STERILISASI, PEMBUATAN MEDIUM, PERHITUNGAN JUMLAH

MIKROBA DAN PEWARNAAN GRAM

LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI

Disusun oleh :

Kelompok 2

Novita Anggun D21010022

Rafli Adrian M D21010004
Ridho kurniawan D21010028
Bagas fitri pratama D210100
Hermawan prasetyo D21010012
Muhammad Arief D210100
Andy kristiaean D21010031
Meylano novi pratama D21010016

PROGRAM STUDI PETERNAKAN

FAKULTAS PERTANIAN DAN PETERNAKAN
UNIVERSITAS BOYOLALI
BOYOLALI
2022
 LEMBAR PENGESAHAN

Judul : STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM,

PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA DAN
PEWARNAAN GRAM

Kelompok : II (DUA)

Program Studi : PETERNAKAN

Fakultas : PERTANIAN DAN PETERNAKAN

Tanggal Pengesahan : Desember 2022

Mengetahui,

Dosen Pengampu

Angela Nitia Nefasa S.Pt., M.Si

NIDN. …………………………
 PERCOBAAN 1

PEMBUATAN MEDIUM POTATO DEXTROSE AGAR

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Medium merupakan suatu bahan yang terdiri atas campuran zat makanan (nutrient)

yang berfungsi sebagai tempat tumbuh mikrobia. Selain untuk menumbuhkan mikrobia,

medium dapat digunakan juga untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat–sifat

fisiologi, dan perhitungan jumlah mikrobia.

Medium dibedakan menjadi tiga macam yaitu :

1. Medium cair digunakan untuk berbagai tujuan termasuk menumbuhkan atau

membiakkan mikroba , fermentasi dan uji-uji lainnya, misalnya Nutrient Broth,

Glucose Broth , dsb;

2. Medium padat digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga

membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung atau diisolasi misalnya Nutrient Agar,

Plate Count Agar, Potato Dextrose Agar

3. Medium setengah Padat memiliki kosistensi diantara medium cair dan medium padat.

Medium padat mengandung bahan pemadat seperti agar , glatin atau silika gel.

Medium yang paling sering digunakan adalah agar yang diperoleh dari ganggang laut

dan telah diperdagangkan dalam bentuk murni dan kering. Konsentrasi penggunaan agar

biasannya 1,5%, tetapi jika akan dilakukan goresan pada permukaan agar dapat

digunakan konsentrasi 1,8-2.0%. Medium yang disimpan dalam keadaan telah memadat.

Misalnya dalam lemari es, dapat dicairkan kembali dengan cara memanaskan wadah

yang berisi medium tersebut di dalam panci yang berisi air mendidih selama beberapa

menit atau menggunakan autoclave.

1.2. Tujuan

Tujuan umum
 I.1.1 Mahasiswa mampu memahami media selektif

I.1.2 Mahasiswa mampu menjelaskan media PDA (Potato Dekstrose Agar)

Tujuan Khusus

I.2.1 Mahasiswa dapat mengetahui prosedur pembuatan media PDA

I.2.2 Mahasiswa dapat membuat media PDA

1.3. Manfaat

Manfaat yang didapatkan oleh mahasiswa adalah mengetahui tentang pratikum

percobaan PDA dan mahasiswa dapat membuat media PDA.

2. MATERI DAN METODE

Praktikum Mikrobiologi dengan materi Pembuatan Medium PDA dilaksanakan pada

hari Senin , tanggal 19 Desember 2022 pukul 08.00 WIB

Alat yang digunakan pada praktikum ini meliputi : timbangan, elenmeyer, waterbath,

gelas beker, gelas ukur, pisau, kain saring, pH meter.

Bahan yang digunakan pada praktikum ini meliputi : Nutrient Broth, Lactose Broth,

kentang, dextrose, agar, aquades.

2.1. Pembuatan medium PDA (Potato Dextrose Agar)

Metode yang dilakukan pada pembuatan Potato Dextrose Agar adalah dengan

menimbang Nutrient Broth kemudian larutkan dalam aquades. Aduk menggunakan

pengaduk magnetic dan lakukan sterilisasi menggunakan autoklaf. Untuk membuat

Nutrient Agar (NA) tambahkan1,5% agar dalam Nutrient Broth (NB).

