BUKU PANDUAN KERJA

KETERAMPILAN

TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT APUS,

PEWARNAAN GRAM (GRAM STAINING)
DAN PENGAMATAN HASIL PEWARNAAN
GRAM

Diberikan pada Mahasiswa Semester II

Program Studi Pendidikan Dokter

Disusun oleh:
dr. Lisa Tenriesa M., M.MedSc., Sp.MK
dr. Firdaus Hamid, PhD, Sp.MK
(Departemen Mikrobiologi FKUH)

Fakultas Kedokteran Universitas

Hasanuddin Makassar
2023

Halaman 1 dari 7.
 Kata Pengantar

Bismillahirrahmanirrahim,

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan kekuatan,
ketekunan dan kesabaran sehingga buku penuntun keterampilan klinik 1 dengan judul
“Teknik Pembuatan Preparat Apus, Pewarnaan Gram (Gram Staining) Dan Pengamatan
Hasil Pewarnaan Gram” akhirnya dapat diselesaikan.
Sumber bacaan pokok dari buku pamdauan keterampilan klinik 1 ini adalah “Clinical
Microbiology Procedures Handbook. 4th ed. Tahun 2016, sebagai pelengkap juga diambil
dari buku-buku antara lain Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology tahun 2010,
Mahon MS et al, Textbook of Diagnostic Microbiology tahun 2019 dan lain-lain.

Buku ini dipersiapkan terutama untuk mahasiswa program studi pendidikan dokter semester 2
yang sedang mengikuti blok Mekanisme Dasar Penyakit dan Keterampilan Klinik 1. Buku ini
terdiri dari Pendahuluan/Dasar Teori, Deskripsi Kegiatan dan Langkah-langkah Keterampilan
Klinik.

Penulisan buku panduan keterampilan klinik ini diawali oleh dr. Baedah Madjid, Sp.MK(K)
dan kemudian dilakukan beberapa perbaikan. Penyusun mengucapkan terima kasih atas
segala bimbingan, motivasi dan arahan dari beliau.

Akhirnya semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi siapa saja yang ingin belajar dan
mendalami Teknik Pewarnaan Gram.

Makassar, 2023

Penyusun
dr. Lisa Tenriesa M., M.MedSc., Sp.MK
dr. Firdaus Hamid, PhD, Sp.MK

Halaman 2 dari 7.
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar
Daftar Isi
I. Tata Tertib
II. Pendahuluan
III. Tujuan dan Target Pembelajaran
IV. Indikasi
V. Media Pembelajaran
VI. Metode Pembelajaran
VII. Bahan dan Alat
VIII. Deskripsi Kegiatan
IX. Langkah Keterampilan Klinik
X. Referensi

Halaman 3 dari 7.
I. Tata Tertib
TATA TERTIB
LATIHAN KETERAMPILAN KLINIK

Mahasiswa yang mengikuti kegiatan ini diharuskan:

1. Membaca manual keterampilan klinik dan laboratorium sebelumnya.
2. Hadir tepat waktu.
3. Dapat membuktikan jatidirinya selama latihan berlangsung (seluruh wajah tampak)
4. Memakai jas praktikum dan papan nama sesuai absensi
5. Berpakaian rapi dan sopan.
6. Berpartisipasi aktif dalam kegiatan latihan keterampilan.
7. Tidak melakukan kegiatan yang tidak berhubungan dengan kegiatan latihan
keterampilan.
8. Tidak meletakkan barang lain diatas meja kerja kecuali manual dan bahan latihan
keterampilan
9. Tidak merusak bahan dan alat latihan keterampilan. Setiap kerusakan harus diganti
dalam waktu maksimal satu minggu.
10. Meninggalkan ruangan latihan keterampilan dalam keadaan rapi dan bersih.
11. Aturan diatas berlaku sejak memasuki koridor skill lab di laboratorium terpadu lantai
1 dan 2.

Halaman 4 dari 7.
II. PENDAHULUAN/DASAR TEORI

Pewarnaan Gram memiliki banyak kegunaan: terutama, pengelompokan bakteri

berdasarkan struktur dinding selnya dan memungkinkan pengamatan ukuran dan
morfologi sel bakteri. Hal ini juga dapat digunakan untuk menilai kualitas spesimen
klinis dan sebagai tes yang penting untuk diagnosis cepat dengan dugaan adanya
agen infektif dari spesimen. Pewarnaan ini awalnya dikembangkan oleh Christian
Gram pada tahun 1884. Modifikasi pewarnaan Gram yang saat ini digunakan
dikembangkan oleh Hucker pada tahun 1921, modifikasi ini memberikan
peningkatan konsistensi dekolorisasi dan diferensiasi organisme yang lebih baik.
Modifikasi Kopeloff, yang menggunakan counterstain basic fuchsin (atau carbol
fuchsin), memiliki kegunaan khusus untuk pewarnaan anaerob dan organisme
Gram-negatif pewarnaan lemah (misalnya, Legionella, Campylobacter, dan
Brucella).

