efektif dari
saluran - saluran tersebut.Beberapa macam tipe zeolit, misalkan tipe molecular sieve 4A
adalah adalah [Na12(AlO2)12(SiO2)12].Molekul berdiameter lebih kecil dari 4A akan
terabsorbsi, misalkan H2O,CO2,H2S,SO2 dan hidrokarbon borongga 1-2 atom karbon. Etana
dapat masuk kedalam molecular sieve 5A, yang dibuat dari molecular sieve 4A dengan
menggantikan Na oleh Ca dan K. paraffin lantai lurus dapat masuk kedalamnya, demikian
juga alcohol sampai dengan C 4, tetapi siklopropana tidak dapat masuk. Demikian juga
asam naftanik dan olekul aromatic lainya. Tipe 10 x dan 13 x adalah Na8(AlO2)80(SiO2)106.
Mereka mengabsobsi molekul berdiameter sampai 10 A.

Molecular sieve mempunyai afinitas lebih besar terhadap molekul polar dan
senyawa yang berpolarisasi karena induksi pada molekul nonpolar yang berukuran sama.
Molekul-molekul polar tertahan dengan kuat dalam rongga Kristal. Pada pemurnian dan
industry gas, molekul sieve digunakan untuk menghilangkan molekul-molekul tidak jenuh
(polar). Zeolit digunakan juga sebagai medium berlangsungnya reaksi. Bahan kimia
didalamnya sebagai hasil reaksi dapat dikeluarkan dengan menggunakan teknik vakum atau
dengan pergeseran menggunakan materi yang berabsorbsi kuat, misalkan air. Molecular
sieve ini dapat diaktifkan kemali dengan peanasan 200-3500 C. mereka juga digunakan
dalam kromatografi gas padat sebagai fase diamnya dalam kolom.
Komponen Yang Digunakan Pada Sistem Kromatografi Eksklusif

a. Kolom

Kolom eksklusi mengandung partikel berpori dengan garis tengah pori yang
berbeda. Solut yang disuntikkan ke dalam kolom akan berdifusi ke dalam pori yang garis
tengahnya lebih besar daripada garis tengah efektif solut. Garis tengah efektif ditunjukkan
pada gambar berikut : (Khopkar, 1990).

Perhatikan, walaupun bobot molekul sama, garis tengah efektifnya berbeda, dan komponen
yang garis tengah efektifnya paling besar terelusi lebih dahulu. Selain itu, garis tengah
efektif mencakup pula molekul solvasi apa saja (Khopkar, 1990).

Dengan bertambah besarnya garis tengah efektif solut, jumlah pori yang dapat
dimasukinya dan kemampuannya berdifusi ke dalam pori menurun. Jadi, jika solut bergaris
tengah demikian rupa sehingga tidak dapat berdifusi ke dalam pori yang mana pun, maka
solut tersebut dapat dikatakan dieksklusi sempurna dan tidak ditahan, artinya solut itu
terelusi dalam volum mati (Vo) kolom. Solut yang mampu berdifusi sempurna ke dalam
semua pori dikatakan berpermerasi sempurna ke dalam kemasan. Solut jenis ini
memerlukan volum pelarut yang jauh lebih besar untuk mengelusinya dari kolom.
Pemisahan komponen dapat tercapai jika komponen itu terelusi dengan volum tambat
antara Vo dan volum permeasi total (Khopkar, 1990). Volum kolom eksklusi terdiri atas
tiga komponen yang jelas, yaitu :

1. volum mati, Vo – volum ruang antarpartikel yang ditepati fase gerak yang mengalir,

2. volum yang ditempati oleh bagian padat kemasan,

3. volum pori (Vp) – volum yang ditempati fase gerak yang mandek.Pada kromatografi
eksklusi, ini dapat disamakan dengan volum fase diam (Khopkar, 1990).
 Kita dapat mendefinisikan koefisien distribusi K solut sebagai nisbah volum pori
yang dapat dimasuki solut (Va) dan volum pori total (Vp), yaitu: K=Va/Vp

