Laporan Praktikum Mikdas

LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI DASAR
Oleh:
Kelompok 7
Nasywa Putri Amelia 215080301111007

Sabdania Sabita 215080301111009
Sabrina Ainun Nadifa 215080301111010
Putri Nur Fauziyyah 215080301111011
Muhammad Shohibul Firdaus 215080301111012
Wahidah Argarita Wardhani 215080301111013
Imeilia Luthfi Azizah 215080301111014
Dia Wulansari 215080301111015
Feliks Oktoparma Sitompul 215080301111016
Aisya Dwi Nur Cahyani 215080301111018
Abized Asharie Abjar 215080307111041
Fathimah Kusumawardani Wahyu Setyoningrum 215080307111043
Noer Elisa 215080307111045
Jovin Najwan 215080307111046
Cisha Mahadewi Puspitaningtyas 215080307111047
Anita Nurrohmah 215080307111049
Andika Abdillah Maulana 215080307111050
Reyvalda Dewi Aditya Putri Prasetyo 215080307111052
Safir Kiram Firdaus 215080307111054
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
2021
LEMBAR PENGESAHAN
Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar disusun sebagai tugas akhir dalam
menyelesaikan Praktikum Mikrobiologi Dasar dan salah satu syarat lulus mata
kuliah Mikrobiologi Dasar.
Menyetujui,
Koordinator Asisten Asisten Laporan 1
(Siska Wahyuningtyas) (Riska Sulistiani Putri)
NIM. 185080301111003 NIM. 185080300111035
Asisten Laporan 2 Asisten Laporan 3
(Rafifa Bunga Jashinta) (M. Fadhilah Fadhlurrohman)
NIM. 185080301111009 NIM. 185080301111024
i
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT, atas rahmat-Nya kami
dapat menyelesaikan penyusunan Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar ini.
Adapun penyusunan Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar ini yaitu untuk
memenuhi tugas akhir Praktikum Mikrobiologi Dasar sebagai syarat lulus dari
mata kuliah Mikrobiologi Dasar.
Tidak lupa, penyusun menyampaikan ucapan terima kasih kepada
seluruh asisten praktikum, rekan-rekan, serta seluruh pihak yang telah
membantu kami dalam penyusunan Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar ini.
Penyusunan laporan praktikum ini tidak akan selesai penyusunannya tanpa
bantuan dari pihak-pihak terkait.
Kami menyadari penyusunan laporan praktikum ini masih belum
sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran serta masukan yang mendukung
sangat kami harapkan dari pembaca.
Akhir kata, semoga laporan praktikum ini bermanfaat dan berguna untuk
pihak-pihak yang membutuhkan.
Malang, 5 Desember 2021
Penyusun
ii
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PENGESAHAN .................................................................................... i
KATA PENGANTAR ........................................................................................... ii
DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ ix
DAFTAR TABEL ................................................................................................ xi
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xii
MATERI 1 ............................................................................................................ 1
Pengenalan Alat, Sterilisasi, dan Teknik Dasar Mikrobiologi ......................... 1
1. PENDAHULUAN ............................................................................................. 2
1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 2
1.2 Maksud dan Tujuan ............................................................................... 3
1.3 Waktu dan Tempat ................................................................................ 4
2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................... 5
2.1 Sterilisasi ............................................................................................... 5
2.2 Teknik Dasar Mikrobiologi...................................................................... 6
3. PEMBAHASAN ............................................................................................... 8
3.1 Pengenalan Alat .................................................................................... 8
3.2 Sterilisasi Autoklaf Elektrik ................................................................... 15
3.2.1 Bagian-bagian Autoklaf................................................................. 15
3.2.2 Cara Pengoperasian Autoklaf ....................................................... 16
3.3 Teknik Dasar Mikrobiologi.................................................................... 17
3.3.1 Pengenceran ................................................................................ 17
3.2.2 Penanaman .................................................................................. 18
3.2.3 Inokulasi ....................................................................................... 19
4. PENUTUP ..................................................................................................... 22
4.1 Kesimpulan .......................................................................................... 22
4.2 Saran ................................................................................................... 22
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 24
iii
LAMPIRAN........................................................................................................ 25
MATERI 2 .......................................................................................................... 26
Inokulasi Mikroba ............................................................................................ 26
1. PENDAHULUAN ........................................................................................... 27
1.1 Latar Belakang .................................................................................... 27
1.2 Maksud dan Tujuan ............................................................................. 28
1.3 Waktu dan Tempat .............................................................................. 28
2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................. 29
2.1 Media Tanam Mikroba ......................................................................... 29
2.1.1 NA (Nutrient Agar) ........................................................................ 29
2.1.2 PCA (Plate Count Agar)................................................................ 29
2.1.3 PDA (Potato Dextrose Agar) ......................................................... 30
2.1.4 LB (Lactose Broth)........................................................................ 30
2.1.5 NB (Nutrient Broth) ....................................................................... 31
2.1.6 MHA (Mueller Hinton Agar) ........................................................... 31
2.2 Sampel Uji ........................................................................................... 31
2.2.1 Ikan Asin....................................................................................... 31
2.2.2 Air Limbah Ikan............................................................................. 32
2.2.3 Terasi ........................................................................................... 32
2.3 Metode Inokulasi ................................................................................. 33
2.3.1 Metode Agar Miring ...................................................................... 33
2.3.2 Metode Gores ............................................................................... 33
2.3.3 Metode Tebar ............................................................................... 33
2.3.4 Metode Tuang .............................................................................. 34
2.3.5 Metode Tusuk ............................................................................... 34
3. PEMBAHASAN ............................................................................................. 35
3.1 Pembuatan Media ............................................................................... 35
3.1.1 NA (Nutrient Agar) ........................................................................ 35
3.1.2 PCA (Plate Count Agar) ..................................................................... 36
3.1.3 PDA (Potato Dextrose Agar) .............................................................. 38
3.2 Pengenceran Sampel .......................................................................... 39
iv
3.2.1 Ikan Asin ............................................................................................ 40
3.2.2 Air Limbah Ikan .................................................................................. 41
3.2.3 Terasi................................................................................................. 43
3.3 Metode Inokulasi ...................................................................................... 44
3.3.1 Metode Agar Miring............................................................................ 44
3.3.2 Metode Gores .................................................................................... 46
3.3.3 Metode Tebar .................................................................................... 48
3.3.4 Metode Tuang.................................................................................... 49
3.3.5 Metode Tusuk .................................................................................... 51
4. PENUTUP ..................................................................................................... 53
4.1 Kesimpulan .......................................................................................... 53
4.2 Saran ................................................................................................... 53
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 54
LAMPIRAN........................................................................................................ 56
MATERI 3 .......................................................................................................... 57
Perhitungan Mikroba ....................................................................................... 57
1. PENDAHULUAN ........................................................................................... 57
1.1 Latar Belakang .................................................................................... 58
1.2 Maksud dan Tujuan .................................................................................. 59
1.3 Waktu Dan Tempat .................................................................................. 60
2.1 Metode Perhitungan Mikroba ............................................................... 61
2.1.1 Metode TPC (Total Plate Count) ................................................... 61
2.1.2 Metode MPN (Most Probable Number) ......................................... 62
2.1.3 Metode Mc Farland ....................................................................... 63
2.1.4 Metode Hemocytometer................................................................ 64
3. METODELOGI............................................................................................... 66
3.1 Pembuatan Media Tanam ........................................................................ 66
3.1.1 LB (Lactose Broth) ............................................................................. 66
3.1.2 NB (Nutrient Broth) ....................................................................... 68
3.2 Skema Kerja Metode ........................................................................... 70
v
3.2.1 Metode TPC (Total Plate Count) ................................................... 70
3.2.2 Metode MPN (Most Probable Number) .............................................. 72
3.2.3 Metode Mc Farland ............................................................................ 74
3.2.4 Metode Hemocytometer ..................................................................... 75
4. PEMBAHASAN ............................................................................................. 77
4.1 Data Hasil Perhitungan Praktikum ....................................................... 77
4.1.1 Metode TPC (Total Plate Count)................................................... 77
4.1.2 Metode MPN (Most Probable Number) ......................................... 79
4.1.3 Metode Mc Farland ....................................................................... 80
4.1.4 Metode Hemasitometer ................................................................ 82
5. PENUTUP ..................................................................................................... 83
5.1 Kesimpulan .......................................................................................... 83
5.2 Saran ................................................................................................... 84
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 85
LAMPIRAN........................................................................................................ 87
MATERI 4 .......................................................................................................... 91
Zona Hambat Antibakteri ................................................................................ 91
1. PENDAHULUAN ........................................................................................... 92
1.1 Latar Belakang .................................................................................... 92
1.2 Maksud dan tujuan .............................................................................. 93
1.3 Waktu dan tempat ............................................................................... 94
2.1 Zona Hambat ....................................................................................... 95
2.2 Metode Cakram ................................................................................... 96
3. METODELOGI............................................................................................... 98
3.1 Pembuatan media MHA (Muller Hinton Agar) ........................................... 98
3.2 Metode Cakram ................................................................................... 99
3.2.1 Perendaman Kertas Cakram ........................................................ 99
3.2.2 Uji Daya Hambat Metode Cakram.................................................... 101
3.2.3 Pengukuran Zona Hambat Dengan Metode Cakram........................ 103
4. PEMBAHASAN ........................................................................................... 106
vi
4.1 Data Hasil Praktikum ......................................................................... 106
5. PENUTUP ................................................................................................... 108
5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 108
5.2 Saran ................................................................................................. 109
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 110
LAMPIRAN...................................................................................................... 111
MATERI 5 ........................................................................................................ 113
Pewarnaan Gram ........................................................................................... 113
2021 ................................................................................................................ 113
1. PENDAHULUAN ......................................................................................... 113
1.1 Latar Belakang .................................................................................. 114
1.2 Maksud dan Tujuan ........................................................................... 115
1.3 Waktu dan Tempat ............................................................................ 115
2. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 116
2.1 Escherichia Coli ................................................................................. 116
2.2 Bacillus Sp. ........................................................................................ 116
2.3 Pewarnaan Gram .............................................................................. 117
3. METODELOGI............................................................................................. 119
3.1 Skema Kerja Pewarnaan Gram ......................................................... 119
3.2 Mekanisme Penyerapan Warna ......................................................... 120
3.2.1 Bakteri Gram Positif .................................................................... 121
3.2.2 Bakteri Gram Negatif ......................................................................... 121
4. PENUTUP .................................................................................................. 123
4.1. Kesimpulan ........................................................................................ 123
4.2. Saran ................................................................................................. 124
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 125
LAMPIRAN...................................................................................................... 127
MATERI 6 ........................................................................................................ 128
Identifikasi Hifa .............................................................................................. 128
1. PENDAHULUAN ......................................................................................... 129
1.1 Latar Belakang .................................................................................. 129
1.2 Maksud dan Tujuan ........................................................................... 130
vii
1.3 Waktu dan Tempat ............................................................................ 130
2. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 131
2.1 Fungi ................................................................................................. 131
2.2 Kapang .............................................................................................. 131
2.3 Khamir ............................................................................................... 132
2.4 Hifa .................................................................................................... 132
2.5 Slide Culture ...................................................................................... 133
3. PEMBAHASAN ........................................................................................... 135
3.1 Pembuatan Slide Culture ................................................................... 135
3.2 Identifikasi Hifa .................................................................................. 136
BAB 4. PENUTUP ........................................................................................... 138
4.1 Kesimpulan ........................................................................................ 138
4.2 Saran ................................................................................................. 138
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 139
LAMPIRAN...................................................................................................... 140
viii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Autoklaf (Andriani, 2016) ................................................................. 15
Gambar 2. Alur Pengoperasian Autoklaf ........................................................... 16
Gambar 3. Skema Kerja Pembuatan Media NA ................................................ 35
Gambar 4. Skema Kerja Pembuatan Media PCA .............................................. 36
Gambar 5. Skema Kerja Pembuatan Media PDA .............................................. 38
Gambar 6. Skema Kerja Pengenceran Sampel Ikan Asin (Fatiqin et al., 2019) . 40
Gambar 7. Skema Kerja Pengenceran Sampel Air Limbah Ikan ....................... 41
Gambar 8. Skema Kerja Pengenceran Terasi (Romadhon et al., 2018) ............ 43
Gambar 9. Skema Kerja Metode Agar Miring .................................................... 44
Gambar 10. Metode Agar Miring (Kevin, 2019) ................................................. 45
Gambar 11. Skema Kerja Metode Gores .......................................................... 46
Gambar 12. Metode Gores (Kevin, 2019) .......................................................... 47
Gambar 13. Skema Kerja Metode Tebar ........................................................... 48
Gambar 14. Metode Tebar (Kevin, 2019) .......................................................... 49
Gambar 15. Skema Kerja Metode Tuang .......................................................... 49
Gambar 16. Metode Tuang (Kevin, 2019) ......................................................... 50
Gambar 17. Skema Kerja Metode Tusuk .......................................................... 51
Gambar 18. Metode Tusuk (Sulthan, 2021)....................................................... 52
Gambar 19. Skema Kerja Pembuatan Media LB ............................................... 66
Gambar 20. Skema Kerja Pembuatan Media NB .............................................. 68
Gambar 21. Skema Kerja Metode TPC ............................................................. 70
Gambar 22. Skema Kerja Metode MPN ............................................................ 72
Gambar 23. Skema Kerja Metode Mc Farland .................................................. 74
Gambar 24. Skema Kerja Metode Hemasitometer ............................................ 75
Gambar 25. Standar Mc Farland ....................................................................... 80
Gambar 26. Air Sampel ..................................................................................... 80
Gambar 27. Spora Hemasitometer .................................................................... 82
Gambar 28. Skema Kerja Pembuatan MHA ...................................................... 98
ix
Gambar 29. Skema Perendaman Kertas Cakram ............................................. 99
Gambar 30. Skema Uji Daya Hambat Cakram ................................................ 101
Gambar 31. Skema Kerja Pengukuran Zona Hambat (Herda et al., 2018) ...... 103
Gambar 32. Skema Kerja Pewarnaan Gram ................................................... 119
Gambar 33. Skema Kerja Pembuatan Slide Culture ........................................ 135
Gambar 34. Skema Kerja Identifikasi Hifa ....................................................... 136
x
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Pengenalan Alat .................................................................................... 8
Tabel 2. Data Hasil Perhitungan TPC ................................................................ 77
Tabel 3. Data Hasil Perhitungan MPN ............................................................... 79
Tabel 4. Data Hasil Praktikum ......................................................................... 106
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Praktikum Materi 1 ........................................................................ 25
Lampiran 3. Lampiran Perhitungan TPC ........................................................... 87
Lampiran 4. Perhitungan Hemasitometer.......................................................... 90
Lampiran 6. Perhitungan Hasil Zona Hambat Data Hasil Praktikum ............... 111
Lampiran 7. Praktikum Materi 4 ...................................................................... 112
xii
MATERI 1
Pengenalan Alat, Sterilisasi, dan Teknik Dasar Mikrobiologi

MALANG
2021
1
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mengenal peralatan laboratorium merupakan pendukung keberhasilan
dalam melaksanakan penelitian. Hal ini disebabkan karena alat-alat yang ada
jumlahnya beragam dan tentunya mempunyai fungsi masing-masing. Pentingnya
mengetahui hal tersebut adalah supaya praktikan bisa memahami alat dalam
menggunakannya, sehingga tidak terjadi kecelakaan dan kerusakan alat akibat
tak mengetahui prosedur kerjanya. Oleh karena itu, penting kiranya mengenal
dan mempelajari alat-alat tersebut yang bertujuan tidak lain Dalam melakukan
penelitian tentunya harus didukung dengan pengetahuan alat-alat yang ada
untuk melakukan kegiatan di laboratorium. Pengetahuan tentang alat-alat
tersebut sangat penting dan menjadi faktor untuk memudahkan dan melancarkan
berlangsungnya praktikum tentang pengetahuan mengenai penggunaan alat
sangat diperlukan (Ririn, 2016).
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian haruslah terjaga
kehigienisannya atau steril. Terlebih jika berhubungan dengan mikrobiologi,
maka steril adalah syarat yang mutlak saat hendak melakukan penelitian. Steril
sendiri dapat diartikan sebagai suatu keadaan dimana terbebas dari kehidupan
dan aktivitas mikroorganisme baik yang menganggu ataupun yang tidak
diharapkan. Jika alat-alat yang digunakan steril maka hasil penelitian yang
didapatkan pun juga akurat dan sesuai. Tidak hanya alat-alat yang digunakan
yang harus bersifat steril, namun ini juga berlaku untuk ruangan, pengguna, dan
bahan-bahan penelitian. Sehingga untuk mencapai keadaan steril haruslah
dilakukan dengan bekerja secara aseptik. Hal ini karena berhubungan dengan
mikroba yang berukuran sangat kecil, dan tidak dapat terlihat langsung oleh
2
mata. Sehingga diperlukan suatu cara atau usaha untuk bisa bekerja secara
aseptik dan menciptakan keadaan steril pada alat. Salah satunya yaitu dengan
sterilisasi. Sterilisasi adalah proses dimana suatu peralatan dapat dibuat bebas
dari kontaminasi mikroorganisme hidup, termasuk bakteri, ragi, dan virus. Saat
mensterilkan alat laboratorium, teknik sterilisasi yang dipilih harus menjaga sifat
struktural dan biokimia alat itu sendiri, dengan demikian dapat dipastikan bahwa
alat tersebut telah memenuhi standar sterilisasi (Cahyani, 2014).
Pengetahuan mengenai alat-alat yang digunakan untuk penelitian harus
dipelajari dengan sungguh-sungguh karena menjadi faktor pendukung
berjalannya penelitian. Begitupula dengan proses sterilisasi harus benar-benar
dipahami karena sangatlah penting peranannya mengingat alat-alat yang
digunakan juga harus steril, artinya terbebas dari aktivitas mikroba dan
kontaminan pihak luar. Sehingga jika alat-alat yang digunakan steril maka hasil
yang didapat pun juga sesuai, akurat, dan mencapai keberhasilan. Dengan
memahami keduanya dapat dipastikan, penelitian yang dilakukan akan berjalan
mudah, lancar, dan kecil resiko kecelakaan saat bekerja di laboratorium. Terlebih
jika berhubungan dengan mikrooganisme, haruslah sangat berhati-hati dan taat
akan prosedur serta tahapan yang ada. Hal ini disebabkan mikroorganisme
adalah makhluk hidup yang tidak terlihat oleh mata, namun dampak negatifnya
sangat terasa. Contohnya seperti bakteri yang bersifat patogen dan dapat
menyebabkan penyakit pada manusia.
1.2 Maksud dan Tujuan
Maksud dari praktikum Mikrobiologi Dasar Materi 1 adalah untuk
mengetahui dan memahami alat-alat praktikum beserta berbagai bagian dan
fungsinya, memahami terkait sterilisasi, dan juga teknik dasar mikrobiologi yang
bisa praktikan dapat sebagai bekal untuk praktikum-praktikum selanjutnya.
3
Tujuan dari praktikum mikrobiologi dasar tentang materi pengenalan alat
dan sterilisasi adalah dapat memahami dan mempelajari alat-alat laboratorium
dan cara proses sterilisasi menggunakan autoklaf
1.3 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 29 November 2021, dan dimulai
pukul 16.15 WIB. Praktikum bertempat di rumah kami masing-masing. Praktikum
berlangsung secara online dengan keadaan yang kondusif dan mendukung.
4
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sterilisasi
Secara garis besar, sterilisasi adalah proses membunuh mikrooganisme
terutama mikroorganisme yang paling tahan panas yaitu spora bakteri, kemudian
saat ditumbuhkan pada medium mikrooganisme tidak dapat tumbuh dan
berkembang biak. Dalam proses sterilisasi alat yang digunakan memerlukan
bahan pengemas agar alat terhindar dari pencemaran serta gangguan fisik
seperti gesekan, benturan dan getaran. Proses sterilisasi memiliki tujuan yaitu
menjaga kebersihan supaya peralatan terbebas dari mikroorganisme berbahaya
sehingga terhindari dari adanya kontaminasi. Selain itu, sterilisasi juga sebagai
jaminan suatu produk sudah bersih, steril, dan aman digunakan oleh konsumen.
Umumnya sterilisasi bertujuan untuk teradinya proses denaturasi protein,
termasuk enzim-enzim didalam sel (Istini, 2020).
Sterilisasi memiliki dua macam yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi
kering. Menurut Istini (2020), sterilisasi basah umumnya menggunakan autoklaf
sebagai alat dengan metode pemanasan pada suhu 121⁰C dan tekanan 1 atm
selama 15 menit. Metode ini sering dipakai karena lebih efisien, cepat, dan
aman. Sterilisasi menggunakan cara pemanasan basah dapat membunuh
mikroorganisme karena pemanasan basah dapat menyebabkan denaturasi
protein, termasuk enzim-enzim didalam sel. Sedangkan sterilisasi kering
menggunakan oven.
5
2.2 Teknik Dasar Mikrobiologi
Teknik dasar mikrobiologi memiliki beberapa teknik dasar antara lain
pengenceran, penanaman, dan inokulasi. Pengenceran merupakan suatu cara
yang biasa digunakan dalam perhitungan dan mempelajari populasi bakteri yang
beragam dengan media yang terbatas. Pengenceran ini dimaksudkan untuk
mengurangi kepadatan bakteri pada sampel. Beberapa mediun yang digunakan
adalah agar ekstrak tanah (soil extract agar), trypticase soy agar (TSA), dan
nutrient agar (NA).Medium peptonized milk-actidion agar (PMA) secara nyata
lebih baik TSA atau SE dalam perhitungan jumlah bakteri. Penentuan besarnya
jumlah mikroba pada sampel digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel pertama
dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel.
Adapun cara kerja teknik pengeceran yaitu, yang pertama siapkan sampel yang
mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10
atau 10¯¹) secara aseptis. Perbadingan berat sampel dengan volume tabung
pertama adalah 1:9. Setelah sampel masuk lalu dihomogenkan hingga merata.
Kedua, ambil 1 ml dari tabung 10¯¹ dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke
tabung 10¯² secara aseptis kemudian dihomogenkan. Selanjutnya, pemindahan
dilanjutkan dengan cara yang sama. Namun pipet ukur yang digunakan harus
selalu diganti, agar pipet ukur yang digunakan setiap langkah pemindahan tetap
dalam keadaan steril (Nuzuludin et al., 2015).
Penanaman suatu mikroba terdapat beberapa faktor nutrisi serta
kebutuhan oksigen. Cara penumbuhan mikroba anaerob dan aerob sangatlah
berbeda. Isolasi mikroba ialah pemisahan mikroba dari lingkungannya dan
menumbuhkannya dalam medium buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara
penanaman dan penumbuhan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat
lain untuk pertumbuhannya. Mikroba memiliki macam-macam penanaman yaitu
6
teknik sebar, swab, dan gores. Teknik sebar merupakan teknik menginokulasi
kultur mikroba secara pulasan atau sebaran di permukaan media agar yang telah
memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba.
Teknik swab dimulai dengan mengambil biakan bakteri pada nutrient broth,
kemudian menutup kapas penutup dengan dijepit menggunakan jari. Selanjutnya
mensterilkan mulut tabung dan batang swab dengan pijar bunsen. Celupkan
kapas swab kedalam biakan, lalu tekan pada dinding tabung. Menutup kembali
tabung dengan kapas setelah mensterilisasi kembali mulut tabung. Langkah
terakhir yaitu swab kapas yang sudah dicelupkan kedalam nutrient pada
permukaan agar yang telah memadat hingga merata. Teknik gores adalah teknik
yang bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya kultur ke
dalam medium baru. Cara ini dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan
yang mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang sesuai pada
cawan petri. Selanjutnya, bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang
terpisah setelah inkubasi mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat
dikultur lebih lanjut. Penggoresan sempurna akan menghasilkan koloni terpisah.
Bakteri yang berflagella seingkali membentuk koloni menyebar pada terutama
pada medium yang basah. Teknik inokulasi merupakan proses pemindahan
bakteri dari medium lama ke medium yang baru. Media yang digunakan pada
inokulasi haruslah steril. Selain itu, pada teknik inokulasi juga terdapat beberapa
metode yang digunakan yaitu metode gores, metode tebar, metode tuang,
Metode tusuk, serta metode agar miring (Winiati dan Nurwitri, 2012).
7
3. PEMBAHASAN
3.1 Pengenalan Alat
Dalam praktimum Mikrobiologi Dasar Materi Pengenalan Alat, Sterilisasi,
dan Teknik Dasar Mikrobiologi membahas mengenai berbagai alat yang harus
diketahui dan dipahami saat melakukan teknik dasar mikrobiologi. Adapun alat-
alat tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Pengenalan Alat

