PRAKTIKUM PEWARNAAN GRAM

Disusun Oleh :

1. Anggun Anggita Candra (190208027)

2. Dewi Ayundanigrum (190208031)
3. Misyaeil Nur Azizah (190208035)
4. Yudi Miftakul Bahrudin (190208044)

PROGRAM STUDI S1 KEPERAWATAN

FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS DUTA BANGSA SURAKARTA
2019/2020

1
 I. TUJUAN
a. Mahasiswa mampu membuat sediaan untuk pewarnaan
b. Melakukan proses pewarnaan sederhana
c. Mengamati bentuk bakteri pada preparat dibawadibawah mikroskop

II. TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi

ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan
infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang
digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang
memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial
lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-
kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan

terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri bersifat tembus
cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo,
2004).

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri,
memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi
jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui
(Hadiutomo. 1990).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae (Anonim, 2008).

2
 Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu
gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan
klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding
sel bakteri (Aditya,2010).

Metode-metode dalam pewarnaan gram :

Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, Kristal violet.
Larutan iodine kemudian ditambahkan, semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel
kemudian diberi alcohol. Sel gram positif akan tetap mengikat senyawa Kristal violet-iodine,
tetap berwarna biru, sel warna negatifwarna hilang oleh alcohol. Sebgai langkah terakhir,
countersain (Mis.safranin pewarna merah) ditambahkan, sehinnga sel gram negative yang
tidak berwarna, akan mengambil warna kontras, sedangkan sel gram positif terlihat dalam
warna biru. Dasar perbedaan reaksi gram adalah struktur dinding sel.

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang
berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, ada kemungkinan penyimpangan hasil
pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding yang rusak tidak lagi
dapat mempertahankan kompleks warna Kristal violet-iodine sehingga terlihat sebagai
bakteri gram negative (Lay,1994).

3
III. METOLOGI PRAKTIKUM
A. Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah

a. Baskom pewarna
b. Botol semprot

c. Bunsen
d. Cawan petri
e. Jarum ose
f. Kaca objek

g. Kawat penyangga
h. Korek api
i. Mikroskop

j. Penjepit tabung

k. Pipet tetes
l. Slide dryer

B. Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah

b. Aquades
b. Alkohol

c. Biakan bakteri
d. Crystal Violet
e. Lugol
f. Minyak emersi

g. Safranin
h. Spiritus

4
C. Prosedur Kerja

1.Mengambil kaca objek, lalu dipanaskan dengan cara melewatkan

kaca objek di atas nyala api spiritus, dan didiamkan beberapa saat.
2.Menteteskan aquades sebanyak 1 tetes diatas kaca objek, lalu
diletakkan di kawat penyangga
3.Membakar jarum ose hingga berwarna seperti bara api, lalu
didinginkan
4.mengambil biakan bakteri pada cawan petri menggunkan jarum ose
dengan posisi cawan petri dibelakang bunsen
5.Melakukan fiksasi dengan panas, caranya dengan melewatkan
sediaan di atas api spiritus.
6.Meletakan sediaan bakteri diatas kawat penyangga yang berada
diatas baskom pewarna, lalu ditambahkan crystal violet pada sediaan
dan didiamkan selama 30 detik.

7.Membilas sediaan dengan menggunakan aquades

8.Menambahkan larutan lugol pada sediaan, lalu didiamkan selama

30detik
9.Membilas kembali sediaan dengan aquades

10.Menambahkan larutan alkohol pada sediaan, lalu didiamkan

selama 5 detik

11.Membilas sediaan dengan menggunakan aquades

12.Menambahkan larutan safranin pada sediaan, lalu didiamkan

selama 30 detik
13.Membilas sediaan dengan menggunakan aquades

14.Mengeringkan sediaan pada slide dryer

15.Mengambil sediaan yang telah kering dan ditambahkan minyak

emersi, lalu diamati di bawah lensa mikroskop dengan pembesaran

5
 1000x

IV. HASIL PENGAMATAN

Tabel data hasil pengamatan pewarnaan bakteri secara gram hasil positif
Bentuk bakteri Keterangan
Warna bakteri
Merah Sreptobasil Gram negatif

Tabel data hasil pengamatan pewarnaan bakteri secara gram hasil negatif
No. Teknik Pewarnaan Pengamatan
1. Pewarnaan Sederhana Keterangan :
Perbesaran 400
Bewarna Ungu
Berbentuk basil
2. Pewarnaan Negatif Keterangan :
Perbesaran 400
Bewarna Kuning
Berbentuk coccus
3. Pewarnaan Gram Keterangan :
Perbesaran 400
Bewarna Merah
Berbentuk basil
Gram negatif
4. Pewarnaan Spora Keterangan :
Perbesaran 400
Bewarna Merah
Berbentuk coccus

6
V. PEMBAHASAN

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan

bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna
crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram
negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu
diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna
ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang
digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine
(Lay.1994).

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ;
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan
larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).

Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan
iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan
untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam
laboratorium, pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro.1998).

Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin
digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel
darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan
untuk deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur
kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi
pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya.
Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga
digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)

Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak
realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan
untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur
selnya (Lay,1994).

Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini
digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet
memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai
antiseptik topikal (Sutedjo,1991).

Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin
digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel
darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan

7
 untuk deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur
kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi
pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya.
Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga
digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991).

Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram positif dengan warna ungu dan
memiliki bentuk Monobacillus pada perbesaran mikroskop 10 hingga 100.

VI. KESIMPULAN

Dari praktikum di atas dapat diketahui kesimpulannya sebagai berikut :

a. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
b. Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif
berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan
terjadi pada dinding selnya
c. Macam-macam pewarnaan anatara lain :pewarnaan sederhana,pewarnaan
differensial,pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul
d. Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol
fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s iodida, dan safranin.

VII. DAFTAR PUSTAKA

1. Dwidjoseputro, D.. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Imagraph;

2005.

2. Waluyo, lud. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press; 2004.

3. Hadiutomo. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga; 1990.
4. Lay, Bibiana.W. Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta :
Rajawali; 1994.

5. Sutedjo, Mul Mulyani. Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta;

1991.

6. Dwidjoseputro, D. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan;

1998.

8
7. Juliantina, Farida. Manfaat Sirih Merah (Piper Crocatum) Sebagai
Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram
Negatif. JKKI –Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia. 2012.

8. Pelczar, Michael J dan Chan, E.C.S. Dasar-Dasar Mikrobiologi.

Jakarta: Universitas Indonesia Press; 2005.

9. Hadioetomo, R.S. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta:

Gramedia; 1993.

10. Darkuni, M. Noviar. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi, dan

Mikologi). Malang: Universitas Negeri Malang; 2001.