Maka volum tambat (Vr) solut dinyatakan dengan persamaan berikut : Vr = Vo + KVp

Rentang K antara 0 sampai 1, karena jika solut dieksklusikan seluruhnya, maka K= 0, dan
jika solut berpermerasi ke pori seluruhnya, maka K=1 (artinya, Va = Vp jika kolom
berperilaku secara eksklusi ’ideal’ (Khopkar, 1990). Maka jelaslah bahwa untuk
memperoleh pemisahan semaksimum mungkin kita menginginkan volum mati yang kecil
dan volum pori yang besar. Harus diingat pula bahwa untuk sistem tertentu, volum yang
diperlukan untuk mengelusi semua komponen cuplikan besarnya tertentu (artinya Vo dan
Vp). Jadi, harus dilakukan segala usaha untuk meminimumkan pelebaran pita (Khopkar,
1990). Memilih ukuran pori kemasan umumnya bergantung pada ukuran molekul solut
yang akan dipisahkan. Sering cuplikan ukurannya sangat beragam (artinya bobot molekul
sangat berbedabeda) dan kemasan dengan satu ukuran pori saja tidak memadai untuk
memisahkan semua jenis molekul.

Beberapa mungkin dieksklusi seluruhnya dari pori (K=0) dan terelusi sabagai satu
puncak dengan volum mati (Vo), sedangkan yang lain berpermeasi ke semua pori (K=1)
dan terelusi sebagai satu puncak dengan volum permeasi total (Vo+Vp). Yang lainnya lagi
berpermeasi ke pori secara selektif, bergantung pada ukuran nisbinya, dan terelusi dengan
volum tambat Vr yang dinyatakan oleh persamaan Vr = Vo + KVp (Khopkar, 1990).
Setiap kemasan eksklusi ruang yang berbeda ukuran porinya mempunyai kurva kalibrasi
sendiri. Batas eksklusi dan rentang kerja bobot molekul (BM) pada gambar tidak
didefinisikan dengan tajam karena distribusi pori kemasan kolom tidak sempit.

Distribusi pori pada kemasan menentukan kemiringan kurva kalibrasi. Jika

distribusi pori lebar, kurva mempunyai kemiringan yang tajam. Jadi, rentang kerja BM
besar, tetapi akan menghasilkan daya pisah rendah pada senyawa-senyawa yang ukuran
molekulnya hampir sama. Jika distribusi sempit, kurva leih mendatar. Jadi rentang kerja
BM akan lebih kecil, tetapi daya pisah molekul yang ukurannya hampir sama akan
meningkat (Khopkar, 1990). Kolom yang berbeda rentang kerja BM-nya dipakai untuk
menghasilkan pemisahan optimum komponen cuplikan yang lebar distribusi bobot
molekulnya. Tiap rangkaian kolom mempunyai kurva kalibrasi sendiri, yang diperoleh
dengan menyuntikkan cuplikan baku yang bobot molekulnya diketahui dan menentukan Vr
masing-masing. Kromatografi eksklusi adalah cara cepat untuk memperoleh harga kira-
kira bobot molekul cuplikan dengan cara perbandingan empiris dengan senyawa baku
otentik (Khopkar, 1990).

Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul linarut yang
akan dipisahkan. Sampel yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak
mampu dipisahkan jenis-jenis molekulnya jika digunakan satu ukuran pori-pori dari
kolom.Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu
kurva kalibrasi tertentu. Batas eksklusi dan rentang kerja BM tidak didefinisikan
dengan tajam karena distribusi pori kolom tidak sempit. Jika distribusi pori lebar maka
akan dihasilkan kurva dengan kemiringan yang tajam. Dengan demikian, senyawa-
senyawa yang memiliki ukuran molekul hampir sama akan dihasilkan daya pisah yang
rendah jika rentang kerja BM-nya besar. Sebaliknya, jika distribusinya sempit maka
akan didapat kurva yang lebih mendatar. Sehingga, rentang kerja BM akan menjadi
lebih kecil tetapi daya pisah molekul yang memiliki ukuran hampir sama akan
meningkat. Pemisahan optimum komponen-komponen suatu senyawa sampel
yang memiliki distribusi bobot molekul lebar dapat diperoleh jika kolom eksklusi
memiliki rentang kerja BM yang berbeda. Pada setiap rangkaian kolom dapat dihasilkan
kurva kalibrasi tersendiri dimana perolehan kurva kalibrasi ini didapat dengan
menyuntikkan senyawa baku (standar baku) yang diketahui bobot molekulnya, kemudian
menentukkan VR masing-masing. Dengan demikian, kromatografi eksklusi merupakan
suatu metode cepat yang dapat digunakan untuk memperoleh perkiraan harga bobot
molekul (BM) suatu sampel dengan membandingkan empirisnya pada senyawa standar
baku. Untuk memperoleh nilai perbandingan yang bagus, struktur antara sampel dengan
senyawa standar baku haruslah sama.
 b. Fase Gerak
Fase gerak dalam SEC harus merupakan pelarut polimer yang baik
untuk menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang sesuai
dan bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut bertujuan agar
pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak atau dengan kata lain memecahkan agregat.
Bila sampel hanya terlarut sebagian dalam fase gerak, maka dapat terjadi peningkatan
tekanan pada kolom karena ukuran partikel yang terlalu besar. Efek tersebut dapat diatasi
dengan cara memilih pelarut lain, atau meningkatkan temperatur kolom.
Pada beberapa kondisi, perlu adanya penambahan elektrolit agar terjadi disagregasi.
Beberapa polimer, seperti polyolefin, biasa digunakan untuk analisis pada suhu tinggi (140-
1500C). Bila analisis dilakukan pada kondisi tersebut, maka fase gerak yang bersifat toksik
tidak dapat digunakan (contoh: triklorobenzen), sehingga perlu dipilih fase gerak yang lain.
Fase gerak dalam SEC terbagi menjadi dua bagian besar, yaitu:

1.Fase gerak SEC untuk protein dan polimer larut air

SEC sering digunakan untuk mengisolasi protein, menghilangkan agregat,
desalting sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau untuk mengetahui sifat
polimer larut air yang digunakan dalam makanan, cat, sediaan farmasi, dan sebagainya.
Fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain:

a. Silika
Jenis kolom:SW,S WxI, dan SuperSW digunakan untuk menganalisis protein dan
asam nukleat menggunakan aqueous buffer sebagai fase gerak.
b. Polimetakrilat
Jenis kolom:PW dan PWxI digunakan untuk menganalisis polimer
industry, oligosakarida, asam nukleatm virus menggunakan fase gerak berupa larutan buffer
atau larutan garam. Kolom PWxI yang digunakan untuk menganalisis polimer kationik
menggunakan fase gerak berupa larutan garam encer.
Contoh pelarut mengandung air yang sering digunakan sebagai fase gerak dalam
SEC yaitu buffer fosfat (pH 7,0), larutan KCl dan larutan NaCl

2.Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut organik.
Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut organik SEC
sering digunakan untuk mengetahui sifat polimer organic polar dan polimer larut dalam
pelarut organik. Pemilihan pelarut organic didasarkan atas efek partisi dan adsorpsi pelarut.
Jenis fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain:
1. Polimetakrilat (high % X-linking)
Jenis kolom:Alpha danSuperAW menggunakan fase gerak berupa pelarut organic
polar seperti methanol, asetonitril, DMF, DMSO, THF, dan HFIP.
2. Polistirena
 Ada dua jenis kolom,yaitu kolom Ultra-low adsorption (contoh : SuperHZ , Super
MultiporeHZ, HxIdan Multipore) menggunakan pelarut yang terbatas, dan kolom
Low adsorption (contoh:SuperH danHhr) dapat menggunakan pelarut yang lebih
bervariasi.