No Nama Alat Gambar Alat Fungsi
1. Gelas ukur untuk tempat mengukur aquades.
2. Mortal dan alu untuk tempat menghaluskan sampel.
3. Beaker glass untuk tempat pembuatan Na-fis.
4. Erlenmeyer untuk tempat pembuatan media.
8
5. Bunsen untuk melakukan pengkondisian
aseptis
6. Washing bottle untuk tempat aquades.
7. Triangle untuk membantu meratakan sampel
bakteri pada media biakan padat
dengan metode spread (tebar).
8. Bola Hisap : a. untuk mengambil larutan
a. S b. untuk mengeluarkan larutan
b. E c. untuk mengeluarkan udara
c. A
9. Ose jarum untuk menginokulasi mikroba dari
media padat ke media padat
10. Pipet tetes untuk mengambil larutan dalam skala
kecil.
11. Pipet serologis untuk mengambil larutan dengan
skala 0,1 – 1 ml.
9
12. Pipet volume untuk mengambil larutan dengan
skala 1 – 10 ml.
13. Spatula untuk menghomogenkan larutan
secara manual
14. Cover glass untuk menutup objek glass.
15. Objek glass untuk tempat objek yang akan diamati
mikroskop
16. Objek glass untuk mengamati jamur
cekung
17. Ose loop untuk menginokulasi mikroba dari
media padat ke cair atau sebaliknya.
18. Tabung reaksi untuk tempat pengenceran bertingkat.
19. Rak tabung untuk meletakkan tabung reaksi.
reaksi
10
20. Kaca arloji untuk alas pada penimbangan media.
21. Crushtable untuk mengambil benda yang panas.
tang
22. Cawan petri untuk tempat melakukan penanaman
mikroba.
23. Sprayer untuk tempat alkohol 70%.
24. Nampan untuk tempat meletakkan alat dan
bahan.
25. Mikropipet untuk memindahkan cairan bervolume
kecil, biasanya kurang dari 1000 µL.
26. Oven untuk melakukan sterilisasi kering
dengan suhu 1600C - 1700C selama
2-3 jam.
11
27. Etalase bakteri untuk menginkubasi bakteri pada
suhu ruang.
28. Inkubator untuk menginkubasi media padat
pada suhu yang bisa ditentukan.
29. Waterbath untuk menginkubasi media cair pada
suhu yang bisa ditentukan.
30. Kulkas untuk tempat menyimpan sampel dan
media isolasi.
31. Mikroskop untuk mengamati mikroorganisme
yang tidak bisa dilihat dengan mata
telanjang.
32 Hot plate untuk memanaskan media.
33. Autoklaf untuk melakukan sterilisasi basah
pada suhu 1210C dan tekanan 1 atm
(0,15 MPa) selama 15-20 menit.
12
34. Kompor untuk sumber pemanas.
35. Kompor untuk sumber pemanas.
elektrik
36. Timbangan untuk menimbang bahan dalam
digital jumlah tertentu dengan ketelitian 0,01
gram.
37. Colony counter untuk menghitung jumlah koloni
bakteri.
38. Vorter mixer untuk membantu menghomogenkan
larutan yang berisi sampel.
39. Incase untuk menyimpan alat alat yang telah
disterilkan.
40. Cooling untuk menginkubasi media biakan
inkubator pada suhu rendah.
13
41. Panci untuk wadah perebusan media dalam
erlenmeyer.
14
3.2 Sterilisasi Autoklaf Elektrik
3.2.1 Bagian-bagian Autoklaf
Keterangan Gambar :
1. Tombol pengatur waktu mundur
2. Katup pengeluaran uap
3. Pengukur tekanan
4. Klep pengaman
5. Tombol on-off
6. Termometer
7. Lempeng sumber panas
8. Aquades
9. Sekrup pengaman
10. Batas penambahan air
Gambar 1. Autoklaf (Andriani, 2016)
Autoklaf merupakan suatu alat yang digunakan untuk proses sterilisasi
yang bertujuan untuk mensterilkan alat dan bahan yang akan digunakan dalam
praktikum agar terbebas dari mikroorganisme dan segala aktivitas mikroba,
sehingga tidak ada kontaminan dari pihak luar. Hal ini dapat terjadi karena panas
yang dihasilkan autoklaf yaitu pada suhu 121 dan tekanan 1 atm mampu untuk
mendenaturasi protein dan menginaktifkan enzim yang digunakan mikroba untuk
bermetabolisme, serta membunuh spora bakteri, sehingga dapat dipastikan
mikroba terbunuh dan tidak bisa tumbuh kembali. Autoklaf ini digunakan pada
sterilisasi basah. Disebut sterilisasi basah dikarenakan terdapat air yang
dimasukkan ke dalam autoklaf dengan tinggi tertentu yang berfungsi sebagai
media sterilisasi (Andriani, 2016).
15
3.2.2 Cara Pengoperasian Autoklaf
Persiapan Autoklaf Proses Pendinginan

Pengoperasian
Meliputi
1.Menuangkan Air 1.Hubungkan kabel pada Ketika sterilisasi

Tuangkan air hingga stopkontak.Ketika sudah selesai, buka klap
mencapai batas yang dihubungkan dengan listrik, pada katup pelepas
ditentukan agar autoklaf maka suhu pada autoklaf akan udara untuk
siap digunakan. naik hingga suhu 121 . mengeluarkan uap.
Ketika jarum
2. Sementara itu, timer pengukur tekanan
berjalan yaitu selama 15 menunjuk ke angka
menit. (sudah diatur) nol, dan bunyi sudah
2. Memasukkan Alat berhenti maka dapat
Praktikum membuka tutupnya.
3. Ketika suhu sudah
Alat yang akan dimasukkan
meningkat, nanti akan ada
sudah dibungkus dengan benar
dan dimasukkan dalam pelat pertambahan suhu, dan klap
saringan sebelum dimasukkan akan berbunyi sebagai
ke dalam autoklaf. pertanda waktu sudah habis.
Maka akan nampak uap atau
gas- gas akan keluar.
4. Kemudian langsung
3. Menutup Autoklaf bukalah klap, dan tunggu
Masukkan plat saringan yang hingga tidak berbunyi.
telah terisi alat-alat praktikum ke
dalam autoklaf. Kencangkan
mue sekrup sampai tutup dan
terkunci dengan tepat.
Gambar 2. Alur Pengoperasian Autoklaf
Autoklaf merupakan alat yang digunakan saat sterilisasi basah dengan
tujuan untuk membebaskan alat-alat praktikum dari mikroorganisme. Sehingg
alat-alat tersebut bisa terjaga kesterilannya dan siap untuk digunakan praktikum.
Penggunaan autoklaf haruslah cermat, teliti, dan selalu ingat terhadap tahapan-
16
tahapan pengoperasiannya. Hal ini dikarenakan suhu yang ada dalam autoklaf
saat dinyalakan sangatlah panas yaitu pada suhu 121 dan dengan tekanan 1
atm. Jika tidak berhati-hati maka bisa sampai melukai praktikan. Panas yang
dihasilkan autoklaf memang sangat tinggi, dengan dibuktikan alat-alat yang
hendak disterilisasi perlu untuk dibungkus dengan benar. Sehingga dalam
pengoperasiannya harus sangat berhati-hati. Terlebih pada tahapan akhir saat
hendak mengambil alat-alat dari autoklaf. Pastikan setelah waktu habis, dan uap
mulai nampak keluar, maka langsung buka klap, dan tunggu hingga jarum
tekanan menunjuk angka nol serta klap berhenti berbunyi. Barulan autoklaf bisa
dibuka dan jangan lupa gunakan kain tebal untuk melindungi tangan dari panas
autoklaf. Barulah setelah itu, alat-alat bisa untuk dikeluarkan.
3.3 Teknik Dasar Mikrobiologi

3.3.1 Pengenceran
Pengenceran yang digunakan biasanya pengenceran bertingkat yang
memiliki tujuan untuk mengurangi jumlah mikroba. Besarnya tingkat pengenceran
tergantung dengan perkiraan jumlah mikroba pada sampel. Digunakan
perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran. Adapun langkah-langkah
teknik pengenceran lebih lanjut yaitu langkah pertama siapakan 4 tabung reaksi
dan beri label A, B, C, dan D. Mengencerkan 1 ml larutan stok dengan 9 ml air
suling dengan membuat pengenceran 1/10, pengenceran 0.1 atau pengenceran
10¯¹.Pindahkan 1 ml dari tabung reaksi A ke tabung reaksi B. Selanjutnya
lakukan pengenceran sebanyak 10 kali dalam tabung reaksi B konsentrasinya
menjadi pengenceran 1/100, yaitu pengenceran 10¯². Langkah diulangi dalam
tabung reaksi C, pindahkan 1 ml larutan dari tabung reaksi B ke tabung reaksi C.
Sehingga, didapatkan pengenceran 1/1000 atau 10¯ᶾ dan aduk hingga merata.
17
Pindahkan 1 ml larutan dari tabung reaksi C ke tabung reaksi D dan akan
mendapatkan pengenceran 1/10000 atau pengenceran 10¯⁴.
Menurut Istini (2020), teknik pengenceran merupakan suatu teknik
dimana digunakan untuk mengurangi kepadatan mikroba. Pengenceran ini
dimaksudkan untuk mengurangi kepadatan bakteri pada sampel. Umumnya
teknik pengenceran menggunakan metode tuang dan metode sebar. Tujuan
pengenceran adalah setelah inkubasi terbentuk koloni pada cawan yang berisis
media dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana julahnya antara 30-300. Selain
itu, terdapat beberapa pilihan medium pengenceran yang digunakan untuk
mikroba tertentu pada analisis mikroba. Pengambilan sampel dilakukan secara
aseptis dan dan setiap kali pengenceran dilakukan pengocokan kira-kira
sebanyak 25 kali untuk memisahkan sel mikroba yang bergabung menjadi satu.
3.2.2 Penanaman
Tiga metode penanaman yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri
antara lain teknik sebar, teknik swab, dan teknik inokulasi. Teknik sebar dimulai
dengan menyalakan api bunsen, lalu sterilisasi cawan petri pada pijar dengan
cara memutar. Kemudian, tuang nutrien agar ke dalam cawan sebanyak 15 ml
dan dihomogenkan. Jangan lupa ambil biakan mikroba pada nutrient broth dalam
bentuk cairan, lalu lepas kapas penutup dengan dijepit menggunakan jari. Tuang
biakan pada cawan dan homogenkan hingga merata dengan cara digoyangkan.
Selanjutnya, sterilisasi kembali cawan petri dengan cara diputar pada pijar
bunsen. Kemudian, diamkan nutrient pada cawan hingga memadat. Teknik yang
kedua yaitu teknik swab, tahapan melakukan teknik swab yaitu diawali dengan
mengambil biakan bakteri pada nutrient broth, lalu jepit kapas penutup dengan
jari. Kemudian sterilisasi mulut tabung dan batang swab dengan pijar bunsen.
Selanjutnya batang swab dimasukkan ke dalam biakan, dan tekan kapas swab
18
pada dinding agar tidak menetes. Sterilisasi kembali mulut tabung dan tutup
dengan kapas swab secara perlahan diatas permukaan agar yang telah
memadat hingga merata. Lalu, sterilisasi kembali batang swab dengan pijar
bunsen. Teknik yang ketiga yaitu teknik inokulasi, teknik ini dimulai dengan
mensterilisasi jarum ose pada pijar bunsen hingga memijar. Lalu, diamkan
hingga pijar mereda dan ambil biakan bakteri pada media nutrient agar miring
menggunakan jarum ose. Goreskan secara zigzag pada media agar yang sudah
memadat. Sterilisasi cawan petri dengan cara memutar pada pijar bunsen. Dan
tahapan yang terakhir yaitu jangan lupa sterilisasi kembali jarum ose hingga
memijar.
Teknik kultur mikroba biasanya dilakukan dengan metode sebar.
Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri dipindahkan secara aseptik pada permukaan
media yang telah memadat dan steril ke dalam cawan petri menggunakan pipet.
Lalu, sterilisasi dilakukan dengan cara mencelupkan ke dalam alkohol kemudian
dibakar dengan dilewatkan diatas api, selanjutnya dibiarkan agar spreader
dingin. Kemudian, sebar kultur bakteri dengan spreader secara merata dan
biarkan sampai permukaan agar mengering. Setelah permukaan agar
mengering, kemudian inkubasikan secara terbalik selama 24 jam pada suhu
kamar ataupun inkubator dan amati pertumbuhannya (Ariyanti et al., 2016).
3.2.3 Inokulasi
Adapun tahapan inokulasi setelah alat dan bahan disterilisasi yaitu diawali
dengan menyalakan lampu dan blower di dalam laminar air flow. Selanjutnya
Sebelum memulai, semprot meja dalam laminar air flow dengan disinfektan atau
alkohol konsentrasi 70%, dan lap meja tersebut dengan tisu kering. Kemudian
nyalakan bunsen untuk membantu proses pemindahan media. Siapkan kultur
bakteri yang akan diinokulasikan. Sebelum memindahkan bakteri, pastikan media
19
yang akan dipindahi sudah dalam kondisi membeku Setelah media miring dan
media yang ada di cawan petri membeku, maka lakukan pemindahan mikroba
(Inokulasi), yaitu dengan memanaskan kawat ose pada nyala api bunsen. Lalu
ambil bakteri yang akan diinokulasikan. Panaskan pinggiran tabung tempat asal
bakteri setelah dibuka. Kemudian masukkan kawat ke dalamnya untuk ambil
bakteri, dan tutup dengan segera. Pindahkan bakteri tersebut ke tabung baru
dengan arah zig-zag. Sebelum ditutup, panaskan pinggiran tabung yang baru
dengan api bunsen. Lalu pijarkan kembali kawat pada api bunsen. Ulangi
tahapan untuk mengambil mikroba lain dan pindahkan ke cawan petri. Sebelum
cawan petri dibuka, panaskan pinggiran cawan petri. Kemudian baru letakkan
inokulan di dalamnya. Jangan lupa untuk tutup dengan segera. Selanjutnya,
pijarkan kembali kawat pada api bunsen karena telah selesai digunakan. Dan
yang terakhir, padamkan api Bunsen dengan langsung menutupnya.
Menurut Suharman (2020), teknik inokulasi adalah proses memindahkan
bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian
yang sangat tinggi. Saat melakukan inokulasi terlebih dahulu menyiapkan semua
alat yang dibutuhkan dengan keadaan yang steril, hal tersebut untuk menghindari
teradinya kontaminasi. Hal ini sangat diperhatikan mengingat keberadaan
mikroorganisme dapat dijumpai dimana-mana, dan dapat mengakibatkan
terjadinya kontaminasi biakan murni mikroorganisme. Oleh karena itu, teknik
inokulasi harus dilakukan secara aseptik dalam keadaan yang steril. Sehingga
sebelum melakukan inokulasi, alat dan bahannya harus lebih dulu disterilisasi.
Sterilisasi dimulai dengan mempersiapkan alat yang akan dan bahan terlebih
dahulu. Setelah itu persiapkan juga media pertumbuhan mikroba yang telah
dibuat untuk juga disterilisasikan. Dan dalam pembuatan agar miring, tentunya
tabung reaksi perlu untuk disterilkan terlebih dahulu. Selanjutnya adalah proses
pembungkusan alat yang dilakukan dengan kertas yang bersih dan sesuai
20
dengan aturan, untuk dimasukkan ke dalam autoklaf dan disterilisasi.
Pembungkusan dengan cara yang baik bertujuan untuk tetap menjaga kesterilan
alat saat di autoklaf hingga dibawa ke laminar flow. Untuk kawat ose dan batang
pengaduk bisa dibungkus menjadi satu dengan kertas yang berkali lipat agar
kertas tidak mudah sobek. Kemudian untuk bahan, tempatkan dalam tabung
erlenmeyer, dan tutup pangkal tabung dengan kapas penutup, lalu bungkus
kembali menggunakan kertas dan rekatkan dengan selotip atau karet yang tahan
panas. Kemudian, masukkan alat dan bahan ke dalam suatu wadah saringan,
dan masukkan ke dalam autoklaf. Ketika semua sudah dimasukkan ke dalam
autoklaf, lalu tutup kembali autoklaf secara diagonal, hal ini bertujuan agar
autoklaf tertutup dengan rapat dan mencegah uap panas keluar. Atur autoklaf
dengan suhu 121⁰C, tekanan 1 atm, dan waktu selama 15 menit. Lalu,
tancapkan kabel autoklaf pada stopkontak, dan suhu di dalam autoklaf tersebut
mulai meningkat. Setelah selesai sterilisasi dari autoklaf, angkat alat-alat yang
telah disterilisasikan dan masukkan ke dalam laminar air flow. Barulah alat-alat
tersebut bisa untuk dibuka dan digunakan.
21
4. PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan Praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Sterilisasi, Pengenalan
Alat, dan Teknik Dasar Mikrobiologi didapatkan kesimpulan sebagai berikut:
 Alat-alat yang berada di laboratorium untuk melakukan berbagai aktivitas
seperti pengenceran bakteri, penanaman bakteri, inokulasi media bakteri,
dan lain-lainnya memiliki fungsi tertentu dan penggunaannya harus sesuai
dengan aktivitas yang akan dilakukan.
 Sterilisasi merupakan usaha yang dapat dilakukan untuk membebaskan alat-
alat laboratorium dari kehidupan mikroba dan segala aktivitasnya sehingga
menjadi steril dan dapat digunakan untuk bekerja secara aseptik. Sterilisasi
terbagi menjadi dua, yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering.
 Sterilisasi pada alat-alat laboratorium penting dilakukan sebelum
dilaksanakannya aktivitas praktikum untuk membersihkan atau membunuh
mikroba pada alat-alat tersebut sehingga mengurangi risiko terjadinya
kontaminasi.
 Sterilisasi basah menggunakan autoklaf merupakan sterilisasi yang paling
umum digunakan karena kemampuan kerjanya yang lebih efiesien untuk
membunuh mikroorganisme.
4.2 Saran
Saran untuk jalan praktikum kedepannya semoga dapat dilaksanakan
secara offline agar praktikan dapat lebih memahami dan mempraktikannya
langsung di laboratorium. Selain itu, diharapkan untuk praktikum berikutnya
22
dapat berjalan lebih efisien dan tidak bertabrakan dengan praktikum lainnya
karena dapat mengurangi pemahaman yang diterima oleh praktikan.
23
DAFTAR PUSTAKA
Andriani R. 2016. Pengenalan Alat-Alat Laboratorium Mikrobiologi Untuk

Mengatasi Keselamatan Kerja dan Keberhasilan Praktikum. Jurnal
Mikrobiologi. Vol. 1, No.1.
Idrus M. 2021. Modul III: Pembuatan Media, Sterilisasi,dan Kultivasi Mikroba.
Jurnal Praktikum Mikrobiologi Kehutanan, BW-3205.
Istini. 2020. Pemanfaatan Plastik Polipropilen Standing Pouch Sebagai Salah
Satu Kemasan Sterilisasi Peralatan Laboratorium. Indonesian Journal Of
Laboratory. Vol. 2 (3) , 41-46.
Winiati dan nurwitri. 2012. Mikrobiologi Pangan. Buku Mikrobiologi IPB Press.
ISBN : 978-979-493-430-2.
Suharman. 2020. Bahan Ajar Mata Kuliah Mikrobiologi Umum.
Vera Nabila Ariyanti, Supriharyono, Niniek Widyorini. 2016. Hubungan Kerapatan
Lamun Dengan Kelimpahan Bakteri Heterototrof di Perairan Pantai Kartini
Kabupaten Jepara. Vol. 5 , No. 4.
24
LAMPIRAN
Lampiran 1. Praktikum Materi 1
25
MATERI 2
Inokulasi Mikroba

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU ELAUTAN
MALANG
2021
26
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Inokuluasi mikroba menurut Pasarbiru et al. (2019), merupakan kegiatan
memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru menurut tingkat
kesterilan dan ketepatan yang tinggi agar tidak terjadi kontaminasi. Fungsi dari
Inokulasi adalah untuk memelihara dan mempersiapkan biakan mikroba. Oleh
karena itu, pekerjaan ini membutuhkan tingkat ketelitian yang sangatlah tinggi.
Dengan begitu akan memperoleh biakan mikroorganisme yang diinginkan.
Ada beberapa metode yang diketahui untuk melakukan teknik Inokulasi
mikroba. Dua metode yang diketahui yang paling umum digunakan adalah
metode cup dan metode pour cup. Hal tersebut didasarkan pada prinsip
pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan
asumsi bahwa setiap koloni dapat dipisahkan dari jenis sel yang dapat diamati.
Kultur murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, termasuk yang
digunakan untuk mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati karakteristik
budaya morfologi, fisiologi mikroba dari satu spesies diperlukan (Harti, 2015).
Semua makhluk yang memiliki ukuran micron atau bahkan lebih kecil
disebut dengan mikroorganisme atau mikroba. Mikroba merupakan salah satu
organisme yang memiliki jumlah yang melimpah dan memiliki ukuran renik.
Mikroba hidup bebas di lingkungan, menyebar di udara, tanah, air, makanan,
bahkan mikroba yang hidup dalam tubuh manusia. Mikroba ada yang bermanfaat
dan ada yang merugikan yang bersifat patogen. Mikroba yang bermanfaat dan
mikroba yang merugikan untuk membedakannya tentu sulit, mengingat mikroba
tersebut dalam bentuk populasi campuran.
27
Maksud dari Praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Inokulasi Mikroba
adalah agar praktikan dapat mengetahui dan memahami teknik-teknik inokulasi
bakteri.
Tujuan dari Praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Inokulasi Mikroba adalah
praktikan dapat mempelajari dan memahami dalam melakukan teknik-teknik
inokulasi bakteri.
Pada praktikum Mikrobiologi Dasar 2021 materi 2 Inokulasi Mikroba
dilaksanakan pada hari Senin, 29 Desember 2021 pukul 16.15 WIB. Praktikum
dilaksanakan di kediaman masing-masing secara daring dengan menggunakan
aplikasi Google meet.
28
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Media Tanam Mikroba

