Isolasi Bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008

ISOLASI BAKTERI DAN KARAKTERISASI PARSIAL ENZIM
OKSIDOREDUKTASE DARI SITU AGATHIS, KAMPUS UNIVERSITAS

INDONESIA, DEPOK
THESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains
Oleh :
SUWARTI
6305040078
UNIVERSITAS INDONESIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM PASCASARJANA
PROGRAM STUDI BIOLOGI
DEPOK
2008
Isolasi bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008.

THESIS
Judul : Isolasi bakteri dan karakterisasi parsial

enzim oksidoreduktase dari Situ Agathis,
kampus Universitas Indonesia, Depok
Nama : Suwarti
NIM : 6305040078
Program Studi : Mikrobiologi
Menyetujui,
1.Komisi Pembimbing
Dr. Arief Budi Witarto Dr. Wellyzar Sjamsuridzal

Pembimbing I Pembimbing II
2. Penguji
Ariyanti Oetari, Ph.D Dr . Wibowo Mangunwardoyo

Penguji I Penguji II
3. Ketua Departemen Biologi 4. Ketua Program

Pascasarjana FMIPA UI
Dr. Rer.Nat. Mufti P. Patria Dr. Adi Basukriadi

KATA PENGANTAR
Alhamdulillahirobbil alamin. Penulis menyampaikan segala puji dan rasa syukur
hanya kepada Allah, SWT, Tuhan semesta alam sehingga akhirnya tesis ini dapat
diselesaikan. Penulis juga ingin menyampaikan rasa terima kasih yang mendalam
kepada beberapa pihak antara lain :
1. Bapak Dr. Arief Budi Witarto, selaku pembimbing I dan Ketua Laboratorium
Rekayasa Protein, Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong untuk bimbingan,
kesabaran, motivasi, dan dukungan baik materil maupun moril sehingga penulis
bisa memiliki kesempatan untuk melaksanakan studi dan penelitian pada
program Magister Biologi di Universitas Indonesia.
2. Ibu Dr. Wellyzar Sjamsuridzal, selaku pembimbing II yang dengan penuh
ketelitian dan kesabaran membimbing penulis dalam penyelesaian penelitian dan
penulisan tesis dalam kurun waktu yang cukup lama.
3. Ibu Aryanti Oetari, Ph. D selaku penguji I, atas segala kritik, saran dan masukan
yang membangun untuk penyempurnaan tesis.
4. Bapak Dr. Wibowo Mangunwardoyo selaku penguji II, atas segala kritik, saran
dan masukan yang diberikan kepada penulis.
5. Ibu Dr. Susiani Purbaningsih, sebagai perwakilan dari Program Pascasarjana
yang memberikan ilmu dan motivasi selama studi di Departemen Biologi UI.
6. ASEA-UNINET Foundation yang memberikan bantuan finansial, sehingga
penulis dapat menyelesaikan studi di Departemen Biologi UI.
vi

vii
7. Nina Maryana dan Dwi Pangestu atas bantuannya selama penelitian di
Laboratorium Rekayasa Protein.
8. Rekan-rekan sesama mahasiswa pascasarjana Biologi angkatan 2005, Ibu
Yuyun, Mba Wulan, Mba Sandra, Imam, Glaudy, Didik, Pak Dondin, Pak Sjahrir
atas bantuannya.
9. Keluarga tercinta, suami Dheni Mita Mala atas pengertian, semangat, motivasi,
dan cinta kasih, Ibu yang memungkinkan semua ini terjadi, dan anakku tercinta
Harvy Raffa Azami, semoga yang dilakukan Bunda dapat menjadi inspirasi kelak.
10. Semua pihak yang membantu penulis dan tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari dengan sangat, tulisan ini masih jauh dari sempurna.
Oleh karena itu, penulis terbuka terhadap segala kritik, saran dan masukan.
Terima kasih.
Depok, Juli 2008
Penulis

viii
DAFTAR ISI
SUMMARY ......................................................................................................... i
KATA PENGANTAR........................................................................................... vi
DAFTAR ISI ....................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ ix
DAFTAR TABEL ................................................................................................ x
DAFTAR LAMPIRAN.......................................................................................... x
PENGANTAR PARIPURNA ............................................................................... 1
MAKALAH I ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM OKSIDOREDUKTASE