c. Detektor

Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem detektor
yang berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau detektor UV-Vis. Intensitas
detektor direkam sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem dikaliberasi dengan
menggunakan polimer sampel yang diketahui berat molekulnya, dapat dilakukan dengan
evaluasi berat molekul dan distribusi berat molekul menggunakan detektor sinar menyebar
(light scatter detector), berat molekul polimer dapat ditentukan secara langsung dan tidak
perlu dikaliberasi terlebih dahulu.
Pemilihan pelarut pada kromatografi eksklusi bertujuan untuk meminimumkan
interaksi antara solut dengan permukaan penyangga karena interaksi apapun dengan
permukaan tidak diinginkan. Persyaratan pelarut pada kromatografi eksklusi adalah
memiliki kemurnian yang tinggi, tidak bereaksi dengan fase diam, dapat bercampur dengan
komponen sistem, pelarutnya baik untuk cuplikan, mampu ‘membasahi’ permukaan
kemasan dan viskositasnya rendah. Jika persyaratan di atas terpenuhi, maka solut dapat
berpermeasi ke pori dengan proses difusi sepenuhnya. Untuk gel lunak, pelarut harus
menggembungkan gel karena keporian (porositas) dipengaruhi oleh jumlah pelarut yang
mandek. Untuk gel dekstran yang sering dijumpai, pelarut yang paling umum adalah air
(Johnson, Stevenson, 1994).
Namun banyak dari pelarut yang berguna dalam kromatografi eksklusi tidak sesuai
dengan detektor UV berkepekaan tinggi yang biasa digunakan pada ragam kromatografi
cair lainnya. Toluena, tetrahidrofuran, dan pelarut aromatik-terhalogenasi banyak dipakai
karena semuanya mempunyai sifat melarutkan yang sangat baik untuk senyawa berbobot
molekul besar yang biasa dianalisis dengan eksklusi. Hanya tetrahidrofuran (THF) yang
dapat digunakan dengan pendeteksian UV pada 254 nm. Akan tetapi, beberapa tingkat
mutu THF distabilkan dengan butil hidroksitoluena (BHT) atau hidrokuinon untuk
mencegah pembentukan peroksida yang dapat meledak. Seyawa penstabil itu dapat
dihilangkan dengan penyulingan secara hati-hati. Destilat yang diperoleh harus disimpan
dalam ruang gelap dan wadahnya diisi gas nitrogen (Johnson, Stevenson, 1994).
Pelarut yang digunakan untuk kromatografi eksklusi, antara lain : Fase Gerak Suhu
Pemakaian Contoh Sistem Polimer Kloroform m-kresol Dekalin Dimetil formamida Suhu
kamar 30-135oC 135oC Suhu kamar – 85 oC Silikon, polimer N-vinilpirolidon, polimer
epoksida, poliester alifatik, selulosa Poliester, poliamida, poliuretan Poliolefin
Poliakrilonitril, beberapa polibenzimidasol, poliuretan selulosa Heksafluoroisopropaol
1,1,2,2-Tetrakloroetana Tetrahidrofuran Toluena 1,2,4-Triklorobenzena Trifluoroetanol Air
(dan dapar) Suhu kamar – 40oC Suhu kamar – 100oC Suhu kamar – 45oC Suhu kamar –
70oC
130-160oC Suhu kamar – 40 oC Suhu kamar – 65oC Poliester, poliamida Senyawa
polisulfida berbobot molekul kecil Cuplikan polimer umum (polivinil klorida, polistirena,
polieter aromatik poliasetat, epoksi, selulosa) Elastomer dan karet, polimer ester vinil
Poliolefin Poliamida Bahan biologi, biopolimer, polielektrolit, seperti polivinil alkohol
seperti polivinil alkohol, biopolimer Tabel di atas memuat pelarut yang lazim digunakan
pada kromatografi eksklusi. Harus diperhatikan bahwa analisisis sering dilakukan pada
suhu di atas suhu kamar. Suhu dinaikkan untuk menurunkan viskositas pelarut. Oleh karena
itu, terjadi peningkatan efisiensi difusi yang memberikan hasil kromatogram yang lebih
baik. Kelarutan sejumlah polimer bertambah besar dengan naiknya suhu pelarut. Pada tabel
ditunjukkan bahwa detektor indeks bias merupakan detektor yang paling lazim digunakan
pada kromatografi eksklusi ruang. Harus diperhatikan bahwa jika kita melakukan
kromatografi eksklusi molekul kecil (cara yang makin populer dengan cepat), maka
pembatasan karena pelarut biasanya berkurang, artinya jarang diperlukan suhu tinggi, dan
kelarutan cuplikan biasanya tidak menjadi masalah (Johnson, Stevenson, 1994)

Tahapan Pemisahan
Berikut ini tahapan-tahapan untuk melakukan pemisahan menggunakan kromatografi
size Eksklusi :

1. Pemilihan fase gerak Fase gerak yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut:

a. Harus mampu melarutkan sampel polimer pada fase diam

b. Memiliki viskositas yang cukup rendah untuk sistem kromatgrafi size eksklusi
sehingga dapat dijalankan dengan range tekanan yang normal.

c. Harus efektif untuk mencegah molekul polimer dari interaksi yang kuat dengan
fase diam (contoh: lewat adsorpsi). Fase gerak yang digunakan dapat berupa fase
gerak larutan, fase gerak organik atau dalam larutan buffer.

