ISOLASI DAN ANALISIS MINYAK ATSIRI DARI PIPERACEAE (Piper Sp.

1 DAN
Piper Sp. 2) SERTA AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN SITOTOKSIK

PROPOSAL PENELITIAN

Oleh
TAUFIK HIDAYAT
NIM. 1610411028

Pembimbing I : Dr. Mai Efdi

Pembimbing II : Bustanul Arifin, M.Si

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
2020
 ii

HALAMAN PENGESAHAN

“Isolasi dan Analisis Minyak Atsiri dari Piperaceae (Piper Sp. 1 dan Piper
Sp. 2) serta Aktifitas Antibakteri Dan Sitotoksik” merupakan proposal
penelitian yang diajukan oleh Taufik Hidayat (1610411028) sebagai salah satu
syarat untuk melakukan penelitian di bidang Kimia Organik Bahan Alam pada
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Andalas, Padang.

Disetujui Oleh:

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Mai Efdi Bustanul Arifin, M.Si

NIP:19725301999031003 NIP:196002281990031001
 iii

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................. ...................ii

DAFTAR ISI ..................................................................................... ..................iii
BAB I PENDAHULUAN ................................................................... ...................1
1.1 Latar Belakang ................................................................... ...................1
1.2 Rumusan Masalah ............................................................. ...................2
1.3 Tujuan Penelitian ............................................................... ...................2
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................. ...................2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................... ...................3
2.1 Tinjauan Botani Piper L ...................................................... ...................3
2.2 Minyak Atsiri....................................................................... ...................3
2.3 Kandungan Senyawa Piper L............................................. ...................4
2.4 Distilasi .............................................................................. ...................5
2.5 Gas Chromatography–Mass Spectrometry ........................ ...................5
2.6 Uji Sitotoksik ...................................................................... ...................6
2.6.1 Analisis Data Uji BSLT ............................................. ...................7
2.6.1 Udang Artimia salina ................................................ ...................7
2.7 Bakteri................................................................................ ...................8
2.7.1 Bakteri Gram Positif dan Negatif .............................. ...................8
2.7.1 Bakteri S. aureus dan E. coli .................................... ...................8
2.8 Metode Difusi ..................................................................... ...................8
BAB III METODOLOGI PENELITIAN .............................................. ...................9
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................. ...................9
3.2 Alat dan Bahan .................................................................. ...................9
3.2.1 Alat .......................................................................... ...................9
3.2.2 Bahan ....................................................................... ...................9
3.3 Tahapan Penelitian ............................................................ ...................9
3.3.1 Persiapan Sampel ................................................... ...................9
3.3.2 Isolasi Minyak Atsiri ................................................. ...................9
3.3.2 Analisis Komponen Miyak Atsiri Dengan GS-MS.......................10
3.3.3 Uji Antibakteri.............................................................................11
3.3.4 Uji Sitotoksik ............................................................ .................12
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................ .................14
LAMPIRAN 1 ................................................................................... .................17
LAMPIRAN 2 ................................................................................... .................18
LAMPIRAN 3 ................................................................................... .................20
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Suku tanaman Piperaceae merupakan tanaman yang hidup di daerah tropis dan
subtropis, tanaman ini memiliki 13 marga dan memiliki lebih dari 2000 jenis spesies
yang tersebar diseluruh dunia1. Salah satu marga dari suku Piperaceae adalah Piper
L, dimana spesies dari marga ini memiliki lebih 700 jenis spesies yang tersebar
tumbuh di daerah tropis dan subtropis2. Suku tanaman Piperaceae merupakan
tanaman yang berbunga berupa semak, memiliki daun yang beraroma aromatis,
berbunga majemuk yang tersusun beruntai dengan ukuran yang kecil dan keras 3.
Tanaman ini tumbuh antara 100-450 meter diatas permukaan laut1.
Di Indonesia, spesies Piper L banyak ditemukan seperti Piper aduncum, Piper
betle, Piper porphyrophylum, Piper nigrum, Piper sylvativum dan masih banyak lagi
yang tersebar hampir diseluruh wilayah Indonesia. Tanaman Piper L di Indonesia
banyak dimanfaatkan masyarakat sebagai tanaman obat dan tanaman hias1, seperti
Piper batle daunnya digunakan sebagai obat penyegar, desinfektan, obat bengkak
dan juga digunakan sebagai penyirihan dalam upacara adat khususnya di Sumatera
Barat4.
Piper L memiliki aroma daun yang khas dan aromatis, ini dikarena tanaman
tersebut mengandung minyak atsiri, minyak atsiri Piper L berbeda kandungan untuk
tiap jenisnya dan juga tergantung pada dilingkungan mana tanaman tersebut
tumbuh5. Minyak atsiri Piper L dilaporkan mengandung kelompok senyawa
monoterpene hydrocarbons, oxygenated monoterpenes, sesquiterpene
hydrocarbons, oxygenated sesquiterpenes, phenylpropanoids6,7,8.
Berdasarkan penelitian sebelumnya terhadap minyak atsiri dari berbagai jenis
Piper L diketahui memiliki bioaktivitas seperti antibakteri, antijamur dan
antioksidan8,9,10 serta memiliki toksistas yang tinggi berdasarkan uji BSLT(Brine
Shrimp Lethality Test) yang dilakukan terhadap salah satu Piper L (Piper nigrum)11.
Untuk uji antibakteri diketahui bahwa minyak atsiri Piper L (Piper batle) memiliki nilai
hambatan pertumbuhan bakteri dari lemah sampai sedang9.
Di Sumatera Barat tanaman Piper L banyak ditemukan dan telah digunakan
oleh masyarakat sebagai obat tradisional4. Dari eksplorasi yang telah dilakukan,
Piper L yang ditemukan tumbuh di Sumatera Barat yaitu, Piper aduncum, Piper

