FRET (Fluorescence Resonant Energy Transfer)

Rodearni Ananda Putri Purba

Fisika, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Semarang
rodearnisidahuruk@gmail.com

Abstract
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) is a process of interaction between two
fluorochromes from donor to acceptor at a certain distance. Fluorescence Resonance Energy
Transfer (FRET) is a process of interaction between the two fluorochromes which is
accompanied by a direct transfer of energy from the donor to the acceptor at a certain distance.
In addition to having a certain distance, FRET events can also occur if the emission wavelength
produced by the acceptor is always larger and the energy is always lower than that of the donor.
FRET microscopy relies on the ability to capture fluorescent signals from labeled molecular
interactions in living or single fixed cells. If FRET occurs, the donor channel signal will be
extinguished and the acceptor channel signal will be sensitized or increased.

Keywords: FRET (Fluorescence Resonant Energy Transfer), acceptors, fluorophore

Abstrak
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) merupakan suatu proses interaksi antara
kedua fluorochromes dari donor ke akseptor pada jarak tertentu. Fluorescence
Resonance Energy Transfer (FRET) adalah suatu proses interaksi antara kedua
fluorochrome yang disertai dengan transfer energi langsung dari donor ke akseptor pada
jarak tertentu. Selain mempunyai jarak tertentu peristiwa FRET juga dapat terjadi
apabilapanjang gelombang emisi yang dihasilkan oleh akseptor selalu lebih besar dan
energinya selalu lebih kecil dari pada donor. Mikroskop FRET bergantung pada kemampuan
untuk menangkap sinyal fluoresen dari interaksi molekul berlabel dalam sel hidup atau tetap
tunggal. Jika FRET terjadi, sinyal saluran donor akan dipadamkan dan sinyal saluran akseptor
akan peka atau meningkat.

Kata kunci: FRET (Transfer Energi Resonansi Fluoresensi), akseptor, fluorofor

I. PENDAHULUAN
Transfer energi resonansi fluoresensi (FRET) telah dikembangkan untuk lebih memahami
regulasi spatiotemporal dari berbagai proses seluler. FRET melibatkan transfer energi tanpa
radiasi dari donor yang awalnya tereksitasi ke akseptor. FRET dapat digunakan untuk memantau
interaksi protein-protein dan perubahan konformasi protein dalam sampel biologis hidup. Dalam
FRET, satu reporter adalah fluorofor donor, reporter lainnya adalah akseptor fluorofor dengan
panjang gelombang yang lebih panjang, dan pembacaannya adalah transfer energi dari donor ke
akseptor. Skala kerja FRET adalah 100 . FRET telah mengizinkan jarak antar dan intramolekul
dalam protein untuk diselidiki. Ini, pada gilirannya, memungkinkan pemetaan interaksi protein-
protein di dalam sel (Hoffman., 2013).

Analisis struktural berbasis FRET sangat cocok untuk kompleks protein terkait membran
besar yang sulit dipecahkan melalui kristalografi sinar-X. Dengan menggunakan metode yang
dijelaskan dalam bab ini, pelabelan protein membran spesifik lokasi dengan probe fluoresen
yang cocok untuk analisis FRET dapat segera dicapai. Analisis berbasis FRET juga dapat
digunakan untuk mengukur perubahan dinamis dalam konformasi protein serta untuk menguji
hipotesis struktural yang muncul dari rekonstruksi cryo-EM dan struktur atom dari eksperimen
kristalografi sinar-X. Selain itu, pengukuran berbasis FRET dinamis antara DHPR dan RyR1
mungkin dapat menyelesaikan perubahan konformasi pada kedua protein yang terjadi selama
kopling eksitasi-kontraksi di otot rangka (Mahalingam dan James., 2015).