2. Pemilihan fase diam Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solute dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi
lewat fase diam.. Fase diam optimum yang digunakan memiliki kriteria sebagai berikut:

a. Packing material tidak berinteraksi dengan sampel

b. Fase diam harus terbasahi semua dengan fase gerak, tetapi tidak mengalami efek
pembengkakan.

c. Fase diam harus stabil pada temperatur yang diatur

d. Harus memiliki volume pori yang cukup dan berbagai ukuran pori sehingga dapat
melakukan distribusi berat molekul sampel yang memadai. Fase diam yang
digunakan biasanya terdiri dari dekstrosa, agarosa, poliakrilamid atau silika yang
 memiliki sifat fisik yang berbeda. Jenis ukuran pori yang ada pada fase diam ini
berkisar 60-4000 Å dengan ukuran partikel berkisar 5-10 µm dengan efisiensi
ribuan theoritical plate setiap 15 cm kolom. Untuk fase gerak organik, kolom yang
biasa digunakan yaitu crosslinked (dengan difinilbenzen) gel polistiren atau
trimetilsilane turunan silika. Untuk fase gerak larutan yang digunakan yaitu
crosslinked hidroksilat polimetakrilat atau gel poli(propilen oksida) atau gliseril
(diol) turunan silika.

3. Penyiapan sampel Sampel harus bebas dari patikel, terutama untuk partikel yang
berukuran 34 mikrometer atau kurang; kemudian dilakukan ekstraksi clean up, sentrifugasi
dan filtrasi. Campuran ekstrak sampel kemudian difiltrasi, dimana campuran sampel terbut
melewati membran filter yang memisahkan sampel padat dari solut. Kemudian pelarut
mencuci sampel dari filter ke bejana pengumpul. Dua atau tiga kali dicuci dapat mencegah
pengurangan sampel. Kemudian sampel disentrifugasi dan ekstras didecanter dan
dipisahkan. Residual sampel dicuci 2 sampai 3 kali. Buffer sampel tidak sama dengan
buffer kolom. Buffer sampel yang dipilih adalah buffer yang membantu stabilitas dan
aktivitas protein. Buffer harus mempertahankan kapasitasnya dan pH yang konstan. Buffer
yang dapat digunakan yaitu 0.05 M Natrium fosfat, 0.15 M NaCl pH 7 atau buffer sampel
dimana proteinnya dapat larut dan stabil. Hal-hal yang perlu diperhatikan pada waktu
preparasi sampel:

a. Sampel harus larut semuanya. Lakukan sentrifugasi atau filtrasi untuk

memisahkan partikel yang tidak larut.

b. Temperatur kolom dan buffer harus sama untuk menghindari masuknya udara ke
dalam kolom

c. Jika menggunakan sampel yang baru gunakan 0.55 mM Natrium Fosfat, 0.5 mM
NaCl, pH 7

d. Jika menggunakan konsentrasi yang tinggi, turunkan kecepatan sentrifugasi dan

perpanjang waktu.

4. Pemisahan Zat Sampel diperlihatkan setelah injeksi pada kepala kolom, fase gerak
melewati kolom dengan laju aliran yang tetap, dengan tekanan gradient pada seluruh
panjang kolom. Sampel sudah masuk ke dalam kolom, partikel dari fase diam merupakan
pori-pori dengan ukuran pori yang dikontrol. Molekul yang lebih kecil mampu untuk
menembus pori- pori ketika melewati kolom, tetapi yang molekul lebih besar terlalu besar
untuk masuk kedalam pori-pori fase diam dan hanya berada di daerah interstitial. Molekul
yang lebih kecil tertahan sebentar pada pori yang dimasuki, hingga molekul yang lain
masuk ke dalam pori. Molekul yang lebih besar mengalir lebih cepat karena mereka tidak
masuk ke dalam pori- pori fase diam. Akhirnya dua molekul tersebut dipisahkan dan
menjadi 2 peak kromatogram yang berbeda
Keuntungan Dan Kerugian