DARI SITU AGATHIS KAMPUS UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK ......................................................................................... 6
Pendahuluan ................................................................................. 6
Bahan dan Cara kerja ................................................................... 11
Hasil dan Pembahasan ................................................................. 23
Kesimpulan ................................................................................... 41
Daftar acuan.................................................................................. 43
MAKALAH II KARAKTERISASI ENZIM OKSIDOREDUKTASE DARI SITU

AGATHIS KAMPUS UNIVERSITAS INDONESIA DEPOK .......... 55
Pendahuluan ................................................................................. 55
Bahan dan Cara kerja ................................................................... 59
Hasil dan Pembahasan ................................................................. 69
Kesimpulan ................................................................................... 84
Daftar acuan.................................................................................. 85
DISKUSI PARIPURNA ....................................................................................... 91
RANGKUMAN KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 97
DAFTAR ACUAN ............................................................................................... 99
LAMPIRAN…………………………………………………………………………….. 105

Name : Suwarti (6305040078)
Title : ISOLATION OF OXYDOREDUCTASE-PRODUCING

BACTERIA AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF
OXYDOREDUCTASE ENZYMES FROM SITU AGATHIS,
UNIVERSITY OF INDONESIA, DEPOK.
Thesis supervisors:
Dr. Arief Budi Witarto, M. Eng; Dr. Wellyzar Sjamsuridzal
SUMMARY
Oxydoreductases are enzymes which catalyze oxidation-reduction
reaction of their corresponding substrates. Oxydoreductase enzymes from
many microorganisms had become major focus of research during last
decades. This reaction had been utilized in biosensor (Yuhashi et al. 2005),
biotransformation and biofuel (Zu et al. 2006). In the field of biosensor,
glucose dehydrogenase application as self-blood glucose monitoring had
evolved through several generation to enhance its sensitivity and specificity
(Witarto et al. 1997).
Oxydoreductase involve cofactor in their active sites. According to
Anthony (1996) among several known cofactors such nicotinamide, flavonoid,
and quinone, Pyrollo Quinoline Qinone (PQQ) as the member group of
quinon is one of the latest known-cofactors. PQQ differs from other cofactor
since it is not covalently bond to its enzyme (Oubrie et al. 1999). PQQ
ubiquitously found in all organisms from prokaryote to eukaryote (Bishop et
al. 1998).

ii
Bacteria is the largest group of PQQ-oxydoreductase producing
microorganisms. They successfully isolated from many habitats such: soil,
water (Toyama et al. 1995), fruits (Adachi et al. 2003), plants, and in human
mouth (Anesti et al. 2005). However, study on PQQ-oxydoreductase
producing bacteria isolation had never been reported in Indonesia.
PQQ-Oxydoreductase bacteria are able to utilize organic substrates
such glucose, ethanol, methanol, up to polyvinyl alcohol (Ameyama et al.
1985). One of the habitats which provides such organic substrates is Situ
Agathis located in University of Indonesia Depok. Situ Agathis contain humic
substances that could be degraded in to glucose, ethanol, methanol, also
quinone.
In this study, isolation of oxydoreductase-producing bacteria from
Situ Agathis University of Indonesia, Depok and characterization of
oxydroreductases of selected isolates were performed. The objectives of this
research are: to investigate the presence of oxydoreductase-producing
bacteria, to isolate the oxydoreductases -producing bacteria, and to partially
characterize oxydoreductases from Situ Agathis University of Indonesia
Depok. This is the first study on bacteria isolation performed in Situ Agathis
UI, Depok. Hence, this study can provide information about the
oxydoreductases- producing bacteria from Situ Agathis, which located in UI,
Depok.