Menurut Waxham (2007), FRET juga dapat dideteksi dengan ekstraksi gambar dimana setiap
piksel mencerminkan spektrum komposit dari semua fluorofor yang ada dalam spesimen dan, di
antaranya, pasangan FRET donor dan akseptor juga. Berbagai spektrum diekstraksi dengan
algoritma linear unmixing dan digunakan untuk perhitungan jumlah transfer energi (efisiensi
FRET) Keuntungan dari metode ini adalah sebagai berikut:

1. fluorofor dengan spektrum emisi yang sangat tumpang tindih yang mengarah ke efisiensi
FRET yang lebih tinggi dapat digunakan
2. seluruh spektrum emisi dapat dikumpulkan berbeda dengan metode FRET berbasis filter,
yang terbatas pada area panjang gelombang yang ditentukan,)
3. fluoresensi latar belakang spesimen dapat dideteksi.

Kerugian intrinsik adalah sebagai berikut:

1. detektor spektral menunjukkan efisiensi kuantum yang relatif rendah

2. mereka memiliki waktu integrasi yang relatif lama,
3. ada kebutuhan untuk akuisisi spektrum referensi di bawah kondisi eksperimental yang
sama dengan FRET. Sampel. Untuk kuantifikasi FRET yang andal, sinyal donor dan
akseptor harus ada dalam magnitudo yang sama (stoikiometri 1 banding 1).

Metodologi ini telah digunakan untuk aplikasi pencitraan seluruh tubuh in vivo karena
ketersediaan perangkat yang mampu menganalisis spektral sinyal fluoresen. Transfer energi
resonansi fluoresensi (FRET) adalah alat yang digunakan untuk menentukan jarak antara dua
fluorofor. FRET adalah transfer energi nonradiatif dari molekul donor ke akseptor dan
berbanding terbalik dengan pangkat enam jarak, seperti yang ditunjukkan pada plot di panel
tengah. Dengan demikian, interaksi protein-protein di dalam sel dapat dinilai dengan memeriksa
apakah FRET terjadi antara dua protein yang ditandai dengan molekul fluoresen yang berbeda.
Dalam contoh, satu protein ditandai dengan cyan fluorescent protein (CFP) dan yang lainnya
dengan yellow fluorescent protein (YFP). Ketika jaraknya kecil, molekul CFP tereksitasi dan
transfer energi dapat terjadi ke molekul YFP dengan emisi berikutnya terdeteksi di saluran YFP.
Spektrum emisi yang dihasilkan dari interaksi tersebut ditunjukkan di panel bawah. Saat
dieksitasi dengan cahaya 430 nm, dalam kondisi FRET rendah, maksimum dilaporkan pada
puncak profil emisi CFP. Di bawah kondisi FRET tinggi, puncak emisi 490 nm CFP menurun
(ini pendinginan karena hilangnya energi ke molekul YFP) sedangkan puncak emisi 530 nm YFP
meningkat. Secara total, FRET menyediakan metodologi untuk menguji dinamika interaksi
protein-protein secara real-time dalam sel hidup

Transfer energi resonansi fluoresensi (FRET) adalah fenomena di mana energi ditransfer dari
fluorofor tereksitasi, donor, ke molekul penyerap cahaya, akseptor. Seperti MB, ia menggunakan
fluorofor dan quencher; namun, dirancang untuk menggunakan dua primer yang mengikat
targetnya sehingga jarak antara pewarna donor pada satu primer berdekatan dengan pewarna
akseptor pada primer lainnya (dalam 10 nm) untuk menyebabkan reaksi fluoresen yang dapat
terjadi. terdeteksi (Gambar 1). Sensitivitas ekstrim dari efisiensi transfer energi dari donor ke
akseptor telah terbukti menjadi sarana yang berharga untuk mempelajari interaksi protein-protein
serta proteolisis replikasi virus dalam sel hidup [91] dan memiliki potensi untuk digunakan untuk
mendeteksi bakteri patogen (Gilbride., 2021).