1
baccatum, Piper porphyrophylum, Piper sylvaticum, Piper betle, Piper muricatum,
Piper villipedunculum, Piper umbellatum, Piper flavomarginatum, Piper majusculum,
Piper mossilasum, Piper acutilimbum dan masih banyak lagi baik telah ataupun
yang belum teridentifikasi1. Berdasarkan data penelitian sebelumnya untuk
bioaktivitas minyak Piper L dan keanekaragaman Piper L yang ditemukan tumbuh di
Sumatera Barat serta masih minimnya penelitian terhadap kandungan senyawa
minyak atsiri dari Piper L tersebut. Oleh sebab itu penelitian ini akan dilakukan untuk
mengetahui kandungan minyak atsiri dari Piper L dan aktivitas antibaketri serta
toksisitas dari minyak atsiri tumbuhan tersebut.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas, dapat dirumuskan suatu permasalahan dari
penelitian ini yaitu:
1. Apa saja kandungan minyak atsiri yang terdapat Piper Sp.?
2. Bagaimanakah aktvitas antibakteri dari minyak atsiri dari Piper Sp.?
3. Bagaimanakah toksisitas minyak atsiri dari Piper Sp.?

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Mengisolasi minyak atsiri dari Piper Sp. dengan metoda distilasi uap.
2. Menganalisi kandungan senyawa minyak atsiri Piper Sp. dengan GS-MS.
3. Menentukan aktivitas antibakteri minyak atsiri Piper Sp. dengan teknik difusi
kertas cakram terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
4. Menentukan nilai toksisitas atau LC50 dari minyak atsiri Piper Sp. dengan metoda
BSLT(Brine Shrimp Lethality Test).

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat mengetahui kandungan minyak atsiri dari Piper Sp.
dan mengetahui bagaimanana aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli
dan Staphylococcus aureus serta mengetahui nilai LC50 minyak atsiri dari Piper Sp.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Botani Piper L

Piper L merupakan tanaman semak yang tumbuh menjalar dan diatas permukaan
tanah, bebatuan dan dibatang pohon tanaman yang lebih besar. Berapa jenis dari
Piper sp juga ditemukan sebagai tumbuhan perdu3, tanaman ini tumbuh diketinggian
50-450 meter diatas permukaan laut1. Tanaman ini merupakan tanaman berbunga
majemuk yang beruntai serta memiliki buah yang berukuran kecil dan bertekstur
keras. Daun dari tanaman ini memiliki aroma yang khas dan aromatis 3. Beberapa
jenis dari tanaman ini dapat dilihat pada gambar

Gambar 2.1 Beberapa spesies Piper L, dari kiri kekanan. Piper aduncum, Piper
batle , Piper porphyrophylum, Piper stylosum3

Menurut Tjitrosoepomo, klasifikasi tanaman Piper L adalah sebagai berikut12.

Kingdom : Plantae
Divisio : Spermatophyta
Subdivisio : Angiospermae
Class : Dicotyledonae
Ordo : Piperales
Familia : Piperaceae
Genus : Piper L

2.2 Minyak atsiri

Salah satu ciri khusus dari tanaman Piper L adalah daun dan batangnya memiliki
bau yang khas dan aromatis. Bau ini berasal dari minyak atsiri yang terkandung pada
bagian tumbuhan tersebut. Minyak atsiri merupakan senyawa yang bersifat mudah

3
menguap dan memiliki bau yang khas. Senyawa ini tersusun atas berbagai
kumpulan senyawa metabolit sekunder yang berikatan secara komplek. Umumnya
minyak atsiri merupakan golangan senyawa terpenoid yang berikatan dengan gugus
alkohol, aldehid, amida dan keton. Minyak atsiri merupakan produk alami dari
tumbuhan yang disintesis melalaui jalur asam mevalonat13,14. Minyak atsiri banyak
digunakan sebagai parfum, kosmetik, antibiotik, dan juga digunakan sebagai aroma
terapi untuk menghilangkan stress yang ringan15.

