- 1815 -
UJI BATAS MIKROBA<51>
A. UJI ENUMERASI MIKROBA
Pendahuluan
Bab ini menjelaskan tentang pengujian kuantitatif
untuk bakteri mesofil dan kapang yang dapat tumbuh
pada kondisi aerob.
Pengujian ini dirancang untuk menentukan suatu
bahan atau sediaan memenuhi spesifikasi mutu secara
mikrobiologi yang telah ditetapkan, termasuk jumlah
sampel yang akan digunakan dan interpretasi hasil uji.
Metode ini tidak dapat diaplikasikan untuk produk
yang mengandung mikroba viabel sebagai bahan
aktif.
Prosedur mikrobiologi lain termasuk metode
otomatisasi dapat digunakan setelah dibuktikan
kesetaraannya dengan metode farmakope.
Prosedur Umum
Pengujian dilakukan pada kondisi aseptik sebagai
tindakan pencegahan untuk menghindari kontaminasi
mikroba dari luar produk, tetapi tidak mempengaruhi
mikroba yang diuji.
Jika produk mempunyai aktifitas antimikroba
sebelum diuji lakukan netralisasi menggunakan
inaktivator yang telah dibuktikan tidak toksik
terhadap mikroba yang diuji.
Jika zat aktif permukaan digunakan untuk
penyiapan sampel, tidak boleh bersifat toksik
terhadap mikroorganisme dan harus kompatibel
dengan inaktivator yang digunakan.
Metode Penghitungan
Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan
Membran atau salah satu Metode Angka Lempeng
yang sesuai. Metode lain adalah Angka Paling
Mungkin (APM) yang umum digunakan untuk produk
dengan tingkat kontaminasi rendah.
Pemilihan metode pengujian berdasarkan beberapa
faktor antara lain jenis produk yang diuji, persyaratan
yang ditentukan dan ukuran sampel yang memadai
untuk memperkirakan kesesuaian secara spesifik.
Kesesuaian metode yang dipilih harus ditetapkan.
UJI FERTILITAS, KESESUAIAN METODE
PENGHITUNGAN DAN KONTROL NEGATIF
Ketentuan Umum
Kemampuan metode untuk mendeteksi mikroba
pada produk harus ditetapkan.
Jika terjadi perubahan kinerja pengujian pada
produk yang mempengaruhi hasil uji, maka harus
dilakukan verifikasi terhadap kesesuaian metode.
Penyiapan Galur Mikroba Uji
Gunakan suspensi mikroba uji terstandar yang
stabil. Galur mikroba uji dipelihara dengan Teknik
Biakan Lot Benih tidak lebih dari 5 pasase dari
master lot benih asli. Biakkan tiap galur bakteri dan
kapang uji secara terpisah seperti yang tertera pada
Tabel 1.
Untuk membuat suspensi mikroba uji gunakan
Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0 atau Dapar
fosfat pH 7,2; untuk memisahkan spora Aspergillus
brasiliensis tambahkan polisorbat 80 P 0,05% pada
dapar. Gunakan dapar dalam waktu 2 jam atau dalam
24 jam jika disimpan pada 2º – 8º. Setelah dipilih
untuk menyiapkan suspensi segar sel vegetatif
A.brasiliensis atau B.subtilis, siapkan suspensi spora
yang stabil dan gunakan untuk inokulum dalam
pengujian dengan volume yang sesuai. Suspensi
spora yang stabil dipelihara pada 2º – 8º untuk jangka
waktu yang tervalidasi.
Kontrol Negatif
Untuk membuktikan kesesuaian kondisi
pengujian, kontrol negatif dilakukan menggunakan
pengencer yang sesuai seperti pada penyiapan larutan
uji. Tidak boleh terjadi pertumbuhan mikroba.
Kontrol negatif dilakukan pada saat pengujian seperti
yang tertera pada Pengujian Sediaan. Kegagalan
kontrol negatif memerlukan investigasi.
Fertilitas Media
Uji setiap bets media jadi dan setiap bets media
yang dibuat dari media kering atau dari bahan yang
tertera pada formula.
Inokulasi sejumlah kecil mikroba (tidak lebih dari
100 koloni per plate) ke dalam Soybean-Casein
Digest Broth, Soybean-Casein Digest Agar dan
Sabouraud Dextrose Agar seperti tertera pada Tabel
1. Inkubasi sesuai dengan kondisi yang tertera pada
Tabel 1.
Untuk media padat, pertumbuhan yang diperoleh
tidak boleh berbeda dua kali dari nilai hitung
inokulum standar. Pertumbuhan mikroba dan hasil uji
fertilitas pada inokulum yang dibuat segar harus
sebanding dengan bets sebelumnya. Media cair dapat
digunakan jika pertumbuhan mikroba uji terlihat jelas
dan sebanding dengan inokulum yang telah sesuai
dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.
 - 1816 -

Tabel 1.
Penyiapan dan Penggunaan Mikroba Uji
Kesesuaian Metode Penghitungan
Fertilitas
dalam Sediaan
Penghitungan Penghitungan Angka Lempeng
Penyiapan Angka Kapang
Mikroba Uji Total Mikroba Total Kapang Total Mikroba
Galur Uji dan Khamir
Aerob dan Khamir Aerob
Staphylococcus Soybean-Casein Soybean-Casein Soybean-Casein
aureus ATCC Digest Agar atau Digest Agar atau Digest Agar/APM
6538, NCIMB Soybean- Casein Soybean- Casein Soybean-Casein
9518, CIP 4.83, Digest Broth, Digest Broth Digest Broth
atau NBRC 30-35°, ≤100 koloni, ≤100 koloni,
13276 18-24 jam 30-35°, 30-35°,
≤ 3 hari ≤ 3 hari
Pseudomonas Soybean-Casein Soybean-Casein Soybean-Casein
aeruginosa Digest Agar atau Digest Agar atau Digest Agar/APM
ATCC 9027, Soybean- Casein Soybean- Casein Soybean-Casein
NCIMB 8626, Digest Broth, Digest Broth, Digest Broth,
CIP 82.118 atau 30-35°, ≤100 koloni ≤100 koloni,
NBRC 13275 18-24 jam 30-35°, 30-35°,
≤ 3 hari ≤ 3 hari
Bacillus subtilis Soybean-Casein Soybean-Casein Soybean-Casein
ATCC 6633, Digest Agar atau Digest Agar atau Digest Agar/APM
NCIMB 8054, Soybean- Casein Soybean- Casein Soybean-Casein
CIP 52.62 atau Digest Broth , Digest Broth Digest Broth
NBRC 3134 30-35°, ≤100 koloni, ≤100 koloni,
18-24 jam 30-35°, 30-35°,
≤ 3 hari ≤ 3 hari

Candida albicans Sabouraud Soybean-Casein Sabouraud Soybean-Casein Sabouraud

ATCC 10231, Dextrose Agar Digest Agar Dextrose Agar Digest Agar Dextrose Agar
NCPF 3179, IP atau Sabouraud ≤100 koloni, ≤100 koloni, ≤100 koloni, ≤100 koloni,
48.72 atau NBRC Dextrose Broth, 30-35°, 20-25°, 30-35°, 20-25°,
1594 20-25°, ≤ 5 hari ≤ 5 hari ≤ 5 hari ≤ 5 hari
2-3 hari APM: tidak ada
Aspergillus Sabouraud Soybean-Casein Sabouraud Soybean-Casein Sabouraud
brasiliensis Dextrose Agar Digest Agar, Dextrose Agar, Digest Agar, Dextrose Agar,
ATCC 16404, atau Potato- ≤100 koloni, ≤100 koloni, ≤100 koloni, ≤100 koloni,
IMI 149007, IP Dextrose Agar 30-35°C 20-25°, 30-35°C, 20-25°,
1431.83 atau 20-25°, ≤ 5 hari ≤ 5 hari ≤ 5 hari ≤ 5 hari
NBRC 9455 5-7 hari, atau APM: tidak ada
hingga diperoleh
sporulasi yang
baik

Kesesuaian Metode Penghitungan Mikroba
dalam Sediaan
PENYIAPAN SAMPEL
Metode penyiapan sampel disesuaikan dengan sifat
fisik sediaan yang diuji. Jika dengan prosedur yang
diuraikan di bawah ini tidak ada yang memuaskan
maka harus dikembangkan prosedur lain yang sesuai.
Sediaan Larut Air Larutkan atau encerkan sediaan
yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan
Dapar Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan
Dapar Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest
Broth bila perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika perlu
encerkan dengan pelarut yang sama.
Sediaan Bukan Lemak yang Tidak Larut dalam
Air Suspensikan atau encerkan sediaan yang akan
diuji (biasanya 1 dalam 10) dalam Larutan Dapar
Natrium Klorida-Pepton pH 7,0, atau Larutan Dapar
Fosfat pH 7,2, atau Soybean-Casein Digest Broth.
Dapat ditambahkan surfaktan seperti Polisorbat 80 1
g per L untuk membantu mensuspensikan bahan yang
sulit dibasahi, jika perlu atur pH hingga 6 - 8. Jika
perlu encerkan dengan pelarut yang sama.
Sediaan Berlemak Larutkan atau encerkan sediaan
yang akan diuji dalam isopropil miristat steril yang
disterilkan dengan cara penyaringan atau campurkan
sediaan yang akan diuji dengan sesedikit mungkin
surfaktan Polisorbat 80 steril atau surfaktan non-
inhibitor lain steril, jika perlu hangatkan dalam tangas
air pada suhu tidak lebih dari 40º atau pada kasus
 - 1817 -