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA)

 Percobaan ini dilakukan pembuatan medium yaitu PDA, karena merupakan salah

satu media yang banyak digunakan sebagai perkembangbiakkan suatu mikroorganisme,

baik itu bakteri/fungi, bakteri, maupun sel makhluk hidup. Potato Dextrose Agar (PDA)

merupakan paduan yang sesuai untuk menumbuhkan biakan. Karena ekstrak potato

(kentang) merupakan sumber karbohidrat, dextrose (gugusan gula, baik itu

monosakarida atau polysakarida) sebagai tambahan nutrisi bagi biakan, sedangkan agar

merupakan bahan media/tempat tumbuh bagi biakan yang baik, karena mengandung

cukup air. Hal ini sesuai pendapat Rais (2011) bahwa media PDA adalah medium yang

umum digunakan dalam kultivasi bakteri. Selain karena proses pembuatannya mudah,

juga karena memiliki komposisi yang kompleks bagi perkembangan bakteri.

Berdasarkan komposisinya PDA termasuk media semi sintetik karena tersusun atas

bahan alami (kentang) dan bahan sintesis (dextrose dan agar). Kentang merupakan

sumber karbon (karbohidrat), vitamin dan energy, dextrose sebagai sumber gula dan

energy, selain itu komponen agar berfungsi untuk memadatkan PDA. Masing-masing

ketiga komponen tersebut sangat diperlukan bagi pertumbuhan dan perkembangbiakan

mikroorganisme.

Tujuan penggunaan medium PDA itu sendiri karena PDA memiliki kandungan

karbohidrat yang cukup sehingga baik digunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme.

PDA (Potato Dextrose Agar) sering digunakan dalam percobaan karena memiliki pH

rendah yaitu antara 4,5 sampai 5,6 sehingga pertumbuhan bakteri menjad terhambat,

juga dibutuhkan lingkungan yang netral dengan pH 7,0 dengan suhu optimum untuk

pertumbuhan bakteri (Cappucino, 2014).

Dalam pertumbuhannya, mikroorganisme memerlukan bahan-bahan oraganik dan

ion-ion pendukung sebagai sumber energy dan katalis (Morse & Meitzner, 2010).

Faktor-faktor yang penting bagi proses pembiakan mikroorganisme yaitu nutrisi,

oksigen dan gas lain, kelembaban, pH media, suhu, serta kontaminan

4. SIMPULAN
 Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum ini adalah percobaan ini dilakukan

pembuatan medium yaitu PDA, karena merupakan salah satu media yang banyak

digunakan sebagai perkembangbiakkan suatu mikroorganisme, baik itu bakteri/fungi,

bakteri, maupun sel makhluk hidup.

Berdasarkan komposisinya PDA termasuk media semi sintetik karena tersusun atas

bahan alami (kentang) dan bahan sintesis (dextrose dan agar).

5. DAFTAR PUSTAKA

Cappuccino, J G. 2014. Manual Laboratorium Mikrobiologi. EGC, Jakarta.

Hadioetomo, 1990, Mikrobiologi Umum, Gadjah Mada Unoversity Press : Yogyakarta.

Waluyo, L.2010. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi.UMM Press.

Sugianto, 2012, Pembuatam Medium, UGM : Yogyakarta.

Wulandari, W., and Rahayu, T., 2015, Aktivitas Antibakteri IsolatAActinomycetes.

Zulkarnain, 2012. Mikrobiologi Dasar “Sejarah Pekrembangan Mikrobiologi”. Program

Studi Pendidikan Biologi Jurusan Pendidikan MIPA Fakultas Keguruan dan Ilmu
Pendidikan. Universitas Tadulako.
 PERCOBAAN 2

STERILISASI

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Sterilisasi adalah usaha yang dilakukan untuk membebaskan alat-alat atau bahan dari

segala macam kehidupan ,termasuk mikroba. Serta proses penghilangan atau membunuh

mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, mycoplasma, virus) dalam benda/peralatan

untuk menjaga peralatan di laboratorium tetap bersih/steril, serta mencegah terjadinya

kontaminasi.

1.2. Tujuan

Tujuan sterilisasi adalah membunuh semua bentuk mikroorganisme hidup termasuk

sporanya pada alat-alat yang disterilkan. Tujuan penelitian ini untuk menilai efisiensi

proses sterilisasi dengan pemanasan kering, oven dengan ozon dan infrared sebagai

pengendalian infeksi.