2.3 Kandungan Senyawa Minyak Atsiri Piper L

Berdasarkan laporan penelitian sebelumnya terhadap berbagi jenis spesies Piper L,
dilaporkan bahwa komposisi minyak atsirinya terdiri atas beberapa golongan
senyawa metabolit sekunder seperti monoterpen hidrokarbon, (α-pinene, myrcene,
limonene, α-terpinene), monoterpen dioksigenase (linalool, terpinen-4-ol, borneol),
sesquiterpene hidrokarbon (β-caryophyllene, α-humulene), sesquiterpen
dioksigenase (spathulenol, caryophyllene oxide, α-cadinol) dan fenilpropanoid
(safrole, dillapiole, myristicin) dan beberapa jenis senyawa aromatik lainnya2,8,7,16

pinene myrcene limineno

Gambar 2.2 Struktur senyawa kelompok moterpen hidrokarbon.

linalool borneol

Gambar 2.3 Struktur senyawa kelompok monoterpen dioksigenase.

safrole myristicin
Gambar 2.4 Struktur senyawa kelompok fenilpropanoid.
4
 humulene caryophyllene
Gambar 2.5 Struktur senyawa kelompok sesquiterpen hidrokarbon

spathulenol cadinol
Gambar 2.6 Struktur senyawa kelompok sesquiterpen dioksigenase

2.4 Distilasi
Menurut Rubiyanto distilasi adalah suatu teknik pemisahan senyawa berdasarkan
titik didih atau volatilitasnya. Teknik pemisahan ini terdiri atas banyak cara seperti
distilasi fraksinansi, distilasi vakum, distilasi normal, desilasi uap dan lainnya. Semua
itu bergantung terhadap senyawa yang akan dipisahkan dengan metoda distilasi17.
Distilasi uap dapat digunakan untuk mengisolasi minyak atsiri tumbuahan, tanaman
yang mengandung minyak atsiri direbus dalam wadah yang tertutup, uap air
bersama minyak atsiri akan naik ke kondensor dan mengalami kondensasi. Air dan
minyak atsiri akan mengalir dari kondensor ke separator dimana air dan minyak akan
terpisah secara otomatis dikarenakan perbedaan berat jenisnya masing-masing18.

2.5 Gas Chromatography–Mass Spectrometry

Teknik kromatografi gas pertama kali dikenalkan oleh James dan Martin pada tahun
1952. Pada dasarnya pemisahan dengan teknik ini dilakukan dengan cara
penguapan sampel menjadi gas kemudian dibawa oleh fasa gerak melewati kolom
kromatograrfi menuju detektor. Pemisahan ini terjadi karena adanya perbedaan
interaksi oleh setiap komponen yang terkandung didalam sampel yang dibawa oleh
fasa gerak dengan fasa diam yang melewati kolom menuju detektor. Komponen
5
komponen yang memiliki waktu interaksi yang singkat dengan fase diam akan lebih
cepat melewati kolom sehingga akan terpisah dengan komponen yang lain. Teknik
pemisahan ini hanya dapat dilakukan untuk senyawa yang tidak mengalami
dekomposisi ketika dipanaskan.
Fasa gerak yang digunakan berupa gas yang bersifat inert dan tidak
mengalami reaksi dengan komponen sampel atau merusak sampel. Kolom yang
digunakan berupa pipa kapiler berisi fasa diam. Temperatur pemanasan sampel
yang dibawa oleh fase gerak akan meningkat dari suhu 4-20 ℃/menit. Sehingga
komponen yang berinteraksi dengan fase diam akan keluar dari kolom berdasarakan
tingkat titik didihnya. Kolom pada GS-MS mulanya terbuat dari aluminium, tembaga,
stainless steel atau kaca yang didalamnya dilapisi oleh fase diam berupa senyawa
polimer yang memiliki titik didih yang tinggi. Dengan perkembangan sekarang ini
telah dibuat berbagai jenis kolom kromatografi gas seperti wall-coated open-tubular
(WCOT) yang diperkenalkan oleh Golay tahun 1958, porous-layer open-tubular
(PLOT) yang digunakan untuk GS-MS dan support-coated open-tubular (SCOT).
Kolom GS-MS umumnya memiliki ukaran diameter dalam 0.10-0.53 mm dan panjang
sekitar 10-60 meter.
Panjang kolom, ukuran diameter dalam kolom dan ketebalan lapisan fasa
diam sangat menentukan hasil pemisahan yang terjadi pada GS-MS. Komponen
analit yang dibawa fase gerak akan keluar dari kolom dan diteruskan ke detektor.
Dimana detektor akan menangkap sinyal dari energi kimia dan mengubahnya
menjadi energi listrik, kemudian energi tersebut dibaca oleh detektor dan diteruskan
ke rekorder (alat perekam). Rekorder akan mengubah sinyal listrik yang diterima
kemudian mencatatnya kedalam bentuk grafik spektrum yang dinamakan dengan
kromatogram. Nantinya berdasarkan kromatogram inilah komponen sampel dapat
dianalisis dan diketahui19.