tertentu tidak lebih dari 45º. Aduk perlahan-lahan dan meyakinkan validitas hasil. Beberapa contoh
jika perlu pertahankan suhu dalam tangas air. perubahan prosedur yaitu dengan :
Tambahkan secukupnya pengencer yang telah (1) Penambahan jumlah volume pengencer atau
dihangatkan hingga diperoleh pengenceran 1 dalam media biakan;
10. Aduk perlahan-lahan dan jika perlu pertahankan (2) Penambahan larutan penetral khusus atau
suhu dengan waktu sesingkat mungkin untuk umum pada pengencer;
pembentukan emulsi. Lakukan pengenceran (3) Penyaringan membran; atau
bertingkat dengan pengencer yang sesuai (4) Kombinasi perubahan di atas.
mengandung surfaktan Polisorbat 80 P dengan kadar
sesuai atau surfaktan non-inhibitor lain steril. Zat Penetral Zat penetral digunakan untuk
Cairan atau Padatan dalam bentuk Aerosol menetralkan aktifitas senyawa antimikroba. (seperti
Pindahkan seluruh isi sediaan dengan cara aseptik yang tertera pada Tabel 2). Zat tersebut dapat
dalam penyaring membran atau wadah steril yang ditambahkan pada pengencer atau media yang sesuai
sesuai untuk pengambilan sampel. Gunakan seluruh sebelum disterilkan. Jika digunakan metode tersebut,
isi atau sejumlah tertentu sediaan dari tiap wadah efikasi dan hilangnya toksisitas terhadap mikroba
yang diuji. harus dibuktikan dengan melakukan penambahan zat
“Transdermal Patches” Lepaskan lapisan, penetral pada blangko tanpa sediaan.
letakkan bagian berperekat menghadap ke atas pada
lempeng kaca steril atau baki plastik. Agar tidak Tabel 2
saling menempel tutup permukaan berperekat dengan Zat Penetral Umum / Metode untuk
bahan berpori steril yang sesuai (misal kasa steril), Zat Penghambat
kemudian pindahkan lembaran transdermal dalam Zat Penghambat
Zat Penetral
wadah berisi pengencer yang mengandung polisorbat Potensial/Metode
80 P atau lesitin dengan volume yang sesuai. Kocok Glutaraldehid, raksa Natrium hidrogen sulfit
kuat selama tidak kurang dari 30 menit. (Natrium bisulfit)
Fenolik, alkohol,
Pengenceran
aldehid, sorbat
INOKULASI DAN PENGENCERAN
Senyawa amonium
kuartener,
Tambahkan suspensi mikroba uji pada sampel dan Lesitin
parahidroksibenzoat
suspensi kontrol (pengencer tanpa sampel) seperti (paraben), bis-biguanida
yang tertera di atas, untuk mendapatkan inokulum Senyawa amonium
dengan jumlah tidak lebih dari 100 koloni. Volume kuartener, iodin, Polisorbat
suspensi inokulum tidak lebih dari 1% dari volume paraben
sediaan yang diencerkan. Raksa Tioglikolat
Untuk menunjukkan perolehan kembali mikroba Raksa, halogen, aldehid Tiosulfat
uji yang dapat diterima dari sediaan, faktor EDTA(edetat) Ion Mg atau Ca
pengenceran terendah dari sampel yang disiapkan
harus digunakan untuk pengujian. Jika hal tersebut Jika tidak dapat ditemukan metode netralisasi yang
tidak memungkinkan karena adanya aktifitas sesuai, dapat diartikan bahwa kegagalan isolasi
antimikroba atau kelarutan sediaan yang rendah, perlu mikroba yang diinokulasikan disebabkan oleh
dikembangkan protokol uji yang sesuai. Jika sifat aktivitas antimikroba dari sediaan. Hal ini
penghambatan pertumbuhan dari sampel tidak dapat menunjukkan bahwa sediaan tidak terkontaminasi
dihindari, maka jumlah total suspensi mikroba uji mikroba uji. Ulangi pengujian dengan pengenceran
mungkin harus ditambah setelah proses netralisasi yang lebih tinggi yang sesuai dengan pertumbuhan
dengan pengenceran atau penyaringan. mikroba uji dan kriteria keberterimaan khusus.

NETRALISASI/PENGHILANGAN PEROLEHAN KEMBALI MIKROBA UJI

AKTIFITAS ANTIMIKROBA DALAM SEDIAAN

Jumlah perolehan kembali mikroba uji dari sampel
yang disuspensikan seperti tertera pada Inokulasi dan
Pengenceran, diinkubasi mengikuti prosedur yang
tertera pada Perolehan kembali mikroba uji dalam
sediaan, dibandingkan dengan jumlah mikroba uji
yang diperoleh kembali dari suspensi kontrol.
Jika pertumbuhan terhambat (dengan faktor
reduksi lebih besar dari 2), maka lakukan perubahan
prosedur untuk penghitungan khusus untuk
Untuk tiap mikroba yang terdaftar, lakukan uji
terpisah. Hanya mikroba yang ditambahkan yang
dihitung.
Penyaringan Membran Gunakan penyaring
membran dengan porositas tidak lebih dari 0,45 µm.
Jenis bahan penyaring dipilih sedemikian rupa
sehingga kemampuan menahan bakteri tidak
dipengaruhi oleh kandungan sampel uji. Gunakan satu
jenis membran penyaring untuk tiap mikroba uji.
 - 1818 -

Pindahkan sejumlah suspensi sampel yang pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan Pengenceran
disiapkan seperti tertera pada Penyiapan Sampel, serta Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba.
Inokulasi dan Pengenceran serta Netralisasi/ Dari tiap tingkat pengenceran suspensi sediaan
Penghilangan Aktifitas Antimikroba (minimal inokulasikan masing-masing 1 mL ke dalam tiga seri
mengandung 1 g sediaan, atau kurang jika tabung berisi 9 – 10 mL media Soybean-Casein
diperkirakan jumlah koloni besar) saring segera dan Digest Broth. Jika perlu tambahkan surfaktan seperti
bilas penyaring membran dengan sejumlah tertentu polisorbat 80 P atau inaktivator zat antimikroba ke
volume pengencer. dalam media. Jika dibuat tiga tingkat pengenceran,
Untuk menentukan angka lempeng total mikroba maka diperoleh 9 tabung terinokulasi. Inkubasi semua
aerob (ALT), pindahkan penyaring membran ke tabung yang telah diinokulasi pada suhu 30° - 35°
permukaan lempeng media Soybean-Casein Digest selama tidak lebih dari 3 hari. Jika terdapat kesulitan
Agar (SCDA). Untuk menentukan Angka Kapang dalam membaca hasil, atau ketidakyakinan terhadap
Khamir (AKK), pindahkan membran ke permukaan sifat dari sediaan yang diuji, lakukan sub-kultur pada
lempeng media Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi media yang sama atau Soybean Casein Digestic Agar
cawan seperti yang tertera pada Tabel 1. Lakukan selama satu sampai 2 hari pada suhu yang sama,
pengamatan dan penghitungan. gunakan hasil ini. Dengan menggunakan Tabel 3
Metode Angka Lempeng Total Metode angka dapat ditentukan angka paling mungkin (APM) per g
lempeng total dilakukan setidaknya duplo untuk tiap atau mL sediaan uji.
media, dan hasil merupakan rata-rata hitung jumlah
koloni. Tabel 3 Nilai Angka Paling Mungkin Mikroba
Metode Tuang Gunakan cawan Petri berdiameter Kombinasi Jumlah APM Batas
9 cm, inokulasikan 1 mL suspensi sampel seperti yang Tabung Pada Tiap Seri per g atau Kepercayaan
tertera pada Preparasi Penyiapan Sampel, Inokulasi yang Menunjukkan per mL 95%
dan Pengenceran serta Netralisasi /Penghilangan Pertumbuhan sediaan
Aktifitas Antimikroba ke dalam tiap cawan dan Jumlah g atau mL
sediaan per tabung
kemudian tambahkan 15 - 20 mL Soybean-Casein
0,1 0,01 0,001
Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar pada suhu 0 0 0 <3 0-9,4
tidak lebih dari 45°. Jika digunakan cawan Petri yang 0 0 1 3 0,1-9,5
lebih besar, sesuaikan jumlah media. Lakukan duplo 0 1 0 3 0,1-10
untuk tiap mikroba uji yang tercantum pada Tabel 1. 0 1 1 6,1 1,2-17
Inkubasi cawan seperti yang tertera pada Tabel 1. 0 2 0 6,2 1,2-17
Hitung jumlah koloni rata-rata dari tiap cawan media 0 3 0 9,4 3,5-35
dan jumlah koloni inokulum awal. 1 0 0 3,6 0,2-17
Metode Sebar Untuk lempeng media gunakan 1 0 1 7,2 1,2-17
cawan Petri diameter 9 cm, diisi 15-10 mL Soybean- 1 0 2 11 4-35
Casein Digest Agar atau Sabouraud Dextrose Agar 1 1 0 7,4 1,3-20
pada suhu lebih kurang 45° pada tiap cawan Petri, dan 1 1 1 11 4-35
biarkan memadat. Jika digunakan cawan Petri yang 1 2 0 11 4-35
lebih besar, sesuaikan jumlah media. Keringkan 1 2 1 15 5-38
permukaan lempeng media dalam lemari laminar- 1 3 0 16 5-38
2 0 0 9,2 1,5-3,5
airflow atau dalam inkubator. Lakukan duplo untuk
2 0 1 14 4-35
tiap mikroba uji yang tertera pada Tabel 1.
2 0 2 20 5-38
Inokulasikan 0,1 mL suspensi sampel yang disiapkan
2 1 0 15 4-38
seperti pada Penyiapan Sampel, Inokulasi dan 2 1 1 20 5-38
Pengenceran serta Netralisasi/Penghilangan Aktifitas 2 1 2 27 9-94
Antimikroba dengan menyebarkan pada permukaan 2 2 0 21 5-40
lempeng media. Inkubasi dan hitung jumlah koloni 2 2 1 28 9-94
seperti yang telah dijelaskan pada Metode Tuang. 2 2 2 35 9-94
Metode Angka Paling Mungkin (APM) Presisi 2 3 0 29 9-94
maupun akurasi Metode APM kurang dibandingkan 2 3 1 36 9-94
dengan Metode Penyaringan Membran atau Metode 3 0 0 23 5-94
Angka Lempeng Total. Hasilnya tidak dapat 3 0 1 38 9-104
diandalkan terutama untuk penghitungan khamir. 3 0 2 64 16-181
Metode APM dapat digunakan untuk menghitung 3 1 0 43 9-181
ALT jika tidak ada metode lain yang sesuai dan jika 3 1 1 75 17-199
telah ditetapkan sebagai metode pilihan. 3 1 2 120 30-360
Siapkan minimal tiga seri pengenceran (10-1, 10-2, 3 1 3 160 30-380
3 2 0 93 18-360
10-3) suspensi sediaan dengan cara seperti yang tertera
 - 1819 -