2.1.1 NA (Nutrient Agar)
Nutrient agar merupakan suatu medium yang berbentuk padat, yang
merupakan perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia.
Nutrient agar terbuat dari campuran ekstrak daging dan pepton dengan
menggunakan agar sebagai pemadat. Dalam hal ini agar digunakan sebagai
pemadat, karena sifatnya mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang
berupa galaktam, sehingga tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Dalam
hal ini ekstrak beef dan pepton digunakan sebagai bahan dasar karena
merupakan sumber protein, nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang sangat
dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang. Media
nutrient agar merupakan media yang sudah teruji secara klinis baik untuk
pertumbuhan bakteri, sehingga proses metabolisme bakteri berlangsung optimal
(Anisah, 2015).
2.1.2 PCA (Plate Count Agar)
Media Plate Count Agar (PCA) digunakan sebagai media tumbuh mikroba
pada uji TPC (Total Plate Count). Media ini mengandung agar sehingga setelah
dingin media tersebut akan menjadi padat. Untuk alasan kepraktisan, media
untuk penyimpanan dibuat dalam satu kali sterilisasi dan kemudian dipanaskan
kembali ketika dibutuhkan. Pemanasan berulang diduga akan menyebabkan
kandungan nutrisi pada media menjadi rusak. Media Plate Count Agar (PCA)
merupakan media padat, yaitu media yang mengandung agar sehingga setelah
29
dingin media tersebut akan menjadi padat. Media PCA terdiri dari casein enzymic
hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar (Wati, 2018).
2.1.3 PDA (Potato Dextrose Agar)
PDA (Potato Dextrose Agar) adalah media yang umum untuk
pertumbuhan jamur di laboratorium karena memilki pH yang rendah (pH 4,5
sampai 5,6) sehingga menghambat pertumbuhan bakteri yang membutuhkan
lingkungan yang netral dengan pH 7,0 dan suhu optimum untuk pertumbuhan
antara 25-30°C (Cappucino, 2014). Berdasarkan komposisinya PDA termasuk
dalam media semi sintetik karena tersusun atas bahan alami (kentang) dan
bahan sintesis (dextrose dan agar). Kentang merupakan sumber karbon
(karbohidrat), vitamin dan energi, dextrose sebagai sumber gula dan energi,
selain itu komponen agar berfungsi untuk memadatkan medium PDA. Masing-
masing dari ketiga komponen tersebut sangat diperlukan bagi pertumbuhan dan
perkembangbiakkan mikroorganisme terutama jamur (Octavia dan Wantini 2017).
2.1.4 LB (Lactose Broth)
Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran
koliform dalam air, makanan, dan produk susu. Medium Lactose Broth
mengandung pepton dan ekstrak daging yang menyediakan nutrien penting
metabolisme bakteri. Laktosa yang terkandung juga menyediakan sumber
karbohidrat yang dapat difermentasi oleh bakteri coliform. Media ini biasanya
digunakan dalam presumptive test atau uji penduga untuk bakteri coliform seperti
jenis e.coli (Rahayudan dan Kusmawati 2018).
30
2.1.5 NB (Nutrient Broth)
Nutrient Broth (NB) termasuk ke dalam media umum yang digunakan
untuk menumbuhkan biakan secara general. NB diformulasikan dengan sumber
karbon dan nitrogen supaya dapat memenuhi kebutuhan nutrisi bakteri. Media
NB (Nutrient Broth) dibuat dengan tujuan untuk mengisolasi bakteri enterik dari
sampel dimana apabila terjadi perubahan warna menjadi keruh menunjukkan
bahwa adanya pertumbuhan dari bakteri. Komposisi NB terdiri dari beef extract
sebagai sumber karbon dan pepton sebagai sumber nitrogen pada sampel
(Wahyuningsih dan Zulaika, 2018).
2.1.6 MHA (Mueller Hinton Agar)
Media MHA (Mueller Hinton Agar) adalah media terbaik untuk
pemeriksaan uji sensitivitas bakteri menggunakan metode Kirby-Bauer pada
bakteri nonfastidious baik aerob maupun aerob fakultatif. MHA memiliki hasil
reproduksi yang baik, rendah sulfonamid, trimetoprim dan inhibitor tetrasiklin,
serta mendukung pertumbuhan bakteri yang sulit tumbuh sekalipun. Media ini
ditemukan oleh Mueller dan Hinton tahun 1941, pada awalnya media Mueller
Hinton digunakan untuk mengisolasi bakteri Neisseria sp. Komposisi media
mueller hinton agar adalah beef extract 2 gram, acid hydrolysate of casein 17,5
gram, starch 1,5 gram, agar 17 gram, dan aquades 1 liter (Pratiwi, 2017).
2.2 Sampel Uji

2.2.1 Ikan Asin
Ikan asin merupakan sampel yang mempunyai kadar garam yang tinggi.
Karena kadar garam yang tinggi tersebut tidak menutup kemungkinan bahwa ada
bakteri yang hidup di bagian tubuh ikan asin, salah satunya yaitu kelompok
bakteri halofilik. Kelompok bakteri halofilik ini merupakan salah satu kelompok
31
mikroorganisme yang dapat hidup di lingkungan berkadar garam tinggi hingga
30%. Berikut bakteri yang terdapat pada bagian tubuh ikan asin yaitu bakteri
Staphylococcus aureus dan Halopilic Bacteria (Lusiana, 2020).
2.2.2 Air Limbah Ikan
Penggunaan air pada kegiatan budidaya ikan di darat (kolam, bak,
akuarium) menghasilkan air limbah sebagai produk sampingan. Produksi limbah
cair pada kegiatan ini berasal dari beberapa sumber air bekas pemeliharaan ikan
dan pencucian peralatan produksi. Air Limbah ikan ini mengandung bahan
organik yang tinggi. Kondisi tersebut disebabkan oleh sisa-sisa pakan dan
metabolisme ikan, seperti urin dan feses (Johannes et al., 2016). Kandungan
bahan organik yang sangat tinggi pada kolam pembenihan ikan lele dapat
menyebabkan tumbuhnya banyak jenis bakteri, baik yang bersifat
menguntungkan maupun yang merugikan. Jenis bakteri pada kolam dibagi
menjadi 2 kelompok, yaitu aerob dan anaerob. Bakteri aerob baik dari jenis
autotrofik maupun heterotrofik umumnya lebih dominan dalam proses penguraian
bahan organik. Bakteri patogen yang terdapat pada air limbah ikan yaitu
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pseudomelle,
Enterobacter aglomerans dan bakteri Vibrio Chorela (Hanif et al., 2017).
2.2.3 Terasi
Terasi merupakan suatu jenis penyedap makanan berbentuk pasta,
berbau khas hasil fermentasi udang, ikan, atau campuran keduanya dengan
garam atau bahan tambahan lain (Romadhon et al., 2018). Proses fermentasi
merupakan cara pengolahan pangan dengan memanfaatkan mikroorganisme
untuk mendapatkan produk yang diinginkan. Bakteri yang digunakan yaitu bakteri
baik asam laktat (Arena et al., 2016). Tapi tidak menutup kemungkinan pada
32
terasi tejadi pembusukan yang disebabkan oleh bakteri pembusuk. Bakteri yang
umum terdapat pada terasi ialah Pseudomonas cerevisiae, Lactobacillus
plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Tetragenococcus halophilus,
Staphylococcus sp., Micrococcus sp., dan Bacillus sp (Romadhon et al., 2018).
2.3 Metode Inokulasi

2.3.1 Metode Agar Miring
Agar miring merupakan satu bentuk medium yang digunakan untuk
pertumbuhan mikroba, terutama yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif.
Agar miring ini berbentuk padat dan penempatannya berada di tabung reaksi
dengan kemiringan 10o. Ciri-ciri kultur bakteri antara lain dari pembentukan
warna dan bentuk pertumbuhan yang dapat diamati. Inokulasi mikroba pada
medium ini dilakukan dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung
mikroba secara zigzag pada permukaan agar miring (Lilies, 2019).
2.3.2 Metode Gores
Inokolum digoreskan pada permukaan medium agar nutrient, dalam
cawan petri dengan menggunakan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-
garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh
menjadi kolon terpisah-pisah. Hal ini bertujuan untuk mengisolasi
mikroorganisme dengan meremajakan kultur bakteri ke dalam medium baru.
Metodenya pun dibagi menjadi 4, yaitu goresan sinambung, goresan T, dan
goresan kuadran, dan goresan radian (Lilies, 2019).
2.3.3 Metode Tebar
Metode tebar merupakan teknik inokulasi mikroba dengan cara
menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar
33
yang telah memadat. setetes inokolum diletakkan di tengah-tengah medium agar
nutrient dalam cawan petri. Dengan menggunakan sebatang katu bengkok steril,
inokolum tersebut disebarkan di permukaan medium. Batang yang sama dapat
digunakan untuk menginokulasi pinggan kedua untuk menjamin penyebaran sel-
selnya dengan baik pada beberapa pinggiran (Lilies, A. 2019).
2.3.4 Metode Tuang
Metode agar tuang dilakukan dengan menuangkan sampel terlebih
dahulu yang kemudian disusul dengan penuangan media. Cara ini berbeda
dengan metode goresan karena agar steril yang akan diinokulasikan masih
dalam bentuk cair tetapi telah didinginkan sampai 45˚C-47˚C. Selanjutnya
diinkubasikan pada suhu dan waktu tertentu, maka koloni akan tumbuh pada
permukaan dan bagian bawah agar. Pengenceran harus dilakukan sedemikian
rupa sehingga pada cawan yang terakhir dapat tumbuh koloni bakteri maupun
jamur yang terpisah (Lilies, 2019).
2.3.5 Metode Tusuk
Metode inokulasi tusuk digunakan untuk mempelajari mekanisme
ketahanan biokimia. Metode ini juga biasa disebut dengan metode agar tegak.
Metode tusuk yaitu dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose
yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media atau
medium. Metode tusuk ini termasuk kedalam media agar tegak yang bertujuan
untuk menstimulir pertumbuhan mikroba aerob maupun anaerob. Bakteri yang
tumbuh pada medium padat akan membentuk kelompok yang disebut koloni.
Karakteristik koloni berbeda-beda pada tiap spesies dan merupakan salah satu
sifat yang dapat digunakan dalam identifikasi mikroorganisme (Lilies, 2019)
34
3. PEMBAHASAN
3.1 Pembuatan Media

3.1.1 NA (Nutrient Agar)
Timbang media NA yang diperlukan
Ukur aquades yang dibutuhkan
Homogenkan media dan aquades di dalam erlenmeyer
Tutup erlenmeyer dengan alumunium foil
Bungkus dengan kertas dan diikat
Direbus selama 15 menit
Disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit
Didapatkan media steril
Gambar 3. Skema Kerja Pembuatan Media NA
Pada metode inokulasi NA digunakan sebagi media pertumbuhan
mikroba. Langkah pertama dalam pembuatan NA yaitu menimbang media NA
yang diperlukan. Lalu ukur aquades yang dibutuhkan. Kemudian homogenkan
media tersebut dengan aquades dalam erlenmeyer. Selanjutnya tutup
erlenmeyer dengan alumunium foil lalu bungkus dengan kertas dan diikat
kemudian direbus selama 15 menit. Setelah itu erlenmeyer tersebut
disterilisasikan selama 15 menit dengan menggunakan autoklaf. Dan dari proses
sterilisasi tersebut didapatkan media yang steril.
35
Proses pembuatan media NA (Nutrient Agar) yaitu melarutkan 0,084
gram bubuk media NA (Nutrient Agar) dengan aquades 30 mL dalam
erlenmeyer. Larutan dipanaskan sampai bubuk benar-benar larut tetapi tidak
sampai mendidih, selanjutnya diukur pH menggunakan kertas pH hingga pH 7,4.
Kemudian, disterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada
suhu 121℃ pada tekanan 1 atam dan menunggu media hingga memadat. Salah
satu media yang menggunakan ekstrak daging dan protein sebagai sumber
glukosa dan asam amino serta paling umum digunakan untuk menumbuhkan
sebagaian besar bakteri adalah media NA (Thohari et al., 2019).
3.1.2 PCA (Plate Count Agar)
Timbang media PCA yang dibutuhkan
Gambar 4. Skema Kerja Pembuatan Media PCA
36
Pada media PCA atau plate count agar yang digunakan sebagi media
pertumbuhan mikroba. Dalam pembuatan media tersebut langkah pertama yang
dilakukan yaitu menimbang media PCA yang diperlukan. Lalu ukur aquades yang
dibutuhkan. Kemudian homogenkan media tersebut dengan aquades di dalam
erlemeyer. Selanjutnya tutup erlenmeyer dengan menggunakan alumunium foil
lalu bungkus dengan kertas dan setelah itu diikat kemudian rebus selama 15
menit. Setelah itu sterilisasikan erlenmeyer menggunakan autoklaf selama 15
menit. Dari hasil sterilisasi didapatkan media yang steril.
Untuk membuat media plate count agar tanpa ekstrak yaitu siapkan
bubuk nutrient agar sebanyak 4,3 g dan aquades steril sebanyak 250 ml.
Masukkan aquades steril ke tabung erlenmeyer setelah itu masukkan bubuk
nutrient agar. Kemudian lakukan sterilisasi dengan autoclave dengan suhu 121
°C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Kemudian tuang nutrient agar ke
dalam 3 cawan petri masing-masingnya 10 ml, dan diamkan hingga padat
(Syafira et al., 2019).
37
3.1.3 PDA (Potato Dextrose Agar)
Timbang media PCA yang dibutuhkan
Gambar 5. Skema Kerja Pembuatan Media PDA
Hal pertama yang dilakukan dalam mebuat media PDA atau plate
dextrose agar adalah menimbang media PDA yang diperlukan. Lalu ukur
aquades yang dibutuhkan. Kemudian homogenkan media tersebut dengan
aquades dalam erlenmeyer. Selanjutnya tutup erlenmeyer dengan alumunium foil
lalu bungkus dengan kertas dan diikat kemudian direbus selama 15 menit.
Setelah itu erlenmeyer tersebut disterilisasikan selama 15 menit dengan
menggunakan autoklaf. Dan dari proses sterilisasi tersebut didapatkan media
yang steril ditujukan untuk membunuh kontaminasi dari luar agar inokulasi
berjalan dengan lancar.
38
Pembuatan media PDA sebanyak 39 g dimasukkan kedalam Erlenmeyer
dan dilarutkan dengan 1000 mL aquades, kemudian dipanaskan hingga mendidih
dan homogen, setelah homogeny dibiarkan sehingga suhu larutan media
menurun hingga suhu 36- 37°C, lalu pH media diukur (4.5-5.5) jika pH media
kurang asam, ditambahkan asam tartat 10% kedalam media. Erlenmeyer ditutup
dengan kapas, kasa, dan kertas kopi, kemudian media disterilkan didalam
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit dengan tekanan dua atm. Kemudian
media dituangkan kedalam cawan petri dan dibiarkan hingga memadat
(Jamilatun et al., 2020).
3.2 Pengenceran Sampel
Pengenceran adalah sebuah cara untuk melarutkan atau melepaskan
mikroba dari substratnya ke dalam air, sehingga lebih mudah penanganannya.
Tujuan dari pengenceran untuk mengurangi kepadatan bakteri yang ditanam.
Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau
memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan
sehingga volume larutan menjadi berubah. Pengenceran sampel sangat penting
pada penanaman dan inokulasi mikroba (Afifi, 2016).
39
3.2.1 Ikan Asin
Timbang ikan asin sebanyak 1 gr
Masukan sampel ikan asin yang sudah dihitung ditimbang ke

dalam 10 ml larutan NaCl fisiologis
Homogenkan dengan vortex
Lakukan pengenceran 1 ml sampel ke dalam faktor

pengenceran lakukan sebanyak 3 kali dan homogenkan
Faktor pengenceran , , , masing-masing berisi

larutan NaCl fisiologis sebanyak 9 ml
Isolasi dengan menggunakan metode tuang sebanyak 0,1 ml

setiap faktor pengenceran yang dituang ke dalam cawan
petri
Inkubasi pada suhu ruang 25-27 selama 24 jam
Ambil koloni mikroba yang tumbuh tiap cawan
Gambar 6. Skema Kerja Pengenceran Sampel Ikan Asin (Fatiqin et al., 2019)
Tahap pertama dalam pengenceran ikan asin yaitu timbang ikan asin
sebanyak 1 gr. Lalu masukan sampel ikan asin yang sebelumnya sudah
ditimbang ke dalam 10 ml larutan NaCl fisiologis. Kemudian homogenkan dengan
menggunakan vortex. Lakukan pengenceran 1 ml sampel ke dalam faktor
pengenceran sebanyak 3 kali dan homogenkan kembali. Dari setiap faktor
pengenceran , , masing-masing berisi larutan NaCl fisiologis 9 ml.
Setelah itu sampel diisolasikan dengan menggunakan metode tuang sebanyak
40
0,1 ml ke dalam setiap faktor pengenceran yang dituangkan ke dalam cawan
petri. Kemudian proses inkubasi selama 24 jam dalam suhu ruang 25-27 .
Terakhir, ambil koloni mikroba yang tumbuh pada setiap cawan petri lalu dihitung
dengan menggunakan colony counter.
3.2.2 Air Limbah Ikan
Ambil sampel ikan dari tujuh titik
Ikan nila dan mujair dibersihkan isi perutnya lalu dicuci

dengan air mengalir sebanyak satu kali
Masing-masing ikan nila dan mujair diambil dagingnya pada

salah satu bagiannya kemudian dimasukan ke dalam plastik
HDPE steril
Variabel yang diamati pada penelitian ini adalah pengujian

angka lempeng total (ALT) dan Escherichia coli dengan
metode tabar
Setiap seri pengenceran diambil 0,1 ml lalu masukan ke

dalam cawan petri
Diratakan dengan spreader steril
Diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu ruang
Amati hasilnya
Gambar 7. Skema Kerja Pengenceran Sampel Air Limbah Ikan
(Ni’ma et al., 2014)
Teknik yang dilakukan dalam pengenceran sampel air limbah ikan yang
pertama yaitu mengambil sampel ikan dari tujuh titik. Dari setiap titik diambil
41
masing-masing 1 ekor ikan mujair dan nila sehingga total sampel sebanyak 7
ekor ikan nila dan mujair. Lalu ikan-ikan tersebut dibuang isi perutnya kemudian
dicuci sebanyak satu kali dengan air bersih. Selanjutnya dari tiap ikan nila dan
mujair diambil dagingnya pada salah satu bagian saja lalu dimasukan ke dalam
plastik HDPE yang steril. Setelah itu dihancurkan dan ditimbang. Dari sampel
tersebut diambil 5 gr untuk dilakukan analisis. Variabel yang diamati pada
penilitian yaitu ALT dan Escheriachia coli dengan menggunakan metode tebar.
Setiap seri pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml dan dimasukan ke dalam
cawan petri lalu diratakan dengan spreader yang sudah steril. Proses selanjutnya
yaitu inkubasi dengan menggunakan suhu ruang selama 1x24 jam lalu amati
hasilnya.
42
3.2.3 Terasi
Timbang 10 gr sampel terasi
Campurkan 2 L NaCl dan analisis dengan 124 gr agar MRS
Didihkan menggunakan hot plate kemudian tutup dengan

kapas dan kertas alumunium
Sterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121 selama

15 menit pada tekanan 1 atm
Lakukan pengenceran hingga
Masukan sampel pada pengenceran sampai lalu

tanam di cawan petri dan diinkubasi
Hitung jumlah koloni pada cawan petri
Kalikan jumlah bakteri dengan jumlah pengenceran
Gambar 8. Skema Kerja Pengenceran Terasi (Romadhon et al., 2018)
Pada pengenceran sampel terasi dilakukan dengan menimbang 10 gr
sampel tersebut lalu campurkan dengan 2 L NaCl dan selanjutnya dilakukan
analisis dengan agar MRS seberat 124 gr. Kemudian didihkan menggunakan hot
plate lalu tutup dengan menggunakan kapas dan kertas alumunium. Setelah itu
sterilkan pada tekanan 1 atm dan pada suhu 121 dengan menggunakan
autoklaf selama 15 menit. Selanjutnya encerkan hingga . Kemudian
masukan sampel pada pengenceran sampai lalu tanam di cawan petri
43
dan diinkubasi. Proses selanjutnya menghitung jumlah bakteri pada cawan petri
dengan mengalikan jumlah bakteri dengan jumlah pengenceran.
3.3 Metode Inokulasi
Dalam menanam suatu mikroba terdapat faktor-faktor yang perlu
diperhatikan yaitu nutrisi dan kebutuhan oksigen. Untuk menumbuhkan bakteri
anaerob dan aerob memerlukan cara yang berbeda. Berikut beberapa metode
yang digunakan untuk menginokulasi mikroba.
3.3.1 Metode Agar Miring
Buat media agar NA miring pada tabung reaksi secara duplo

dan siapkan biakan bakteri
Panaskan ose loop pada nyala api spiritus hingga membara
Panaskan leher tabung reaksi biakan bakteri pada nyala api

spiritus
Ambil satu ose biakan bakteri menggunakan ose loop
Goreskan secara zig-zag di atas permukaan agar
Panaskan ujung ose loop hingga membara dan bungkus

hasil inokulasi bakteri dengan plastik wrap
Simpan dalam etalase bakteri selama 24 jam dan amati

biakan bakteri yang tumbuh
Kalikan jumlah bakteri dengan jumlah pengenceran
Gambar 9. Skema Kerja Metode Agar Miring
44
Untuk melakukan teknik inokulasi metode agar miring pertama kita harus
menyiapkan biakan bakteri dan membuat media agar NA miring pada tabung
reaksi secara duplo. Lalu panaskan kawat ose pada nyala api spiritus hingga
memijar dan juga panaskan leher tabung reaksi biakan bakteri pada nyala api
spiritus. Kemudian ambil satu ose biakan bakteri dengan menggunakan ose loop
lalu goreskan secara zig-zag di atas permukaan agar. Selanjutnya panaskan
kembali ujung ose loop hingga membara dan hasil inokulasi bakteri tersebut
dibungkus dengan plastik wrap. Terakhir simpan bakteri dalam etalase selama
24 jam dan amati biakan bakteri yang tumbuh.
Cara pengujian metode agar miring yaitu pertama adalah nyalakan
bunsen untuk perlakuan aseptis, lalu siapkan biakan sample air selokan dan
medium agar miring yang baru. Ambil jarum ose dengan tangan kanan dan bakar
pada bunsen hingga memijar, dinginkan, kemudian ambil tabung biakan bakteri
dengan tangan kiri, buka tutup tabung kemudian bakar mulut tabung dengan
bunsen. Ambil bakteri dengan jarum ose lalu bakar kembali mulut tabung biakan
dan tutup, letakkan dengan tangan kiri, ambil medium agar miring baru dengan
tangan kiri, buka penutup dengan cara yang sama dengan sebelumnya dan
bakar mulut tabung reaksi pada bunsen. Masukkan jarum ose ke dalam tabung
medium, tanam bakteri dengan menggerakkan jarum ose secara zig-zag lalu
bakar mulut tabung medium dan tutup kembali. Kemudian bakar jarum ose
hingga memijar pada nyala api bunsen untuk mematikan bakteri (Moda, 2019).
Gambar 10. Metode Agar Miring (Kevin, 2019)
45
3.3.2 Metode Gores
Buat media agar NA miring pada tabung reaksi secara duplo

dan siapkan biakan bakteri
Panaskan ose loop pada nyala api spiritus hingga membara
Panaskan pinggiran cawan petri
Ambil satu ose biakan bakteri menggunakan ose loop
Goreskan secara kuadran di atas permukaan agar
Panaskan ujung ose loop hingga membara dan bungkus