2.6 Uji Sitotoksik dengan BSLT

Toksisitas adalah kemampuan suatu senyawa untuk merusak sel hidup 20. Salah satu
cara untuk mengetahui suatu senyawa memiliki kemampuan tersebut adalah dengan
mengujinya dengan metoda BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) yang dikemukan
oleh Mayer21. Metoda ini menggunakan larva udang Artemia salina sebagai hewan
uji dalam metoda tersebut. Kemampuan senyawa yang memiliki daya toksisitas
dapat diketahui berdasarkan nilai Lethal Concentration 50% (LC50).

6
2.6.1 Analisis Data Uji BSLT
LC50 merupakan suatu nilai yang menunjukan konsentrasi dari zat yang bersifat
toksik (senyawa uji) yang mampu untuk membunuh hewan uji sampai 50% dari
jumlah totalnya. Penentuan nilai LC50 dengan persen kepercayaan 95% dilakukan
dengan analisis probit22. Persen kematian hewan uji dapat ditentukan dengan rumus
uji - kontrol
Persen kematian = X 100%
kontrol
Nantinya berdasarkan nilai kematian hewan uji, dapat dicarai nilai probit
menggunakan tabel probit, yang kemudian dimasukan kedalam grafik persaman
linear20
Y = a + bX
Dimana:
Y = Nilai probit
a = Konsentrasi regresi
b = Slope/kemiringan regresi
x = Logaritma konsentrasi uji
Untuk nilai LC50 dapat dikategorikan sebagai berikut. Jika nilai LC50 besar dari 1000
µg /mL maka dikategorikan tidak beracun, dan nilai LC50 kecil dari 1000 µg /mL
dikategorikan beracun21.

2.6.2 Udang Artimia salina

Hewan uji yang digunakan untuk uji BSLT adalah udang Artimia salina, jenis udang
ini memiliki keunggulan karena memiliki sifat yang sensitif terhadap senyawa uji,
mudah untuk dibiakan dan siklus hidupnya yang cepat. Ukuran diameter larva udang
ini berkisar antara 200-300 µm, penetasan larva udang Artimia salina sangat mudah,
cukup dengan direndam dengan air laut pada suhu ruang kemudian disinari dengan
lampu pijar dan dibiarkan selama 24 jam21,22.

2.7 Bakteri
Senyawa metabolit sekunder hasil isolasi memiliki kemungkinan untuk menghambat
pertumbahan atau mematikan bakteri. Akitivitas ini dinamakan sebagai aktivitas
antibakteri23. Pencencegah dan pengendalian untuk penyakit yang disebabkan oleh
bakteri sangatlah penting, karena bakteri dapat menginfeksi makhluk hidup dan
dapat menyebabkan berbagai penyakit. Penyakit yang dapat disebabkan oleh bakteri
antara lain seperti kolera, diare, maningitis, tetanus, tuberkolosis, tipus, infeksi
terhadap mata dan telinga serta keracunan melalui makanan dan lain sebagainya.
7
Seperti bakteri E. coli yang hidup dalam saluran usus manusia, bakteri ini tidak
berbahaya selama masih dalam usus, tetapi bakteri ini akan mengakibatkan penyakit
apa bila masuk kedalam saluran cacing, aliran darah atau luka. Bakteri dapat
menginfeksi manuasia melalui kulit, mata, telinga, sistem pernapasan, dan pada
bagian oral24.

2.7.1 Bakteri Gram Positif dan Negatif

Bergey’s Manual dalam Burton's Microbiogy for the Health Sciences, bakteri terdiri
atas 5.007 spesies dan berdasarkan karakter fisiknya, bakteri terbagi atas dua jenis
yaitu bakteri gram positif dan gram negatif. Pengelompokan ini berdasarkan atas
bentuk dasar kerangkan dan morfologi penyusun dinding selnya. Secara umum
bakteri garam positif dan garam negatif memiliki perbedaan pada peptidoglikan,
asam teichoic dan asam lipoteichoic serta lipopolisakarida di dinding sel. Bakteri
gram positif memiliki peptidoglikan yang lebih tebal serta memiliki asam teichoic dan
asam lipoteichoic pada dinding sel. Untuk bakteri gram negatif memiliki dinding sel
yang tipis dan memiliki lipopolisakarida pada di dinding selnya24.