Kombinasi Jumlah APM Batas mendapatkan jumlah yang diperlukan, campurkan

Tabung Pada Tiap Seri per g atau Kepercayaan sejumlah isi wadah hingga mencapai jumlah sampel
yang Menunjukkan per mL 95% yang cukup.
Pertumbuhan sediaan
3 2 1 150 30-380
Pemeriksaan Sediaan
3 2 0 93 18-360
3 2 2 210 30-400
3 2 3 290 90-990
PENYARINGAN MEMBRAN
3 3 0 240 40-990
3 3 1 460 90-1980 Gunakan alat penyaring yang dirancang
3 3 2 1100 200-4000 sedemikian rupa sehingga memungkinkan
3 3 3 >1100 pemindahan membran penyaring ke media. Siapkan
sampel menggunakan metode yang tertera pada Uji
HASIL DAN INTERPRETASI Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan,
pindahkan sejumlah yang sesuai pada dua penyaring
Jika ada kesesuaian antara Metode Penyaringan membran, saring segera. Bilas tiap penyaringan sesuai
Membran atau Metode Angka Lempeng, hitung dengan prosedur.
jumlah rata-rata mikroba uji dengan nilai Untuk menentukan ALT, pindahkan satu penyaring
keberterimaan tidak lebih dari faktor 2 suspensi membran ke permukaan Soybean-Casein Digestic
kontrol tanpa sediaan seperti yang tertera pada Agar. Untuk menentukan AKK, pindahkan satu
Inokulasi dan Pengenceran. penyaring membran yang lain ke permukaan
Jika ada kesesuaian dengan Metode APM nilai Sabouraud Dextrose Agar. Inkubasi cawan Soybean-
inokulum yang dihitung harus dalam batas Casein Digest Agar pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5
kepercayaan 95% dari nilai suspensi kontrol. hari dan cawan Sabouraud Dextrose Agar pada suhu
Jika kriteria tersebut di atas tidak dapat dipenuhi 20° - 25° selama 5-7 hari. Hitung jumlah koloni per g
untuk satu atau lebih mikroba yang diuji dengan atau per mL sediaan.
metode tersebut di atas, maka metode dan kondisi uji Untuk pengujian sampel “transdermal patches”,
harus mendekati kriteria yang digunakan untuk secara terpisah saring 10% dari volume larutan seperti
menguji sediaan. yang tertera pada Penyiapan Sampel, gunakan dua
penyaring membran steril. Pindahkan satu membran
PENGUJIAN SEDIAAN pada Soybean-Casein Digest Agar untuk ALT dan
membran lainnya pada Sabouraud Dextrose Agar
Jumlah Sediaan yang Digunakan untuk untuk AKK.
Pengujian
METODE ANGKA LEMPENG TOTAL
Jika tidak dinyatakan lain gunakan 10 g atau 10 mL
sediaan uji yang diambil dengan cara seperti di atas. Metode Tuang Siapkan sampel menggunakan
Untuk sediaan cairan atau padatan dalam aerosol metode yang sesuai seperti yang tertera pada Uji
gunakan 10 wadah sampel, demikian juga untuk Fertilitas dan Kesesuaian Metode Penghitungan.
sampel “transdermal patches”. Siapkan untuk masing-masing media sekurang-
Jumlah yang diuji dapat dikurangi untuk sediaan kurangnya dua cawan Petri untuk tiap tingkat
dengan bahan aktif yang dibuat dalam tiap unit dosis pengenceran. Inkubasi cawan Soybean-Casein Digest
(contoh tablet, kapsul, injeksi) kurang dari atau sama Agar pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari dan cawan
dengan 1 mg, atau jumlah per g atau mL (untuk Sabouraud Dextrose Agar pada suhu 20° - 25° selama
penyiapan sampel tidak dalam unit dosis) kurang dari 5-7 hari. Pilih cawan dari satu tingkat pengenceran
1 mg. Dalam hal ini jumlah sampel yang diuji tidak dengan jumlah koloni tertinggi yang kurang dari 250
kurang dari 10 unit dosis atau 10 g atau 10 mL untuk ALT dan 50 koloni untuk AKK. Hitung jumlah
sediaan. rata-rata koloni dalam media biakan dan jumlah
Untuk bahan aktif dengan jumlah sampel terbatas koloni per g atau per mL sediaan.
atau ukuran bets sangat kecil (misalnya kurang dari Metode Sebar Siapkan sampel dengan metode
1000 mL atau 1000 g) jumlah sampel yang diuji harus yang sesuai seperti yang tertera pada Uji Fertilitas
1% dari bets kecuali jumlah yang lebih kecil dan Kesesuaian Metode Penghitungan. Siapkan
ditentukan atau dinyatakan dan disetujui. sekurang-kurangnya dua cawan Petri untuk tiap
Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets media dan tiap tingkat pengenceran. Untuk inkubasi
kurang dari 200 unit (misal sampel untuk uji klinis), dan penghitungan jumlah koloni, lakukan seperti yang
ukuran sampel dapat dikurangi menjadi dua unit atau tertera pada Metode Tuang.
satu unit jika kurang dari 100 unit.
Ambil sampel secara acak dari ruahan sediaan atau
dari wadah yang tersedia pada saat pengerjaan. Untuk
 - 1820 -

METODE ANGKA PALING MUNGKIN (APM) PROSEDUR UMUM

Siapkan dan encerkan sampel dengan metode Penyiapan sampel dilakukan seperti tertera pada
sesuai seperti yang tertera pada Uji Fertilitas dan Uji enumerasi mikroba.
Kesesuaian Metode Penghitungan. Inkubasi semua Jika produk yang akan diuji memiliki aktifitas
tabung selama 3-5 hari pada suhu 30°-35°. Jika perlu antimikroba, sebaiknya sifat antimikroba dihilangkan
lakukan subkultur, gunakan metode yang sesuai. atau dinetralkan seperti tertera pada Uji enumerasi
Catat jumlah tabung yang menunjukkan pertumbuhan mikroba.
mikroba pada tiap tingkat pengenceran. Tentukan Jika digunakan bahan aktif permukaan (surfaktan)
APM mikroba per g atau mL sediaan berdasarkan untuk penyiapan sampel, harus dapat dibuktikan
Tabel 3. sesuai dan tidak toksik bagi mikroba dan sesuai
dengan inaktivator yang digunakan dalam produk
Interpretasi Hasil yang diuji seperti yang tertera pada Uji enumerasi
mikroba.
Angka Lempeng Total (ALT) dianggap sama
dengan angka koloni yang ditemukan pada Soybean- FERTILITAS DAN DAYA HAMBAT MEDIA,
Casein Digest Agar; jika koloni jamur ditemukan KESESUAIAN UJI DAN KONTROL NEGATIF
pada media ini, dihitung sebagai bagian dari jumlah
ALT. Angka Kapang dan Khamir (AKK) dianggap Kemampuan metode deteksi mikroba yang terdapat
sama dengan jumlah koloni yang ditemukan pada dalam produk yang diuji harus ditetapkan. Jika ada
Sabouraud Dextrose Agar; jika koloni bakteri perubahan kemampuan dalam pengujian atau ada
ditemukan pada media ini, maka dihitung sebagai perubahan dalam produk yang dapat mempengaruhi
bagian dari AKK. Jika AKK diperkirakan melebihi hasil uji, harus dilakukan konfirmasi metode.
kriteria keberterimaan berdasarkan pertumbuhan
bakteri, dapat digunakan Sabouraud Dextrose Agar Penyiapan Galur Uji
yang mengandung antibiotik. Jika penghitungan
dilakukan menggunakan metode APM, maka nilai Gunakan suspensi galur uji baku yang stabil. Galur
penghitungan yang diperoleh merupakan angka total uji dipelihara dengan Teknik Biakan Lot Benih tidak
mikroba aerobik (ALT). lebih dari 5 pasase dari master lot benih asli.
Jika telah ditetapkan kriteria keberterimaan untuk
mutu mikrobiologi, maka di-interpretasikan sebagai MIKROBA AEROB
berikut:
- 101 koloni: maksimal penghitungan yang dapat Biakkan masing-masing galur bakteri di bawah ini,
diterima = 20; pisahkan masing-masing dalam wadah berisi media
- 102 koloni: maksimal penghitungan yang dapat Soybean-Casein Digest Broth atau Soybean-Casein
diterima = 200; Digest Agar, pada suhu 30⁰ - 35⁰ selama 18 - 24 jam.
- 103 koloni: maksimal penghitungan yang dapat Biakkan galur uji Candida albicans dalam Sabouraud
diterima = 2000; dan seterusnya. Dextrose Agar atau Sabouraud Dextrose Broth, pada
Larutan dan media yang disarankan tertera pada suhu 20⁰ - 25⁰ selama 2 - 3 hari.
Pengujian Mikroba Spesifik.
Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB
B. PENGUJIAN MIKROBA SPESIFIK 9518, CIP 4.83 atau
NBRC13276
PENDAHULUAN Pseudomonas ATCC 9027, NCIMB
aeruginosa 8626, CIP 82.118 atau
Pada Bab ini akan dijelaskan tentang Uji Batas NBRC 13275
Mikroba Spesifik yang mungkin terdeteksi dengan Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB
kondisi dan metode yang sesuai. 8545, CIP 53.126 atau
Metode uji dirancang untuk menetapkan suatu NBRC 3972
produk memenuhi kriteria mutu secara mikrobiologi. Salmonella enterica ATCC 14028
Untuk pelaksanaan pengujian ikuti petunjuk di bawah subsp enterica serovar
ini, termasuk jumlah sampel dan interpretasi hasil uji. Typhimurium atau
Metode pilihan termasuk metode otomatis sebagai pilihan lain
dimungkinkan untuk digunakan setelah dibuktikan
Salmonella enterica NBRC 100797, NCTC
kesetaraannya dengan metode farmakope.
subsp enterica serovar 6017 atau CIP 80.39
Abony

Candida albicans ATCC 10231, NCPF
3179, IP 48.72 atau
NBRC 1594
Gunakan Dapar Natrium Klorida–Pepton pH 7 atau
Dapar Fosfat pH 7,2 untuk membuat suspensi uji.
Gunakan suspensi tersebut dalam waktu 2 jam atau
jika digunakan sampai 24 jam harus disimpan pada
suhu 2° - 8°.
CLOSTRIDIA
Gunakan Clostridium sporogenes seperti ATCC
11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651)
atau ATCC 19404 (NCTC 532 atau CIP 79.3).
Biakkan galur uji Clostridia dalam keadaan anaerob
pada Reinforce Medium for Clostridia pada suhu
30° - 35° selama 24 - 48 jam. Sebagai pilihan lain,
siapkan dan encerkan sel vegetatif dalam bentuk
suspensi segar. Suspensi spora stabil pada suhu 2° - 8°
selama periode yang tervalidasi.
Kontrol Negatif
Untuk verifikasi kesesuaian kondisi pengujian,
kontrol negatif dilakukan menggunakan pelarut yang
sesuai menggantikan sediaan uji. Tidak boleh terjadi
pertumbuhan mikroba. Kontrol negatif juga dilakukan
pada saat dilakukan uji terhadap sediaan seperti yang
tertera pada Pengujian Sediaan. Apabila terjadi
kegagalan pada kontrol negatif diperlukan investigasi.
Fertilitas dan Daya hambat Media
Uji setiap bets media siap-pakai, media yang
disiapkan dari media kering atau dari komponen
media. Verifikasi sifat seperti yang tertera pada Tabel
1.
Uji Fertilitas Media Cair Inokulasikan ke dalam
media yang sesuai, mikroba uji dalam jumlah sedikit
(tidak lebih dari 100 koloni), inkubasi pada suhu
tertentu, tidak lebih dari periode terpendek yang
tertera pada prosedur uji. Untuk media cair,
pertumbuhan mikroba uji harus terlihat jelas dan
harus sama dengan inokulum yang telah sesuai
dengan hasil uji fertilitas bets media sebelumnya.
Tabel 1 Uji Fertilitas, Penghambatan dan “Test for Indicative Properties”
Uji/Media
Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-
negatif
Media Cair Pengkaya Fertilitas
Enterobacteriaceae Mossel
Daya hambat
Violet Red Bile Glucose Agar Fertilitas + indikatif
- 1821 -
Uji Fertilitas Media Padat Gunakan Metode
Sebar seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji
enumerasi mikroba. Inokulasikan masing-masing
cawan dengan sejumlah mikroba uji yang sesuai
(tidak lebih dari 100 koloni). Inkubasikan pada suhu
tertentu tidak lebih dari periode terpendek seperti
tertera dalam prosedur uji. Pertumbuhan mikroba
sama dengan inokulum yang telah sesuai dengan hasil
uji fertilitas bets media sebelumnya.
Uji Daya Hambat Media Cair atau Padat
Inokulasikan sejumlah mikroba uji paling sedikit 100
koloni pada sejumlah media yang diinkubasi pada
suhu tertentu tidak kurang dari periode terpanjang
seperti tertera pada Prosedur uji. Tidak boleh ada
pertumbuhan mikroba uji.
“Test for Indicative Properties” Gunakan Metode
Sebar seperti tertera pada Metode Tuang dalam Uji
enumerasi mikroba. Inokulasikan masing-masing
cawan dengan mikroba sesuai (tidak boleh lebih dari
100 koloni). Inkubasikan pada suhu tertentu dalam
batas uji. Ciri koloni mikroba uji harus terlihat jelas
dan harus sama dengan inokulum yang sebelumnya.
Kesesuaian Metode Uji
Untuk masing-masing sediaan baru yang diuji
lakukan penyiapan sampel, seperti tertera pada
Pengujian Sediaan. Pada saat inokulasi suspensi
sampel, tambahkan masing-masing galur mikroba uji
tidak lebih dari 100 koloni dalam media pertumbuhan
yang telah ditentukan.
Lakukan uji seperti tertera pada Pengujian Sediaan
dengan masa inkubasi terpendek.Mikroba uji spesifik
harus dapat dideteksi dengan reaksi dan sifat-sifat
seperti dijelaskan dalam Pengujian Sediaan.
Modifikasi prosedur uji untuk menetralkan
aktifitas antimikroba harus dilakukan (tertera pada
Netralisasi/Penghilangan Aktifitas Antimikroba
dalam Uji Enumerasi Mikroba).
Untuk sediaan yang telah diberi penetral aktivitas
antimikroba dengan mengacu pada prosedur yang
sesuai, dan ternyata aktivitas antimikroba tidak dapat
dinetralkan, maka diasumsikan bahwa tidak ada
mikroba yang terhambat dalam sediaan.
Sifat Mikroba Uji
E. coli
P.aeruginosa
S. aureus
E.coli
P.aeruginosa
 - 1822 -