Bakteri Gram positif atau Gram negatif didasarkan dari perbedaan komposisi dan
struktur dinding sel. Mikroorganisme Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan
yang tebal dan sejumlah besar asam teikoat. Bakteri ini tidak terpengaruh oleh
dekolorisasi alkohol dan mempertahankan primary stain, hasilnya akan tampak
ungu tua jika dinding selnya tidak rusak oleh usia, agen antimikroba, atau faktor
lainnya. Bakteri gram negatif memiliki satu lapisan peptidoglikan yang melekat
pada membran luar bilayer phospholipid-lipopolisakarida yang asimetris dengan
diselingi dengan protein. Membran luar ini dapat dirusak oleh dekolorizer berbasis
alkohol, memungkinkan kompleks kristal violet-iodine bocor keluar dan digantikan
oleh counterstain.

Interpretasi apusan pewarnaan Gram melibatkan pertimbangan karakteristik

pewarnaan dan ukuran, bentuk, dan susunan sel. Karakteristik ini dapat dipengaruhi
oleh banyak faktor, termasuk usia biakan, media, atmosfer inkubasi, metode
pewarnaan, dan adanya zat penghambat, termasuk paparan antibiotik.

Persiapan Pembuatan Preparat Apus

Pastikan label telah tercantum pada kaca objek sebelum memulai pembuatan apusan
dan pewarnaan sesuai dengan masing-masing spesimen. Kaca objek yang digunakan
harus sudah dibersihkan terlebih dahulu sehingga hasil yang didapatkan murni
berasal dari spesimen pemeriksaan. Spesimen harus merata pada permukaan kaca
objek sehingga pengamatan dapat berlangsung dengan baik (tidak bertumpuk/ tebal

Halaman 5 dari 7.
saat pengamatan dengan mikroskop).

Persiapan Pewarnaan Gram

Pastikan preparat apus sudah difiksasi sehingga tidak terhapus/ larut pada
saat dilakukan pewarnaan Gram.
Pastikan alat dan bahan pewarnaan sesuai dan tidak menggumpal/ mengkristal.

Persiapan Pembacaan Menggunakan Mikroskop

Mengangkat mikroskop dari tempat penyimpanan menggunakan kedua tangan.
Satu tangan memegang leher mikroskop dan tangan lainnya menyangga
bagian bawah mikroskop. Memutar lensa objektif dengan hati-hati dan selalu
memulai pengamatan dengan pembesaran terkecil. Setelah pengamatan
mikroskop harus memastikan lensa dibersihkan dengan xylol dan kertas
minyak agar lensa tidak rusak.

Halaman 6 dari 7.
III. TUJUAN DAN TARGET PEMBELAJARAN
A. Tujuan Pembelajaran
Mahasiswa mampu melakukan pembuatan preparat apus dan teknik pewarnaan
Gram secara baik, tepat dan efisien serta membaca hasil pewarnaan dengan baik
menggunakan mikroskop.

B. Target Pembelajaran
Setelah melakukan latihan keterampilan ini, mahasiswa:
1. Dapat melakukan persiapan alat/ bahan dengan benar
2. Dapat melakukan pembuatan preparat apus dengan tepat
3. Dapat melakukan teknik pewarnaan Gram dengan tepat
4. Dapat melakukan pengamatan hasil menggunakan mikroskop
5. Dapat menentukan hasil diamati pada teknik pewarnaan Gram
IV. INDIKASI
Dilakukan pada spesimen cairan tubuh maupun spesimen dari swab.
V. MEDIA PEMBELAJARAN
- Buku Penuntun Keterampilan Klinik
- Video Keterampilan Klinik Swab Duh Vagina & Urethra
VI. METODE PEMBELAJARAN
- Demonstrasi sesuai Penuntun Keterampilan Klinik
VII. ALAT DAN BAHAN
1. Kaca objek 8. Kertas label
2. Rak pewarnaan 9. Isolat bakteri Gram positif dan Gram negatif
3. Sarung tangan 10. Zat pewarna primer dan sekunder (Crystal violet, safranin)
4. Sengkelit/ose 11. Zat mordan (Iodine)
5. Pinset/forceps 12. Zat peluntur (ethanol 95%)
6. Lampu spiritus 13. Rak penyimpanan slide/ kotak preparat
7. Spidol permanen 14. Air mengalir atau larutan aquades
VIII. DESKRIPSI KEGIATAN
KEGIATAN WAKTU DESKRIPSI
1. Pengantar 2 menit Pengantar
2. Bermain peran 30 menit 1. Mengatur posisi duduk mahasiswa
& tanya jawab 2. Dosen memberikan contoh bagaimana cara
pembuatan preparat apus dan pewarnaan Gram