hasil inokulasi bakteri dengan plastik wrap

biakan bakteri yang tumbuh
Gambar 11. Skema Kerja Metode Gores
Dalam melakukan metode gores hal pertama yang dilakukan adalah
menyiapkan biakan bakteri dan membuat media agar NA miring pada cawan
petri duplo. Lalu panaskan pinggiran cawan petri dan kawat ose pada nyala api
spiritus hingga memijar. Kemudian ambil satu ose biakan bakteri dengan
menggunakan ose loop lalu goreskan secara kuadran pada permukaan agar.
Selanjutnya panaskan kembali ujung ose loop hingga membara dan bungkus
hasil inokulasi bakteri tersebut dengan menggunakan plastik wrap. Selanjutnya
tahap terakhir yaitu menyimpan bakteri dalam etalase selama 24 jam dan amati
biakan bakteri yang tumbuh.
46
Cara pengujian metode gores yaitu pertama nyalakan Bunsen untuk
aspetis. Siapkan biakan Saccharomyces cerevisiae dan medium PDA di cawan
petri. Ambil jarum ose dan bakar pada bunsen hingga memijar, dinginkan. Ambil
tabung biakan, buka tutup, bakar mulut tabung dengan bunsen. Ambil bakteri
dengan jarum ose lalu bakar kembali mulut tabung biakan dan tutup dengan
penutupnya. Ambil medium agar, buka penutup cawan petri dan dilakukan dekat
dengan bunsen. Goreskan bakteri pada jarum ose pada medium agar dengan
arah zig-zag. Setelah goresan yang terakhir, bakar ose pada bunsen. Buat
kuadran goresan bakteri yang kedua, yang berasal dari goresan pertama.
Setelah selesai buat lagi kuadran berikutnya, hingga semuanya berjumlah 4
kuadran goresan. Setiap kali membuat kuadran baru, jarum ose dibakar pada
bunsen. Setelah selesai, bakar jarum ose untuk mematikan bakteri. Simpan
kultur bakteri pada inkubator pada posisi terbalik (Moda, 2019).
Gambar 12. Metode Gores (Kevin, 2019)
47
3.3.3 Metode Tebar
Buat media agar PCA miring pada cawan petri secara duplo
dan siapkan sampel terasi
Lakukan pengenceran pada sampel terasi hingga
Ambil 0,1 ml sampel terasi dan pengenceran
Panaskan pinggiran cawan petri dan masukan sampel ke

dalam cawan petri yang berisi media PCA secara duplo
Ratakan sampel menggunakan triangle
Bungkus dengan plastik wrap dan masukan cawan petri yang

telah diinokulasi ke dalam etalase bakteri dan inkubasi
selama 24 jam pada suhu 37
Gambar 13. Skema Kerja Metode Tebar
Untuk melakukan teknik inokulasi metode tebar dapat dilakukan dengan
menyiapkan sampel terasi dan dilanjutkan dengan membuat media agar PCA
miring pada cawan petri secara duplo. Lalu melakukan pengenceran terhadap
sampel terasi sampai . Kemudian dari pengenceran dan ambil
sebanyak 0,1 ml sampel terasi. Selanjutnya panaskan pinggiran cawan petri dan
masukan sampel tersebut ke dalam cawan petri yang sudah berisi media PCA
duplo. Ratakan sampel dengan menggunakan triangle dan bungkus dengan
menggunakan plastik wrap lalu masukan cawan petri yang telah diinokulasi ke
dalam etalase bakteri dan inkubasi pada suhu 37 selama 24 jam.
Tahapan pertama dalam teknik inokulasi tebar adalah menyiapkan
sampel lalu encerkan sampel tersebut dengan larutan NaCl fisiologis. Kemudian
inokulasikan sampel pada media PCA dengan menggunakan metode sebar.
48
Setelah itu sampel diinkubasikan selama 24 jam dan tahap terakhir yaitu
melakukan proses perhitungan terhadap bakteri yang akan diamati
menggunakan metode perhitungan bakteri (Damayanti et al., 2020).
Gambar 14. Metode Tebar (Kevin, 2019)
3.3.4 Metode Tuang
Masukan 1 ml sampel ikan asin pengenceran

menggunakan pipet serologis ke dalam cawan petri secara
duplo
Tuang media agar PDA steril pada cawan petri
Dihomogenkan dengan membentuk angka delapan
Bungkus hasil inokulasi bakteri dengan plastik wrap

spora jamur yang tumbuh
Gambar 15. Skema Kerja Metode Tuang
Dalam melakukan teknik inokulasi tuang hal pertama yang dilakukan
adalah memasukan sampel pengenceran ikan asin sebesar 1 ml dengan
menggunakan pipet serologis ke dalam cawan petri secara duplo. Lalu pada
49
cawan petri dituangkan media agar PDA steril lalu homogenkan dengan
membentuk angka delapan. Kemudian bungkus hasil inokulasi bakteri tersebut
dengan plastik wrap dan simpan pada etalase bakteri selama 72 jam lalu amati
spora jamur yang tumbuh.
Metode inokulasi tuang dapat dilakukan dengan menyalakan bunsen.
Kemudian menyiapkan sample yeast cair dan medium agar PDA. Lalu tuangkan
sample yeast cair ke dalam cawan petri secara duplo dengan menggunakan
pipet serologis. Selanjutnya tuang media agar PDA pada cawan petri lalu tutup
cawan petri tersebut. Setelah itu homogenkan dengan membentuk angka
delapan. Kemudian sterilkan sekitar cawan petri dan tahap terakhir yaitu simpan
pada inkubator dengan posisi yang terbalik (Moda, 2019).
Gambar 16. Metode Tuang (Kevin, 2019)
50
3.3.5 Metode Tusuk
Buat media agar PDA pada tabung reaksi secara duplo dan
siapkan biakan jamur
Panaskan ose jarum pada nyala api spiritus hingga membara
Ambil satu ose biakan bakteri menggunakan ose jarum
Tusukan dengan hati-hati pada agar, dimulai dari dasar

tabung
Dipanaskan ujung ose jarum kembali sampai membara
Bungkus hasil inokulasi dengan plastik wrap dan simpan

dalam etalase selama 72 jam
Gambar 17. Skema Kerja Metode Tusuk
Dalam melakukan metode inokulasi tusuk yang pertama kali dilakukan
adalah menyiapkan biakan jamur dan membuat media agar PDA secara duplo.
Kemudian panaskan jarum ose pada nyala api spiritus hingga membara. Lalu
ambil satu ose biakan materi dengan menggunakan ose jarum. Selanjutnya
tusukan pada media agar dari dasar tabung dengan hati-hati. Panaskan kembali
ujung ose jarum sampai membara. Dan bungkus hasil inokulasi dengan plastik
wrap lalu simpan selama 72 jam dalam etalase.
Alat dan bahan disiapkan terlebih dahulu lalu langkah selanjutnya adalah
batang ose dipanaskan pada api bunsen. Lalu kultur bakteri diambil
menggunakan batang ose jarum. Kemudian diinokulasikan pada media agar
tegak dengan cara tusuk. Ditusuk hingga setengah media. Lalu batang ose
dipanaskan kembali dan diinkubasi selama 24-48 jam (Idrus, 2021).
51
Gambar 18. Metode Tusuk (Sulthan, 2021)
52
4. PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Pada praktikum Mikrobiologi Dasar dengan materi Inokulasi Mikroba
dapat ditarik kesimpulan bahwa:
 Teknik inokulasi mikroba merupakan teknik yang digunakan untuk
mentransfer mikroba dari medium lama ke medium baru yang bertujuan
untuk mendapatkan kultur murni tanpa terjadinya kontaminasi dari mikroba
yang tidak diinginkan.
 Dalam proses mendapatkan kultur murni perlu menggunakan media tanam
mikroba diantaranya yaitu ada nutrient agar, plate count agar, potato
dextrose agar, lactose broth, nutrient broth, dan mueller hinton agar. Adapun
sampel yang bisa digunakan yaitu ikan asin, air limbah ikan, dan terasi.
 Ada banyak metode yang digunakan dalam proses inokulasi bakteri seperti
metode agar miring, metode tuang, metode tebar, metode tusuk, dan metode
gores.
4.2 Saran
Dikarenakan kondisi covid-19 ini maka kegiatan praktikum harus
dilakukan di rumah secara daring. Dengan ini diharapkan agar di tahun depan
praktikum dapat dilaksanakan secara offline di laboratorium sehingga para
praktikan dapat mengaplikasikan materi praktikum yang telah didapat.
53
DAFTAR PUSTAKA
Afifi, C., & Sugiarti, L. (2016). Analisis Mikrobiologis Jamu Tujuh Angin dan Sari
Asih PT. Jamu Air Mancur Surakarta dengan Metode ALT dan
AKK. Jurnal Keperawatan dan Kesehatan Masyarakat Cendekia
Utama, 5(2).
Astuti, L.A. (2014). Penuntun Praktikum Oral Biologi. Gowa. AGMA
Azhar, M. H., & Ulkhaq, M. F. (2017). Kelimpahan dan Keanekaragaman Bakteri
Pada pembenihan Ikan Lele (Clarias gariepinus) dengan Sistem Air
Tertutup (Close Water System). Journal of Aquaculture Science, 2(1),
81-89.
Badaring, D. R., & Bahri, A. (2020, October). IDENTIFIKASI MORFOLOGI
MIKROBA PADA RUANGAN WATER CLOSET JURUSAN BIOLOGI
UNIVERSITAS NEGERI MAKASSAR. In Seminar Nasional Biologi 1(1).
Damayanti, N. W. E., Abadi, M. F., & Bintari, N. W. D. (2020). PERBEDAAN
JUMLAH BAKTERIURI PADA WANITA LANJUT USIA BERDASARKAN
KULTUR MIKROBIOLOGI MENGGUNAKAN TEKNIK CAWAN TUANG
DAN CAWAN SEBAR. Meditory: The Journal of Medical
Laboratory, 8(1), 1-4.
Fatiqin, A., Novita, R., & Apriani, I. (2019). Pengujian Salmonella Dengan
Menggunakan Media SSA dan E. Coli Menggunakan Media EMBA
Pada Bahan Pangan. Indobiosains, 1(1). 26.
Fatmariza, M., Inayati, N., & Rohmi, R. (2019). Tingkat Kepadatan Media Nutrient
Agar Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus Aureus. Jurnal
Analis Medika Biosains (JAMBS), 4(2), 69-73.
Febrianto, J., Purwanto, M. Y. J., & Waspodo, R. S. B. (2016). Pengolahan Air
Limbah Budidaya Perikanan melalui Proses Anaerob Menggunakan
Bantuan Material Bambu. Jurnal teknik sipil dan lingkungan, 1(2), 83-90.
Hamami, L. P. (2020). Identifikasi Staphylococcus aureus Pada Ikan
Asin (Doctoral dissertation, STIKes Insan Cendekia Medika Jombang).
Hasrianti, H., Sukarti, S., Arwansyah, A., & Suhaeni, S. (2018). EFEKTIVITAS
EKSTRAK PANGSA KULIT BUAH DURIAN TERHADAP
PERTUMBUHAN BAKTERI BAU BADAN. Prosiding, 3(1).
Hayati, S. I. D. T. Pembuatan Media, Sterilisasi, dan Kultivasi Mikroba. Laporan
praktikum mikrobiologi kehutanan BW-3205.
Jamilatun, M., Azzahra, N., & Aminah, A. (2020). Perbandingan Pertumbuhan
Aspergillus fumigatus pada Media Instan Modifikasi Carrot Sucrose Agar
dan Potato Dextrose Agar. Jurnal Mikologi Indonesia, 4(1).
Kobayashi T, Kajiwara M, Wahyuni M, Kitakado T, Hamada-Sato N, Imada
C, Watanabe E. (2011). Isolation and characterization of halophilic
lactic acid bacteria isolated from “terasi” shrimp paste: a traditional
54
fermented seafood product in Indonesia. J. Gen. Appl. Microbiol
XLIX (I): 279-286.
Lilies, A. A. (2019). Penuntun Praktikum Oral Biologi. Gowa. AGMA
Moda, K. F. (2019). Inokulasi Bakteri pada Media Padat & Cair. Laporan
Praktikum Biologi. 6-11.
Ni’ma, N., & Widyorini, N. (2014). Kemampuan Apu-apu (Pistia SP.) Sebagai
Bioremediator Limbah Pabrik Pengolahan Hasil Perikanan (Skala
Laboratorium). Management of Aquatic Resources Journal
(MAQUARES), 3(4), 257-264.
Octavia, A., & Wantini, S. (2017). Perbandingan pertumbuhan jamur
Aspergillusflavus pada mediaPDA (Potato Dextrose Agar) dan media
alternatifdari singkong (Manihot esculenta Crantz). Jurnal Analis
Kesehatan, 6(2), 626.
PRATIWI, W. (2017). PERBEDAAN UJI KEPEKAAN BAKTERI Staphylococcus
aureus MENGGUNAKAN MEDIAMUELLER HINTONAGAR DAN
NUTRIENT AGAR TERHADAP ANTIBIOTIK ERITROMISIN,
VANCOMYSIN, DAN CHLORAMPHENICOL (Doctoral dissertation,
Universitas Muhammadiyah Semarang).
Romadhon, R., Rianingsih, L., & Anggo, A. D. (2018). Aktivitas antibakteri dari
beberapa tingkatan mutu terasi udang rebon. Jurnal Pengolahan Hasil
Perikanan Indonesia, 21(1), 68-77.
Sari, W. P. (2017). PERBEDAAN HASIL UJI KEPEKAAN Salmonella tyhpi
MENGGUNAKAN MUELLER HINTON AGAR DAN NUTRIENT AGAR
DENGAN ANTIBIOTIK Ampicillin, Ciprofloxacin dan Trimethoprim-
Sulfamethoxazole (Doctoral dissertation, Universitas Muhammadiyah
Semarang).
Syafira, A. F., Masyhudi, M., & Yani, S. (2019). Efektivitas Ekstrak Etanol Daun
Beluntas Pluchea Indica (L.) Less Terhadap Bakteri Saliva Secara In
Vitro. Odonto: Dental Journal, 6(2), 68-75.
Thohari, M. N., Pestariati, & Wisnu, I. (2019). Pemanfaatan tepung kacang hijau
(vigna radiata L.) sebagai media alternatif na (nutrient agar) untuk
pertumbuhan bakteri escherichia coli. Analisis Kesehatan Sains. 8(2),
725-737.
Wahyuningsih, N., & Zulaika, E. (2019). Perbandingan Pertumbuhan Bakteri
Selulolitik pada Media Nutrient Broth dan Carboxy Methyl Cellulose.
Jurnal Sains dan Seni ITS, 7(2), 36-38.
Wati, R. Y. (2018). Pengaruh pemanasan media Plate Count Agar (PCA)
berulang terhadap uji Total Plate Count (TPC) di Laboratorium Mikrobiogi
Teknologi Hasil Pertanian Unand. J. Teknologi dan Manajemen
Pengelolaan Laboratorium, 1(2), 44-47.
Rahayudan, L., & Kusmawati, W. (2018, September). KONTAMINASI
Escherichia coli AIR MINUM ISI ULANG PADA DEPOT AIR MINUM DI
KOTA MALANG. In Prosiding Seminar Nasional Hayati (Vol. 6, pp. 179-
182).
55
LAMPIRAN
56
MATERI 3
Perhitungan Mikroba

MALANG
2021
57
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Menurut Wibowo (2016), keberadaan mikroorganisme dalam bahan
pangan menjadi salah satu indikator mutu dan daya simpan produk yang dapat
dilihat dari jumlah dan jenis mikroorganisme yang terdapat didalamnya.
Pengukuran jumlah mikroorganisme secara tepat penting dilakukan sebagai
dasar analisis mikrobiologi bahan pangan. Perhitungan jumlah mikroorganisme
pada praktikum kali ini dilakukan dengan menghitung jumlah sel dengan Metode
Total Plate Count (TPC), Most Probable Number (MPN), Mc Farland, dan
Hemocytometer
Metode Total Plate Count (TPC) menurut Nunik dan Junianto (2012),
merupakan metode yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme
yang ada dalam sampel, metode ini dikenal dengan metode ALT (Total Plate).
TPC memberikan pengetahuan tentang kualitas dan kebersihan bahan secara
keseluruhan, tetapi metode ini memiliki kemampuan terbatas untuk
mengidentifikasi sumber kontaminasi mikroba. Prinsip dari metode ini, yaitu
menumbuhkan sel-sel mikroba yang hidup pada media, selanjutnya
mikroorganisme tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang
dapat dilihat secara langsung, kemudian dihitung dengan mata telanjang tanpa
perlu dikeluarkan. Metode TPC dapat dibedakan menjadi 2 cara, yaitu metode
tuang dan metode permukaan. Adapun juga Menurut Harti (2015), memaparkan
mengenai metode kedua, yaitu metode MPN dimana adalah metode yang
menggunakan data pertumbuhan mikroba cair spesifik dalam rangkaian tabung
yang dikultur dari sampel padat atau cair untuk mendapatkan kisaran jumlah
mikroba dalam perkiraan terdekat. Metode selanjutnya adalah metode Mc
58
Farland yang menurut Haris et al. (2013), standard Mc Farland adalah
penyetaraan konsentrasi mikroba dengan menggunakan larutan BaCl21% dan
H2SO4 1%. Standar Kekeruhan MC Farland dimaksudkan untuk menggantikan
jumlah bakteri satu-satu dan memperkirakan kepadatan sel untuk digunakan
dalam prosedur pengujian antibiotik. Standar MC Farland dapat digunakan untuk
menentukan perkiraan konsentrasi sel dalam suspensi atau larutan. Perkiraan
hasil konsentrasi diberikan dalam satuan CFU/mL, dan standar ini digunakan
untuk mengukur konsentrasi bakteri Gram-negatif seperti Elasmobranchi coli.
Setiap koloni yang tumbuh dan berasal dari satu sel dapat disebut dengan
pertumbuhan mikroorganisme. Penyebaran materi dapat diketahui dengan cara
menghitung jumlah koloni yang ada pada suatu bahan. Berbagai cara dapat
dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan,
tergantung pada jenis mikroba dan bahannya. Terdapat 2 macam cara
perhitungan jumlah mikroba/bakteri, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak
langsung. Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba
dihitung secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup, sedangkan
perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung
secara keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk
menentukan jumlah mikroba yang hidup saja, hal ini didasarkan pada cara-cara
yang dilakukan.
Maksud dari melakukan praktikum Mikrobiologi Dasar materi Perhitungan
Mikroba, yaitu supaya praktikan mampu menguasai berbagai metode
perhitungan mikroba baik secara langsung maupun tidak langsung.
59
Tujuan dari Perhitungan Mikroba materi 3 yaitu:
a. Praktikan mampu mengetahui dan menguasai skema kerja dan cara
perhitungan mikroba dengan metode TPC (Total Plate Count).
b. Praktikan mampu mengetahui dan menguasai skema kerja dan cara
perhitungan mikroba dengan metode MPN (Most Probable Number).
c. Praktikan mampu mengetahui dan menguasai skema kerja dan cara
perhitungan mikroba dari metode Mc Farland.
e. Praktikan mampu mengetahui dan menguasai skema kerja dan cara
perhitungan mikroba dengan metode Hemasitometer.
1.3 Waktu Dan Tempat
Waktu praktikum Mikrobiologi Dasar materi Perhitungan Mikroba
dilaksanakan pada hari Selasa tanggal 30 November 2021 pukul 16.30 - 17.30
WIB. Tempat praktikum Mikrobiologi Dasar materi Perhitungan Mikroba
dilaksanakan di rumah masing-masing atau daring melalui google meet.
60
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Metode Perhitungan Mikroba