2.7.2 Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

Staphylococcus aureus merupakan bakteri garam positif, bakteri ini memiliki
morfologi cocci berkelompok (cocci in cluster). Bakteri ini dapat mengakibatkan
infeksi pada luka, bisul, pneumonia, septikemia dan keracunan makanan. Klasifikasi
Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut28.
Kingdom : Procaryota
Divisio : Firmicutes
Kelas : Bacili
Ordo : Bacilales 29
Family : Staphylococcaceae
Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
Salah satu bakteri yang termasuk kedalam kelompok bakteri gram negatif
adalah Escherichia coli bakteri ini dapat mengakibatkan infeksi saluran kemih dan
penyakit septikemia24. Klasifikasi Escherichia coli adalah sebagai berikut28.
Kingdom : Procaryota
Divisio : Gracilicetus 30
Kelas : Scotobakteria
Genus : Escherichia
8
Spesies : Escherichia coli

2.8 Metoda Difusi

Salah satu metoda yang paling umun digunakan dalam uji aktivitas antimikroba
adalah dengan menggunakan metoda difusi. Metoda difusi merupakan metoda yang
bersifat kulitatif, metoda mudah ini dilakukan dan sederhana. Metoda ini dimulai
dengan menginokulasi bakteri pada cawan petri yang berisi nutrisi dan meletakan
piringan cakram yang telah direndam dengan sampel uji dan mengikubasinya
selama 18-24 jam pada suhu 37℃26. Metoda difusi dengan cakram disk dapat
dilakukan untuk mikroorganisme uji seperti bakteri, ragi dan jamur. Media yang
digunakan bergantung terhadap jenis mikroorganisme yang digunakan, untuk bakteri
media yang digunakan yaitu Mueller-Hinton Agar (MHA)27.

Gambar 2.7 Metoda difusi dengan cakram26.

9
 BAB III
METODOLOGI

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada pada bulan Januari hingga April 2020. Determinasi
tanaman sampel akan dilakukan di Hebarium Jurusan Biologi FMIPA UNAND,
Pengekstrakan minyak atsiri dan uji sitotoksik metoda BSLT akan dilakukan di
Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam Jurusan Kimia FMIPA UNAND, analisis
komponen minyak atsiri dengan GC-MS akan dilakukan di Falkutas Pertanian FMIPA
UNAND, uji aktivitas antibakteri akan dilakukan Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia
FMIPA UNAND.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Peralatan yang akan digunakan dalam penelitian adalah, peralatan gelas, alumunium
voil, cawan petri, jarum ose, mikropipet, autoclave, laminar flow, seperangkat alat
distilasi uap (pompa, labu didih, kondensor, alat pemanas, trapping), neraca analitik
dan teknis, aerator, alat GS-MS.

3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan yaitu sampel Piper Sp, bakteri Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli, larva udang Artimia salina, akuades, air laut, Na2SO4 anhidrat,
DMSO, agar NA, NaCl fisiologis, ampicilin.

3.3 Tahap Penelitian

3.3.1 Pengambilan Sampel
Sampel Piper Sp. diambil dari hutan Biologi Universitas Andalas, sampel diambil
pada bagian aerial. Kemudian dipisahkan antara batang dengan daun, kemudian
ditimbang berat basah daun.

3.3.2 Isolasi Minyak Atsiri

Daun Piper Sp. dipotong kecil kemudian ditimbang sebanyak 30 gram. Sampel
kemudian dimasukan ke labu distilasi dan tambahkan dengan pelarut akuades
sampai sampel terendam hingga tiga perempat isi labu. Distilasi sampel dilakukan
selama ±8 jam hingga diperoleh campuran minyak atsiri dan air. Na 2SO4 anhidrat
ditambahkan pada distilasi minyak untuk memisahkan air dengan minyak.

10
3.3.2.1 Penentuan Rendemen
Rendemen minyak atsiri hasil isolasi dihitung terhadap berat basah sampel dengan
menggunakan rumus:
Output
Rendemen= x 100%
Input

Keterangan:
Output = berat minyak atsiri hasil Distilasi (gram)
Input = berat sampel basah (gram)

3.3.3 Anlisis Komponen Minyak Atsiri dengan GS-MS

Minyak atsiri hasil distilasi dianalisi komponennya dengan GS-MS.

3.3.4 Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri minyak atsiri dilakukan dengan teknik difusi dengan metoda
kertas cakram.

3.3.4.1 Pembuatan Sampel Uji Antibakteri

Minyak atsiri masing-masing ditimbang sebanyak 0.2; 0.15; 0.1 dan 0.05 gram dan
dilarutkan dengan DMSO 0.2 mL untuk mendapatkan konsentrasi 100%,75%, 50%,
dan 25% (b/v). Kemudian dilarutkan sampai homogen selama 10 menit 27.