1.3. Manfaat

Sterilisasi di dalam laboratorium mikrobiologi menjadi bagian yang penting untuk

menghindari hasil positif palsu. Sterilisasi terhadap alat dan bahan sebelum pelaksanaan

kegiatan praktikum mikrobiologi membantu hasil atau identifikasi yang akurat terhadap

pemeriksaan mikrobiologi,serta memastikan alat dan bahan aman dari bakteri ataupun

kontaminasi dari luar.

2. MATERI DAN METODE

Praktikum mikrobologi dengan metode sterilisasi dilaksanakan pada tanggal 19

Desember 2022 pukul 08.00 .

 Alat yang digunakan pada praktikum ini meliputi : oven, autoklaf, cawanpetri, pipet

hisab, erlenmeyer

Serta bahan yang digunakan pada praktek ini meliputi : kertas pembungkus, kapas,

alkohol dan alumunium foil. Metode yang digunakan pada sterilisasi ini adalah

2.1. Sterilisasi Kering

1. Siapkan pipet, cawan petri, eryemeler serta alat gelas lainya sesuai dengan

kebutuhan.

2. Bersihkan cawan petri dengan menggunakan kapas yang dibahasi dengan alkohol

untuk menghilangkan kotoran dan lemak yang menempel pada cawan, kemudian

bungkus sepasang cawan petri tsb dengan kertas pembungkus.

3. Bersihkan pipet hisab dan sumbat bagian pangkal pipet dengan kapas kemudian

bungkus beberapa pipet dengan kertas jangan lupa memberi tanda pada bagian

pangkal dan ujung.

4. Tutup mulut erlenmeyer dengan menggunakan alumunium foil engan rapat.

5. Masukkan awan petri, pipet an erlenmeyer kedalam oven selama 2 jam pada suhu

160°C atau 1 jam pada suhu 170°C.

2.2. Sterilisasi Basah

1. Masukkan medium yang akan di serilisasi kedalam erlenmeyer atau tabung reaksi

serta larutan pengencer alam tabung reaksi, kemudian tutup rapat menggunakan

kapas.

2. Masukkan erlenmeyer dan tabung reaksi tsb kedalam autoklaf kemudian tutup

autoklaf dengan rapat.

3. Nyalakan autoklaf, tunggu hingga manometer dan termometer menunjukkan tanda

sterilisasi pada suhu 121°C, diamkan 15 menit.

 4. Tunggu hingga tekanan autoklaf berkisar 0,5 atm, buka katup pengaman biarkan

hingga autoklaf tiak lagi bertekanan, setelah itu buka autoklaf dan keluarkan

mediumnya.

5. Kusus untuk medium agar, untuk menurunkan suhunya dan menjaga agar tidak

membeku maka masukkan medium kedalam inkubator bersuhu 55° sebelum

digunakan.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Sterilisasi Kering

Berasarkan hasil percobaan yang dilakukan sterilisasi alat yang digunakan yaitu

cawan petri dan pipet hisab menggunakan oven dan menggunakan kapas yang dibasahi

dengan alkohol, hal ini sesuai dengan pendapat yang ada di diktat.

a. Tujuan dilakukan sterilisasi kering adalah Sterilisasi kering lebih efektif dalam

menghambat pertumbuhan koloni bakteri Escherichia coli bila dibandingkan dengan

desinfeksi tingkat tinggi teknik basah,serta untuk membersihkan kotoran yang

menempel dialat yang akan digunakan.

b. Alat dan bahan yang di perlukan saat melakukan sterilisasi kering adalah

Alat : Pipet, awan petri, erlenmeyer serta alat lainya sesuai dengan kebutuhan.

Bahan : Kertas pembungkus, kapas, alkohol, alumunium foil.

c. Tujuan alat disemprot dengan alkohol adalah mensterilkan alat yang akan digunakan

dari bakteri yang dapat tercampur dengan bahan yang akan diletakkan pada alat tsb.