2.1.1 Metode TPC (Total Plate Count)
Metode Total Plate Count (TPC) merupakan metode yang digunakan
untuk menghitung jumlah mikroba yang terdapat dalam satu sample atau
sediaan, metode ini biasanya juga disebut degan metode ALT (Angka Lempeng
Total). TPC memberikan gambaran tentang kualitas dan hygiene suatu bahan
secara keseluruan, akan tetapi metode ini memiliki kemampuan yang terbatas
dalam mengidentifikasi sumber kontaminasi bakteri. Prinsip dari metode ini
adalah menumbuhkan sel mikroorganisme yang masih hidup pada medium,
kemudian 15 mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni
yang dapat dilihat langsung, selanjutnya akan dihitung menggunakan colony
counter dan dimasukkan pada rumus (Nunik & Junianto, 2012).
Dengan analisis TPC (Total Plate Count) menurut Putri et al. (2019),
analisis dengan TPC (Total Plate Count) dilakukan untuk pertumbuhan koloni
bakteri dengan cara menimbang 10 gram sampel, kemudian memasukkannya ke
dalam larutan pepton dalam larutan kerucut 90 ml, dan kemudian dihomogenisasi
dengan shaker. Operasikan selama 3 jam pada suhu kamar dengan kecepatan
150 rpm selama 24 jam untuk mendapatkan pengenceran 10-1. Kemudian ambil
1 ml kadar pengenceran 10-1 ini, masukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9
ml pepton, kemudian dihomogenkan dengan kecepatan pengenceran 10-2.
Begitu seterusnya, hingga pengenceran mencapai 10-7, lalu 10-1 hingga 10-7,
ambil 1 ml masing-masing pengenceran menggunakan metode penuangan untuk
memasukkannya ke dalam cawan petri untuk ditanam, lalu tuangkan hingga 20
ml. dari media NA, kemudian pindahkan pelat sesuai angka 8 untuk
61
homogenisasi.
2.1.2 Metode MPN (Most Probable Number)
Metode perhitungan sel terutama untuk perhitungan bakteri coliform yang
didasarkan oleh jumlah perkiraan terdekat, dimana perkiraan terdekat yaitu
didapat dari perhitungan dalam range tertentu disebut dengan metode Most
Probable Number (MPN). Dihitung sebagai nilai duga dekat secara statistik
dengan merujuk pada tabel MPN (Most Probable Number) dikutip dari Hartanti
(2015). Adapun menurut Sari dan Apridamayanti (2014), MPN (Most Probable
Number) adalah metode pencacahan mikroorganisme yang menggunakan data
di hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cairan khusus dalam
rangkaian implan dari sampel padat atau cair yang ditanam menurut jumlah
sampel atau setelah pengenceran menurut level seri tabung Menghasilkan
serangkaian mikroorganisme uji dengan nilai MPN (Most Probable Number) / unit
volume Atau kualitas sampel. Coliform adalah sekelompok bakteri yang
digunakan sebagai indikator keberadaan polusi, kotoran dan kondisi sanitasi
tidak baik untuk air, makanan, susu dan Produk susu. Keberadaan coliform ini
bisa terdeteksi dengan pengujian mikrobiologi menggunakan metode MPN (Most
Probable Number). Adapun perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung
reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada
suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan
mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil
(tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik
yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan
menggunakan 3 atau 5 seri tabung.
Nilai maksimum angka probabilitas tertinggi Most Probable Number
(MPN) ialah 0/100ml yang merupakan sampel yang dianalisis. Menurut Sunarti
62
(2015), pemeriksaan MPN untuk memeriksa kualitas air minum, air pemandian
umum, air PDAM, air bersih, air badan, dan pemeriksaan jumlah bakteri pada air
kolam renang. Dimana air yang layak diminum ialah wajib air sehat yang harus
memenuhi pengawasan dan persyaratan kualitas air minum sesuai ketetapan
Kepengawasan Menteri Kesehatan Republik Indonesia
No.907/MenKes/SK/VII/2002. Adapun juga kualitas air wajib memenuhi
persyaratan fisik, bakteriologis.
2.1.3 Metode Mc Farland
Menurut Haris et al. (2013), standard Mc Farland adalah penyetaraan
konsentrasi mikroba dengan menggunakan larutan BaCl 21% dan H2SO4 1%.
Standar Kekeruhan MC Farland dimaksudkan untuk menggantikan jumlah bakteri
satu-satu dan memperkirakan kepadatan sel untuk digunakan dalam prosedur
pengujian antibiotik. Standar MC Farland dapat digunakan untuk menentukan
perkiraan konsentrasi sel dalam suspensi atau larutan. Perkiraan hasil
konsentrasi diberikan dalam satuan Cfu/mL, dan standar ini digunakan untuk
mengukur konsentrasi bakteri Gram-negatif seperti Escherichia coli.
Menurut Dalynn (2014), prosedur pembuatan larutan standar McFarland
yaitu terlebih dahulu untuk menambahkan BaCl2, setelah itu kemudian
menambahkan H2SO4 ke sesuai dengan komposisi skala standard Mc Farland,
lalu mengaduk larutan dan menutupi dengan aluminium foil dan menyimpannya
pada suhu kamar. Skala standard Mc Farland yang digunakan adalah 0,5
dengan komposisi 0,05 ml 1% BaCl 9,95 ml H2SO 1 dengan perkiraan jumlah
bakteri dalam suspensi 1,5 × 108 CFU/ml dan absorbansi adalah (Kerapatan
Optik) 0,8 sampai 1.
63
2.1.4 Metode Hemocytometer
Metode perhitungan secara mikroskopis yang bertujuan untuk
menghitung mikroba atau yang biasa disebut dengan metode hemacytometer
menurut Mikapin. (2012), yaitu adalah metode atau suatu alat yang dapat
digunakan dan memiliki fungsi untuk melakukan perhitungan sel dengan cepat
juga dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah.adalah metode
perhitungan secara mikroskopis yang bertujuan untuk menghitung mikroba
atau biasa juga disebut suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan
perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang
rendah. Sel bakteri tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung sehingga
jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui. Adapun ruang hitung
tersebut sendiri terdiri atas 9 buah kotak besar dengan luas 1 mm², lalu
terdapat satu kotak besar ditengah yang dibagi menjadi 25 kotak sedang
dengan panjang 0,05 mm. Kemudian juga satu kotak sedang yang dibagi lagi
menjadi 16 kotak kecil, Dimana dengan penjelasan tersebut dapat diketahui
satu kotak besar tersebut terdiri dari 400 kotak kecil. Ditambahkan menurut
Sardjito et al. (2013) bahwasanya alat hemacytometer merupakan terobosan
besar terutama di bidang Kesehatan atau medis. Dimana walaupun alat
hemacytometer ini tergolong gold standart untuk mengitung sperma karena alat
ini sering disebut sebagai standar untuk menghitung konsentrasi sperma,
namun alat ini juga memiliki kekurang. Contohnya dikarenakan alat ini bekerja
secara manual dan hasil perhitungannya juga tergantung dari skill operatornya,
maka membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mengitung kosentrasi
sperma.
Kemudian pada metode hemacytometer ini pula, menurut Azizah et al.
(2015) dengan bantuan mikroskop, dihitunglah eritrosit pada metode ini.
64
Adapun cara untuk melakukan perhitungan jumlah mikroba menggunakan
metode hemacytometer ini dilakukan dengan langkah pertama, yaitu
meneteskan sampel mikroba dalam bagian parit melintang haemocytometer,
selanjutnya ditutup oleh cover glassnya, kemudian sampel yang diteteskan
sebelumnya harus telah disuspensi dan dicampur dengan zat pewarna trypan
blue menggunakan pipet. Adapun kekurangan dari metode haemocytometer
ialah hasil perhitungan bersifat subjektif, prosesnya berlangsung lama, serta
dapat terjadi kekeliruan volumetrik karena kesalahan saat menggunakan pipet
pada sampel dan peletakan kaca penutup. Selain kekurangan, terdapat
kelebihan pada metode haemocytometer, yaitu perhitungan sel dengan
menggunakan haemocytometer adalah dapat menghitung jumlah sel yang
hidup maupun yang sudah mati, tergantung dari tipe pewarna yang digunakan
secara tepat. Untuk penjabaran lebih rinci yaitu menurut Saadah et al. (2020)
persiapan yang dibutuhkan menggunakan alat haemocytometer ialah yang
pertama dibuatnya media pertumbuhan sel dari campuran media CD optiCHO
96% dan L-glutamin 4% dalam media 100 mL. Adapun media CD optiCHO
digunakan untuk jenis suspensi kultur sel,dimana berbentuk cair, mengandung
buffer natrium bikarbonat dan aditif natrium piruvat, tanpa serum, glutamin dan
antibiotik. Kemudian diwaktu yang sama, L-glutamin adalah asam amino yang
dibutuhkan kultur sel. Lalu pindahkan sel ke media baru. Langkah selanjutnya
ialah, sel dengan triptofan biru dengan rasio kontras 0,4% menggunakan alat
haemocytometer digunakan untuk menghitung, yaitu 25 μl sel CHO-DG44 dan
25 μl triptofan biru. Jika viabilitas sel 80-100%, sel tersebut akan berfusi. Hasil
akhir ialah genotipe dan fenotipe dalam populasinya konsisten karena sel
dengan laju pertumbuhan tertinggi di erlenmeyer akan mendominasi
pertumbuhan.
65
3. METODELOGI
3.1 Pembuatan Media Tanam
Media tanam mikroba merupakan suatu komponen yang utama dan
diperlukan saat hendak melaksanakan kegiatan penanaman mikroba pada
sampel uji.
3.1.1 LB (Lactose Broth)
Ditimbang media LB yang dibutuhkan
Diukur aquades yang dibutuhkan
Dihomogenkan media dan aquades di

erlenmeyer
Diambil 9 ml dalam pipet volume dan masukkan ke dalam

tabung reaksi
Masukkan durham dan tutup dengan kapas serta wrap
Gambar 19. Skema Kerja Pembuatan Media LB
Skema kerja pada pembuatan media tanam LB (Lactose Broth) dimulai
dengan proses menimbang media LB yang dibutuhkan, lalu mengukur
aquades yang dibutuhkan, kemudian dihomogenkan media dan aquades di
66
dalam erlenmeyer, selanjutnya ambil 9 ml dengan pipet volume masukkan
kedalam tabung reaksi, setelah itu masukkan durham dan tutup dengan kapas
serta wrap, dilanjut masukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian masukkan
durham dan tutup dengan kapas dan wrap. Tabung durham berfungsi sebagai
indikator ada tidaknya gas yang terbentuk. Selanjutnya sterilisasikan dengan
menggunakan autoklaf selama 15 menit. Autoklaf sendiri berfungsi untuk
melakukan sterilisasi basah dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm (0,15
MPa) selama 15- 20 menit. Setelah itu proses sterilisasi akan didapatkan
media yang steril.
Menurut Sukawaty et al. (2016), diawali dengan proses menimbang LB
sebanyak 10.4 g, lalu ukur aquades sebanyak 800 mL, masukkan LB yang
telah ditimbang ke dalam erlenmeyer. Kemudian masukkan aquadestilata
sebanyak 800 mL dan masukkan magnetic stirrer ke dalam erlenmeyer, lalu
homogenkan di atas hot plate. Selanjutya masukkan tabung durham ke dalam
160 tabung reaksi secara terbalik, lalu masukkan larutan LB ke dalam 160
tabung reaksi dengan menggunakan pipet volume, dimana setiap tabung
reaksi berisi 5 mL larutan LB. Setelah itu, tutup setiap tabung reaksi dengan
menggunakan kertas aluminium, lalu ikat tabung reaksi menjadi satu ikatan,
dan disterilkan dengan menggunakan autoclave selama ± 15 menit.
67
3.1.2 NB (Nutrient Broth)
Adapun pembuatan media NB (Nutrient Both) pada praktikum
Mikrobiologi Dasar dilaksanakan dengan tahapan sebagai berikut:
Ditimbang media NB yang dibutuhkan
Dihomogenkan NB dan aquades di erlenmeyer
Diambil 9 ml menggunakan pipet volume dan masukkan ke

dalam tabung reaksi
Tutup tabung reaksi menggunakan kapas dan plastic wrap
Media disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu

121⁰C
Media ditunggu sampai turun suhunya
Gambar 20. Skema Kerja Pembuatan Media NB
Berdasarkan skema kerja diatas, skema kerja pembuatan media
tanam Nutrient Both (NB) diawali dengan cara menimbang media NB yang
dibutuhkan, lalu dilanjutkan dengan mengukur aquades yang berfungsi sebagai
pelarut, setelah itu menghomogenkan NB dan aquades di erlenmeyer, dilanjut
dengan mengambil 9 ml larutan hasil penghomogenan dengan menggunakan
pipet volume lalu memasukkannya ke dalam tabung reaksi, lalu tutup tabung
reaksi menggunakan kapas dan plastic wrap, kemudian sterilisasi media dalam
68
autoklaf selama 14 menit pada suhu 12⁰C dan tunggu sampai media turun
suhunya.
Pembuatan media tanam Nutrient Broth (NB) Menurut Mulyadi et al.
(2017), digunakan sebagai media pembiakan bakteri. Ditambahkan menurut
Nuyanti et al. (2016), bahwasanya untuk pembuatan media tanam Nutrient
broth (NB) diawali dengan proses menimbang dengan kadar 3,25 gram NB lalu
diambahkan dengan 250 ml aquades dan selanjutnya diambil media NB yang
telah dibuat sebanyak 30 ml. Langkah selanjutnya menyetarakan ose dengan
kekeruhan larutan standar Mc Farland dengan cara menambahkan jamur
Candida Albicans sebanyak 5 ose. Kemudian, kocok dan vortex agar
tercampur secara merata dan menginkubasinya selama 24 jam dengan suhu
37°C. Pengamatan ini dilaksanakan setelah 24 jam berlalu dan pada media NB
yang diinokulasi tersebut, bakteri terlihat keruh dimana menunjukkan adanya
pertumbuhan bakteri dalam Nutrient Broth (NB).
69
3.2 Skema Kerja Metode
Pada praktikum Mikrobiologi Dasar tentang materi Perhitungan Mikroba.
Metode TPC dapat dilakukan dengan cara seperti berikut:
Diambil hasil inkubasi bakteri inokulasi tebar
Hitung dengan colony counter dan catat hasilnya untuk dihitung

menggunakan rumus SNI
Gambar 21. Skema Kerja Metode TPC
Skema kerja metode TPC (Total Plate Count) memiliki 3 tahapan. Tahap
pertama, yaitu pengambilan hasil inkubasi bateri inokulasi tebar. Tahap kedua,
yaitu menghitung dengan colony counter. Tahap ketiga, yaitu mencatat hasilnya
untuk dihitung menggunakan rumus SNI.
Menurut Yusmita et al. (2018), bahwa pemeriksaan kelipahan bakteri
menggunakan metode perhitungan cawan (TPC) dengan menggunakan media
PCA (Plate Count Agar). PCA sendiri memiliki arti yaitu media pertumbuhan
mikroorganisme yang sering digunakan untuk melakukan perhitungan jumlah
bakteri. Pembuatan media PCA yakni dengan menimbang media PCA sebanyak
22,5 gram, setelah ditimbang dimasukkan kedalam tabung erlemenyer.
Kemudian menambahkan dengan akuades sekitar 1.000 ml, setelah
ditambahkan akuades, tutup lah mulut tabung erlemenyer menggunakan
aluminium foil. Selanjutnya homogenkan media dengan menggunakan hotplate
magnetic stirrer. Menurut Hartati (2013) perhitungan jumlah bakteri yang
dilakukan pada cawan mengandung 25 sampai 250 koloni bakteri sesuai SNI 01-
2332.3-2006 tentang pengujian angka lempeng total. Ketika sudah didapatkan
70
hasil dari perhitungan jumlah bakteri tersebut dimasukkan kedalam rumus
perhitungan TPC menurut SNI:
∑C
N=
[(1 x n1) + (0,1 x n2)] d
Keterangan:
N = Jumlah koloni
(Koloni/ml)
Perhitungan TPC juga
∑C = Jumlah koloni
pada seuma mempunyai persyaratan:
cawan yang
dihitung  Jumlah koloni antara 25
n1 = Jumlah cawan hingga 250 koloni

pada
pengenceran  Tidak TBUD
1 yang dapat
dihitung  Tidak Spreader
n2 = Jumlah cawan
 Rasional.
pada
pengenceran
2 yang dapat
dihitung
d = Pengenceran
1 yang dapat
dihitung
71
Sampel air limbah ikan
Pengenceran bertingkat hingga 10-3
Pindahkan larutan dengan menggunakan pipet steril sebanyak 1

mlkemsetiap tabung LB berisi tabung durham dalam 3 seri dan
5 seri
Inkubasi tabung-tabung selama 48 jam pada suhu 35°C tabung

positif ditandai dengan kekeruhan dan gelembung dalam tabung
durham
Tentukan angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan

jumlah tabung-tabung LB yang positif dengan menggunakan
Angka Paling Memungkinkan (APM) nyatakan angkanya sebagai
“APM/g coliform”
Gambar 22. Skema Kerja Metode MPN
Skema kerja pada metode MPN (Most Probable Number) diawali
dengan proses pembuatan media LB (Lactose Broth) kemudian dilanjutkan
dengan pengujian MPN (Most Probable Number). Pembuatan media LB diawali
dengan proses menimbang media LB yang dibutuhkan. Kemudian mengukur
aquades yang akan digunakan. Selanjutnya homogenkan media dan aquades
dalam erlenmeyer. Lalu ambil 9 ml hasil penghomogenan dengan
menggunakan pipet volume. Setelah itu masukkan kedalam tabung reaksi.
Kemudian masukkan durham dan tutup dengan kapas dan wrap. Tabung
durham berfungsi sebagai indikator ada tidaknya gas yang terbentuk.
Selanjutnya sterilisasikan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit.
Autoklaf berfungsi untuk melakukan sterilisasi basah dengan suhu 121oC dan
tekanan 1 atm (0,15 MPa) selama 15-20 menit.
72
Pengujian MPN diawali denn proses penyiapan sampel air limbah ikan.
Kemudian dilakukan pengenceran bertingkat hingga 10-3. Lalu pindahkan
larutan dengan menggunakan pipet steril sebanyak 1 ml ke setiap tabung LB
yang berisi tabung durham dalam 3 seri dan 5 seri. Selanjutnya inkubasi
tabung-tabung selama 48 jam pada suhu 35°C, tabung positif ditandai dengan
kekeruhan dan gelembung dalam tabung durham. Setelah itu tentukan Angka
Paling Memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung LB yang
positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM), lalu
nyatakan angkanya sebagai “APM/g coliform”. Pengujian ada tidaknya coliform
dengan MPN (Most Probable Number) menurut Putri dan Kurnia (2018),
dilakukan dengan cara uji praduga (Presumtif Test) antara lain menyiapkan
sampel sebanyak 100 ml secara steril. Lalu dihomogenkan dengan cara
mengocoknya sebanyak 25 kali. Setelah itu masukkan masing-masing sampel
10 ml, ke dalam 3 tabung reaksi yang masing- masing berisi Lactosa Broth.
Kemudian masukkan masing-masing 1 ml sampel ke dalam 3 tabung reaksi
yang masing-masing berisi Lactosa Broth. Lalu masukkan masing-masing 0,1
ml sampel ke dalam 3 tabung reaksi yang masing- masing berisi Lactosa Broth.
Setelah itu inkubasi semua tabung pada suhu 37°C selama 2x24 jam.
Kemudian amati terbentuknya gas. Lalu catat jumlah tabung reaksi yang
terbentuk gas (positif terdapat gas) pada tiap seri tabung (10 ml, 1ml, 0,1 ml).
Setelah itu tentukan nilai MPN.
73
Sterilisasi dengan autoklaf
Sterilisasi dengan autoklaf
Dibiarkan sampai dingan
Inokulasikan 1 ose biakan bakteri
Inkubasi selama 24 jam
Hasil inkubasi dibandingkan dengan standart Mc Farland
Gambar 23. Skema Kerja Metode Mc Farland
Berdasarkan skema kerja diatas, metode ini dilakukan dengan cara
media NB dimasukkan ke tabung reaksi, dilanjut sterilisasi dengan autoklaf dan
dibiarkan sampai dingin, lalu inokulasikan 1 ose biakan bakteri dan inkubasis
selama 24 jam, kemudian hasil inkubasi dibandingkan dengan standart
McFarland.
Menurut Febrianti et al. (2019), Pembuatan Standar Mc. Farland 9,95
ml H2SO4 1% ditambah 0,05 ml BaCl2 1% dicampur dan homogenkan.
kekeruhan suspensi bakteri uji samakan kekeruhan suspensi standar Mc.
Farland 0,5. Mc. Farland dimaksudkan untuk menggantikan perhitungan
bakteri satu per satu dan untuk memperkirakan kepadatan sel yang akan
digunakan pada prosedur pengujian antimikroba.
74
3.2.4 Metode Hemocytometer
Hasil Inkubasi
Masukkan twin 80 10% sebanyak 2 ml ke media PDA
Putar angka 8 selama 2 menit
Ambil 1 ml dengan piper serologis
Masukkan ke Na-Fis steril 9 ml sebagai pengenceran 10-1
Masukkan ke Hemositometer
Lakukan pengenceran 10-3
Perhitungan jumlah spora
Gambar 24. Skema Kerja Metode Hemasitometer
Berdasarkan skema kerja diatas, metode hemocytometer diawali
dengan adanya proses penyiapan hasil inkubasi dengan cara memasukkan
twin 80 10% sebanyak 2 ml ke media PDA, yang mana twin 80 berfungsi untuk
melarutkan spora dalam media PDA dan adapun PDA sendiri berfungsi
sebagai media penanaman bakteri. Selanjutnya putar angka 8 selama 2 menit,
lalu ambil 1 ml dengan piper serologis, kemudian masukkan ke Na-Fis steril 9
ml sebagai pengenceran 10-1. Adapun Na-Fis steril berfungsi sebagai
pengencer bertingkat. Langkah selanjutnya lakukan pengenceran 10-3 dan
diakhiri dengan memasukkannya ke hemositomer lalu hitung jumlah sporanya.
Pada metode ini yang dipaparkan menurut Setyahadi dan Puji (2012),
75
dengan bantuan mikroskop sampel diletakkan pada suatu ruang hitung dan
jumlah bakteri dapat dihitung langsung. Adapun ruang hitung pada
hemocytometer terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm2, satu kotak
besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang x lebar = 0,2
x 0,2 mm. Lalu pada satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil.
Dengan deskripsi demikian maka satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak
kecil. Dimana kedalaman ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang
tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut, sehingga jumlah
bakteri per satuan volume dapat diketahui.
76
4. PEMBAHASAN
4.1 Data Hasil Perhitungan Praktikum
Setelah dilakukannya praktikum Mikrobiologi Dasar 2021, maka dapat
diperoleh hasil dari perhitungan menggunakan metode TPC (Total Plate Count),
metode MPN (Most Probable Number), metode Mc Farland, dan menggunakan
metode Hemositometer.
Prinsip dari metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TCP)
adalah menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada media agar,
sehingga mikroba akan berkembangbiak dengan membentuk koloni yang dapat
dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
Contoh sampel yang dipakai adalah produk sambal terasi.
Tabel 2. Data Hasil Perhitungan TPC
Sampel Kode Jumlah Koloni Bakteri Hasil

10-4 10-5 TPC
Terasi 1 A TBUD 216 214.5 x 106
Cfu/ml
B TBUD 213
Terasi 2 A SP 224 159 x 106
Cfu/ml
B TBUD 159
Terasi 3 A SP 224 159 x 106
cfu/ml
B EROR 159
Terasi 4 A SP 141 1.10 x 106
cfu/ml
B 110 SP
Pengujian menggunakan metode TPC (Total Plate Count) menggunakan
sampel 4 terasi secara duplo yaitu kode A dan B dengan masing-masing
77
pengenceran 10-4 dan 10-5. Pada sampel Terasi 1 dengan pengenceran
10-4 kode A dan B jumlah koloni bakterinya TBUD (Terlalu Banyak Untuk
Dihitung), dan pada pengenceran 10-5 kode A dan B jumlah koloni bakterinya
adalah 216 dan 213, sehingga didapatkan hasil TPC sebesar 214.5 × 106
cfu/ml. Pada sampel Terasi 2 dengan pengenceran 10-4 kode A dan B jumlah
koloni bakterinya adalah SP (spreader) dan TBUD, sehingga tidak dapat
dihitung karena tidak memenuhi syarat perhitungan TPC. Sedangkan pada
pengenceran 10-5 kode A dan B jumlah koloni bakterinya adalah 224 dan 159,
sehingga didapatkan hasil TPC sebesar 159 x 106 cfu/ml. Pada sampel Terasi 3
pengenceran 10-4 kode A dan B jumlah koloni bakterinya tidak memenuhi
syarat. Perlakuan yang digunakan adalah Perhitungan TPC karena SP terletak
diatas. Sedangkan pada pengenceran 10-5 kode A dan B jumlah koloni
bakterinya adalah 224 dan 159, sehingga didapatkan hasil TPC sebesar 159 x
106 cfu/ml. Pada sampel Terasi 4 dengan pengenceran 10-4 kode A dan B
jumlah koloni bakterinya adalah SP dan 110. Sedangkan pada pengenceran 10-
5
kode A dan B jumlah koloni bakterinya adalah 141 dan SP, sehingga
didapatkan hasil TPC sebesar 1.10 x 106 cfu/ml. Dengan demikian, dapat
disimpulkan bahwa sampel terasi dengan jumlah koloni bakteri tertinggi adalah
Terasi 1 dengan nilai TPC sebesar 214.5 x 106 cfu/ml, sedangkan sampel terasi
dengan jumlah koloni bakteri terendah adalah Terasi 4 dengan nilai TPC
sebesar 1.10 x 106 cfu/ml.
78
Pemeriksaan mikrobiologis air sangat diperlukan untuk mencegah
timbulnya pencemaran terhadap air yang dikonsumsi oleh manusia. Salah satu
metode yang sering digunakan yaitu Most Propable Number Method (MPN).
MPN merupakan suatu metode tabung fermentasi yang dapat digunakan untuk
mendeteksi adanya bakteri pada air. Berikut perhitungan mikroba
menggunakan metode MPN (Most Probable Number) didapatkan hasil sebagai
berikut:
Tabel 3. Data Hasil Perhitungan MPN