Uji/Media Sifat Mikroba Uji

Uji Escherichia coli
MacConkey Broth Fertilitas E.coli
Daya hambat S. aureus
MacConkey Agar Fertilitas + indikatif E.coli
Uji Salmonella
Rappaport Vassiliadis Salmonella Fertilitas Salmonella enterica subsp.
Enrichment Broth entericaserovar Typhimurium atau
Salmonella enterica subsp.
entericaserovar Abony
Daya hambat S.aureus
Xylose Lysine Deoxycholate Agar Fertilitas + indikatif Salmonella enterica
subsp.entericaserovar Typhimurium
atau Salmonella enterica subsp.
entericaserovar Abony
Uji Pseudomonas aeruginosa
Cetrimide Agar Fertilitas P.aeruginosa
Daya hambat E.coli
Uji Staphylococcus aureus
Mannitol Salt Agar Fertilitas + indikatif S.aureus
Daya hambat E.coli
Uji Clostridia
Reinforced Medium for Clostridia Fertilitas Cl.sporogenes
Columbia Agar Fertilitas Cl.sporogenes
Uji Candida albicans
Sabouraud Dextrose Broth Fertilitas C.albicans
Sabouraud Dextrose Agar Fertilitas + indikatif C.albicans

PENGUJIAN SEDIAAN suspensi sampel hingga mengandung 0,1 g, 0,01 g dan

Uji Toleransi Empedu Bakteri Gram-negatif 0,001 g (atau 0,1 mL, 0,01 mL dan 0,001 mL), dan
inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 24-48 jam.
Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi Lakukan sub-kultur dengan menginokulasi masing-
Siapkan sampel 1 dalam 10 volume pengencer masing biakan pada cawan media Violet Red Bile
dimana tidak lebih dari 1 g sampel diuji seperti tertera Glucose Agar, inkubasi pada suhu 30° - 35° selama
pada Uji Enumerasi Mikroba, gunakan Soybean- 18 – 24 jam.
Casein Digest Broth sebagai pengencer, campur, dan Interpretasi Hasil positif ditunjukkan dengan
inkubasi pada suhu 20° - 25° selama waktu yang adanya pertumbuhan koloni.
cukup untuk menumbuhkan bakteri tetapi tidak cukup Catat hasil positif pada jumlah terkecil sediaan dan
untuk memicu multiplikasi mikroba (biasanya 2 jam hasil negatif pada jumlah terbesar sediaan. Tentukan
tapi tidak boleh lebih dari 5 jam). Angka Paling Mungkin (APM) dari bakteri
menggunakan Tabel 2.
Uji negatif
Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing Tabel 2 Interpretasi Hasil
monografi, gunakan 1 g sediaan seperti yang tertera Hasil dari masing-masing
pada Penyiapan Sampel dan Pra-inkubasi, dalam jumlah sediaan APM / g atau /mL
media cair pengkaya Enterobacteriaceae Mossel. 0,1 g 0,01 g 0,001 g
sediaan
Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 4 - 48 jam. atau 0,1 atau atau
Lakukan subkultur pada cawan Violet Red Bile mL 0,01 mL 0,001 mL
Glucose Agar. Inkubasi pada suhu 30° - 35° selama + + + Lebih dari 103
18 - 24 jam. Sampel memenuhi syarat bila tidak ada + + - Kurang dari 103
pertumbuhan koloni. dan lebih dari 102
+ - - Kurang dari 102
Uji Kuantitatif dan lebih dari 10
Seleksi dan subkultur Inokulasi sejumlah suspensi - - - Kurang dari 10
dengan penyiapan sampel langsung ke dalam media
Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Encerkan
 - 1823 -
Escherichia coli
Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi Siapkan
sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer
dimana tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti
tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 mL
atau sejumlah sesuai sampai 1 g atau 1 mL, inokulasi
ke dalam media Soybean-Casein Digest Broth,
dengan jumlah seperti tertera dalam Kesesuaian
Metode Uji, campur dan inkubasi pada suhu 30° - 35
selama 18 - 24 jam.
Seleksi dan Subkultur Kocok wadah, pindahkan
1 mL biakan Soybean-Casein Digest Broth ke dalam
100 mL MacConkey Broth, inkubasi pada suhu 42° -
44 selama 24 - 48 jam. Inokulasi biakan MacConkey
Broth pada cawan media Mac Conkey Agar, suhu 30°
- 35 selama 18 - 72 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni menunjukkan
adanya E.Coli yang dikonfirmasi dengan uji
identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni
yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi
negatif.
Salmonella
Penyiapan sampel dan Pra-inkubasi Siapkan
sediaan uji seperti yang tertera pada Uji Enumerasi
Mikroba. Gunakan jumlah yang sesuai, tidak kurang
dari 10 g atau 10 mL, inokulasi ke dalam sejumlah
volume Soybean-Casein Digest Broth yang sesuai
(seperti tertera pada Kesesuaian Metode Uji), campur
dan inkubasi pada suhu 30° - 35 selama 18-24 jam.
Seleksi dan Subkultur Pindahkan 0,1 mL biakan
Soybean-Casein Digest Broth ke dalam 10 mL media
Rappaport Vasiliadis Salmonella Enrichment Broth,
inkubasi pada suhu 30° - 35 selama 18 - 24 jam.
Subkultur pada cawan Xylose Lysine Deoxycholate
Agar, inkubasi pada suhu 30° - 35 selama 18 - 48
jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni berwarna merah,
dengan atau tanpa titik hitam di bagian tengah
menunjukkan karakteristik Salmonella yang
dikonfirmasi dengan uji identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh
tidak seperti yang diuraikan di atas atau jika hasil uji
konfirmasi identifikasi negatif.
Pseudomonas aeruginosa
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan
sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer
dimana tidak lebih dari 1 g sediaan diuji seperti tertera
pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 mL atau
jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 mL, inokulasi
ke dalam media Soybean-Casein Digest Broth,
dengan jumlah yang sesuai (seperti tertera pada
Kesesuaian Metode Uji), campur dan inkubasi pada
suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam.
Untuk menguji “transdermal patches”, gunakan
membran penyaring steril, saring sejumlah volume
sampel yang sesuai dengan satu “patch” (lihat
“Transdermal Patches” pada Penyiapan Sampel
dalam Uji Enumerasi Mikroba) dan masukkan
penyaring membran ke dalam 100 mL media
Soybean-Casein Digest Broth. Inkubasi pada suhu
30° - 35 selama 18-24 jam.
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada
cawan media Cetrimide Agar dan inkubasi pada suhu
30 - 35 selama 18 - 72 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni menunjukkan
adanya P.aeruginosa yang dikonfirmasi dengan uji
identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat jika koloni yang tumbuh
tidak seperti yang diuraikan di atas atau jika hasil uji
konfirmasi identifikasi negatif.
Staphylococcus aureus
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan
sampel menggunakan 1 dalam 10 volume pengencer
dimana tidak kurang dari 1 g sediaan diuji seperti
yang tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Gunakan
10 mL atau jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 mL,
inokulasi ke dalam media Soybean-Casein Digest
Broth, dengan jumlah yang sesuai (seperti yang
tertera pada Kesesuaian Metode Uji) campur dan
inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 18 - 24 jam.
Untuk menguji “transdermal patches”, gunakan
membran penyaring steril, saring sejumlah volume
sampel yang sesuai dengan satu “patch” (lihat
“Transdermal Patches” pada Penyiapan Sampel
dalam Uji Enumerasi Mikroba) dan masukkan
penyaring membran ke dalam 100 mL media
Soybean-Casein Digest Broth. Inkubasi pada suhu
30 - 35 selama 18 - 24 jam.
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada
cawan media Mannitol Salt Agar dan inkubasi pada
suhu 30 - 35 selama 18 - 72 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni berwarna kuning
atau putih dikelilingi zona kuning menunjukkan
adanya S.aureus yang di konfirmasi dengan uji
identifikasi.
Sediaan memenuhi syarat uji jika pertumbuhan
koloni tidak seperti diuraikan atau jika hasil uji
konfirmasi identifikasi negatif.
Clostridia
Penyiapan Sampel dan Perlakuan Panas
Siapkan sampel menggunakan 1 dalam 10 volume
pengencer (dengan total volume minimum 20 mL)
tidak kurang dari 2 g atau 2 mL sediaan untuk diuji
seperti tertera pada Uji Enumerasi Mikroba. Pisahkan
sampel menjadi dua bagian, sekurang-kurangnya 10
 - 1824 -