Serta tujuan alat dibungkus dengan kertas pembungkus adalah agar mesterilkan alat

sebelum digunakan.

d. Mekanisme kerja sterilisasi kering menggunakan oven. Oven merupakan alat

laboratorium yang memiliki peranan yang sang penting. Alat ini digunakan untuk

memanaskan dan mengeringkan sampel, melakukan proses sterilisasi, dll. Prinsip

kerja dari oven adalah melakukan pemanasan secara tertutup sehingga suhu dan
 waktunya bias diatur, oven dapat digunakan sebagai alat sterilisasi yang bertujuan

membunuh mikrobakteri yang menempel pada sempel atau alat yang akan

digunakan.

e. Alasan menggunakan suhu 160°C selama 2 jam atau 170°C Selama 1 jam agar

bakteri yg menempel pada alat atau sampel yang akan digunakan bisa benar benar

mati.

f. Prinsip sterilisasi kering, Sterilisasi kering prinsip dasarnya adalah melalui

mekanisme konduksi, panas akan diabsorpsi oleh permukaan luar dari peralatan

yanag akan disterilkan, lalu merambat kebagian yang lebih dalam dari peralatan.

4.1. Sterilisasi Basah

Berasarkan hasil percobaan yang dilakukan sterilisasi bahan yang digunakan yaitu

aquaest dialam tabung reaksi dan medium PDA didalam eryerlener menggunakan larutan

pengencer,hal ini sesuai dengan pendapat pada diktat kami.

a. Tujuan dilakukan sterilisasi basah yaitu proses sterilisasi secara cepat menggunakan

uap air dengan alat yaitu autoklaf. Sterilisasi basah bertujuan untuk membunuh dan

menghancurkan mikroorganisme termasuk sporanya karena menyebabkan denaturasi

protein pada mikroorganisme tersebut.

b. Alat : Erlenmeyer, tabung reaksi, autoklaf, inkubator

Bahan : Medium yang akan digunakan atau disterilkan

c. Prinsip dasar sterilisasi basah, metode sterilisasi basah atau panas basah adalah

pemanasan menggunakan air atau uap air. Uap air adalah media penyalur panas yang

terbaik dan terkuat daya penetrasinya.

d. Alasan penggunaan suhu 121°C selama 15 menit yaitu agar medium yang akan

dipakai bisa benar benar steril dari mikrobakteri.

e. Prinsip kerja sterilisasi basah dalam membunuh mikroba adalah sterilisasi basah

biasanya dilakukan dengan alat autoklaf uap dengan menggunakan uap air jenuh

pada suhu 121 °C selama 15 menit agar steril dari mikroba.

4. SIMPULAN

Kesimpulan dari praktikum ini adalah sebagai berikut :

1. Dalam mensterilkan alat memakai terdapat beberapa metode yaitu metode kering dan

basah.

2. Hal yang harus diperhatikan dalam sterilisasi yaitu jenis alat yang akan disterilisasikan

terbuat dari bahan yang berbeda-beda. Karena dalam sterilisasi fisik harus

memperhatikan ketahanan fisik peralatan terhadap proses sterilisasi serta kebersihan

pengguna alat mikrobiologi.

5. DAFTAR PUSTAKA

Anneke. 2011. Metode Sterilisasi (http://rgmaisyah.wordpress.com/ metode-sterilisasi/).

Ali, A. 2005. Mikrobiologi Dasar Jilid I. State University of Makassar Press.
Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT.Gramedia Pustaka
Utama. Jakarta.
Brock, T. D. Madigan, M. T. 1991. Biology of Microorganisms. Sixth ed.
PrenticeHall International.
Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang

PERCOBAAN 3

PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Bakteri merupakan mikro uniseluler. Pada umumnya bakeri tidak mempunyai

klorofil. Ada beberapa yang fotosintetik dan reproduksi aseksualnya secara pembelahan.

Bakteri terwsebut luas di alam.

Menurut Waluyo (2007) Pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual

maupun kelompok dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan di dalam

medium yangn tidak cair maka akan terjadi suatu kelompok yang di namakan koloni.

Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan

terdiri dari metode hitungan cawan, Most Propable number (NPN), dan metode hitungan

mikroskopik langsung.

1.2. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah agar mahasiswa mampu mengidentifikasikan

mikroorganisme dengan metode hitung cawan atau Total plate Count ( TPC).

1.3. Manfaat

Manfaat yang didapat dari dari praktikum ini adalah Metode hitungan

cawan merupakan cara yang akurat untuk menentukan jumlah mikroba, karena hanya sel

yang masih hidup yang dihitung. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung dan dapat

digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba sekaligus.

2. MATERI DAN METODE

Praktikum Mikrobiologi dengan materi Penghitungan Jumlah Bakteri dilaksanakan

pada hari Senin, tanggal 19 April 2022 pukul 08.00 WIB

Alat yang digunakan pada praktikum ini meliputi tabung reaksi, cawan petri, pipet,

penghisap, erlenmeyer dan bunsen.