Jumlah Gelembung
Sampel Kode
APM
A 3 1 >5
Air
B 1 5 1
74 APM/g
Limbah
C 3 1 1
Pada , jumlah gelembung pada kode A = 3, B = 1, dan C = 3. Nilai
APM adalah nilai yang lebih dominan dari ketiga kode. Jadi, nilai APM di
adalah 3, hal ini dikarenakan nilai yang dominan adalah 3 yang ditunjukkan
pada sampel kode A dan C menunjukkan jumlah gelembung yang sama.
Kemudian, pada banyak gelembung pada kode A = 1, B = 5, dan C = 1.
Jadi, nilai APM sebesar 1, hal ini dikarenakan nilai yang dominan pada
sampel kode A dan C menunjukkan jumlah gelembung yang sama. pada
banyak gelembung pada kode A >5, B = 1, C = 1. Oleh karena itu, nilai APM
dari dipastikan bernilai 1. Dari tabel seri 3, dapat ditarik kesimpulan
bahwa nilai APM nya berturut-berturut yaitu 3, 1, 1. Maka hasil akhirnya adalah
74 APM/gram.
79
Penyetaraan konsentrasi mikroba dengan menggunakan larutan
BaCl21% dan H2SO4 1% disebut dengan metode Mc Farland. Standar Mc
Farland secara umum berlabel 0,5–10 dan berisi larutan garam Barium.
Gambar 25. Standar Mc Farland
Gambar 26. Air Sampel
Didapatkan hasil seperti pada Gambar 25 dan Gambar 26 pada
praktikum Mikrobiologi Dasar materi Perhitungan Mikroba menggunakan metode
Mc Farland dari Standar McFarland diatas. Metode Mc Farland sendiri dapat
digunakan untuk mengetahui konsentrasi sel dalam suatu suspensi secara
visual. Adapun jika dibandingkan dengan standar Mc Farland Pada Gambar 25
80
dan biakan bakteri sampel air pada Gambar 26, mempunyai tingkat kekeruhan
yang sama dengan standar Mc Farland No.1 yang berarti bahwa jumlah hasil
biakan bakteri tersebut adalah 3 x 108/ml.
81
4.1.4 Metode Hemasitometer
Hemasitometer adalah metode yang paling umum digunakan karena
modal yang dikeluarkan tidak terlalu mahal. Hemasitometer memiliki kotak
berukuran besar berjumlah 9, memiliki 16 kotak berukuran sedang, dan memiliki
25 kotak berukuran kecil.
Gambar 27. Spora Hemasitometer
Pada gambar tersebut dapat diperoleh jumlah selnya yaitu 28 dan
terdapat faktor delusinya (pangkat dari pengenceran) adalah 3. Selanjutnya data
yang sudah diperoleh tadi, dimasukkan ke dalam rumus perhitungan mikroba
menggunakan metode hemasitometer dan diketahui bahwa volume sedang
adalah 4 x 10-3. Sel yang sudah mati akan terlihat berwarna dibawah mikroskop
karena integritas membran selnya telah rusak sehingga membrannya sudah tidak
semi-permeable lagi. Berbeda dengan sel hidup yang tidak akan berwarna ketika
diberi pearnaan. Maka dapat dihitung jumlah spora yaitu 28.
82
5. PENUTUP
5.1 Kesimpulan
 Prinsip dari metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TPC) adalah
menumbuhkan sel mikroorganisme yang masih hidup pada media agar,
sehingga mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni
yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan
mikroskop.
 MPN adalah suatu metode perhitungan mikroorganisme berdasarkan
data kualitatif hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik
dalam seri tabung untuk memperoleh kisaran data kuantitatif jumlah
mikroorganisme tersebut (MPN/mL (g)).
 Mc Farland adalah peyetaraan konsentrasi mikroba dengan
menggunakan larutan BaCl21% dan H2SO4 1% Standar kekeruhan Mc
Farland ini dimaksudkan untuk menggantikan perhitungan bakteri satu per
satu dan untuk memperkirakan kepadatan sel.
 Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan
perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel
yang rendah. Hemasitometer dapat digunakan untuk menghitung jumlah sel
spora jamur.
 Data hasil terbesar dan terkecil metode TPC didapat dari perhitungan
Terasi 1 dengan nilai TPC sebesar 214.5 x 106 cfu/ml, sedangkan sampel
terasi dengan jumlah koloni bakteri terendah adalah Terasi 4 dengan nilai
TPC sebesar 1.10 x 106 cfu/ml.
 Data perhitungan metode MPN menunjukkan, bahwa nilai APM nya
berturut-berturut yaitu 3, 1, 1. Maka hasil akhir metode MPN adalah 74

83
APM/gram.
 Data perbandingan metode Mc Farland didapat karena pada gambar 1
dan biakan bakteri sampel air pada gambar 2, mempunyai tingkat kekeruhan
yang sama dengan standar Mc Farland No.1 menunjukkan bahwa jumlah
hasil biakan bakteri tersebut adalah 3 x 108/ml.
 Data perhitungan metode Hemocytometer menurut gambar diperoleh
jumlah sel 28 dan faktor delusinya 3, sehingga setelah dimasukkannya data
tersebut kedalam rumus perhitungan mikroba menggunakan metode
Hemocytometer diketahui bahwa volume sedang yaitu 4 x 10-3. Dimana
dapat dihitung jumlah sporanya 28 melalui pengamatan sel hidup yang tidak
akan berwarna Ketika diberi pewarnaan.
5.2 Saran
Untuk jalan praktikum kedepannya semoga dapat dilaksanakan secara
offline agar praktikum dapat lebih mudah untuk dipahami dan mendapatkan
pengalaman saat meng implementasikan metode di laboratorium. Oleh karena
itu, diharapkan untuk praktikum berikutnya dapat berjalan secara offline karena
dapat menambah pengalaman serta pemahaman yang diterima oleh praktikan.
84
DAFTAR PUSTAKA
Apriani, R., Reza F, Razali R. (2017). Jumlah Cemaran Mikroba dan

Nilai Organoleptik Ikan Tongkol (Euthynnus affinis). JIMVET.
01(3), 598-603.
Azizah, R., Sulistianingtiyas, I., Pringgenies, D., dan Rudiyanti, S. (2016).

Potensi Rumput Laut Eucheuma sp. Terhadap Kepadatan
Fitoplankton Chlorella sp. Jurnal Kelautan Tropis. 18(3), 166-177.
Febrianti, D., Yugo S, Rakhmadhan N, Siti L. (2019). Aktivitas Antibakteri

Minyak Atsiri Kulit Jeruk Siam Banjar (Citrus reticulata) Terhadap
Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa. Jurnal Pharmascience.
06(01), 10 – 17.
Mulyadi, M., Wuryanti A, Purbowatiningrum R. (2017). Konsentrasi

Hambat Minimum (KHM) Kadar Sampel Alang-Alang (Imperata
cylindrica) dalam Etanol Melalui Metode Difusi Cakram. Jurnal
Kimia Sains dan Aplikasi. 20(3), 130 – 135.
Putri, A., Pramudya K. (2018). Identifikasi Keberadaan Bakteri Coliform

dan Total Mikroba dalam Es Dung-Dung di Sekitar Kampus
Universitas Muhammadiyah Surakarta. Media Gizi Indonesia.
13(1), 41–48.
Putri, R. M. S., Nurjanah, Tarman, K. (2018). Analisis kuantitatif

mikrobiologi serbuk minuman fungsional lintah laut (discodoris
sp.) pada suhu yang berbeda selama penyimpanan. Majalah
Ilmiah Biologi Biosfera, 35(3), 124-130.
Putri, S. S., Budiasa, I. K. M., & Roni, N. G. K. (2019). Populasi bakteri

pelarut fosfat dan karakteristik berbagai jenis media tanam dan
pupuk organik. Journal of Tropical Animal Science, 7(3), 1082-
1095.
Rosmania & Yanti, F. (2020). Perhitungan jumlah bakteri di laboratorium

mikrobiologi menggunakan pengembangan metode
spektrofotometri. Jurnal Penelitian Sains, 22(2), 76-86.
Saadah, A., Santoso, A., Wardhani, P. H. W., Astuti, Y. (2020). Preparasi

sel mamalia cho-dg44 dan isolasi plasmid dari bakteri eschericia
coli dh5-alfa sebagai tahap dalam produksi protein terapeutik
erythropoetin sebagai obat anemia. Jurnal Biologi Udayana,
24(2), 87-95.
Sardjito, T., Ramayadi, W., Srianto, P. Nidom, C. A. (2013).

Perbandingan penghitungan konsentrasi spermatozoa domba
85
merino dengan metode hemocytometer thoma dan
spectrophotometer. Veteranaria Medika, 6(2), 121-126.
Sari, R. & Apridamayanti, P. (2014). Cemaran bakteri eschericia coli

dalam beberapa makanan laut yang beredar di pasar tradisional
kota pontianak. Kartika Jurnal Ilmiah Farmasi, 2(2), 14-19.
Setyahadi, S., & Puji R. (2012). Potease dari Bacillus sp. Sebagai
Pendegradasi Bulu Ayam untuk Pembuatan Tepung Bulu. JRL,
8(1), 59 – 66.
Sukawaty, Y., Muhammad, K., & Eko, K . (2012). Uji cemaran Cemaran
Bakteri Coliform pada Minuman Air Tebu. Jurnal Ilmiah
Manuntung, 2(2), 248-253
Sunarti, R. N. (2015). Uji kualitas air sumur dengan menggunakan

metode mpn (most probable numbers). Bioilmi, 1(1), 30-34.
Yunita, M., Hendrawan, Y., & Yulianingsih, R. (2015), Analisis kuantitatif

mikrobiologi pada makanan penerbangan (aerofood acs) garuda
indonesia berdasarkan tpc (total plate count) dengan metode pour
plate. Jurnal Keteknikan Pertanian Tropis Dan Biosistem, 3(3),
237-248.
Zamora, L. L. & Pe´rez, M. T. (2012). Using digital photography to

implement the mcfarland method. Journal of The Royal Society
Interface, 9, 1892-1897.
Zen, N. A. M., Queljoe, D., & Singkoh, M. (2015). Uji bioaktivitas ekstrak
padina australis dari pesisir pantai molas sulawesi utara terhadap
bakteri staphylococcus epidermidis. Jurnal Pesisir dan Laut
Tropis, 2(1), 34-40
86
LAMPIRAN
Lampiran 3. Lampiran Perhitungan TPC
Rumus Perhitungan TPC
A. Sampel Terasi 1
Diket :
A B
10^-4 TBUD TBUD ∑C = 216 + 213 = 429

n1 =0
10^-5 216 213
n2 =2
d = 10-5
Cfu/ml = 214,5 x 106 Cfu/ml
B. Sampel Terasi 2
A B
87
10^-4 SP TBUD ∑C = 159
10^-5 224 159 n1 =0

n2 =1
d = 10-5
C. Sampel Terasi 3
∑C = 159
A B
n1 =0
10^-4 SP ERROR
n2 =1
10^-5 224 159 d = 10-5
88
D. Sampel Terasi 4
A B ∑C = 110
10^-4 SP 110 n1 =1
n2 =0
10^-5 141 SP
d = 10-4
Cfu/ml = 1,10 x 106
89
Lampiran 4. Perhitungan Hemasitometer
Total sel = 28
Volume sedang : 4 x 10-3
90
MATERI 4
Zona Hambat Antibakteri

MALANG
2021
91
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri merupakan sekelompok mikroorganisme bersel tunggal yang tidak
mempunyai selubung inti. Organisme ini termasuk dalam prokariota dan memiliki
ukuran sangat kecil (mikroskopis). Bakteri memiliki jumlah yang paling banyak
dan penyebarannya sangat luas dibandingkan dengan makhluk hidup lainnya.
Dalam kehidupan sehari-hari, bakteri mempunyai peranan negatif maupun
peranan negatif. Peranan positif dari bakteri yaitu dalam proses pembuatan
antibiotik oleh beberapa bakteri, seperti Streptomyces griseus, Streptomyces
aureofaciens, dan Bacillus brevis. Bakteri juga berperan dalam proses
pembuatan olahan susu, seperti yougurt. Sedangkan bakteri yang memiliki
peranan negatif disebabkan karena bakteri tersebut bersifat patogen yang dapat
menyebabkan beberapa penyakit pada manusia dan hewan. Contoh bakteri
patogen yang menyebabkan penyakit pada manusia yaitu S.aureus. Cara untuk
mencegah dan membunuh bakteri yaitu dengan memberikan zat antibakteri.
Antimikroba merupakan suatu senyawa biologis atau kimia yang memiliki sifat
menghambat pertumbuhan bakteri ataupun kapang yang disebut dengan
bakteriostatik, serta dapat bersifat membunuh mikroba atau kapang, disebut
dengan bakterisidal (Yanis et al., 2020).
Aktivitas antimikroba dapat dipelajari menggunakan metode difusi cakram.
Metode cakram dapat dilakukan dengan kertas sebagai media untuk menyerap
bahan antibakteri yang kemudian dijenuhkan ke dalam bahan uji. Kertas cakram
dapat diletakkan pada permukaan media agar yang telah diinokulasikan dengan
biakan mikroba yang kemudian diinokulasi pada suhu 35C dalam waktu 18-24
jam. Untuk mengetahui ada atau tidaknya pertumbuhan bakteri, dapat diamati
92
dengan melihat zona bening di sekitar kertas cakram. Metode ini memiliki
kelebihan karena dapat dilakukan pengujian yang lebih cepat pada penyiapan
alat cakram (Nurhayati et al.,2020).
Bakteri patogen merupakan jenis bakteri yang merugikan karena dapat
menyebabkan beberapa penyakit. Tingkat penyebaran bakteri sangat luas dan
dapat hidup di berbagai tempat sehingga perlu adanya pengendalian terhadap
pertumbuhan bakteri. Antimikroba merupakan senyawa yang dapat digunakan
untuk menghambat dan membunuh pertumbuhan bakteri/mikroba. Aktivitas
antimikroba dapat dilakukan dengan cara mengukur zona hambat dari ekstrak
yang digunakan. Antimikroba dapat diuji dengan menggunakan metode cakram,
yaitu pengujian keefektifan antimikroba yang dapat diketahui dengan
terbentuknya zona bening pada kertas cakram yang digunakan sebagai media
dalam pengujian.
1.2 Maksud dan tujuan
Maksud dari praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Antimikroba adalah
supaya praktikan dapat mengetahui pengaruh penambahan senyawa antibakteri
alkohol, chloram phenol, dan amoxilin terhadap efektivitas penghambatan
mikroba.
Tujuan dari praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Antimikroba adalah untuk
mempelajari dan memahami cara uji daya hambat mikroba dengan
menggunakan metode cakram.
93
1.3 Waktu dan tempat
Praktikum Mikrobiologi Dasar materi Antimikroba dilakukan pada hari
Selasa, 30 April 2021 pada pukul 16.15 – selesai dan dilakukan di rumah
masing-masing secara daring melalui aplikasi google meet.
94
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Zona Hambat
Menurut Zeniusa et al. (2019), daerah sekeliling cakram disk yang tidak
ditemukan adanya aktivitas bakteri atau bisa juga disebut zona bening yang
terdapat pada media Muller Hinton Agar (MHA) merupakan pengertian dari zona
hambat. Setiap jenis bakteri mempunyai tingkat kerentanan yang berbeda
sehingga untuk mengukur kerentanan bakteri terhadap lingkungannya dapat
melihat dari zona hambatnya itu sendiri yang diameternya diukur menggunakan
jangka sorong. Diameter zona hambat bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor,
yaitu kekeruhan suspensi bakteri. Semakin besar zona hambat maka tingkat
kekeruhan suspensi kurang keruh dan sebaliknya semakin kecil diameter zona
hambat yang terbentuk maka tingkat suspensi kekeruhan sangat keruh.
Pengelompokkan respon zona hambat bakteri berdasarkan diameter zona
bening dimana pengelompokkan dibedakan dalam respon lemah, sedang, kuat,
dan sangat kuat menurut Ariyani et al., (2018), Respon lemah merupakan zona
hambat yang memiliki diameter 5 mm, respon sedang merupakan zona hambat
yang memiliki diameter 5-10 mm, respon kuat merupakan zona hambat yang
memiliki diameter 10 – 20 mm, dan yang terakhir respon sangat kuat merupakan
zona hambat yang memiliki diameter >20 mm.
Metode yang dapat dilakukam dalam pengujian aktivitas antibakteri
adalah metode difusi dan metode pengenceran. Petunjuk dari adanya respon
penghambatan adalah dengan adanya diameter zona bening (clear zone) yang
dapat diukur. Pengukuran ini sering disebut dengan Disc diffusion test atau uji
difusi disk. Metode difusi ini dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu silinder, metode
lubang atau sumuran dan metode kertas cakram. Penjelasan mengenai
95
bagaimana proses uji bakteri menggunakan metode lubang atau sumuran,
Pembuatan lubang pada agar padat yang sudah diinokulasi bakteri selanjutnya
lubang tersebut dinjeksi dengan ekstrak yang akan diuji. Proses inkubasi telah
dilalui, kemudian pengamatan pertumbuhan bakteri guna untuk mengetahui ada
tidaknya daerah hambatan disekitar lubang (Ariyani et al., 2018).
2.2 Metode Cakram
Pengujian aktivitas antimikroba suatu antibiotik terhadap mikroorganisme
patogen penyakit umumnya menggunakan metode cakram. Indikator yang dituju
pada metode ini adalah ada atau tidaknya hambatan pertumbuhan
mikroorganisme akibat ekskresi zat antimikroba pada area bening disekitar
kertas cakram. Bahan yang dibutuhkan dalam metode cakram ini adalah kertas
cakram saring (paper disc) yang memiliki fungsi sebagai tempat menampung zat
antimikroba. Cara kirby bauer menyebutkan bahwa terdapat dua jenis zona
hambat yang terbentuk yaitu radical zone dan irradical zone. Radical zone
memiliki arti Kondisi dimana sekitar kertas disk tidak ada tanda pertumbuhan
bakteri. Sedangkan irradical zone merupakan daerah sekitar disk dimana
pertumbuhan bakteri dihambat oleh antibakteri (Ariyani et al., 2018).
Prinsip dari metode difusi cakram ini sendiri adalah bahan uji dijenuhkan
dalam cakram kertas. Cakram kertas yang mengandung bahan tertentu ditanam
pada media pembenihan agar padat yang telah dicampur dengan mikroba yang
diuji. Tahapan selanjutnya adalah penginkubasian pada suhu dalam rentan
waktu 18-24 jam. Proses difusi dari bahan uji pada cakram masuk ke dalam
media agar selama proses inkubasi. Banyaknya bahan uji yang ditambahkan
pada kertas cakram akan berbanding lurus dengan diameter zona bening. Zona
bening ini merupakan indikator utama proses pengamatan berdasarkan ada
96
tidaknya pertumbuhan mikroba. Metode ini dapat digunakan secara rutin untuk
menguji sensitivitas antibiotik untuk bakteri pathogen (Nurhayati et al, 2020).
97
3. METODELOGI
3.1 Pembuatan media MHA (Muller Hinton Agar)
Ditimbang MHA yang dibutuhkan
Dihomogenkan MHA dan aquades di dalam erlenmeyer
Tutup Erlenmeyer dengan alumunium foil dan kertas
Rebus selama 15 menit
Ditunggu hingga hangat
Tuangkan media MHA ke cawan petri
Tunggu hingga menjadi gel
Gambar 28. Skema Kerja Pembuatan MHA
Muller Hinton Agar (MHA) adalah media yang digunakan untuk platting.
Lankah pembuatannya yaitu dengan menimbang MHA yang dibutuhkan dan
menimbang aquades yang diperlukan. Jumlah MHA dan aquades berdasarkan
komposisi pada kemasan, seperti contohnya MHA seberat 38 gr dan aquades 1
98
liter. Kemudian dilarutkan hingga homogen di dalam erlenmeyer, dapat dengan
bantuan pemanasan bila diperlukan. Tutup Erlenmeyer dengan alumunium foil
dan kertas yang bertujuan untuk menjaga tabung dan media tetap steril. Lakukan
sterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dan dalam suhu 1210C. Biarkan
hingga hangat kemudian tuang dalam cawan petri yang sudah steril dan biarkan
hingga memadat menjadi gel.
3.2 Metode Cakram

3.2.1 Perendaman Kertas Cakram
Alkohol konsentrasi 70%, chloram phenicol dan amoxcilin
Rendam kertas cakram pada masing-masing antimikroba

selama 1 jam
Gambar 29. Skema Perendaman Kertas Cakram
Perendaman kertas cakram yaitu pertama-tama kertas cakram diberi
lubang kecil disekitarnya kemudian direndam dalam larutan alcohol 70%,
chloram phenicol dan amoxcilin. Perendaman ini dilakukan selama 1 jam dalam
larutan antimikroba tersebut. Kemudian kertas cakram dapat diletakkan pada
media yang ditumbuhi bakteri selama 3 x 24 jam pada suhu 370C dan setiap 1 x
24 jam zona bening dapat diukur menggunakan jangka sorong.
Biakan bakteri pada suspensi diambil sebanyak 500 μL kemudian dituang
ke dalam cawan petri steril dan media agar dituang ke dalam cawan petri steril
yang berisi suspensi bakteri lalu dihomogenkan. Masing-masing ekstrak pada
variasi 2 x 104 ppm, 4 x 104 ppm, 6 x 104 ppm, 8 x 104 ppm, kontrol positif dan
kontrol negatif sebanyak 50 μL diteteskan pada kertas cakram steril dan
dibiarkan beberapa saat kemudian kertas cakram yang sudah kering diletakkan
secara teratur di atas medium agar yang mengandung bakteri uji dan kemudian
99
diberi label dan diinkubasi selama 3 x 24 jam pada suhu 37 °C, setiap 1 x 24 jam
zona bening yang terbentuk diukur dengan jangka sorong. Sebagai kontrol positif
digunakan kloramfenikol sedangkan kontrol negatif digunakan dimetilsulfoksida
(DMSO) (Prestianti. I. et al., 2018)
100
3.2.2 Uji Daya Hambat Metode Cakram
Persiapan media dalam cawan petri dan dibiarkan hingga

memadat
Suspensi bakteri dengan menggunakan lidi kapas steril
Media dimasuki kertas cakram yang sebelumnya sudah

direndam dalam larutan control positif (Tetrasiklin)
Ekstrak etanol umbi hati tanah (konsentrasi 1%, 5%, dan