iii
The study consists of two part: first part describe the isolation of
oxydoreductase-producing bacteria from Situ Agathis. Second part describe
the partial characterization of oxydoreductases which covers enzyme activity,
molecular weight, and PQQ effects on the enzymes’ activity.
The research was carried out at the Protein Engineering Laboratory,
Biotechnology Research Centre, Indonesian Institute of Science, Cibinong
and the Laboratory of Microbiology, Department of Biology, University of
Indonesia, Depok during February – September 2007.
The isolation of bacteria was conducted in three methods i.e :
dilution, filtration using filter paper Milipore membran (0.2 µm) based on
Cappucino and Sherman (2002). Isolation of oxydoreductase-producing
bacteria was carried out by using selective media based on Toyama et al.
(1995). The assay of oxydoreductases was performed by using Native-PAGE
based on Khodijah (2002).
The result showed that 83 isolates were obtained from Situ Agathis
which we assumed could produce oxydoreductase enzymes. Among those
isolates, 15 isolates were randomly selected for further study e.g : five
isolates which could grow in glucose as sole carbon sources by producing
glucose dehdyrogenase, six isolates which could grow on ethanol as sole
carbon sources by producing ethanol dehydrogenase and four isolates which
could grow on methanol as sole carbon sources by producing methanol
dehydrogenase. The selected isolates showed various morphotypes

iv
indicating no specific morphological character in oxydoreductase-producing
bacteria.
Two oxydoreductases from selected isolates were selected to be
analyzed further in second part this thesis. Those enzymes were examined
for their possibility to have intracellular PQQ cofactor. Those enzymes were
obtained from isolate G1H1D30 (glucose dehydrogenase) and isolate
A1H2D60 (ethanol dehydrogenase). Native-PAGE result confirmed that
crude extract fraction, dialyzed fraction and elution of open column
chromatography of isolate G1H1D30 can produce glucose dehydrogenase
and isolate A1H2D60 can produce ethanol dehdyrogenase. The molecular
weight of glucose dehydrogenase subunit is about 46 kDa using SDS-PAGE.
SDS-PAGE of ethanol dehydrogenase did not show any protein band in
acrylamide gel. We assumed that the amount of protein extracted from cell
cytoplasm was not sufficient enough to be detected in SDS-PAGE. Cell of
isolate A1H2D60 should be treated by other destruction method such as
French pressure or ultrasonicator since this isolate is Gram positive bacteria
which had thicker peptydoglycan layer than isolate G1H1D30 which is Gram
negative bacteria.
Other characterization performed was addition of PQQ as the
cofactor to investigate its effect on enzymes activity. Glucose dehydrogenase
from isolate G1H1D30 was known to be PQQ dependent enzymes from its
activity increased after addition of PQQ. The addition of PQQ raised the

v
enzyme activity to eight fold from 0.102 U/mL to 0.94 U/mL of crude enzyme
extract. In contrast, addition of PQQ did not give significant effect to EDH
enzyme activity (activity of crude enzyme remain 0.082 U/mL in the presence
and absence of PQQ). However, further study should be performed to
analyze the real cofactor of EDH from isolate A1H2D60. EDH differs from
GDH since it had disulphide ring which stabilize PQQ bound to its enzyme.
Hence, PQQ could remain bound to EDH as purification procedure
performed. PQQ-GDH do not have any disulphide ring which could stabilize
PQQ bound. This fact implicated unstable PQQ bound to GDH while isolation
and purification performed.
xi + 113 pp; 17 plates; 5 tables; 8 appendix.
Bibl : 35 (1970 – 2007)

MAKALAH I
ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM OKSIDOREDUKTASE DARI SITU

AGATHIS KAMPUS UNIVERSITAS INDONESIA, DEPOK
Suwarti
atiesuwarti@yahoo.com
ABSTRACT
In this study, the presence of oxydoreductase-producing bacteria from water