mL. Panaskan satu bagian pada 80 selama 10 menit,

dinginkan dengan cepat. Satu bagian lainnya tidak Larutan Dapar Natrium Klorida – Pepton pH 7,0
dipanaskan. Kalium dihidrogen fosfat 3,6 g
Seleksi dan Subkultur Gunakan 10 mL atau Dinatrium hidrogen fosfat dihidrat 7,2 g (setara
jumlah yang sesuai dengan 1 g atau 1 mL kemudian 0,067 M
keduanya diinokulasi ke dalam sejumlah Reinforced fosfat)
Medium for Clostridia yang sesuai, (seperti tertera Natrium klorida 4,3 g
pada Kesesuaian Metode Uji). Inkubasi pada kondisi Pepton (daging atau kasein) 1,0 g
anaerob pada suhu 30 - 35 selama 48. Sesudah Air 1000 mL
inkubasi buat subkultur dari tiap wadah pada Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang
Columbia Agar dan inkubasi pada kondisi anaerob tervalidasi.
pada suhu 30 - 35 selama 48 - 72 jam.
Interpretasi Pertumbuhan koloni anaerob bentuk Soybean-Casein Digest Broth
batang (dengan atau tanpa endospora) memberikan Pancreatic digest of casein 17,0 g
reaksi katalase negatif, menunjukkan adanya Papaic digest of soybean 3,0 g
Clostridia yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Natrium klorida 5,0 g
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada koloni Dibasa hidrogen fosfat 2,5 g
yang tumbuh atau jika hasil uji konfirmasi identifikasi Glukosa monohidrat 2,5 g
negatif. Air 1000 mL
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3  0,2
Candida albicans
pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf
Penyiapan Sampel dan Pra-Inkubasi Siapkan dengan siklus yang tervalidasi.
sediaan yang akan diuji seperti tertera pada Uji
Enumerasi Mikroba. Gunakan 10 mL atau jumlah Soybean-Casein Digest Agar
yang sesuai tidak kurang dari 1 g atau 1 mL, inokulasi Pancreatic digest of casein 15,0 g
ke dalam 100 mL media Sabouraud Dextrose Broth, Papaic digest of soybean 5,0 g
campur dan inkubasi pada suhu 30 - 35 selama 3 - 5 Natrium klorida 5,0 g
hari. Agar 15,0 g
Seleksi dan Subkultur Lakukan subkultur pada Air 1000 mL
cawan Sabouraud Dextrose Agar, dan inkubasi pada Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3  0,2
suhu 30 - 35 selama 24 - 48 jam. pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf
Interpretasi Adanya pertumbuhan koloni dengan siklus yang tervalidasi.
berwarna putih menunjukkan adanya C.albicans.
yang dikonfirmasi dengan uji identifikasi. Sabouraud Dextrose Agar
Sediaan memenuhi syarat uji jika tidak ada Dekstrosa 40,0 g
pertumbuhan koloni seperti diuraikan di atas atau jika Mixture peptic digest of animal 10,0 g
hasil uji konfirmasi identifikasi negatif. tissue and pancreatic digest of
casein (1:1)
LARUTAN DAN MEDIA KULTUR Agar 15,0 g
YANG DISARANKAN Air 1000 mL
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6  0,2
[Catatan Bagian ini sebagai informasi.] pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf
Larutan dan media kultur berikut memenuhi tujuan dengan siklus yang tervalidasi.
seperti tertera pada uji kontaminasi mikroba dalam
Farmakope. Media lain mungkin dapat digunakan Potato Dextrose Agar
setelah kesesuaiannya dibuktikan. Infusion from potatoes 200 g
Larutan Dapar Persediaan Timbang 34 g Kalium Dekstrosa 20,0 g
Dihidrogen Fosfat P, masukkan ke dalam labu
Agar 15,0 g
tentukur 1000 mL, larutkan dalam 500 mL air, atur
Air 1000 mL
pH menjadi 7,2  0,2, tambahkan air sampai tanda,
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6  0,2
dan campur homogen.
Masukkan ke dalam wadah, dan sterilisasi. Simpan pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf
dengan siklus yang tervalidasi.
pada suhu 2° - 8.
Larutan Dapar Fosfat pH 7,2 Siapkan campuran
air dan Larutan Dapar persediaan (800:1 v/v),
kemudian sterilisasi.
 - 1825 -

Sabouraud Dextrose Broth Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,1 ± 0,2
Dekstrosa 20,0 g pada suhu 25º. Didihkan selama 1 menit dengan
Mixture Peptic Digest of Animal 10,0 g pengadukan konstan, kemudian sterilisasi
Tissue and Pancreatic Digest of menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.
Casein (1:1)
Air 1000 mL Rappaport Vassiliadis Salmonela Enrichment
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 5,6  0,2 Broth
pada suhu 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf Soya peptone 4,5 g
dengan siklus yang tervalidasi. Magnesium klorida heksahidrat 29,0 g
Natrium klorida 8,0 g
Enterobacteria Enrichment Broth Mossel Dikalium fosfat 0,4 g
Pancreatic digest of gelatin 10,0 g Kalium dihidrogen fosfat 0,6 g
Glukosa monohidrat 5,0 g Malachite green 0,036 g
Dehydrated ox bile 20,0 g Air murni 1000 mL
Kalium dihidrogen fosfat 2,0 g Larutkan dalam keadaan agak hangat. Sterilisasi
Dinatrium hydrogen fosfat dihidrat 8,0 g menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi,
Brilliant green 15 mg pada suhu tidak lebih dari 115º. Setelah disterilisasi
Air 1000 mL menggunakan otoklaf pH menjadi 5,2 ± 0,2 pada suhu
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,2  0,2 25º.
pada 25. Panaskan hingga 100º selama 30 menit dan
dinginkan segera. Xylose Lysine Deoxycholate Agar
Xylose 3,5 g
Violet Red Bile Glucose Agar L-lysine 5,0 g
Yeast extract 3,0 g Laktosa monohidrat 7,5 g
Pancreatic digest of gelatin 7,0 g Sukrosa 7,5 g
Bile salts 1,5 g Natrium klorida 5,0 g
Natrium klorida 5,0 g Yeast extract 3,0 g
Glukosa monohidrat 10,0 g Merah fenol 80 mg
Agar 15,0 g Agar 13,5 g
Merah netral 30 mg Sodium deoksikolat 2,5 g
Kristal violet 2 mg Sodium tiosulfat 6,8 g
Air 1000 mL Besi (III) ammonium sitrat 0,8 g
Air 1000 mL
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,4  0,2
pada 25. Panaskan hingga mendidih, jangan Atur pH sehingga setelah pemanasan menjadi 7,4
dipanaskan menggunakan otoklaf. 0,2 pada suhu 25. Panaskan hingga mendidih,
dinginkan hingga 50, tuang ke dalam cawan Petri.
MacConkey Broth Jangan disterilisasi menggunakan otoklaf.
Pancreatic digest of gelatin 20,0 g
Laktosa monohidrat 10,0 g Cetrimide Agar
Dehydrated ox bile 5,0 g Pancreatic digest of gelatin 20,0 g
Ungu bromokresol 10 mg Magnesium klorida 1,4 g
Air 1000 mL Dikalium sulfat 10,0 g
Atur pH sehingga setelah sterilisasi menjadi 7,3  0,2 Setrimid 0,3 g
Agar 13,6 g
pada 25. Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan
siklus yang tervalidasi. Air 1000 mL
Gliserol 10,0 mL
MacConkey Agar Panaskan hingga mendidih selama 1 menit dengan
Pancreatic digest of gelatin 17,0 g pengocokan. Atur pH sehingga setelah sterilisasi
Peptones (meat and casein) 3,0 g menjadi 7,2  0,2 pada 25. Sterilisasi menggunakan
otoklaf dengan siklus yang tervalidasi.
Laktosa monohidrat 10,0 g
Natrium klorida 5,0 g
Mannitol Salt Agar
Bile salts 1,5 g
Pancreatic digest of casein 5,0 g
Agar 13,5 g
Peptic digest of animal tissue 5,0 g
Merah netral 30,0 mg
Beef extract 1,0 g
Kristal violet 1 mg
D-manitol 10,0 g
Air 1000 mL
 - 1826 -