Gambar. 1 Ilustrasi sistem FRET

 Ilustrasi sistem FRET. Suar molekuler adalah molekul berbentuk jepit rambut dengan
fluorofor yang dipadamkan secara internal. Mereka dirancang sedemikian rupa sehingga bagian
loop molekul adalah urutan probe yang melengkapi molekul asam nukleat target. Bagian
fluoresen melekat pada ujung satu lengan dan bagian pendinginan melekat pada ujung lengan
lainnya. Batang menjaga kedua bagian ini berdekatan satu sama lain, menyebabkan fluoresensi
fluorofor dipadamkan oleh transfer energi. Ketika probe bertemu dengan molekul target, ia dapat
membentuk hibrida yang lebih panjang dan lebih stabil daripada batang. Hal ini menyebabkan
suar molekuler mengalami perubahan konformasi spontan yang memaksa batang terpisah, dan
menyebabkan fluorofor dan quencher bergerak menjauh satu sama lain yang mengarah ke
fluoresensi. Sistem FRET telah digunakan untuk mendeteksi patogen atau namun, tidak ada
penelitian yang hanya menggunakan sistem FRET untuk mendeteksi patogen yang terbawa air
dari sumber air.

II. RUMUSAN MASALAH

1. Apa yang dimaksud dengan identifikasi FRET?
2. Apa persyaratan untuk FRET?
3. Bagaimana pinsip kerja dari FRET?

III. PEMBAHASAN
3.1 Identifikasi FRET
Identifikasi FRET merupakan Transfer non radiatif (elektromagnetik) dari kromofor
tereksitasi (donor) ke molekul reseptor (akseptor) melalui kopling dipol-dipol. Kemudian
akan mengalami deeksitasi, yaitu kembali kekeadaan dasar. Proses transfer forster dinamis
sangat bergantung pada jarak, kecepatan konstanta ∞=1/R^6 metode untuk melihat
interaksi molekul protein-protein dan interaksi reseptor-ligan.
Senyawa fluoresen atau fluorofor dapat diidentifikasi dan diukur pada berdasarkan
sifat eksitasi dan emisinya. Spektrum eksitasi adalah ditentukan dengan mengukur
intensitas emisi pada panjang gelombang tetap, sambil memvariasikan panjang gelombang
eksitasi. Spektrum emisi ditentukan dengan mengukurvariasi panjang gelombang
intensitas emisi untuk panjang gelombang eksitasi tetap. Sifat eksitasi dan emisi suatu
senyawa adalah tetap, untuk instrumen tertentu dan kondisi lingkungan, dan dapat
digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi.
III.2 Persyaratan FRET
1. Sangat bergantung pada jarak 2-10 nm.
2. Spektrum yang tumpang tindih
3. Memiliki emisi yang tepat

III.3 Prinsip kerja dari FRET

 Semua senyawa kimia menyerap energi yang menyebabkan eksitasi electron dalam
molekul, menghasilkan transisi antara keadaan energi elektronik diskrit. Agar transisi
terjadi, energi yang diserap harus setara dengan perbedaannya antara keadaan elektronik
awal dan keadaan energi tinggi. Nilai ini konstan dan merupakan karakteristik dari
struktur molekul. Ini disebut sebagai eksitasi panjang gelombang. Jika kondisi
memungkinkan, molekul tereksitasi akan kembali ke keadaan dasar dengan emisi energi
melalui panas dan/atau emisi kuanta energi seperti: foton. Energi emisi atau panjang
gelombang dari kuanta ini juga setara dengan perbedaan antara dua keadaan energi diskrit
dan merupakan karakteristik dari struktur molekul.
Fluoresensi terjadi ketika molekul menyerap foton dari sinar UV-tampak spektrum
cahaya (200-900 nm), menyebabkan transisi ke keadaan elektronik energi tinggi dan
kemudian memancarkan foton saat kembali ke keadaan awalnya, dalam waktu kurang dari
10-9 detik. Beberapa energi, di dalam molekul, hilang melalui panas atau getaran sehingga
energi yang dipancarkan lebih sedikit daripada energi tereksitasi; yaitu, panjang
gelombang emisi selalu lebih panjang dari panjang gelombang eksitasi. Perbedaan antara
eksitasi dan emisi panjang gelombang disebut pergeseran Stokes.
Keuntungan utama fluoresensi dibandingkan radioaktivitas dan penyerapan
spektroskopi adalah kemampuan untuk memisahkan senyawa berdasarkan spektrum
eksitasi atau emisi, sebagai lawan dari spektrum tunggal. Keuntungan ini adalah lebih
ditingkatkan dengan pewarna fluoresen komersial yang sempit dan jelas spektrum eksitasi
dan emisi yang terpisah. Meskipun emisi maksimum hanya terjadi untuk eksitasi dan
emisi tertentu pasangan panjang gelombang, besarnya intensitas fluoresen tergantung pada
keduanya sifat intrinsik senyawa dan pada eksperimen yang mudah dikontrol parameter,
termasuk intensitas cahaya yang diserap dan konsentrasi fluorofor dalam larutan.
Intensitas cahaya yang dipancarkan, F, dijelaskan oleh hubungan