 Bahan yang digunakan pada praktikum ini meliputi sampel yang akandihitung

(bakteri/jamur/mikroba), medium.

2.1. Perhitungan Jumlah Mikroba

Metode yang digunakan dalam praktikum penghitungan jumlah bakteri adalah

metode hitung cawan (total plate count) metode ini dibagi menjadi 2 yaitu :

1. Metode Tuang (Pour Plate)

Dengan cara pengambilan larutan 1 ml atau 0,1 dengan pipet 1 ml kedalam

cawan petri penuangan ini sebisa mungkin tidak lebih dari 30 menit dari awal

pengenceran. Kemudian agar tidak cair steril didinginkan sampai 47-50C sebanyak

10-15 ml lalu di masukkan dalam cawan tersebut. Dalam penuangan medium tutup

cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi luar. Lalu

cawan digerakkan seperti angkat delapan untuk menyebarkan dan meratakan sel

mikroba secara merata. Setelah memadat cawan-cawan tersebut dapat diikubasi di

dalam incubator.

2. Metode Permukaan (Surface Plate)

Pada metode permukaan, medium agar yang telah steril didiamkan dalam

cawan petri sampai membeku. Setelah medium membeku sempurna permukaan

medium dipipet dengan sampel yang sudah dicairkan sebanyak 0,1 ml. lalu diratakan

dengaan cara memutar cawan petri di atas meja. Selanjutnya diinkubasi dan di

lakukan perhitungan koloni seperti yang dilakukan di metode tuang. Diingat jumlah

sampel yang dibutuhkan hanya 0,1 ml, jadi harus dimasukkan ke dalam perhitungan

pengenceran untuk mendapat “total plate”.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Penghitungan Jumlah Mikroba

 Berdasarkan hasil praktikum penghitungan jumlah mikroba diperoleh data

sebagai berikut :

Tabel 1. Hasil Penghitungan Koloni Bakteri

SPC
Medium Pengenceran
Sampel Metode (CFU/ml)

10-4 10-5 10-6

Susu sapi PDA Tuang  952

Sumber: Data Primer Praktikum Mikrobiologi, 2021.

Berdasarkan data hasil praktikum dapat diketahui bahwa jumlah bakteri dalam suatu

koloni pada media

a. Mikroba dalam susu di bawah sampel rata-rata (dibawah SNI) jadi susu ini baik

b. Batas cemar pada susu sapi mempunyai batas maksimal cemaran Entprobacteriacpae 1

x 103 CFU/ml dan staphylococcus aureus 1 x 102 CFU/ml dengan total organisme

c. Faktor yang mempengaruhi hasil perhitungan cawan diantaranya

- Koloni bakteri kurang atau lebih dari 30-300 koloni bakteri

- Pengenceran seri dan metode atau teknik kultur yang digunakan

d. Faktor pengenceran yaitu rasio antara volume akhir dan volume awal dari solusi

4. SIMPULAN

Dengan praktikum ini kita dapat, menyimpulkan bahwa :

1. Mengetahui banyaknya mikroba pada sampel susu dengan menggunakan metode

tuang dan permukaan

2. Mengetahui cara perhitungan jumlah koloni pada pengenceran susu

5. DAFTAR PUSTAKA

Saraswati, Rasti, dkk. 2007. Metode Analisis Tanah. Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertaanian : Bogor.
Widanarni., dkk. 2008. Inhibitory Mechanism of Robiotic Bacteria on The Growth of Vibro
harveyi in Tiger Shrimp (Penaeus monodon) Larvae dalam Jurnal Akuakultur
Indonesia, Vol 7, No 2.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang

Winda, S. 2009. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar. Diunduh pada tanggal 18
November 2018. http://www.mikromedia.co.org. 21 Februari 2019 .

PERCOBAAN 4

PEWARNAAN GRAM
1. PENDAHULUAN
2.2 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.

Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada
bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan
pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus.
Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung
(Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah
satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi(Dwidjoseputro.1998).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen.
Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun
pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna
asam dan pewarna basa.
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan
kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui
teknik pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-
bagian bakteri.
Fiksasi

Fiksasi adalah kegiatan membunuh bakteri dan membuat sel-sel bakteri tersebut
melekat pada gelas objek, biasanya digunakan panas dari api bunsen. Jika kultur
diambil dari medium cair, maka penyebaran dapat langsung dilakukan diatas kaca
objek yang bersih menggunakan loop. Tetapi jika kultur yang diambil dari medium
padat maka sebelumnya di atas kaca objek harus diberi setetes air, kemudian kultur
diambil sedikit dengan menggunakan ujung loop yang telah dipijarkan dan diratakan
di atas kaca objek sehingga terbentuk lapisan tipis Kesalahan yang sering dilakukan
adalah pengambilan kultur yang.