Natrium klorida 75,0 g mikroba yang ada atau yang masuk secara tidak
Agar 15,0 g sengaja selama ataupun sesudah proses produksi.
Merah fenol 0,025 g Pada sediaan steril dosis ganda, pengawet
Air 1000 mL ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan
Panaskan hingga mendidih selama 1 menit dengan mikroba yang mungkin masuk pada pengambilan
pengocokan. Atur pH sehingga setelah sterilisasi berulang. Satu jenis atau lebih pengawet
menjadi 7,4  0,2 pada suhu 25. Sterilisasi diperbolehkan pada semua sediaan steril dosis ganda.
menggunakan otoklaf dengan siklus yang tervalidasi. Pengawet tidak boleh digunakan sebagai pengganti
cara produksi yang baik atau semata-mata untuk
Reinforced Medium for Clostridia menurunkan populasi mikroba viabel dari produk
Beef extract 10,0 g tidak steril atau mengendalikan bioburden pra-
Pepton 10,0 g sterilisasi dari formulasi sediaan dosis ganda pada
waktu diproduksi. Pengawet sesuai bentuk sediaan
Yeast extract 3,0 g
dalam farmakope memenuhi syarat untuk Bahan
Soluble starch 1,0 g
Tambahan dalam Ketentuan Umum.
Glukosa monohidrat 5,0 g
Semua zat antimikroba yang digunakan bersifat
Sistein hidroklorida 0,5 g toksik. Untuk melindungi konsumen secara
Natrium klorida 5,0 g maksimum, kadar pengawet yang efektif dalam
Natrium asetat 3,0 g kemasan akhir produk hendaknya di bawah tingkat
Agar 0,5 g toksik bagi manusia berdasarkan dosis obat yang
Air 1000 mL dianjurkan. Kadar pengawet yang ditambahkan dapat
Basahi dan larutkan agar menggunakan air murni, dan dikurangi apabila bahan aktif dalam formulasi secara
panaskan hingga mendidih dengan pengadukan secara intrinsik mempunyai aktivitas antimikroba. Untuk
terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sehingga semua produk injeksi dosis ganda atau produk lain
setelah sterilisasi menjadi 6,8  0,2 pada suhu 25. yang mengandung pengawet, harus menunjukkan
Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang adanya efektivitas antimikroba baik sebagai sifat
tervalidasi. bawaan dalam produk maupun yang dibuat dengan
penambahan pengawet.
Columbia Agar Efektivitas antimikroba juga harus ditunjukkan
Pancreatic digest of casein 10,0 g untuk semua produk dosis ganda berbasis air pada
Meat peptic digest 5,0 g sediaan topikal, oral dan sediaan lain seperti tetes
Heart pancreatic digest 3,0 g mata, telinga, hidung, irigasi dan cairan dialisis.
Yeast extract 5,0 g Untuk pengujian, sediaan bentuk larutan dengan
Maized starch 1,0 g aktivitas air lebih dari 0,6.
Natrium klorida 5,0 g Mikroba tantang digunakan umumnya berdasarkan
Agar, tergantung pada daya 10,0-15,0 g pada cemaran yang mungkin ada pada produk obat
pembentukan gel dengan mempertimbangkan sifat fisika, formulasi dan
Air murni 1000 mL tujuan penggunaan. Mikroba tantang yang tercantum
Basahi dan larutkan agar menggunakan air murni, dan dalam pengujian ini tidak membatasi digunakannya
panaskan hingga mendidih dengan pengadukan secara mikroba spesies lain jika dianggap perlu untuk
terus menerus. Jika diperlukan, atur pH sehingga mengukur aktivitas biologi dari sistem pengawetan
setelah sterilisasi menjadi 7,30,2 pada suhu 25. suatu sediaan. Mikroba tantang tambahan ini tidak
Sterilisasi menggunakan otoklaf dengan siklus yang masuk pembahasan dalam bab ini, tetapi mungkin
dapat ditambahkan pada penjelasan mikroba uji.
tervalidasi. Dinginkan hingga mencapai 45-50, bila
perlu tambahkan gentamisin sulfat yang setara dengan
20 mg gentamisin basa, dan tuang ke dalam cawan PROSEDUR UMUM
Petri.
Lampiran ini dimaksudkan untuk menunjukkan
efektivitas pengawet antimikroba yang ditambahkan.
Pengawet antimikroba tersebut harus dinyatakan pada
UJI EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA <61>
etiket. Prosedur dan kriteria keberterimaan pada
lampiran ini hanya berlaku pada produk dalam wadah
PENDAHULUAN
asli, bersegel, yang didistribusikan oleh produsen
(lihat Tabel 1 untuk katagori produk). Uji efektivitas
Pengawet antimikroba adalah zat antimikroba yang antimikroba tidak dilakukan pada wadah, tetapi
ditambahkan pada sediaan farmasi non-steril bentuk diperlukan kehati-hatian untuk mencegah
larutan. Dosis pengawet yang ditambahkan adalah penggunaan bahan wadah yang dapat berinteraksi
untuk melindungi sediaan terhadap pertumbuhan dengan pengawet.
 - 1827 -
PROSEDUR UJI FERTILITAS DAN
KESESUAIAN METODE PEROLEHAN
KEMBALI
KETENTUAN UMUM
Kemampuan prosedur untuk mendeteksi mikroba
tantang dalam sediaan uji yang telah dinetralkan harus
ditetapkan. Kesesuaian prosedur harus dipastikan
kembali jika ada perubahan bahan atau metode atau
perubahan sediaan yang berasal dari akibat kontak
langsung bahan dan berpengaruh pada hasil
pengujian.
Kemampuan media yang digunakan untuk
menumbuhkan mikroba dalam prosedur ini juga harus
ditetapkan.
PENYIAPAN GALUR UJI
Gunakan suspensi mikroba baku atau yang
disiapkan dengan teknik pemeliharaan biakan lot
benih sehingga mikroba viabel untuk inokulasi tidak
melebihi 5 pasase dari biakan induk. Tumbuhkan
mikroba uji bakteri dan kapang secara terpisah (lihat
Tabel 2).
Gunakan biakan mikroba berikut: Candida
albicans (ATCC No. 10231), Aspergillus brasiliensis
(ATCC No. 16404), Escherichia coli (ATCC No.
8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027)
dan Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538).
Mikroba viabel yang digunakan dalam prosedur ini
sebaiknya merupakan biakan segar (sebagai contoh
dalam fase pertumbuhan logaritma) kecuali untuk
spora biakan A. brasiliensis. Kondisi biakan untuk
biakan inokula dalam media yang sesuai yaitu
Soybean-Casein Digest atau Sabouraud Dextrose
Agar (lihat Tabel 2).
Untuk memanen biakan bakteri dan C.albicans
gunakan larutan salin LP steril sebagai pencuci
pertumbuhan di permukaan dan kumpulkan dalam
wadah steril yang sesuai. Untuk memanen spora A.
brasiliensis gunakan larutan salin LP steril yang
mengandung polisorbat 80 P 0,05%. Pembuatan
suspensi spora sebaiknya secara aspetik misal
disaring melalui wol kaca steril untuk memisahkan
hifa. Seluruh suspensi mikroba sebaiknya disiapkan
untuk memastikan bebas dari residu media
pertumbuhan dari inokula misal disentrifus kemudian
diresuspensi dalam larutan steril yang sesuai.
Cara lain, biakan mikroba persediaan dapat
ditumbuhkan dalam media cair yang sesuai misal
Soybean-Casein Digest Broth atau Sabouraud
Dextrose Broth, sel dipanen dengan disentrifus, dicuci
dan diresuspensi dalam larutan steril yang sesuai.
Suspensi mikroba yang digunakan untuk inokulasi
sebaiknya diatur untuk mendapatkan jumlah mikroba
lebih kurang 1 x 108 koloni per mL. Gunakan suspensi
bakteri dan khamir dalam waktu 2 jam atau 24 jam
bila disimpan pada suhu antara 2° dan 8°. Suspensi
spora yang stabil dapat disiapkan dan dipelihara pada
suhu antara 2° dan 8° sampai 7 hari. [Catatan
Perkiraan kadar inokula dapat dilakukan dengan
pengukuran turbidimetri untuk mikroba tantang
kemudian dikonfirmasi dengan angka lempeng.]
FERTILITAS MEDIA
Media yang digunakan dalam prosedur ini harus
mampu menunjang pertumbuhan mikroba. Setiap bets
media jadi dan setiap bets media yang disiapkan dari
media kering atau yang dibuat sendiri berdasarkan
komposisi media harus diuji.
Untuk media padat, jumlah koloni yang
ditumbuhkan harus sedikitnya 50% dari nilai
perhitungan inokula yang telah dibakukan. Untuk
inokula segar yang baru disiapkan, pertumbuhan
mikroba sebanding dengan pertumbuhan mikroba
dari bets media yang telah teruji.
KESESUAIAN METODE
PENGHITUNGAN DALAM SEDIAAN
Siapkan pengenceran 10-1 dengan menambahkan 1
mL sediaan (bentuk cair) pada 9 mL salin LP atau
pengencer penetral lain. Lanjutkan ke tingkat
pengenceran 10-2 dan 10-3. Tambahkan sejumlah
mikroba tantang pada setiap pengenceran sediaan,
campur dan kemudian tambahkan sejumlah volume
yang sesuai ke dalam lempeng media untuk
menghasilkan pertumbuhan kurang dari 250 koloni
per lempeng bakteri dan khamir (antara 25 dan 250
koloni) atau kurang dari 80 koloni per lempeng untuk
A. brasiliensis (antara 8 dan 80 koloni). Lempeng
sebaiknya dilakukan minimal duplo (makin besar
replikat dapat meminimalkan variabilitas perkiraan
jumlah koloni). Pada prosedur ini, sebagai kontrol
positif dimasukkan inokula ke dalam salin LP.
Pindahkan volume salin LP yang sama tanpa inokula
pada lempeng agar. Perkiraan perolehan kembali
pertumbuhan koloni dari suspensi kontrol positif ini
sedikitnya 50% (dari rata-rata).
Jika sediaan yang diencerkan menunjukkan adanya
antimikroba, perlu ditambahkan penetral khusus ke
dalam media perolehan kembali.
Kemampuan prosedur untuk mengukur efektivitas
pengawet dapat dikompromikan jika metode
mempersyaratkan kesesuaian tingkat pengenceran
(10-2 atau 10-3) koloni perolehan kembali (misal
kesulitan mengukur 3log reduksi untuk inokula 105-
106). Jika tidak diperoleh penetral atau metode yang
sesuai dan kesesuaian metode mempersyaratkan
tingkat pengenceran yang nyata, maka dapat
digunakan inokula tingkat kerapatan lebih tinggi
(misal 107-108), sehingga 3log reduksi dapat diukur.
Perolehan kembali tidak dapat dilaporkan kurang dari
 - 1828 -
1 koloni per lempeng dari rata-rata (atau 100 koloni
per mL jika digunakan 1 mL inokula pada
pengenceran 10-2 untuk lempeng yang dibuat duplo).
Penyaring membran dapat digunakan untuk
menyaring volume pengenceran lebih besar guna
mengatasi kesulitan tersebut atau menetralisasi daya
antimikroba.
PENGUJIAN SEDIAAN
KATEGORI SEDIAAN
Untuk tujuan pengujian, sediaan dibagi menjadi
empat kategori (Lihat Tabel 1). Kriteria efektivitas
antimikroba untuk sediaan tergantung cara
pemberiannya. Formulasi yang mengandung
pengawet diharapkan dapat memenuhi standar efikasi
minimal baik pada kemasan dosis ganda atau dosis
tunggal.
Tabel 1. Kategori Sediaan
Kategori Uraian Sediaan
1 Injeksi, sediaan parenteral lain
termasuk emulsi, sediaan tetes telinga,
sediaan tetes hidung steril , dan
sediaan tetes mata yang dibuat dengan
dasar atau pembawa air.
2 Sediaan topikal yang dibuat dengan
dasar atau pembawa air, sediaan tetes
hidung non-steril, dan emulsi,
termasuk sediaan yang dioleskan pada
membran mukosa.
3 Sediaan oral selain antasida, dibuat
dengan dasar atau pembawa air.
4 Antasida yang dibuat dengan
pembawa air
PROSEDUR
Pengujian dapat dilakukan dalam tiap lima wadah
asli bila volume sediaan tiap wadahnya mencukupi
dan wadah sediaan dapat ditusuk secara aseptik
(dengan jarum dan alat suntik melalui tutup karet
elastomerik), atau dalam lima wadah bakteriologi
Tabel 2. Kondisi Biakan untuk Penyiapan Inokula
Mikroba Media yang sesuai
Escherichia coli Soybean-Casein Digest
ATCC No.8739 Broth; Soybean-Casein
Digest Agar
Pseudomonas Soybean-Casein Digest
aeruginosa Broth; Soybean-Casein
ATCC No. 9027 Digest Agar
bertutup steril, berukuran mencukupi untuk volume
sediaan yang dipindahkan. Inokulasi tiap wadah
dengan satu inokula baku yang telah disiapkan dan
diaduk. Volume suspensi inokula yang digunakan
antara 0,5% dan 1,0% dari volume sediaan untuk
meminimalkan efek potensial pada sediaan. Kadar
mikroba uji yang ditambahkan pada sediaan (Kategori
1, 2, atau 3) seperti halnya kadar akhir sediaan uji
setelah diinokulasi antara 1 x 105 dan 1 x 106 koloni
per mL sediaan. Untuk sediaan Kategori 4 (antasida)
kadar akhir sediaan uji setelah inokulasi antara 1 x 103
dan 1 x 104 koloni per mL sediaan.
Kadar awal mikroba viabel dalam setiap sediaan uji
diperkirakan berdasarkan kadar mikroba dalam
inokula baku yang ditetapkan dengan metode ALT.
Inkubasi wadah yang sudah diinokulasi pada suhu
22,5º±2,5º. Ambil sampel dari setiap wadah pada
interval yang sesuai seperti tertera pada Tabel 3.
Amati dan catat setiap perubahan yang terjadi pada
interval tersebut. Tetapkan dengan prosedur ALT
jumlah koloni yang ada dari setiap sediaan uji untuk
interval yang digunakan seperti tertera pada lampiran
Uji Batas Mikroba <51>. Angka Lempeng Total
menggunakan replika lempeng minimal, dengan
menghitung rata-rata jumlah koloni sebelum
penetapan kesimpulan koloni per mL. Jika digunakan
penyaring membran, lakukan duplikasi membran
penyaring untuk setiap perkiraan.
Dengan menggunakan penghitungan kadar koloni
per mL pada pengujian awal, hitung perubahan nilai
kadar koloni per mL dalam log10 untuk tiap mikroba
pada interval pengujian dan nyatakan perubahan
kadar sebagai log reduksi. Log reduksi adalah
perbedaan antara nilai log10 koloni per mL kadar awal
dalam suspensi dan log10 koloni per mL yang bertahan
hidup pada saat itu.
KRITERIA EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA
Persyaratan untuk efektivitas antimikroba dipenuhi
jika kriteria yang tertera pada Tabel 3 dipenuhi (Lihat
Hasil Uji pada Ketentuan Umum): Tidak terjadi
peningkatan lebih tinggi dari 0,5 log10 unit terhadap
nilai log mikroba awal.
Waktu inkubasi
Waktu inkubasi
Suhu inkubasi perolehan kembali
inokulum
mikroba
32,5º ± 2,5º 18 – 24 jam 3 – 5 hari
32,5º ± 2,5º 18 – 24 jam 3 – 5 hari
 - 1829 -