3.3.4.2 Pembuatan Media Nutrien Agar (NA)

Nutrien agar (NA) ditimbang sebanyak 2.3 gram dan dilarutkan dengan akuades
hingga volume 100 mL, dipanaskan dan diaduk dengan magnetic stirer hingga
homogen. Larutan agar kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu 121℃
selama 15 menit27.

3.3.4.3 Peremajaan Bakteri Uji

Bakteri uji (Staphylococcus aureus dan Escherichia coli) diambil 1-2 ose kemudian
digoreskan pada media NA miring dan diinkubasi pada suhu 37℃ selama 24 jam27.

3.3.4.4 Pembuatan Inokulum Bakteri Uji

Bakteri uji diambil dan dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 mL NaCl
fisiologis dan diaduk homogen sehingga didapatkan larutan 10 0. Dari larutan 100
diambil sebanyak 1mL dan dimasukan kedalam tabung reaksi yang berisi 9 mL NaCl
fisiologis lalu diaduk sampai homogen dan didapatkan pengenceran 10-1.

11
Pengenceran dilakukan dengan cara yang sama hingga didapatkan pengenceran
sampai 10-5. Masing-masing hasil pengencaran dari 100 sampai 10-5 diambil
sebanyak 1mL dengan mikropipet ke cawan petri yang steril lalu ditambahkan media
NA dan dihomogenkan. Dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37℃27.

3.3.4.5 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Inokolasi bakteri uji diambil 1-2 ose dan dimasukan kedalam tabung reaksi steril
yang berisi 10 mL NaCl fisiologis kemudian dihomogenkan27.

3.3.4.6 Pembuatan Kontrol Positif dan Kontrol Negatif Antibakteri

Untuk kontrol positif, ditimbang sebanyak 2 gram ampicilin dan dilarutkan dalam 2
mL NaCl fisiologis dan dihomogekan. Kontrol negatif dibuat dari 2 mL aquades
steril27.

3.3.4.7 Pengujian Aktivitas Antibakteri

Suspensi bakteri dipipet sebanyak 1000 µL dengan mikropipet ke cawan petri yang
berisi media NA lalu dihomogenkan. Kertas cakram direndam pada masing-masing
konsentrasi sampel uji minyak atsiri (100%,75%, 50%, dan 25% (b/v)). Cawan petri
dibagi menjadi 4 juring dan diletakan masing-masing kertas cakram yang telah
direndam ke cawan petri yang telah berisi media NA yang telah berisi suspensi
bakteri. Dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37℃. Dilakukan perlakuan hal
yang sama untuk kontrol positif dan negatif 27.

3.3.5 Uji Sitotoksik

Uji Sitotoksik minyak atsiri dilakukan dengan metoda BSLT (Brine Shrimp Lethality
Test) dengan mengunakan hewan uji larva udang Artimia salina

3.3.5.1 Pembuatan Sampel Uji Minyak Atsiri

Sebanyak 20 mg masing-masing minyak atsiri ditambah dengan 5 tetes DMSO dan
dilarutkan dengan air laut 10 mL. Dari larutan tersebut dibuat larutan induk dengan
memipet sebanyak 1 mL dan dilarutkan dengan air laut hingga 10 mL, hingga
didapatkan larutan induk konsentrasi 100 µg/mL. Dari larutan induk diencerakan
untuk mendapakan konsentrasi masing-masing 10; 7.5; 5; 2.5 µg/mL22.

3.3.5.2 Penetasan Larva Artimia salina

Telur udang Artimia salina ditetaskan pada tabung kaca yang telah berisi air laut
dilengkapi dengan aerator dan lampu penerangan. Ditunggu selama 24 jam hingga
larva udang menetas22.
12
3.3.5.3 Uji Sitotoksi dengan Metoda BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)
Masing-masing larutan uji yang telah dibuat dengan konsentrasi 10; 7.5; 5 2.5 µg/mL
dipipet sebanyak 5 mL ke dalam botol vial. 10 ekor larva udang Artimia salina diambil
dan dimasukan kedalam botol vial. Dibiarkan selama 24 jam, dihitung larva udang
yang mati dan dilakukan analisis untuk menentukan nilai LC5022.

13
 DAFTAR PUSTAKA

1. Munawaroh E, Astuti IP, Sumanto. Studi Keanekaragaman dan Potensi Suku

Piperaceae di Sumatera Barat. Berk Penel Hayati. 2011;5A:35-40.

2. Hieu LD, Thang TD, Hoi TM, Ogunwande IA. Chemical composition of
essential oils from four Vietnamese species of Piper (Piperaceae). J Oleo Sci.
2014;63(3):211-217.

3. Munawaroh E, Yuzammi. The Diversity and Conservation of Piper (Piperaceae)

in Bukit Barisan Selatan National Park, Lampung Province. Media Konserv.
2018;22(2):118-128.