2.3. Tujuan

Untuk Mengetahui teknik

pewarnaan pada bakteri serta
mengetahui perbedaan bakteri
gram
negatif dan bakteri gram positif.
Untuk Mengetahui teknik
pewarnaan pada bakteri serta
mengetahui perbedaan bakteri
gram
negatif dan bakteri gram positif.
Untuk Mengetahui teknik
pewarnaan pada bakteri serta
mengetahui perbedaan bakteri
gram
negatif dan bakteri gram positif.
Untuk mengetahui teknik pewarnaan pada bakteri serta mengetahui perbedaan
bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

2.4 Manfaat

Agar mahasiswa dapat mengetahui dan membedakan bakteri gram positif dan bakteri
gram negatif.

2. MATERI DAN METODE

Praktikum Mikrobiologi dengan materi Pewarnaan Gram dilaksanakan pada hari
Senin, tanggal 19 April 2022 pukul 08.00 WIB
Alat yang digunakan pada praktikum ini meliputi : Kaca objek, bunsen, loop,
mikroskop. Bahan yang digunakan pada praktikum ini meliputi : larutan gram (A,B,C,D),
biakan bakteri.
2.1 Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan salah satu cara pewarnaan yang paling sering
dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi. Cara pewarnaan gram ini merupakan cara
pewarnaan deferinsial, dimana dengan cara ini bakteri dapat dibedakan menjadi 2
group yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan dari kedua grup
bakteri tersebut disebabkan oleh perbedaan komponen dalam lapisan-lapisan dinding
selnya.

Pada pewarnaan gram, mula-mula bakteri diwarnai dengan zat warna basa
yaitu violet kristal, dan diikuti perlakuan menggunakan suatu mordant yaitu larutan
yodium (lugol). Mordant adalah suatu zat yang dapat menaikkan afinitas atau
peningkatan antar sel dengan zat warna. Keberadaan mordant menyebabkan zat
warna akan lebih sukar tercuci. Sel kemudian dicuci dengan alkohol untuk
menghilang violet kristal. Setelah dicuci dengan air, sel diwarnai dengan
“counterstain” yaitu safranin. Sel-sel yang tidak dapat melepaskan warna akan tetap
berwarna kristal violet yaitu biru-ungu dan disebut bakteri gram positif, sedang sel-
sel yang dapat melepaskan violet violet kristal dan mengikat safranin sehingga
berwarna merah-merah muda disebut bakteri gram negatif.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Pencernaan gram

Salah satu pewarnaan bakteri yang sering di gunakan identifikasi jenis bakteri adalah
pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan teknik pewarnaan yang memiliki tujuan
untuk identifikasi bakteri melalui perbedaan gram positif dan gram negatif yang dihasilkan
melalui pewarnaan dengan zat pewarna kristal violet dan safranin. Prinsip dari teknik
pewarnaan ini yaitu didasarkan pada ikatan ion antara komponen seluler bakteri dengan
senyawa aktif yang terdapat did alam zat pewarna, atau yang biasa disebut kromagen.
Pewarnaan gram membantu mempermudah pengamatan struktur dalam bakteri misalnya
dinding sel, memperjelas ukuran sel bakteri dan mengetahui sifat fisika kimia bakteri.
Bakteri dalam pewarnaan gram dibedakan menjadi gram positif dan gram negatif
3.1.1. Lactobacillus casei
Berdasarkan praktikum gram yang telah dilaksanakan diperoleh hasil sebagai berikut :
Lactobacillus Casei Lactobacillus Casei

Bentuk : diameter 0,7 um, lebar 0,4 Bentuk : diameter 0,7 um, lebar 0,4

um sampai 0,7 um um sampai 0,7 um.

 Koloni : bundar, cepung, halus Koloni : bundar, cepung, halus

Warna : merah Warna : merah

Gram : negatif Gram : negatif

Sumber : Data Primer Praktikum Sumber:

Mikrobiologi, 2022.

Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini
digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet
memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai
antiseptik topikal (Sutedjo,1991).

Berdasarkan percobaan pewarnaan Gram didapat warna violet pada bakteri

Lactobacillus plantarum yang menandakan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram

positif.

Penjelasan pembahasan meliputi :

a. Ciri-ciri bakteri Gram positif

1. Anaerob
2. tidak memiliki alat gerak
3. tidak menghasilkan spora
4. berbentuk batang
5. salah satu bakteri yang berperan penting dalam pencernaan

b. Fenomena yang terjadi selama proses pewarnaan gram?

1. Teknik pewarnaan Gram dimulai dari pengambilan specimen

2. kemudian dilanjutkan dengan persiapan apusan, pewarnaan Gram

3. pemeriksaan slide di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif memiliki

lapisan peptidoglikan yang tebal (20-80 nm), sehingga akan mengambil

 kompleks stain-mordant primer dan akan tampak biru atau ungu di bawah

mikroskop.

c.Peran bakteri gram positif?

Bakteri gram positif mampu menahan kompleks pewarna primer ungu kristal yodium

sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap dan ungu).

3.1.2. Escherichia coli

Berdasarkan praktikum pewarnaan Gram yang telah dilaksanakan diperoleh hasil

sebagai berikut :

Escherichia coli Escherichia coli

: basil sekitar 2 um, diameter

Bentuk 0,7 um, lebar 0,4 sampai 0,7 Bentuk
:basil sekitar 2 um, diameter
um
0,7 um, lebar 0,4 sampai 0,7
um

Koloni : bundar, cepung, halus Koloni : bundar, cepung, halus

Warna : merah Warna : merah

Gram : negatif Gram : negatif

Sumber :data pewarnaan gram bakteri
Sumber : Data Primer Praktikum
Mikrobiologi, 2021. eschericia coli, IJPST, 2017
Ilustrasi 2. Gambar Pengamatan

Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat

warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui
morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa
pasda umumnya antara lain kristal violet, dan safranin(lay ,1994)
Bakteri Gram Negatif Perbesaran 100X.Berdasarkan percobaan pewarnaan Gram

didapat warna merah pada bakteri Escherichia coli yang menandakan bahwa bakteri tersebut

merupakan bakteri gram negatif.

Penjelasan pembahasan meliputi :

a. Ciri-ciri bakteri Gram negative

1. Memiliki pembungkus / envelope sel yang berbeda dengan bakteri Gram positif

2. Mempunyai ruang periplasma yang memisahkan antara membran luar dengan lapisan

sitoplasma

3. Ruang periplasma memilki jaringan rantai peptidoglikan yang diketahif sebagai

lapisan peptidoglikan Memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis Memiliki membran

luar yang tersusun atas lipopolisakarida.

4. Anggota dari bakteri Gram negatif tidak selamanya berkorelasi dengan kelompok

5. Proteobakteria Gram negatif, seperti bakteri fotosintesis contohnya

sianobakteria,klorobi (bakteri sulfur hijau), lorofleksi (bakteri non-sulfur hijau)

6. Bakteri Gram negatif juga termasuk kedalam kelompok yang bersifat anaerob

obligat.

7. Bakteri Gram negatif fermentasi dapat memfermentasi banyak jenis gula, asam

amino asam-asam organik dan beberapa dapat melakukan respirasi dengan

menggunakan fumarat / nitrat

8. Beberapa spesies dari bakteri Gram negatif juga dikenal sebagai agensia penyebab

penyakit terhadap hewan, tumbuhan dan manusia,

b. Fenomena yang terjadi selama proses pewarnaan gram?

 bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (1-3 nm) dan
persentase ikatan silang yang rendah diikuti dengan lapisan membran luar yang tipis
(7-8 nm), sehingga tidak mengikat kompleks stain-mordant dan akan tampak merah
di bawah mikroskop.

c. .Peran bakteri gram negatif

1. memoertahankan zat pewarna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram
sehingga akan bewarna biru atau ungu dibawah microskop
2. mampu menurunkan microba
 KESIMPULAN
Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :
- Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
- Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada
gram positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal
violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya
- Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan
differensial,pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul
- Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain :
alkohol, carbol fuchsin, crystal violet, dan safranin.
DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan

Hadiutomo. 1990.

Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga Lay, Bibiana.W.1994.

Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali Sutedjo, Mul

Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta Waluyo, lud. 2004.
Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press