Halaman 7 dari 7.
 3. Mahasiswa menyimak/ mengamati peragaan
dengan menggunakan penuntun belajar
4. Mahasiswa mendapat kesempatan untuk bertanya
dan dosen memberikan penjelasan tentang aspek-
aspek yang penting
6. Praktek 100 menit 1. Diperlukan minimal 1 orang instruktur untuk
bermain peran mengamati setiap langkah yang dilakukan oleh
dengan umpan setiap mahasiswa
balik 2. Setiap mahasiswa melakukan langkah
pembuatan preparat apus
3. Instruktur berkeliling di antara mahasiswa
dan melakukan supervisi menggunakan
ceklist
4. Instruktur memberikan pertanyaan dan umpan
balik kepada setiap pasangan
4. Curah 15 menit 1. Curah pendapat/ diskusi: Apa yang dirasakan
pendapat/diskusi mudah? Apa yang sulit?
2. Instruktur membuat kesimpulan dengan menjawab
pertanyaan terakhir dan memperjelas hal-hal yang
masih belum dimengerti

150 menit
5. Total waktu

Halaman 8 dari 7.
 PENUNTUN PEMBELAJARAN
TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT APUS DAN
PEWARNAAN GRAM / GRAM STAINING
(digunakan oleh Mahasiswa)

LANGKAH PEMBUATAN PREPARAT APUS

1 Siapkan alat dan bahan yang dibutuhkan.
2 Siapkan spesimen (dalam hal ini isolat bakteri) yang akan dibuat apusannya.
3 Gunakan sarung tangan dengan tepat.
4 Bersihkan kaca objek dengan merendamkan pada ethanol 95%
Ambillah kaca objek menggunakan pinset/ forceps dan membiarkan sisa alcohol mengering
5
lalu melidah-apikan kaca objek.

6 Dalam keterampilan ini pengambilan spesimen disesuaikan dengan jenis spesimennya:

a.     Untuk spesimen cair seperti urine: Meng-homogenkan spesimen lalu mengambil 10µl
spesimen cair (menggunakan sengkelit 10µl yang sudah disterilkan dengan pemijaran) pada
gelas objek lalu dikeringkan di udara tanpa diratakan.

b.     Untuk spesimen swab: memutar swab secara perlahan pada kaca objek.
c.     Untuk spesimen dari medium agar: mengambil sedikit bakteri dari koloni yang ada
menggunakan sengkelit/ ose yang sudah disterilkan dengan pemijaran dan meratakan pada
kaca objek secara perlahan.
7 Keringkan preparat dengan didiamkan di udara bebas.
Fiksasi preparat dengan melewatkan pada api sebanyak dua hingga tiga kali. Jangan sampai
8
melakukan pemanasan berlebihan.
LANGKAH PEMBUATAN PREPARAT APUS
9 Siapkan alat dan bahan yang dibutuhkan.
1
Siapkan spesimen (dalam hal ini isolat bakteri) yang akan dibuat apusannya.
0
1
Gunakan sarung tangan dengan tepat.
1
1
Bersihkan kaca objek dengan merendamkan pada ethanol 95%
2
1 Ambillah kaca objek menggunakan pinset/ forceps dan membiarkan sisa alcohol mengering
3 lalu melidah-apikan kaca objek.
Dalam keterampilan ini pengambilan spesimen disesuaikan dengan jenis spesimennya:

1 a. Untuk spesimen cair seperti urine: Meng-homogenkan spesimen lalu mengambil 10µl
4 spesimen cair (menggunakan sengkelit 10µl yang sudah disterilkan dengan pemijaran)
pada gelas objek lalu dikeringkan di udara tanpa diratakan.
b. Untuk spesimen swab: memutar swab secara perlahan pada kaca objek.