10%) dimasukkan dengan bantuan pinset steril
Cawan petri dibungkus dengan plastic wrap
Media diinkubasi dalam inkubator
Zona bening pada media yang padat dapat diukur dengan

jangka sorong
Gambar 30. Skema Uji Daya Hambat Cakram
Uji daya hambat metode cakram dilakukan dengan menambahkan 10 ml
media kedalam cawan petri dan dibiarkan hingga memadat. Suspensi bakteri
Staphylococcus aureus dimasukkan dalam media dengan menggunakan lidi
kapas steriL. Kemudian media dimasuki kertas cakram yang sebelumnya sudah
direndam dalam larutan control positif (Tetrasiklin) selama 1 jam. Sampel uji
(ekstrak etanol umbi hati tanah) konsentrasi 1%, 5%, dan 10% dimasukkan
dengan bantuan pipet steril. Selanjutnya cawan petri dibungkus dengan plastic
101
wrap untuk menjaga agar media tetap steril. Setelah itu, proses inkubasi
dilakukan selama 24 jam dan dalam suhu 370C. Zona bening yang muncu pada
media padat dapat dihitung menggunakan jangka sorong.
Menurut Susi et al. (2018), pengujian ekstrak umbi hati tanah dilakukan
dengan menggunakan 4 konsentrasi yaitu 1%, 5%, 10%, dan 15%. Hasilnya
menunjukkan adanya daya hambat dari ekstrak etanol umbi hati tanah terhadap
pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus yang ditanaman dalam inkubasi
seama 24 jam dan suhu 370C. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak etanol umbi
Hati Tanah maka semakin besar zona hambat yang dihasilkan. Jika
dibandingkan dengan ketentuan pada CLSI, maka zona hambat yang dihasilkan
oleh ekstrak etanol umbi Hati Tanah pada konsentrasi 1% dan 5% dapat
dikategorikan intermediate sedangkan pada konsentrasi 10% dan 15% dapat
diinterpretasikan ke dalam kategori susceptible. Hasil berupa zona bening yang
terbentuk dikarenakan terdapat kandungan senyawa aktif pada umbi Hati Tanah
berupa flavonoid yang berperan sebagai antibakteri sehingga dapat menghambat
pertumbuhan bakteri. Flavonoid bekerja dengan menghambat pembelahan atau
proliferasi sel bakteri. Senyawa ini mengikat protein pada mikrotubulus dalam sel
dan mengganggu fungsi mitosis sehingga menimbulkan penghambatan
pertumbuhan bakteri.Senyawa fenol sebagai antibakteri adalah dengan
mendenaturasi ikatan protein pada membran sel sehingga membran sel lisis dan
memungkinkan fenol menembus ke dalam sitoplasma yang menyebabkan
bakteri tidak berkembang.
102
3.2.3 Pengukuran Zona Hambat Dengan Metode Cakram
Pembuatan simplisia
Pembuatan ekstrak
Pembuatan media
Uji aktivitas antimikroba dengan kertas cakram
Analisis data
Gambar 31. Skema Kerja Pengukuran Zona Hambat (Herda et al., 2018)
Langkah kerja pengukuran zona hambat dimulai dengan pembuatan
simplisia. Kulit limau dicuci, ditiriskan dan dianginkan didara tetapi tidak terkena
cahaya matahari secara langsung, kemudian dioven dalam suhu <500C selama
12 jam dan dihaluskan. Selanjutnya pembuatan ekstrak dengan 1000 gr serbuk
limau diekstrak dengan 250 ml etanol 96% dan ditutup. Setelah dimaserasi
selama 24 jam, filtrat disaring dan residunya diremaserasi kembali dengan
pelarut yang sama. sebanyak tiga kali. Kemudian disimpan dalam wadah tertutup
rapat. Ekstrak dikentalkan menggunakan water bath sampai didapatkan ekstrak
kental dan timbangan analitik dan disimpan di freezer hingga digunakan (Herda
et al., 2018). Pembuatan media dengan menimbang 10 gr nutrient agar dan
103
dimasukkan dalam Erlenmeyer, ditambahkan 500 ml aquades, dihomogenkan
dan disterilisasi. Selanjutnya dimasukkan dalam tabung miring. Pada Cakram
kertas digunakan suatu kertas cakram saring (paper disc) yang berfungsi sebagai
tempat menampung zat antimikroba. Kertas saring yang mengandung zat
antimikroba tersebut diletakkan pada lempeng agar yang telah diinokulasi
dengan mikroba uji kemudian diinkubasi pada waktu dan suhu tertentu, sesuai
dengan kondisi optimum dari mikroba uji yaitu pada suhu 37ºC selama 18-24
jam. Terdapat 2 zona hambat yang terbentuk yaitu: Radical zone yaitu suatu
daerah disekitar disk dimana sama sekali tidak ditemukan adanya pertumbuhan
bakteri, potensi antibakteri diukur dengan mengukur diameter dari zona radikal
dan irradical zone yaitu suatu daerah sekitar disk dimana pertumbuhan bakteri
dihambat oleh antibakteri, tetapi tidak dimatikan.
Analisis data dari pengukuran zona hambat dengan metode cakram yaitu
Efektitifitas ekstrak etanol kulit limau kuit sebagai antibakteri dapat dilihat dengan
melakukan pengujian daya hambat menggunakan metode difusi agar dengan
melihat zona bening yang terbentuk disekitar paper disc yang telah ditetesi
ekstrak etanol kulit limau kuit pada beberapa variasi konsentrasi (100%, 75%,
50%, 25%). Paper disc yang telah ditetesi ekstrak etanol kulit limau kuit
diletakkan diatas pemukaan media NA yang dihomogenkan dengan suspensi
bakteri S.aureus dan E.coli yang telah memadat. Menurut Herda et al. (2018),
zona bening di sekitar paper disc menunjukkan adanya aktivitas antibakteri.
Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri yang bisa mengkontaminasi bahan
pangan dan biasa ada ditangan yaitu Escherichia coli dan Staphylococcus
aureus. Metode yang digunakan adalah metode kertas cakram dan uji replika.
Metode kertas cakram merupakan metode yang biasa digunakan untuk menguji
aktivitas antimikroba suatu antibiotik terhadap mikroorganisme patogen
penyebab penyakit. Kepekaan mikroorganisme patogen terhadap antibiotik
104
terlihat dari ukuran zona bening yang terbentuk (Herda et al., 2018). Parameter
yang digunakan adalah zona bening, yaitu area bening di sekeliling cakram
kertas sebagai indikasi tidak adanya atau terhambatnya pertumbuhan
mikroorganisme akibat ekskresi zat antimikroba oleh kompetitornya. Menurut
Herda et al. (2018), kriteria kekuatan daya antibakteri sebagai berikut: diameter
zona hambat 5 mm atau kurang dikategorikan lemah, zona hambat 5-10 mm
dikategorikan sedang, zona hambat 10-20 mm dikategorikan kuat dan zona
hambat 20 mm atau lebih dikatakan sangat kuat. Berdasarkan kategori tersebut,
maka daya hambat yang dihasilkan ekstrak daun jambu biji dalam sediaan gel
handsanitizer dikategorikan kuat karena menghasilkan zona hambat diatas 10
mm.
105
4. PEMBAHASAN
4.1 Data Hasil Praktikum
Berdasarkan uji aktivitas antimikroba, diperoleh data yang dilakukan
dengan cara mengukur diameter zona hambat yang terbentuk. Diameter zona
hambat merupakan diameter yang tidak ditumbuhi oleh mikroba. Zona hambat
dapat diketahui dengan cara menghitung diameter zona bening dikurangi dengan
diameter kertas cakram. Dari perhitungan tersebut diperoleh hasil zona
hambatnya. Berikut merupakan tabel hasil praktikum :
Tabel 4. Data Hasil Praktikum
Larutan Uji Diameter Diameter Hasil Zona
Kertas Zona Bening Hambat
Cakram (cm)
Alkohol 70% 0,06 2,66 2,6 cm
Chloramfenikol 0,06 5,44 5,38 cm
Amoxilin 0,06 4,76 4,7 cm
Berdasarkan tabel data hasil praktikum, menunjukkan bahwa setiap larutan
uji mempunyai hasil zona hambat yang berbeda. Terdapat 3 larutan uji yang
digunakan pada praktikum ini, yaitu Alkohol 70%, Chloramfenikol, dan Amoxilin.
Pada larutan uji Alkohol 70% dengan diameter kertas cakram 0,06 cm dan
diameter zona bening 2,66 cm setelah dilakukan inkubasi didapatkan hasil zona
hambat antimikroba sebesar 2,6 cm. Pada larutan uji Chloramfenikol dengan
diameter kertas cakram 0,06 cm dan diameter zona bening 5,44 cm setelah
dilakukan inkubasi didapatkan hasil zona hambat antimikroba sebesar 5,38 cm.
106
Pada larutan yang terakhir yaitu larutan Amoxilin dengan diameter kertas cakram
0,06 cm dan diameter zona bening 4,76 cm setelah dilakukan inkubasi
didapatkan hasil hambat antimikroba sebesar 4,7 cm. Berdasarkan hasil zona
hambat dari ketiga larutan uji, larutan Chloramfenikol memiliki hasil zona hambat
antimikroba tertinggi dibandingkan dengan larutan uji lainnya, yaitu sebesar 5,38
mm.
Hasil dari praktikum zona hambat menggunakan larutan alcohol 70%,
chloram phenicol dan amoxcilin berturut-turut adalah 2.60, 5.38, dan 4.70. Hasil
ketiga larutan berbeda-beda disebabkan oleh faktor yang mempengaruhi ukuran
dari zona penghambat tiap larutan, seperti faktor sensitivitas mikroorganisme,
medium kultur, kondisi inkubasi, dan kecepatan difusi agar. Selain itu, kecepatan
difusi agar juga dipengaruhi oleh faktor lain seperti konsentrasi mikroorganisme,
komposisi media, suhu inkubasi, dan waktu inkubasi. Dengan memperhatikan
banyak faktor tersebut, maka tiap larutan akan memiliki hasil yang berbeda-beda.
107
5. PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum Mikrobiologi Dasar materi Zona Hambat
Antibakteri dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:
 Zona hambat adalah daerah sekeliling cakram disk yang tidak ditemukan
adanya aktivitas bakteri atau bisa juga disebut zona bening yang terdapat
pada media Muller Hinton Agar (MHA).
 Pengelompokkan respon zona hambat bakteri berdasarkan diameter zona
bening dimana pengelompokkan dibedakan dalam respon lemah (diameter 5
mm), sedang (diameter 5-10 mm), kuat (10-20 mm), dan sangat kuat (>20
mm).
 Metode cakram adalah pengujian aktivitas antimikroba suatu antibiotik
terhadap mikroorganisme patogen penyakit umumnya.
 Prinsip dari metode difusi cakram ini sendiri adalah bahan uji dijenuhkan
dalam cakram kertas. Kemudian penginkubasian pada suhu dalam
rentan waktu 18-24 jam. Proses difusi dari bahan uji pada cakram masuk ke
dalam media agar selama proses inkubasi. Banyaknya bahan uji yang
ditambahkan pada kertas cakram akan berbanding lurus dengan diameter
zona bening.
 Zona hambat tertinggi menggunakan larutan Chloran Phenicol dengan hasil
5,38 cm dan zona hambat terendah menggunakan larutan Alkohol 70%. Hal
ini disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya yaitu faktor sensitivitas
mikroorganisme, medium kultur, kondisi inkubasi, dan kecepatan difusi agar.
108
Alkohol 70% lebih lambat masuk kedalam tubuh bakteri diabndingkan
dengan larutan Chloram Phenicol.
5.2 Saran
Saran dalam praktikum materi Zona Hambat Antibakteri adalah semoga
praktikum bisa dilaksanakan secara offline dengan tujuan agar praktikan bisa
mempraktikkannya secara langsung dan tidak hanya belajar materi saja. Durasi
praktikum terlalu singkat sehingga pemateri menyampaikannya terlalu cepat
yang berdampak materi sulit dicerna. Untuk materi pada buku panduan kami
rasa kurang lengkap dan terdapat materi yang sulit ditangkap.
109
DAFTAR PUSTAKA
Ariyani, H., Nazemi, M., Hamidah, H., & Kurniati, M. (2018). Uji Efektivitas
Antibakteri Ekstrak Kulit Limau Kuit (Cytrus hystrix DC) Terhadap
Beberapa Bakteri. JCPS (Journal of Current Pharmaceutical
Sciences), 2(1), 136-141.
Novaryatiin, A., et al. (2018). Uji Daya Hambat Ekstrak Etanol Umbi Hati Tanah
(Angiotepris sp.) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus. Jurnal
Farmasi Universitas Muhammadiyah Palangkaraya, 3(2), 27-30.
Nurhayati, L. Y., et al (2020). Perbandingan Pengujian Aktivitas Antibakteri
Starter Yogurt Dengan Metode Difusi Sumuran dan Metode Difusi
Cakram. Jurnal Teknologi Hasil Peternakan, 1(2), 41-46.
Nurhayati, L. S., Yahdiyani, N., & Hidayatulloh, A. (2020). Perbandingan

Pengujian Aktivitas Antibakteri Starter Yogurt Dengan Metode Difusi
Sumuran Dan Metode Difusi Cakram. Jurnal Teknologi Hasil
Peternakan, 1(2), 41-46.
Prestianti, I., et al (2018). Uji Aktivitas Antibakteri Sarang Lebah Hutan (Apis
dorsata) terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus, Eschericia coli,
dan Pseudomonas aeruginosa, 14(2), 314-316.
Yanis, I. F., et al (2020). Potensi antibakteri dari ekstrak segar daun kersen
(Muntingia calabura L.) dalam menghambat pertumbuhan bakteri Shigella
dysentriae. Jurnal Biologi Universitas Andalas, 8(1), 14-19.
Zeniusa, P., Ramadhian, M. R., Nasution, S. H., & Karima, N. (2019). Uji Daya
Hambat Ekstrak Etanol Teh Hijau TerhadapEscherichia coli Secara In
Vitro. Jurnal Majority, 8(2), 136-143.
110
LAMPIRAN
Lampiran 6. Perhitungan Hasil Zona Hambat Data Hasil Praktikum
Rumus perhitungan zona hambat:
Zona hambat = Diameter zona bening – Diameter kertas cakram
1. Alkohol 70%
Zona hambat = D. zona bening – D. kertas cakram

= 2,66 – 0,06
= 2,60 cm
2. Chloram phenicol

= 5,44 – 0,06
= 5,38 cm
3. Amoxcilin

= 4,76 – 0,06
= 4,70 cm
111
112
MATERI 5
Pewarnaan Gram

MALANG
2021
113
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri merupakan Mikroorganisme yang memiliki sel tunggal, tidak
berklorofil, selalu berkelompok (berkoloni), berkembang biak dengan
pembelahan diri, serta dengan bentuk kecilnya yang mikroskopis sehingga hanya
bisa dilihat oleh alat bantu mikroskop. Hal itu sesuai dengan pernyataan bahwa
Bakteri adalah cabang dari ilmu mikro-biologi yang selalu berkelompok
(berkoloni) untuk melakukan perkembang biakan dan bertahan hidup karena
ketergantungan satu sama lain. Klasifikasi bakteri dibedakan berdasarkan
bentuk, letak flagella, cara memperoleh makanan, kebutuhan oksigen, dan
pewarnaan gram. Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk mengidentifikasi
mikroba. Pewarnaan gram merupakan suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel (Claudia dan Muhammad, 2017)
Dalam menyerap zat warna Gram, Bakteri Gram positif menyerap zat
warna pertama yaitu Kristal violet yang menyebabkan berwarna ungu,
sedangkan bakteri Gram negative menyerap zat warna kedua yaitu safranin yang
menyebabkan bakteri berwarna merah. Bakteri gram positif terdiri dari struktur
dinding sel yang tebal (15-80 nm) dan berlapis tunggal dengan kandungan lipid
yang rendah (1-4%), sedangkan bakteri gram negatif terdiri dari struktur dinding
sel yang tipis dan berlapis tiga (10-15 nm) namun memiliki kandungan lipid tinggi
(11-22%). Hal ini sesuai dengan hasil praktikum yang menyatakan bahwa bakteri
gram positif memiliki dinding sel tebal dan kandungan lipid rendah, sedangkan
bakteri gram negatif kandungan lipid tinggi (Boleng, 2015)
114
Prosedur pewarnaan Gram pada umumnya hanya diberlakukan terhadap
bakteri saja karena erat hubungannya terhadap proses identifikasi dengan
pewarnaan diferensial yang dapat membedakan jenis bakteri berdasarkan reaksi
yang timbul pada struktur dinding sel selama prosedur pewarnaan.
Maksud dari praktikum Mikrobiologi Dasar materi Pewarnaan Gram
adalah supaya praktikan mampu memahami bagaimana cara pewarnaan gram.
Tujuan dari praktikum Mikrobiologi Dasar materi supaya dapat melakukan
pewarnaan gram untuk mengidentifikasi mikroba yang merupakan bakteri gram
positif atau bakteri gram negatif.
Waktu pelaksanan praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Pewarnaan Gram
dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 1 Desember 2021 pada pukul 19.15 –
selesai.
Tempat pelaksanaan praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Pewarnaan
Gram dilaksanakan di rumah masing-masing praktikan secara daring melalui
Google Meet.
115
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Escherichia Coli
Escherichia Coli adalah bakteri flora normal yang sering dijumpai pada
usus manusia, bersifat unik karena dapat menyebabkan infeksi primer seperti
diare (Karsinah dkk, 2011). Menurut buku yang di karang oleh Radji (2011),
Escherichia coli atau E.coli adalah bakteri Gram negatif yang termasuk dalam
family Enterobacteriaceae, yang ada di dalam tubuh manusia. Bergerak
menggunakan flagel dan berbentuk batang pendek atau biasa disebut kokobasil.
Escherichia coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus dengan
tepi yang nyata. Escherichia coli termasuk kelompok bakteri Enterobacteriaceae
yang sering mengkontaminasi makanan sehingga dapat menyebabkan diare.
2.2 Bacillus Sp.
Bacillus Sp. merupakan bakteri endofitik yang dapat diisolasi dari organ
jaringan tanaman dan memiliki beberapa peranan lain seperti penghambat N2
dari udara, menghasilkan fitohormon seperti Asam Asetat Indole-3 (IAA) serta
sitokinin yang dapat memacu pertumbuhan. Bacillus Sp. memiliki memiliki
karakteristik umum yakni berwarna krem keputihan serta bentuk koloni yang
bulat dan tidak beraturan. Selain itu, tepi koloni ada yang rata dan tidak rata,
permukaannya kasar dan tidak berlendir, bahkan ada cenderung kering dan
berbubuk, koloni besar dan tidak mengkilat (Puspita et al., 2017)
116
2.3 Pewarnaan Gram
Menurut Fardiaz (1992), dalam pewarnaan Gram sel-sel yang tidak dapat
melepaskan warna dan akan tetap berwarna seperti warna kristal violet yaitu biru
-ungu disebut bakteri Gram positif. Sedangkan sel-sel yang dapat melepaskan
kristal violet dan mengikat safranin sehingga akan berwarna merah, merah muda
disebut bakteri Gram negatif. Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan
dinding sel mengikat zat warna dasar (kristal violet) setelah pencucian dengan
alkohol 95%. Keadaan ini berhubungan dengan komposisi senyawa penyusun
dinding sel. Di dalam bakteri Gram positif terkandung peptidoglikan lebih banyak
dan lemak lebih sedikit dibanding dengan bakteri Gram negatif.
Mekanisme pewarnaan gram menurut Virgianti dan Luciana (2017),
memiliki perbedan dimana pada bakteri gram positif dan gram negatif ketika
ditambahkan dengan larutan peluntur. Pada bakteri gram positif warna akan
dipertahankan, tetapi pada gram negatif akan hilang. Oleh karena itu, diperlukan
pewarna penutup yang kontras untuk mewarnai bakteri gram negatif, yaitu
dengan pewarna yang berwarna merah. Pewarna penutup yang sering
digunakan pada pewarnaan gram adalah basic fuchsin atau safranin. Prinsip
dasar pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri,
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan
penambahan larutan pencuci. Terdapat kelebihan dan kekurangan pada metode
pewarnaan gram, kelebihannya ialah pewarnaan gram merupakan salah satu
metode paling sederhana dan murah untuk diagnosis cepat infeksi bakteri.
Metode ini jauh lebih cepat dibandingkan dengan kultur bakteri, dan sebagai
pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik sebelum tersedia bukti definitif
bakteri penyebab infeksi secara spesifik. Kekurangan dari metode ini yaitu hanya
dapat mengetahui ukuran dan bentuk bakteri serta melihat sitruktur dalam bakteri
117
dengan zat warna saja. Kondisi pewarnaan gram dan morfologi bakteri kadang-
kadang berubah karena terapi anti-mikroba.
118
3. METODELOGI
3.1 Skema Kerja Pewarnaan Gram
Kaca Objek
Dibersihkan dengan alkohol 70%
Koloni bakteri dalam cawan petri
Bakteri diambil dan diletakkan pada kaca objek
Diberikan Na-Fis Tidak diberikan Na-Fis
Difiksasi diatas bunsen
Ditetesi dengan kristal ungu dan didiamkan selama 1 menit
Dibilas dengan aquades
Ditetesi iodium, didiamkan selama 2 menit
Dicuci dengan alkohol 70%
Ditetesi safranin dan didiamkan ½ menit
Diamati pada mikroskop
Gambar 32. Skema Kerja Pewarnaan Gram
Sesuai dengan skema kerja pewarnaan gram di atas dijelaskan bahwa,
langkah pertama yang wajib dilakukan dalam metode pewarnaan gram adalah
menyiapkan kaca objek. Kemudian, bersihkan kaca objek menggunakan alkohol
119
70%. Setelah itu, siapkan koloni bakteri yang ada di dalam cawan petri. Langkah
selanjutnya, ambil bakteri dan letakkan di atas kaca objek dengan memberikan
dua perlakuan yang berbeda, yaitu perlakuan diberi Na-Fis dan perlakuan tidak
diberi Na-Fis. Lalu, lakukan fiksasi di atas bunsen. Jika sudah melakukan fiksasi,
maka selanjutnya diberi tetesan kristal ungu dan diamkan selama 1 menit.
Kemudian, bilas dengan menggunakan aquades dan tetesi dengan iodium serta
diamkan selama 2 menit. Langkah berikutnya, bilas kembali dengan
menggunakan aquades dan cuci dengan alkohol 70%. Setelah itu, bilas kembali
dengan aquades, lalu diberi tetesan safranin serta diamkan selama ½ menit. Jika
sudah selesai didiamkan, maka bilas kembali menggunakan aquades. Langkah
terakhir dari semua proses di atas adalah mengamati objek tersebut dengan
mikroskop untuk melihat pewarnaannya.
3.2 Mekanisme Penyerapan Warna
Identifikasi bakteri menurut Saputri, et al. (2016), diawali pewarnaan
Gram dengan tujuan untuk mengetahui bentuk bakteri (basil, kokus atau spiril),
penentuan bakteri jenis Gram positif atau Gram negatif pada saat pengamatan di
mikroskop. Apabila warna bakteri terlihat merah, artinya bakteri bersifat gram
negatif karena sel bakteri tidak menyerap cat utama (Gram’s iodin) dengan kuat
sehingga terbilas dengan alkohol dan terwarnai dengan cat pelawan, dan jika
warna bakteri ungu atau biru artinya bakteri bersifat gram positif.
Bakteri gram negatif memiliki kandungan lipid yang tinggi dan dinding sel
yang tipis sehingga ketika mendapat perlakuan alkohol pada proses pewarnaan
gram menyebabkan terekstraksinya lipid, sehingga memperbesar daya rembes
(permeabilitas) dinding sel. Hal ini menyebabkan warna Ungu Kristal-Yodium
(UK-Y) terekstraksi sehingga organisme gram negatif kehilangan warna tersebut.
120
Sedangkan warna ungu pada bakteri gram positif setelah mendapat perlakuan
pewarnaan gram dikarenakan oleh rendahnya kandungan lipid pada dinding sel
sehingga lipid menjadi terdehidrasi selama perlakuan alkohol. Ukuran pori-pori
mengecil, permeabilitasnya berkurang dan kompleks Ungu Kristal-Yodium (UK-
Y) tidak dapat terekstraksi.
3.2.1 Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif akan memperlihatkan warna ungu setelah melalui
tahapan pewarnaan gram. Menurut Hidayat dan Alhadi (2012) bakteri gram
positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violet-yodium tetap
dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat. Larutan pemucat yang
digunakan bisa berupa aseton maupun alkohol. Adanya peptidoglikan yang tebal
pada dinding sel bakteri gram positif menyebabkan bakteri lebih tahan saat
dekolorisasi. Dekolorisasi menyebabkan pori-pori dinding sel menyempit dan
dinding sel akan mempertahankan warna ungu.
Kompleks zat warna kristal violet-yodium menyebabkan warna bakteri
gram positif menjadi ungu atau biru. Kompleks ini dapat bertahan karena terjebak
di pori-pori dinding sel bakteri gram positif yang menyempit akibat dekolorisasi.
Dinding sel bakteri gram positif sebagian besar tersusun dari peptidoglikan yang
tebal. Dinding sel bakteri gram positif relatif lebih tipis dibandingkan bakteri gram
negatif karena hanya tersusun dari peptidoglikan.
3.2.2 Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negatif memperlihatkan warna merah setelah melalui
tahapan pewarnaan gram. Menurut Oktavia dan Pujiyanto (2018) dinding sel
bakteri negatif tidak hanya tersusun atas peptidoglikan, bakteri gram negatif
memiliki tiga komponen utama pembentuk dinding sel yaitu lipoprotein, membran
121
luar, dan lipopolisakarida. Komponen lipida dalam dinding sel bakteri gram
negatif akan larut saat proses dekolorisasi oleh alkohol dan aseton. Hal ini
menyebabkan pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan daya larut
kompleks kristal violet-yodium pada dinding selnya. Sehingga bakteri gram
negatif akan menangkap zat pewarna selanjutnya yaitu safranin yang akan
memperlihatkan warna merah.
Dinding sel bakteri gram negatif relatif lebih tebal dibandingkan bakteri
gram positif. Hal ini karena dinding sel bakteri gram negatif bukan hanya
tersusun oleh peptidoglikan, melainkan juga tersusun oleh lipoprotein, membran
luar, dan lipopolisakarida. Dekolorisasi dengan alkohol maupun aseton
menyebabkan lapisan lipida dalam dinding sel larut dan juga kompleks kristal
violet-yodium akan ikut terlarut. Akibatnya bakteri akan menangkap zat warna
selanjutnya yang menimbulkan warna merah dan dalam praktikum ini adalah zat
safranin.
122
4. PENUTUP
4.1. Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diperoleh dari praktikum Mikrobiologi Dasar
materi pewarnaan gram adalah sebagai berikut :
 Bakteri merupakan sel prokariotik dengan genom berbentuk sirkuler dan
mempunyai plasmid
 Bakteri ada yang bersifat patogen dan juga ada yang bermanfaat bagi
manusia seperti dalam produksi youghurt dan antibiotik.
 Pewarnaan gram terdiri dari 4 tahap yaitu pewarnaan primer dengan
kristal ungu, pewarnaan dengan iodium, dekolorisasi dengan alkohol atau
aseton, dan pewarnaan dengan safranin
 Identifikasi bakteri dapat menggunakan pewarnaan gram dengan hasil
bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
 Bakteri gram positif memperlihatkan warna biru atau ungu karena
kompleks warna kristal violet-yodium terjebak di dalam pori-pori dinding
sel yang tersusun atas peptidoglikan.
 Bakteri gram negatif memperlihatkan warna meah karena kompleks
warna kristal violet-yodium terlarut bersama komponen lipida dinding sel.
 Contoh bakteri gram positif adalah Bacillus sp. sedangkan gram negatif
adalah Escherichia coli.
123
4.2. Saran
Praktikum Mikrobiologi Dasar pada materi pewarnaan gram sangat perlu
untuk dilakukan secara langsung, bukan secara daring atau simulasi. Hal
tersebut dianjurkan supaya praktikan dapat benar-benar memahami setiap
prosedur pewarnaan gram. Namun, dengan adanya praktikum Mikrobiologi
Dasar materi pewarnaan gram yang dilakukan secara daring ini diharapkan
praktikan mampu mengetahui dan memahami setiap konsep dasar dari
pewarnaan gram itu sendiri.
124
DAFTAR PUSTAKA
Malik Claudia P. & Mustafa M. Iqbal. (2017). Identifikasi Mikroba Metode
pewarnaan Gram. Praktikum Mikrobiologi Umum. 5: 2-3.
Boleng, D. T. 2015. Bakteriologi Konsep-Konsep Dasar. Malang: UMM Press
Puspita, F., Ali, M., & Pratama, R. (2017). Isolasi dan karakterisasi morfologi dan
fisiologi bakteri Bacillus sp. endofitik dari tanaman kelapa sawit (Elaeis
guineensis Jacq.). Jurnal Agroteknologi Tropika, 6(2), 44-49.
Erina, E., & Darmawi, D. (2017). TOTAL BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) PADA
CAECUM PUYUH (Coturnix japonica). JURNAL ILMIAH MAHASISWA
VETERINER, 1(4), 774-779.
Virgianti, D. P. (2017). Penggunaan ekstrak kombinasi angkak dan daun jati
sebagai pewarna penutup pada pewarnaan gram. Jurnal Kesehatan
Bakti Tunas Husada: Jurnal Ilmu-ilmu Keperawatan, Analis Kesehatan
dan Farmasi, 17(1), 66-72.
Saputri, R. A., Widyorini, N., dan Purnomo, P. W. (2016). Identifikasi dan
kelimpahan bakteri pada jenis karang acropora sp. di reef flat terumbu
karang pulau panjang jepara identification and abundance of bacteria in
acropora sp. at coral reef flat panjang island jepara. Saintek Perikanan:
Indonesian Journal of Fisheries Science and Technology, 12(1), 35-39.
Hidayat, R., & Alhadi, F. (2012). Identifikasi Streptococcus equi dari kuda yang
diduga menderita strangles. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia, 17(3), 199-
203.
125
Oktavia, N., & Pujiyanto, S. (2018). Isolasi dan uji antagonisme bakteri endofit
tapak dara (Catharanthus roseus, L.) terhadap bakteri Escherichia coli
dan Staphylococcus aureus. Berkala Bioteknologi
Karsinah, Lucky, H.M., Suharto, Mardiastuti, H.W. 2011. Buku Ajar Mikrobiologi
Kedokteran : Batang Negatif Gram Escherichia. Tangerang : Binarupa
Aksara Publisher. pp. 195-8.
Radji, M., 2011, Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi dan
Kedokteran, 107, 118, 201-207, 295, Jakarta, Buku Kedokteran EGC.
126
LAMPIRAN
127
MATERI 6
Identifikasi Hifa