Waktu inkubasi
Waktu inkubasi
Mikroba Media yang sesuai Suhu inkubasi perolehan kembali
inokulum
mikroba
Staphylococcus aureus Soybean-Casein Digest 32,5º ± 2,5º 18 – 24 jam 3 – 5 hari
ATCC No. 6538 Broth; Soybean-Casein
Digest Agar

Candida albicans Sabouraud Dextrose 22,5º ± 2,5º 44 – 52 jam 3 – 5 hari

ATCC No. 10231 Broth; Sabouraud
Dextrose Agar

Aspergillus brasiliensis Sabouraud Dextrose 22,5º ± 2,5º 6 – 10 hari 3 – 7 hari

ATCC No. 16404 Agar; Sabouraud
Dextrose Broth

Tabel 3. Kriteria untuk Mikroba Uji

Untuk Sediaan Kategori 1
Bakteri Koloni tidak kurang dari 1,0 log reduksi dari jumlah hitungan awal pada hari ke-7,
tidak kurang dari 3,0 log reduksi dari hitungan awal pada hari ke-14, dan tidak
meningkat sampai dengan hari ke-28.

Kapang dan khamir Koloni tidak meningkat dari jumlah hitungan awal sampai hari ke-7, 14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 2
Bakteri Koloni tidak kurang dari 2,0 log reduksi dari jumlah hitungan awal pada hari ke-14,
dan tidak meningkat pada hari ke-14 sampai hari ke-28.

Kapang dan khamir Koloni tidak meningkat dari jumlah hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 3
Bakteri Koloni tidak kurang dari 1,0 log reduksi dari jumlah hitungan awal pada hari ke-14,
dan tidak meningkat pada hari ke-14 sampai hari ke-28.

Kapang dan khamir Koloni tidak meningkat dari jumlah hitungan awal sampai hari ke-14 dan 28.
Untuk Sediaan Kategori 4
Bakteri, kapang dan Koloni tidak meningkat dari jumlah hitungan awal pada hari ke-14 dan 28.
khamir

UJI KINERJA RESISTENSI INDIKATOR
BIOLOGI <65>
PENGHITUNGAN ANGKA SPORA
Untuk indikator biologi dengan pembawa kertas,
lepaskan tiga buah indikator biologi yang relevan dari
masing-masing wadahnya. Dispersikan kertas
pembawa dengan memasukkan ke dalam 250 mL
“blender” steril berisi 100 mL Air Murni dingin,
campurkan hingga terbentuk suspensi homogen.
Umumnya pencampuran dilakukan selama 15 menit
atau lebih untuk memperoleh perolehan kembali yang
optimal. Pindahkan sejumlah 10 mL alikuot suspensi
ke dalam 16 x 125 mm tabung bertutup ulir steril.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah
dengan Pembawa Kertas, panaskan tabung berisi
suspensi dalam tangas air pada 95º – 100º selama 15
menit (syok panas) dimulai setelah suhu mencapai
95º. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Panas Kering
dengan Pembawa Kertas dan Indikator Biologi
Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas,
panaskan tabung berisi suspensi dalam tangas air pada
80º – 85º selama 10 menit dimulai setelah suhu
mencapai 80º. Dinginkan secara cepat dalam tangas
air-es pada 0º - 4º. Pindahkan 1 mL alikuot masing-
masing ke dalam dua tabung yang sesuai, dan lakukan
seri pengenceran secukupnya dalam Air Murni steril,
pengenceran dipilih dengan hasil penghitungan 30 –
300 koloni, tetapi tidak kurang dari 6, pada tiap
pasangan lempeng dengan perlakuan sebagai berikut
ini. Bila indikator biologi mempunyai kadar spora
rendah, mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi
dan menggunakan lempeng lebih banyak untuk tiap
pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng untuk
tiap alikuot. Masukkan 1,0 mL suspensi dari tingkat
 - 1830 -
pengenceran yang dipilih ke dalam masing-masing
dua cawan Petri 15 – 100 mm. Dalam waktu 20 menit
tambahkan pada tiap cawan 20 mL media Soybean-
Casein Digest Agar cair dan telah didinginkan 45º –
50º. Campur dengan memutar cawan hingga suspensi
homogen, dan kemudian dibiarkan memadat.
Inkubasikan lempeng dengan posisi dibalik pada 55º
– 60º, untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah
dengan Pembawa Kertas, dan pada 30º–35º Indikator
Biologi Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa
Kertas dan Indikator Biologi Sterilisasi Panas Kering
dengan Pembawa Kertas atau pada suhu optimal
perolehan kembali ditentukan dari pabrik. Amati
lempeng setelah 24 dan 48 jam, catat jumlah koloni
tiap lempeng; dan gunakan jumlah koloni yang
diamati setelah 48 jam untuk menghitung hasil.
Hitung jumlah rata-rata spora tiap indikator dari hasil
penghitungan, menggunakan faktor pengenceran
yang sesuai. Pengujian dinyatakan absah bila log
jumlah spora per (kertas) pembawa pada 48 jam sama
atau lebih besar dari log jumlah setelah 24 jam dalam
tiap wadah. Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap
Basah, Self-Contained lepaskan secara aseptik tiga
buah pembawa dari masing-masing wadahnya, dan
perlakukan langsung seperti pada Indikator Biologi
Sterilisasi Uap Basah dengan Pembawa Kertas.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan
Basah, Pemanasan Kering, dan Gas, dengan
Pembawa Non-Kertas, lepaskan secara aseptik tiga
buah pembawa dari masing-masing kemasan asli atau
wadahnya. Masukkan tiap pembawa ke dalam wadah
steril yang sesuai berisi 100 mL Air Murni dingin, dan
sonikasi atau kocok dengan pengocok-resiprok
secukupnya. Lima belas menit atau lebih mungkin
diperlukan untuk perolehan kembali yang optimal.
Sebaiknya telah dilakukan studi pendahuluan untuk
memastikan bahwa metode perolehan kembali
menghasilkan sedikitnya 50%-300% perolehan
kembali angka spora hidup. Pindahkan sejumlah 10
mL alikuot suspensi ke dalam 16x125 mm tabung
bertutup ulir steril. Panaskan tabung berisi suspensi
Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus
coagulans pada 80º – 85º selama 10 menit. Panaskan
tabung berisi suspensi Geobacillus
stearothermophilus pada 95º – 100º selama 15 menit.
Penghitungan waktu dimulai pada saat tiap rentang
suhu pemanasan mencapai yang terendah. Dinginkan
segera dalam tangas air es pada 0º - 4º. Pindahkan
masing-masing 1 mL alikuot ke dalam dua tabung
yang sesuai, dan lakukan seri pengenceran
secukupnya dalam Air Murni steril, pengenceran
dipilih dengan hasil penghitungan 30 – 300 koloni,
tetapi tidak kurang dari 6, pada tiap pasangan lempeng
dengan perlakuan sebagai berikut ini.
Bila indikator biologi mempunyai kadar spora
rendah, mungkin seri pengenceran perlu dimodifikasi
dan menggunakan lempeng lebih banyak untuk tiap
pengenceran. Siapkan seri terpisah lempeng untuk
tiap alikuot. Masukkan 1 mL suspensi dari tingkat
pengenceran yang dipilih ke dalam masing-masing
dua cawan Petri 15–100 mm. Dalam waktu 20 menit
tambahkan pada tiap cawan 20 mL media Soybean-
Casein Digest Agar cair dan telah didinginkan 45° –
50º. Campur dengan memutar cawan hingga suspensi
homogen.
Untuk G.stearothermophilus, B.atrophaeus, B.subtilis,
dan B.coagulans, gunakan media Soybean-Casein
Digest Agar dan inkubasikan lempeng secara aerob
dengan posisi dibalik pada suhu berturut-turut untuk
tiap mikroba sebagai berikut: 55º – 60º, 30º – 35º, 48º–
52º, atau pada suhu optimum khusus sesuai dengan
indikator biologi pabrik. Amati lempeng setelah 24
dan 48 jam. Catat jumlah koloni tiap lempeng. Hitung
rata-rata jumlah spora tiap indikator dari hasil
penghitungan, menggunakan faktor pengenceran
yang sesuai. Pengujian dinyatakan absah bila log
jumlah spora per pembawa pada 48 jam sama atau
lebih besar dari log jumlah setelah 24 jam dalam tiap
wadah.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Pemanasan
Basah, Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora
Cair, menggunakan G.stearothermophilus, B.atrophaeus,
B.subtilis, dan B.coagulans sebagai indikator biologi,
disiapkan seri pengenceran secukupnya, suspensi asli
spora dengan Air Murni dingin steril dalam tabung
bertutup ulir 16 x 125 mm menggunakan prosedur
khusus penghitungan angka spora dengan Indikator
Biologi Sterilisasi Pemanasan Basah, Pemanasan
Kering, dan Gas, dengan Pembawa Non-Kertas.
PENETAPAN NILAI-D
Lakukan seluruh pengujian seperti dijelaskan
dalam bagian ini di bawah kondisi aseptik,
menggunakan peralatan steril untuk mikroba non-
termofilik. Penetapan Nilai-D untuk
G.stearothermophilus dan B.coagulans dapat
dilakukan di lingkungan tidak diklasifikasi tetapi
terkendali.
Peralatan
Peralatan uji untuk menetapkan resistensi
mikrobiologi yang dijelaskan secara rinci dalam ISO
18472, Sterilisasi Produk Kesehatan-Indikator
Biologi dan Kimia-Peralatan Uji. Rincian
Resistometer Evaluasi Indikator Biologi (REIB)
secara individu bervariasi dengan rancangan spesifik
dan proses sterilisasi utama bersama dengan yang
digunakan. Tetapkan bahwa kinerja bejana REIB
sesuai dengan persyaratan standar ISO untuk paparan
indikator biologi, dengan perbedaan rancangan yang
dapat diterima.
 - 1831 -
Prosedur
Lakukan pengujian Nilai-D pada setiap pengaturan
kondisi sterilisasi, paket indikator biologi diberi tanda
(label) untuk digunakan. Ambil kelompok spesimen
indikator biologi sejumlah yang cukup dalam wadah
asli masing-masing, setiap kelompok terdiri dari tidak
kurang 5 spesimen. Jumlah kelompok menyediakan
rentang pengamatan dari tidak kurang dari satu label
nilai-D di bawah tanda waktu bertahan hidup
(”survival time”) sampai tidak kurang dari satu label
nilai-D di atas tanda waktu mematikan (”kill time”).
Letakkan setiap kelompok pada tempat spesimen
(“specimen holder”) terpisah yang sesuai yang
memungkinkan setiap spesimen terpapar kondisi
sterilisasi yang telah ditentukan pada lokasi khusus
dalam bejana sterilisasi REIB. Periksa alat REIB
untuk parameter pengoperasian menggunakan
“specimen holder” tanpa spesimen. Pilih seri
tambahan waktu sterilisasi dari waktu terpendek
untuk spesimen yang diuji. Perbedaan pada seri waktu
sterilisasi, sedapat mungkin konstan dan perbedaan
antara waktu yang berdekatan tidak lebih besar dari
75% nilai-D label.
Prosedur uji penggunaan bejana REIB untuk
evaluasi resistensi mikroba ditetapkan dalam standar
ISO seri 11138. Indikator biologi sebaiknya
mengikuti standar yang sesuai. Metode uji dan
penggunaan pembawa dengan REIB mungkin dapat
disesuaikan untuk indikator biologi khusus. Metode
dan peralatan yang digunakan untuk pembawa kertas
dapat berbeda dengan pembawa lain dan secara
substansial berbeda dari penggunaan suspensi
indikator biologi.
Kondisi pemaparan nilai-D untuk pembawa bahan
alternatif sama dengan kondisi yang digunakan untuk
menetapkan nilai-D pembawa kertas. Jika label pabrik
membolehkan penggunaan pembawa dengan
berbagai metode sterilisasi, maka data nilai-D,
”survival time”, “kill time” disediakan oleh pabrik
untuk setiap metode sterilisasi. Hal ini
memungkinkan indikator biologi yang diinokulasi
pada pembawa selain kertas disterilisasi/
dekontaminasi dengan metoda gas atau uap seperti
fase uap hidrogen peroksida dan klorin dioksida.
Standar kondisi fisik evaluasi indikator biologi
untuk penggunaan dengan fase uap hidrogen
peroksida dan klorin dioksida belum ditetapkan.
Dalam hal klorin dioksida, kadar gas, kelembaban
relatif, dan suhu merupakan pengendali kondisi
proses yang penting, yang dapat diukur dengan
akurat. Pabrik penghasil indikator biologi
menggunakan klorin dioksida harus menyatakan
kondisi yang harus dilakukan di bawah penetapan
nilai-D, sehingga pengguna dapat paling tidak melihat
resistensi banyak indikator biologi sebagai
pembanding untuk mengantisipasi kondisi yang
digunakan. Situasi dengan fase uap hidrogen
peroksida lebih kompleks, berbagai peralatan pabrik
menawarkan dekontaminasi atau kondisi sterilisasi
yang berbeda. Jadi tidak ada proses standar untuk
melakukan dekontaminasi dengan fase uap hidrogen
peroksida atau sterilisasi permukaan. Hal ini diikuti
tidak adanya metode evaluasi standar industri
indikator biologi, walaupun mungkin tidak
berhubungan langsung antara kadar uap dan
kecepatan ataupun keefektivan inaktivasi indikator
biologi. Sebagai tambahan, sulit untuk mengases
kelembaban relatif secara akurat, yang sering
ditetapkan sebagai parameter proses kritis dengan
adanya uap hidrogen peroksida. Untuk alasan ini lebih
masuk akal untuk menetapkan resistensi indikator
biologi menjadi relatif atau ukuran relatif pabrik
daripada nilai-D sebenarnya. Selanjutnya tergantung
peralatan dan proses yang dikerjakan, dan ini menjadi
tidak mungkin bagi pengguna mengulangi uji
resistensi biologi yang telah dilakukan oleh pabrik.
Untuk Indikator Biologi Sterilisasi Uap Basah,
Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora Cair,
dilakukan penetapan nilai-D untuk tiap mikroba untuk
menyediakan suspensi hasil panen spora cair. Uji
dilakukan dengan seri pengenceran berdasarkan status
titer spora dari suspensi dengan Air Murni dalam
tabung steril.
Bila suspensi dimasukkan pada atau dalam substrat
misal tutup elastomerik atau produk formulasi,
resistensinya mungkin berbeda dari yang ditetapkan
dalam Air Murni. Perbedaan itu mungkin bermakna
untuk penggunaan indikator biologi dan pengukuran
yang sesuai sebelumnya untuk digunakan dalam
aktivitas validasi sterilisasi.
Perolehan Kembali
Setelah melengkapi prosedur sterilisasi Indikator
Biologi untuk Sterilisasi Panas Kering dengan
Pembawa Kertas dan Indikator Biologi untuk
Sterilisasi Etilen Oksida, dengan Pembawa Kertas;
atau Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap dengan
Pembawa Kertas yang dapat diterapkan dan dalam
catatan waktu tidak lebih dari 4 jam, buka secara
aseptik dan tambahkan tiap strip ke dalam media
sesuai (lihat Media di bawah Uji Sterilitas <71>)
untuk merendam indikator biologi dalam tabung yang
sesuai. Untuk tiap Indikator Biologi untuk Sterilisasi
Uap Basah, Self-Contained spesimen, strip kertas
direndam dalam media self-contained menurut
petunjuk pabrik, dalam catatan waktu tidak lebih dari
4 jam. Inkubasi tiap tabung pada suhu optimal
perolehan kembali yang ditetapkan pabrik. Amati tiap
tabung berisi media yang diinokulasi pada interval
yang cukup untuk total 7 hari setelah inokulasi. (Bila
terjadi pertumbuhan pada saat pengamatan maka
inkubasi tidak perlu dilanjutkan). Catat jumlah
spesimen yang tidak tumbuh pada tiap waktu.
 - 1832 -