Halaman 9 dari 7.
 c. Untuk spesimen dari medium agar: mengambil sedikit bakteri dari koloni yang ada
menggunakan sengkelit/ ose yang sudah disterilkan dengan pemijaran dan meratakan
pada kaca objek secara perlahan.
1
Keringkan preparat dengan didiamkan di udara bebas.
5
1 Fiksasi preparat dengan melewatkan pada api sebanyak dua hingga tiga kali. Jangan sampai
6 melakukan pemanasan berlebihan.
LANGKAH PEWARNAAN GRAM
1 Letakkan preparat apus diatas rak pewarnaan.
2 Genangi preparat dengan larutan crystal violet. Biarkan hingga 30 detik.
Buanglah larutan crystal violet pada preparat apus dan membilas perlahan dengan air
3 mengalir. Bilas dengan air mengalir dilakukan pada sisi ujung slide dan bukan diarahkan
langsung di atas preparat.
Bilas kembali preparat apus dengan larutan iodine, lalu menggenangi preparat apus dengan
4
larutan iodine. Membiarkan selama 30 detik.
5 Bilas kembali preparat dengan air mengalir.
Lakukan dekolorisasi dengan mengalirkan ethanol 95% pada apusan dari bagian ujung kaca
objek dengan membentuk sudut. Berhenti pada saat tidak ada lagi zat warna yang terlihat
6
mengalir dari preparat. Waktu dekolorisasi paling lama 30 detik tergantung ketebalan
apusan.
7 Hilangkan ethanol 95% dengan membilas menggunakan air mengalir.
8 Genangi preparat apus dengan safranin selama 30 detik.
9 Bilaslah safranin dari preparat apus dengan menggunakan air mengalir.
1 Miringkan kaca objek untuk mengalirkan sisa air pada preparat apus dan membiarkan
0 preparat kering di udara bebas.
LANGKAH PENGAMATAN DI BAWAH MIKROSKOP
1 Letakkan preparat yang sudah diwarnai pada meja objek dari mikroskop cahaya.
Amati preparat dengan menggunakan pembesaran objektif 10x.
a.     Mengamati adanya Kristal atau presipitat.
b.     Apabila terdapat presipitat maka sebaiknya melakukan pewarnaan ulang.

2 c.     Memastikan dekolorisasi berjalan dengan baik (bagian latar berwarna Gram negatif,
jika terdapat leukosit akan terwarnai seperti Gram negatif, apabila dekolorisasi berlebihan
maka sebaiknya melakukan pewarnaan ulang.
d.     Menentukan apakah ketebalan preparat apus sudah tepat. Hal ini terlihat dari adanya sel
yang tumpah tindih atau bertumpuk.
Jika terdapat sel, melakukan penghitungan jumlah sel leukosit dan sel epitel pada
3
setidaknya 20 – 40 lapangan pandang.
Putarlah lensa ke sampai daerah di atas kaca objek bebas dari lensa lalu meneteskan 1 – 2
4
tetes minyak emersi di atas preparat apus.
Amati dengan menggunakan pembesaran objektif 100x pada 20 – 40 lapangan pandang
5
untuk mengamati morfologi bakteri dan reaksi Gram.
Catatlah hasil pengamatan dan melaporkan hasil pada dokter. Pencatatan hasil adalah
6
sebagai berikut
Halaman 10 dari
7.
 JUMLAH SEL PADA JUMLAH BAKTERI PADA LAPANGAN
* Deskripsi Sel yangPANDANG
LAPANGAN diamati: Sel epitel; PMN; Eritrosit;
PANDANG Material
BESAR dari host (misal
(DENGAN MINYAKKristal, dll)

KECIL (OBJ. 40x)* EMERSI, OBJ. 100x)**

1+ (jarang) : < 1/LPK 1+ (jarang) : < 1/ LPB

2+ (sedikit) : 1 - 9/ LPK 2+ (sedikit) : 1 - 5/ LPB
3+ (sedang) : 10 - 25/LPK 3+ (sedang) : 6 - 30 /LPB
4+ (banyak) : > 25/ LPK 4+ (banyak) : > 30/ LPB

** Deskripsi bakteri yang diamati: Gram positif (bentuk dan pengelompokan);

Gram negatif (bentuk dan pengelompokan)

DAFTAR PUSTAKA

1. Leber, Amy L., ed. 2016. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 4th ed. Washington,
D.C., DC: American Society for Microbiology.
2. Mahon MS, C.R., L. E. Mls. S. D. C. (2019). Textbook of Diagnostic Microbiology.
3. Goldman E., Green L. H. Practical handbook of microbiology. Danvers: CRC Press. 2015
4. Jorgensen J.H., Pfaller M. A. Manual of Clinical Microbiology. Canada : ASM Press. 2015
5. Mishra S. K., Agrawal D. A Concise Manual of Pathogenic Microbiology. New Jersey : John
Wiley & Sons, Inc. 2013
6. Brooks G. F., et al. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology (25th ed.). New
York: McGraw-Hill. 2010
7. Cowan M. K. Microbiology A Systems Approach (3rd ed.). New York: McGraw Hill. 2012
8. Talaro K.P., Chess B. Foundation in Microbiology (8th ed.). New York: McGraw-Hill. 2012

Halaman 11 dari
7.