di mana adalah φ efisiensi kuantum, I0 adalah daya radiasi yang datang, adalah molar
absorptivitas, b adalah panjang lintasan sel, dan c adalah konsentrasi molar pewarna
fluoresen
Efisiensi kuantum adalah persentase molekul dalam keadaan tereksitasi keadaan
elektronik yang meluruh ke keadaan dasar oleh emisi fluoresen; yaitu, cepat emisi foton
cahaya dalam kisaran 200-900 nm. Nilai ini selalu kurang dari atau sama dengan satu dan
merupakan karakteristik dari struktur molekul. Efisiensi tinggi adalah diinginkan untuk
menghasilkan intensitas emisi yang relatif lebih tinggi. Semua non-fluorescent senyawa
memiliki efisiensi kuantum nol.
Intensitas cahaya eksitasi, yang menimpa sampel, tergantung pada jenis sumber,
panjang gelombang dan faktor instrumen lainnya. Sumber cahaya, biasanya merkuri atau
xenon, memiliki spektrum karakteristik untuk intensitas emisirelatif terhadap panjang
 gelombang. Pada konsentrasi pewarna tinggi atau panjang jalur pendek, intensitas
fluoresensi relatif terhadap konsentrasi pewarna menurun sebagai akibat dari
"pendinginan". Sebagai konsentrasi molekul dalam larutan meningkat, kemungkinan
tereksitasi molekul akan berinteraksi satu sama lain dan kehilangan energi melalui proses
selain emisi fluoresen meningkat. Setiap proses yang mengurangi kemungkinan emisi
fluorescent dikenal sebagai pendinginan. Parameter lain yang dapat menyebabkan
pendinginan termasuk adanya pengotor, peningkatan suhu, atau pengurangan viskositas
media larutan.

IV. KESIMPULAN

Transfer energi resonansi fluoresensi (FRET) adalah fenomena di mana energi ditransfer dari
fluorofor tereksitasi, donor, ke molekul penyerap cahaya, akseptor. FRET adalah transfer energi
nonradiatif dari molekul donor ke akseptor dan berbanding terbalik dengan pangkat enam jarak,
seperti yang ditunjukkan pada plot di panel tengah. FRET juga dapat dideteksi dengan ekstraksi
gambar dimana setiap piksel mencerminkan spektrum komposit dari semua fluorofor yang ada
dalam spesimen dan, di antaranya, pasangan FRET donor dan akseptor juga.

DAFTAR PUSTAKA

Gilbride. K. 2021. Waterborne Pathogens Second Edition. Belanda; Elsevier B.V

Hilger. I. 2014. Comprehensive Biomedical Physics. Belanda; Elsevier B.V.

Hoffman R.M. 2013. Brenner's Encyclopedia of Genetics Second Edition. Belanda; Elsevier Inc..

Mahalingam. M dan James D. F, 2015. Methods in Enzymology. Belanda; Elsevier Inc.

Waxham. M. N. 2007. Protein Trafficking in Neurons. Belanda; All rights reserved.