Untuk Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap UJI STERILITAS <71>

Basah, Pemanasan Kering, dan Sterilisasi Gas,
Pembawa Bukan kertas, perolehan kembali spora dari
pembawa indikator biologi akan mengikuti prosedur
yang dijelaskan dalam prosedur Angka Total Spora
Hidup. Metode penetapan nilai-D indikator biologi
dengan pembawa kertas dapat digunakan untuk
menghitung nilai-D untuk pembawa bukan kertas.
Kondisi inkubasi mikroba yang akan digunakan untuk
indikator biologi dengan pembawa bukan kertas
dijelaskan dalam bab Angka Total Spora Hidup.
Untuk Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap
Basah, Pemanasan Kering, dan Gas, Suspensi Spora
Cair, metode perolehan kembali setelah kondisi
pemaparan sterilisasi adalah metode yang dijelaskan
dalam bab Angka Total Spora Hidup suspensi spora
cair, dan jika penetapan nilai-D pemanasan kering
dibuat dari suspensi B. atrophaeus, prosedur
perolehan kembali sama seperti dijelaskan dalam
Indikator Biologi untuk Sterilisasi Uap Basah dengan
Pembawa Kertas.
Ketika digunakan Clostridium sporogenes sebagai
indikator biologi, metode persiapan, inokulasi,
metode perolehan kembali dan media harus
diadaptasikan untuk dapat mengakomodasi
penggunaan pembentukan spora anaerob.
Penghitungan
Penetapan nilai-D indikator biologi dapat
dilakukan menggunakan Metode Spearman-Karber
Terbatas, Kurva Survival atau prosedur Sumbu-
Murphy-Cochran. Lebih baik menggunakan metode
sama dengan yang ditetapkan oleh pabrik indikator
biologi untuk menetapkan nilai-D. Penggunaan
metode berbeda akan memberikan hasil berbeda lebih
kepada sebagai alat dari pada variasi kinerja indikator
biologi.
Prosedur farmakope ini didesain bukan untuk
menjamin bahwa satu bets produk adalah steril atau
telah disterilkan. Hal ini terutama harus disertai
dengan validasi proses sterilisasi atau prosedur proses
aseptik.
Pengujian digunakan untuk bahan, sediaan, alat
sesuai dengan farmakope yang dipersyaratkan harus
steril. Hasil yang diterima menunjukkan bahwa tidak
ada kontaminasi mikroba ditemukan dalam sampel di
bawah kondisi pengujian.
TINDAKAN PENCEGAHAN TERHADAP
KONTAMINASI MIKROBA
Pengujian sterilitas dilaksanakan pada kondisi
aseptik. Untuk mencapai kondisi tersebut, lingkungan
pengujian harus dibuat sama seperti ketika uji
sterilitas dilakukan. Tindakan pencegahan untuk
mencegah kontaminasi tidak boleh mempengaruhi
mikroba yang ada dalam pengujian. Kondisi
pengerjaan, ketika uji dilakukan dimonitor secara
berkala dengan melakukan sampling yang sesuai pada
area kerja dan kontrol yang sesuai.
MEDIA DAN SUHU INKUBASI
Media untuk pengujian dapat dibuat seperti tertera
di bawah ini atau setara dengan media komersil yang
memenuhi syarat Uji Fertilitas Aerob, Anaerob dan
Kapang.
Media berikut adalah media yang sesuai untuk uji
sterilitas. Media Cair Tioglikolat terutama digunakan
untuk pertumbuhan bakteri anaerob, termasuk juga
untuk mendeteksi bakteri aerob. “Soybean-Casein
Digest Medium” sesuai untuk pertumbuhan kapang
dan bakteri aerob.

”Survival time” dan “Kill time” Media Cair Tioglikolat

Gunakan dua kelompok, masing-masing terdiri dari L-Sistin P 0,5 g

10 indikator biologi yang relevan, dalam wadah asli. Natrium klorida P 2,5 g
Tempatkan spesimen tiap kelompok dalam rak Dekstrosa monohidrat/anhidrat P 5,5/5,0 g
spesimen yang memungkinkan tiap spesimen terpapar Agar P 0,75 g
kondisi sterilisasi pada lokasi khusus dalam bejana Yeast extract (larut dalam air) 5,0 g
REIB.
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Lakukan pemaparan spesimen untuk “survival
Natrium tioglikolat P atau 0,5 g
time” yang disyaratkan, masukkan ke dalam bejana,
Asam tioglikolat P 0,3 mL
dan pisahkan wadah yang berisi 10 spesimen. Ulangi
prosedur di atas segera, atau panaskan sebelumnya Larutan natrium resazurin P (1 dalam 1,0 mL
bila selang waktu yang cukup telah dilampaui, 1000) dibuat segar
sehingga wadah yang berisi 10 spesimen kedua Air murni 1000 mL
diperlakukan sama seperti yang pertama kecuali pH setelah sterilisasi 7,1 ± 0,2
untuk persyaratan “kill time”.
“Survival time” dan “kill time” untuk seluruh Campur dan panaskan hingga larut L-sistin P,
monografi indikator biologi dijelaskan dalam masing- natrium klorida P, dekstrosa, yeast extract dan
masing monografi. pancreatic digest of casein dalam air murni. Larutkan