MALANG
2021
128
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Hifa adalah suatu struktur fungus berbentuk tabung menyerupai seuntai
benang panjang yang terbentuk dari pertumbuhan spora atau konidium (Gandjar
dkk., 2006b). Bagian yang mencolok dari jamur benang adalah miselium yang
terbentuk dari kumpulan hifa yang bercabang-cabang membentuk suatu jala.
Hifa sendiri memiliki fungsi yaitu
1. Penyerapan Nutrisi dari inang.
2. Penyerapan Nutrisi dari Tanah.
Fungi merupakan organisme yang bersifat heterotrof. Organisme ini
mendapatkan nutrisi dengan menyerap zat-zat makanan dari medium di
sekitarnya (Campbell, 2003). Fungi atau jamur berperan sebagai salah satu
dekomposer yang membantu proses dekomposisi bahan organik untuk
mempercepat siklus materi dalam ekosistem hutan (Suharna, 1993).
Fungi ada yang bersifat saprofit dan parasit. Fungi saprofit memperoleh
makanan dengan menyerap nutrisi dari bahan organik seperti tumbuhan dan
sisa-sisa hewan yang telah mati. sedangkan fungi parasit memperoleh nutrisi
dengan menyerap dari tumbuhan ataupun hewan yang masih hidup. Kelompok
utama fungi yang berperan sebagai pendegradasi ligniselulosa berasal dari
Basidiomycetes, karena mampu menghasilkan enzim pendegradasi ligniselulose
seperti selulose, ligninase, dan hemiselulose (Munir, 2006) , sehingga siklus
materi di alam dapat terus berlangsung.
129
Maksud dari Praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Identifikasi Hifa adalah
agar praktikan mampu memeahami cara mengidentifikasi hifa.
Tujuan dari Praktikum Mikrobiologi Dasar Materi Identifikasi Hifa adalah
untuk mempelajari dan memahami cara mengidentifikasi hifa jamur yang ditanam
pada media slide culture.
Waktu pelaksanaan praktikum Mikrobiologi Dasar dengn Materi
Identifikasi Hifa yaitu pada Hari Rabu, 01 Desember 2021 di rumah masing-
masing secara daring melalui via Google Meet.
130
2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Fungi
Jamur adalah mikroorganisme yang masuk golongan eukariotik dan tidak
termasuk golongan tumbuhan. Jamur berbentuk sel atau benang bercabang dan
mempuyai dinding sel yang sebagian besar terdiri atas kitin dan glukan, dan
sebagian kecil dari selulosa atau kitosan. Gambaran tersebut yang membedakan
jamur dengan sel hewan dan sel tumbuhan. Sel hewan tidak mempunyai dinding
sel, sedangkan sel tumbuhan sebagian besar adalah selulosa. Jamur
mempunyai protoplasma yang mengandung satu atau lebih inti, tidak mempunyai
klorofil dan berkembang biak secara aseksual, seksual, dan keduanya (Sutanto,
2008).
Sifat umum jamur (heterotropik) yaitu organisme yang tidak mempunyai
klorofil sehingga tidak dapat membuat makannya sendiri melalui proses
fotosintesis seperti tanaman. Untuk hidupnya jamur memerlukan zat organik
yang berasal dari hewan, tumbuh-tumbuhan, serangga dan lain-lain, kemudian
dengan menggunakan enzim zat organik tersebut diubah dan dicerna menjadi
zat anorganik yang kemudian diserap oleh jamur sebagai makanannya. Sifat
inilah yang menyebabkan keruskan benda dan makanan (Sutanto, 2008).
2.2 Kapang
Kapang adalah jamur yang tersusun dari hifa-hifa. Hifa tersebut dapat
bersekat sehingga terbagi menjadi banyak sel, atau tidak bersekat disebut hifa
senositik (coenocytic). Anyaman hifa baik yang multiseluler atau senositik disebut
miselium. Kapang membentuk koloni yang menyerupai kapas (cottony, woolly)
atau padat (velvety, powdery, granular) (Sutanto, 2008).
131
Kapang dapat tumbuh dalam suatu substrat atau medium berisikan
konsentrasi gula yang dapat menghambat pertumbuhan kebanyakan bakteri.
Demikian pula kapang umumnya dapat bertahan terhadap keadaan yang lebih
asam dari pada kebanyakan mikroba yang lain. Kapang adalah mikroorganisme
aerob sejati dan dapat tumbuh dalam kisaran suhu dari 22ºC sampai 30ºC,
spesies patogenik mempunyai suhu optimum lebih tinggi, biasanya 30 sampai
37ºC. Beberapa kapang akan tumbuh pada atau mendekati 0ºC dan dengan
demikian dapat menyebabkan kerusakan pada daging atau sayur-sayuran dalam
penyimpanan dingin (Pelczar, 2013).
2.3 Khamir
Sel khamir terdiri dari kapsul, dinding sel, membran sitoplasma, nucleus,
vakuola, globula lipid dan mitokondria. Khamir ini berbentuk oval (bulat telur)
dengan ukuran sekitar 1-5μm atau 20-25μm dengan lebar sekitar 1-10μm.
Koloninya berbentuk rata, lembab, mengkilap dan halus (Agustining, 2012).
Untuk khamir sendiri, secara makroskopis memiliki ciri-ciri koloni
berwarna putih susu atau putih kekuningan, memiliki spora dan tidak berlendir
(Pelczar, 1988). Selain dari bentuk dan warna, khamir dapat diamati juga dengan
bau yang dihasilkan isolat tersebut yaitu bau tape (alkohol).
2.4 Hifa
Bagian yang cukup penting dari sel jamur benang adalah hifa. Kumpulan
hifa membentuk struktur yang bernama miselium dan bisa dilihat mata telanjang.
Bentuknya yang seperti kumpulan benang-benang membuat jamur benang
memiliki sebutan lain yaitu jamur benang. Hifa memiliki fungsi untuk menyerap
nutrien dari lingkungan serta membentuk struktur untuk reproduksi. Hifa adalah
132
suatu struktur fungus berbentuk tabung menyerupai seuntai benang panjang
yang terbentuk dari pertumbuhan spora atau konidium (Gandjar dkk., 2006b).
Bagian yang mencolok dari jamur benang adalah miselium yang
terbentuk dari kumpulan hifa yang bercabang-cabang membentuk suatu jala.
Hifa berisi protoplasma yang dikelilingi oleh suatu dinding yang kuat.
Pertumbuhan hifa berlangsung terus-menerus di bagian apikal, sehingga
panjangnya tidak dapat ditentukan secara pasti. Diameter hifa umumnya tetap,
yaitu berkisar 3-30 μm. Jenis yang berbeda memiliki diameter yang berbeda
pula, dan ukuran diameter tersebut dapat juga dipengaruhi oleh keadaan
lingkungan (Carlile dan Watkinson,1994).
2.5 Slide Culture
Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengamati fungi yaitu
metode slide culture. Metode slide culture ini meliputi pengamatan bentuk hifa,
bentuk spesies fungi, serta ukuran spora dari fungi tersebut. Metode ini dapat
menunjukkan struktur mikroskopis kapang secara utuh sehingga proses
pengajaran dapat berlangsung dengan mudah (Sundari, 2012).
Pembuatan slide culture memiliki tujuan agar mendapatkan suatu biakan
kapang yang utuh sehingga bisa diamati strukturnya secara mikroskopis. Proses
pembuatan slide culture ini dilakukan secara aseptik (Sundari, 2012). Alat dan
bahan yang dibutuhkan diantaranya yaitu gelas objek, batang untuk penahan
gelas objek, gelas penutup, serta kapas steril. Metode ini dilakukan dengan
meneteskan media ke dalam gelas objek secukupnya, lalu jamur bisa dititikkan
ke dalam media yang sudah diteteskan. Setelah jamur dititikkan, gelas objek
ditutup menggunakan gelas penutup. Gelas tersebut diletakkan pada cawan petri
yang sudah diberi kapas steril dan batang penahan. Kapas ditetesi dengan
sedikit aquades dan diletakkan di bagian samping gelas objek yang telah
133
diletakkan pada cawan petri. Peletakan kapas steril yang ditetesi aquades ini
bertujuan untuk menjaga kelembaban ruangan di dalam cawan petri. Setelah itu,
cawan petri dibungkus dan siap diinkubasi dalam 3-5 hari (Valencia dan
Meitiniarti, 2017).
134
3. PEMBAHASAN
3.1 Pembuatan Slide Culture
Ambil media PDA yang telah disiapkan
Potong media PDA dengan ukuran 5 cm x 5 cm
Ambil potongan PDA dan letakkan di objek glass yang telah disterilkan
Tutup dengan cover glass yang telah disterilkan
Tusukkan sampel jamur pada potongan PDA
Taruh ke dalam cawan petri yang telah disterilkan
Beri kapas dan aquades steril
Inkubasi selama 3-7 hari
Gambar 33. Skema Kerja Pembuatan Slide Culture
Pembuatan slide culture dimulai dengan mengambil media berupa PDA
(Potato Dextrose Agar) yang sudah disiapkan. Lalu, media PDA tersebut
dipotong agar menjadi bentuk persegi dengan ukuran 5 cm x 5 cm. Potongan
PDA tersebut diletakkan pada objek glass yang kondisinya sudah steril. Setelah
PDA diletakkan pada objek glass, objek glass ditutup dengan cover glass yang
kondisinya sudah steril. Selanjutnya, sampel jamur ditusukkan pada potongan
135
medium PDA dan ditaruh pada cawan petri yang steril. Ruangan dalam cawan
petri diberi kapas dan aquades steril. Terakhir, dilakukan inkubasi selama 3-7
hari.
3.2 Identifikasi Hifa
Ambil sampel yang telah diinkubasi selama 3 -7 hari
Ambil cover
Taruh didalam objek glass yang telah di sterilkan
Tambahkan lactophenol blue
Amati di bawah mikroskop
Gambar 34. Skema Kerja Identifikasi Hifa
Dalam Praktikum Mikrobiologi Dasar ini, setelah dilakukannya pembuatan
slide culture tahapan selanjutnya adalah identifikasi hifa. Langkah pertama yaitu
mengambil slide culture yang telah diinkubasi selama 3-7 hari. Kemudian, ambil
cover dan letakkan di dalam objek glass yang telah disterilsasikan. Langkah
selanjutnya menambahkan lactophenol blue ke dalam objek glass. Kemudian,
amatilah sampel tersebut dibawah mikroskop.
Menurut Ristiari, N. P. N. et al. (2018), dalam pengamatan isolasi dan
identifikasi jamur mikroskopis pada rizosfer tanaman jeruk siam menggunakan
136
media PDA (Potato Dextrose Agar) yang dimana sama seperti yang digunakan
dalam Praktikum Mikrobiologi Dasar, akan tetapi waktu yang digunakan sampel
ketika inkubasi berbeda. Sampel jamur mikroskopis pada PDA dilakukan inkubasi
selama 7 hari dengan suhu 26-29°C, sedangkan pada praktikum dilakukan
inkubasi selama 3-7 hari. Salah satu biakan yang dihasilkan yaitu Mucor sp.
Biakan diamati ketika berumur 6 hari dan menunjukkan adanya ciri – ciri diantara
koloni memiliki hifa tidak bersepta dan berwarna hialin kebiruan, sporangiofor
berdinding tebal, terdapat kolumela, serta spora berbentuk bulat, oval, elips,
ovoid, semibulat, obovoid. Biakan Mucor sp. memenuhi cawan petri dalam waktu
6 hari pada media PDA. Hasil dalam pengamatan tersebut menunjukkan hifa
putih tidak bersepta, spora berdinding halus, berbentuk lonjong, hingga semi
bulat.
137
BAB 4. PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan Praktikum Mikrobiologi Dasar Identifikasi Hifa yang tealh
dilaksanakan, didapatkan kesimpulan sebagai berikut :
 Fungi ada yang bersifat saprofit dan parasit. Fungi saprofit memperoleh
makanan dengan menyerap nutrisi dari bahan organik seperti tumbuhan
dan sisa-sisa hewan yang telah mati
 Bagian yang cukup penting dari sel jamur benang adalah hifa. Kumpulan
hifa membentuk struktur yang bernama miselium dan bisa dilihat mata
telanjang.
 Hifa memiliki fungsi untuk menyerap nutrien dari lingkungan serta
membentuk struktur untuk reproduksi.
 Fungi terbagi menjadi beberapa kelompok berdasarkan
penampakkannya, yaitu Kapang, Khamir, dan Cendawan
4.2 Saran
Untuk jalannya praktikum kedepannya semoga dapat dilaksanakan
secara langsung atau offline di Laboratorium.
138
DAFTAR PUSTAKA
S. Fardiaz. 1992. Mikrobiologi Pangan I . Jakarta. Gramedia Pustaka Utama.
Gandjar, Indrawati dan Sjamsuridzal W. 2006. Mikologi dasar dan Terapan.
Jakarta: Yayasan obor Indonesia.
Abedon S. Fungi (2010). http://www.scribd.com/doc/34410557/Makalah-Kel-8-
Mikrobiologi-Basidiomycota-2003-Edisi-Revisi
Pratiwi, D. A. Maryati, Sri, Srikini, Suharno, Bambang, S. 2006. Biologi Jilid 1.
Jakarta: Erlangga.
Pratama, A.,A. Fitriani., H. Chairunnisa., T. Tyas (2017). Isolasi Dan Screnning
Yeast Isolat Lokal Dari Dendeng Sapi Dan Ayam Yang Memiliki
Potensi Fermentasi Glukosa. Laboratorium Teknologi Pengolahan
Produk Peternakan, Laboratorium Sosial Ekonomi Peternakan,
Laboratorium Mikrobiologi Program Studi Kedokteran Hewan. 17(1).
Ristiari, N. P. N, et al. (2018). Isolasi dan Identifikasi Jamur Mikroskopis Pada
Rizosfer Tanaman Jeruk Siam (Cytrus nobilis Lour.) di Kecamatan
Kintamani, Bali. Jurnal Biologi dan Perikanan Kelautan. Universitas
Pendidikan Ganesha Singaraja, 6 (1), 12-16.
Sundari. (2012). Suatu Model Pengembangan Media Pembelajaran Slide Culture
untuk Pengamatan Struktur Mikroskopis Kapang pada Matakuliah
Mycologi. Jurnal Bioedukasi, 1(1), 39-47.
Valencia, P.E., dan Meitiniarti, V.I. (2017). Isolasi dan Karakterisasi Jamur
Ligninolitik serta Perbandingan Kemampuannya dalam
Biodelignifikasi. Scripta Biologica, 4(3), 171-175.
139
LAMPIRAN
140

Laporan Praktikum Mikdas

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Laporan Praktikum Mikdas

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

LAPORAN PRAKTIKUM

Nasywa Putri Amelia 215080301111007

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar disusun sebagai tugas akhir dalam

kuliah Mikrobiologi Dasar.

Koordinator Asisten Asisten Laporan 1

(Siska Wahyuningtyas) (Riska Sulistiani Putri)

NIM. 185080301111003 NIM. 185080300111035

Asisten Laporan 2 Asisten Laporan 3

(Rafifa Bunga Jashinta) (M. Fadhilah Fadhlurrohman)

NIM. 185080301111009 NIM. 185080301111024

dapat menyelesaikan penyusunan Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar ini.

Adapun penyusunan Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar ini yaitu untuk

mata kuliah Mikrobiologi Dasar.

Tidak lupa, penyusun menyampaikan ucapan terima kasih kepada

seluruh asisten praktikum, rekan-rekan, serta seluruh pihak yang telah

membantu kami dalam penyusunan Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar ini.

Penyusunan laporan praktikum ini tidak akan selesai penyusunannya tanpa

bantuan dari pihak-pihak terkait.

Kami menyadari penyusunan laporan praktikum ini masih belum

sangat kami harapkan dari pembaca.

pihak-pihak yang membutuhkan.

Malang, 5 Desember 2021

Pengenalan Alat, Sterilisasi, dan Teknik Dasar Mikrobiologi

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

1.1 Latar Belakang

Mengenal peralatan laboratorium merupakan pendukung keberhasilan

jumlahnya beragam dan tentunya mempunyai fungsi masing-masing. Pentingnya

menggunakannya, sehingga tidak terjadi kecelakaan dan kerusakan alat akibat

penelitian tentunya harus didukung dengan pengetahuan alat-alat yang ada

untuk melakukan kegiatan di laboratorium. Pengetahuan tentang alat-alat

berlangsungnya praktikum tentang pengetahuan mengenai penggunaan alat

sangat diperlukan (Ririn, 2016).

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian haruslah terjaga

kehigienisannya atau steril. Terlebih jika berhubungan dengan mikrobiologi,

dan aktivitas mikroorganisme baik yang menganggu ataupun yang tidak

bahan-bahan penelitian. Sehingga untuk mencapai keadaan steril haruslah

alat tersebut telah memenuhi standar sterilisasi (Cahyani, 2014).

Pengetahuan mengenai alat-alat yang digunakan untuk penelitian harus

dipelajari dengan sungguh-sungguh karena menjadi faktor pendukung

berjalannya penelitian. Begitupula dengan proses sterilisasi harus benar-benar

dipahami karena sangatlah penting peranannya mengingat alat-alat yang

memahami keduanya dapat dipastikan, penelitian yang dilakukan akan berjalan

jika berhubungan dengan mikrooganisme, haruslah sangat berhati-hati dan taat

menyebabkan penyakit pada manusia.

1.2 Maksud dan Tujuan

Maksud dari praktikum Mikrobiologi Dasar Materi 1 adalah untuk

mengetahui dan memahami alat-alat praktikum beserta berbagai bagian dan

bisa praktikan dapat sebagai bekal untuk praktikum-praktikum selanjutnya.

dan sterilisasi adalah dapat memahami dan mempelajari alat-alat laboratorium

dan cara proses sterilisasi menggunakan autoklaf

1.3 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 29 November 2021, dan dimulai

pukul 16.15 WIB. Praktikum bertempat di rumah kami masing-masing. Praktikum

berlangsung secara online dengan keadaan yang kondusif dan mendukung.

Secara garis besar, sterilisasi adalah proses membunuh mikrooganisme

saat ditumbuhkan pada medium mikrooganisme tidak dapat tumbuh dan

berkembang biak. Dalam proses sterilisasi alat yang digunakan memerlukan

menjaga kebersihan supaya peralatan terbebas dari mikroorganisme berbahaya

Umumnya sterilisasi bertujuan untuk teradinya proses denaturasi protein,

termasuk enzim-enzim didalam sel (Istini, 2020).

Sterilisasi memiliki dua macam yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi

kering. Menurut Istini (2020), sterilisasi basah umumnya menggunakan autoklaf