4. Munawaroh E. Studi Keanekaragaman Jenis Piper Spp dan Potensinya di

Kebun Raya Bogor. 2009:139-144.

5. Hertiani T, Purwantini I. Minyak Atsiri Hasil Distilasi Ekstrak Etanol Daun Sirih
(Piper betle L.) dari Beberapa Daerah di Yogyakarta dan Aktivitas Antijamur
terhadap Candida albicans. J Farm Indones. 2002;13(4):193-199.

6. da Silva JK, da Trindade R, Alves NS, Figueiredo PL, Maia JGS, Setzer WN.
Essential Oils from Neotropical Piper Species and Their Biological Activities. Int
J Mol Sci. 2017;18(12).

7. Paz RF, Guimarães EF, Ramos C. Short communication The occurrence of

phenylpropanoids in the saps of six Piper species ( Piperaceae ) from Brazil.
Gayana Bot. 2017;74(1):236-239.

8. Salleh WMNHW, Ahmad F, Khong HY. Chemical composition of Piper

stylosum Miq. and Piper ribesioides Wall. essential oils, and their antioxidant,
antimicrobial and tyrosinase inhibition activities. Bol Latinoam y del Caribe
Plantas Med y Aromat. 2014;13(5):488-497.

9. Sujono H, Rizal S, Purbaya S, Jasmansyah J. Antibacterial Activity of the

Essential Oil from Betel leaf (Piper betle L.) against Streptococcus pyogenes
and Staphylococcus aureus. J Kartika Kim. 2019;2(1):30-36.

10. Febriyanti. Analisis Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih (Piper
bettle Linn.) Dan Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap Beberapa Jenis Bakteri
Gram Positif. 2010.
14
11. Yasmin H, Abushama M., Abdalgadir H, Khalid A, Khalid H. Essential oils of
common spices traditionally used in Sudan as potential antioxidantsMedicine,
Traditional. J Ethnobiol Tradit Med. 2014;122:848-853.

12. Tjitrosoepomo G. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). Yogyakarta: Gajah

Mada University Press; 1993.

13. Tajidin NE, Ahmad SH, Rosenani AB., Azimah H, Munirah M. Chemical
composition and citral content in lemongrass ( Cymbopogon citratus ) essential
oil at three maturity stages. African J Biotechnol Vol. 2012;11(11):2685-2693.

14. Ganjewala D. Cymbopogon essential oils : Chemical compositions and

bioactivities. Int J Essent Oil Ther. 2009;3:56-65.

15. Pratiwi A, Utami LB. Isolasi Dan Analisis Kandungan Minyak Atsiri Pada
Kembang Leson. Bioeksperimen J Penelit Biol. 2018;4(1):42.

16. Rubiyanto D. Metoda Kromatografi: Prinsip Dasar, Pratikum, Dan Pendekatan

Pembelajaran Kromatogarfi. Yogyakarta: Deepublish; 2017.

17. Handa SS, Khanuja SPS, Longo G, Rakesh DD, eds. Extraction Technogies
for Medical and Aromatic Plants. Trieste: Internasinal Center for Science High
Technolgy; 2008.

18. Sparkman OD, Penton ZE, Kitson FG. Gas Chromatography and Mass
Spectrometry (Second Edition). In: Section 1: The Fundamentals of GC/MS. ;
2011:15-83.

19. Valadares ACF, Alves CCF, Alves JM, et al. Essential Oils from Piper aduncum
Inflorescences and Leaves: Chemicacomposition and Antifungal Activity
Against Aclerotinia sclerotiorum. An Acad Bras Cienc. 2018;90(3):2691-2699.

20. Puspitasari E, Sriwijaya U, Rozirwan R. Uji Toksisitas dengan Menggunakan

Metode Brine Shrimp Lethality Test ( Bslt ) Pada Ekstrak Mangrove ( Avicennia
Marina , Rhizophora Mucronata , Sonneratia Alba dan Xylocarpus Granatum
).2018;(February 2019).

21. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE. Brine shrimp: A convenient general
bioassay for active plant constituents. Planta Med. 1982;45(1):31-34.

15
22. Darmawan I. Bioaktivitas Minyak Atsiri Pohon Suren (Toona sinensis Roemor)
Berdasarkan Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Skripsi. 2011.

23. Febrianasari F. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Kirinyu (Chromolaena

odorata ) TERHADAP Staphylococcus aureus. Skripsi. 2018.

24. Engelkirk PG, Duben-Engelkirk J. Burton’s Microbiogy for the Health Sciences.
2011.

25. Dwivedi C, Pandey I, Pandey H, Ramteke PW. Electrospun Nanofibrous

Scaffold as a Potential Carrier of Antimicrobial Therapeutics for Diabetic
Wound Healing and Tissue Regeneration. Elsevier Inc.; 2017.

26. Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK. Methods for in vitro evaluating antimicrobial
activity : A review. J Pharm Anal. 2015;6(2):71-79.

27. Ali S, Baharuddin M, Sappewali. Jahe ( Zingiber officinale Roscoe ) Terhadap

Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. :18-31.

28. Brooks, G.F.; Butel JS. MSA. Mycobacteriaceae in Jawetz Medical Microbiologi,
22ed, McGraw-Hill Companies Inc:453-65.; 2001

16
 DAFTAR LAMPIRAN

LAMPIRAN 1. Skema Kerja Isolasi Minyak Atsiri dengan Metode Distilasi Uap

Daun Piper Sp.

- dipotong kecil-kecil
- ditimbang 30 gram
- dimasukkan kedalam labu distilasi
- ditambahkan akuades
- didistilasi selama ± 8 jam
Hasil distilasi

- dipisahkan air-minyak atsiri dengan Na2SO4

Minyak atsiri

17
LAMPIRAN 2. Skema Kerja Uji Aktifitas Antibakteri
a. Pembuatan Sampel Uji Antibakteri

Minyak atsiri

- ditimbang masing-masing sebanyak 0.2; 0.15; 1.0 dan 0.05 gram

- dilarutkan dengan 0.2 mL DMSO
- diaduk dan dihomogenkan
- didapatkan konsentarsi 100%, 75%, 50% dan 25% (b/v)

Sampel uji

b. Pembuatan Media Nutrien Agar (NA)

Nutrien agar

- ditimbang sebanyak 2.3 gram

- dilarutkan dengan akuades
- dipanaskan dan diaduk dengan magnetic stirer
- disterilkan dengan autoclave pada 121℃ selama 15 menit
Media NA

c. Peremajaan Bakteri Uji

Bakteri uji
(S. aureus dan E. coli)

- diambil 1-2 ose

- digoreskan pada media NA miring
- diinkubasi pada 37℃ selama 24 jam

Bakteri

d. Pembuatan Inokum Bakteri

Bakteri uji
(S. aureus dan E. coli)
- diambil 1-2 ose
- dimasukan dalam tabung reaksi yang berisi 10 mL NaCl fisiologis
- diaduk dan dihomogenkan

Larutan 100

18
 Larutan 100

- diambil 1mL
- ditambah dengan NaCl fisiologis sebanyak 9 mL
- diaduk sampai homogen

Larutan 10-1

- cara yang sama dilanjutkan hingga pengenceran 10-5

Larutan 100 sampai 10-5

- masing-masing diambil sebanyak 1mL

- dimasukan kedalam cawan petri steril
- ditambahkan media NA
- dihomogenkan
- diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37℃

Suspensi bakteri

e. Pembuatan Kontrol Positif

Ampicilin

- ditimbang sebanyak 2 gram

- dilarutkan dengan 2 mL NaCl fisiologis

Kontrol positif

f. Uji Aktivitas Antibakteri

Suspensi bakteri Kertas cakram

- dipipet 1000 µL ke cawan - direndam masing-masing pada

petri yang berisi media NA larutan uji dengan konsentarsi
- dihomogenkan 100%, 75%, 50% dan 25% (b/v)

- dibagi cawan petri menjadi 4 juring

- diletakan kertas cakram yang telah direndam dengan kecawan
petri yang telah berisi media NA
- diinkubasi selama 24 jam pad suhu 37℃

Hasil 19

- dilakukan hal yang sama untuk kontrol postif dan negatif

LAMPIRAN 3. Skema Kerja Uji Aktivitas Sitotoksik dengan Metoda BSLT
a. Pembuatan Larutan Induk

Minyak atsiri

- ditimbang sebanyak 20 mg
- ditambahkan 5 tetes DSMO
- ditambahkan air laut 10 mL dan dihomogenkann
Larutan

- diambil 1 mL
- dilarutkan dengan air laut hingga 10 mL
Larutan induk
100 µg/mL

b. Pembuatan Larutan Uji

Larutan induk
100 µg/mL

- dilakukan pengenceran bertingkat 10; 7.5; 5; 2.5 µg/mL

Larutan uji dengan

variasi konsentrasi

c. Penetasan Larva Udang Artemia salina

Telur udang
- dimasukan kekotak
- direndam dalam air laut
- disinari dengan lampu biasa selama 24 jam

Larva udang

d. Uji Sitotoksik Metode BSLT

Larutan uji
- dipipet masing-masing sebanyak 5 mL kebotol vial kecil
- dimasukan 10 ekor lavar udang ke botol vial
- dibiarkan selama 24 jam
- dihitung jumlah udang yang mati
- dilakukan analisis untuk menentukan nilai LC50
Hasil

20
21