Keuntungan dari metode ini termasuk pemisahan yang baik untuk molekul besar
dari molekul kecil dengan volume eluat minimal, dan berbagai larutan bisa digunakan tanpa
mengganggu proses filtrasi, menjaga aktivitas biologis dari partikel-partikel yang akan
dipisahkan. Teknik ini biasanya dikombinasikan dengan teknik pemisahan lain yang lebih
lanjut dengan karakteristik lainnya, seperti keasaman, kebasaan, biaya, dan ketertarikan
untuk senyawa tertentu. Dengan kromatografi ekslusi, waktunya pendek dengan pemisahan
yang jelas dan band sempit, yang menyebabkan sensitivitas yang baik. Juga tidak ada
kerugian sampel karena zat terlarut tidak berinteraksi dengan fase diam. Biayanya lebih
murah karena tidak diperlukan regenerasi. Biaya operasi ditentukan oleh sirkulasi air dan
komponen sampel yang melalui sistem. Metode ini dapat digunakan untuk berbagai macam
materi. Prosesnya sederhana dan dapat digunakan pula untuk operasi kontinyu dan otomatik
(Johnson, Stevenson, 1994).

Kerugiannya, hanya dalam jumlah terbatas pita bisa ditampung karena skala waktu
kromatogram pendek, dan, secara umum, perbedaan massa molekul harus 10% agar
memiliki resolusi yang baik. Komposisi sampel terbatas utuk spesies kation dan anion
tunggal. Eksklusi umumnya tidak dilakukan untuk mengeluarkan komponen utama pada
pemisahan komponen ionik dari larutan nonelektrolit. Volume larutan sampel dibatasi oleh
volume larutan yang diabsorbsi resin dan pada praktek kurang dari 1 volume yang
tereksklusi (Johnson, Stevenson, 1994).

KESIMPULAN
1. Dari penjelasan di atas dapat disimpulkan bahwa :
Kromatografi eksklusi adalah Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau
perbedaann ukuran dan geometri molekul.
2. Teknik permeasi gel merupakan suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat
sesuai dengan ukuran molekulnya.
3. Eksklus dan reterdasi ion adalah suatu proses untuk memisahkan materi ionic dari
materi nonionic didasari pada perbedaan distribusi pada ke dua tipe zat pelarut ini di
antara vase resin penukar ion dan larutan air.
4. Inorganic molecular sieves merupakan Suatu saringan molekul untuk pemisahan
gas-gas dan molekul organic berukuran organic berukuran kecil.
5. Kelebihan SEC :
a. Waktu pemisahan yang cepat dan hasil yang baik.
b. Frekuensi tajam dan sensitivitas baik.
 c. Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak berinteraksi dengan fase
stasioner.
d. Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa menganggu proses filtrasi

Kekurangan SEC :
a. Hanya sejumlah frekuensi terbatas dapat diakomodasi karena skala
waktu kromatogram pendek.
b. Tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran seragam, seperti isomer.
6. Komponen yang digunakan pada sistem kromatografi eksklusi, yaitu:
a. Kolom, pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul
linarut yang akan dipisahkan
b. Fase Gerak,fase gerak dalam SEC harus merupakan pelarut polimer yang
baik untuk menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada
suhu yang sesuai dan bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan.
Hal tersebut bertujuan agar pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak
atau dengan kata lain memecahkan agregat
Fase gerak dalam SEC terbagi menjadi dua bagian besar, yaitu:
1. Fase gerak SEC untuk protein dan polimer larut air
SEC sering digunakan untuk mengisolasi protein, menghilangkan
agregat, desalting sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau
untuk mengetahui sifat polimer larut air yang digunakan dalam makanan,
cat, sediaan farmasi, dan sebagainya
2. Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut
organik.
Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut
organik SEC sering digunakan untuk mengetahui sifat polimer organic polar
dan polimer larut dalam pelarut organik. Pemilihan pelarut organic
didasarkan atas efek partisi dan adsorpsi pelarut
3. Detektor
Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan
sistem detektor yang berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau
detektor UV-Vis. Intensitas detektor direkam sebagai fungsi volume pelarut.
DAFTAR PUSTAKA

Fadhli,Haiyul.Januari 2012.” Size exclusion chromatography (SEC).(online),

( http://www.haiyul-fadhli, diakses pada 29 Juni 2017)

Muthfi,Muhammad.Desember 2009.”Kromatografi Eksklusif”(online),

( https://banemo.wordpress.com,diakses pada 29 Juni 2017)