of Situ Agathis located in University of Indonesia, Depok was investigated. Sampling
was conducted in February 2007 with two sampling sites.Isolation of
oxydoreductase-producing bacteria was performed from two water samples and
using three different kinds of carbon sources containing media, e.g. ethanol, glucose,
and methanol. Carbon sole sources were added as 0.2 % v/v medium for ethanol
and methanol, and 0.2 % w/v for glucose. A total of 83 bacterial isolates were
obtained e.g., 44 isolates from alcohol containing medium, 19 isolates from glucose
containing medium and 21 isolates from methanol containing medium. Fiveteen
randomly selected isolates were further analyzed for their ability to produce
oxydoreductase enzyme by Native PAGE method and characterization of their
phenotypic properties by macroscopic and microscopic observation. Native-PAGE
showed positive result for all 15 selected isolates which indicated production of
oxydoreductase enzymes. Macroscopic and microscopic observation of the colonies
showed various morphotype of oxydoreductase-producing bacteria.
Keywords: isolation; native-polyacrylamide gel electrophoresis; oxydoreductase;

pond-water.
PENDAHULUAN
Enzim oksidoreduktase (E.C. 1.1.) merupakan enzim yang bekerja
berdasarkan reaksi oksidasi-reduksi dengan melibatkan donor dan akseptor
elektron (Anthony 1996). Enzim tersebut dihasilkan oleh berbagai organisme
mulai dari bakteri, khamir, hingga mamalia (Bishop et al. 1998). Enzim

7
oksidoreduktase tersebut digunakan untuk memecah berbagai sumber
nutrien dalam proses metabolisme.
Secara umum, bakteri dapat menghasilkan enzim oksidoreduktase
yang berperan pada berbagai jalur metabolisme seperti Entner-Doudoroff
(Peekhaus dan Conway 1998), jalur asimilasi Ribulosa-Monofosfat (Moat et
al. 2002) dan siklus asimilasi serin (Korotkova et al. 2002). Moat et al.
(2002) mengungkapkan pada proses metabolisme tersebut, enzim
oksidoreduktase yang dihasilkan akan mengkatalisis reaksi katabolisme
senyawa makromolekul dengan mentransfer elektron kepada senyawa-
senyawa akseptor elektron seperti senyawa kuinon (Veletrop et al. 1995),
nikotinamid (Ludwig et al. 1995) atau flavonoid (Moat et al. 2002).
Bakteri penghasil enzim oksidoreduktase dinilai memiliki potensi
ekonomi yang cukup tinggi. Bakteri tersebut dapat dimanfaatkan untuk
biosensor (Yuhashi et al. 2005), biofuel dan biotransformasi (Zu et al. 2006).
Pemanfaatan biosensor dari bakteri penghasil enzim oksidoreduktase sudah
banyak beredar di masyarakat khususnya biosensor kadar glukosa dalam
darah (Witarto 1997). Selain biosensor glukosa, saat ini juga sedang
dikembangkan biosensor kadar alkohol dalam darah dengan pemanfaatan
salah satu enzim oksidoreduktase yakni enzim etanol dehidrogenase
(Gumaste et al. 2005).
Jenis bakteri penghasil enzim oksidoreduktase sangat beragam.
Enzim tersebut dapat dihasilkan oleh bakteri Gram negatif (Frank dan Duine

8
1979; Duine et al. 1986; Adamowicz et al. 1991) maupun bakteri Gram positif
(Van Ophem et al. 1991). Bakteri-bakteri metilotropik (Doronina et al. 2002;
Chistoserdova et al. 2003) dan bakteri-bakteri asam asetat (Toyama et al.
2005) diyakini mampu menghasilkan enzim oksidoreduktase. Selain memiliki
keragaman jenis, bakteri penghasil enzim oksidoreduktase memiliki distribusi
habitat yang luas. Bakteri-bakteri tersebut dapat hidup pada kawasan
terestrial (Toyama et al. 1995) maupun kawasan perairan (Gallego et al.
2005). Bakteri penghasil oksidoreduktase telah diisolasi pada beberapa
substrat lain seperti tanaman (Adachi et al. 2003), kaki serta kulit manusia
(Anesti et al. 2004).
Secara umum, bakteri-bakteri penghasil enzim oksidoreduktase
membutuhkan senyawa karbon organik untuk dapat hidup (heterotrof).
Sumber karbon yang dibutuhkan dapat diperoleh dari glukosa (Dokter et al.
1986), etanol (Toyama et al. 1995), metanol (Christoserdova et al. 2003),
format (Yoch et al. 1990) dan senyawa-senyawa organik yang lebih kompleks
seperti polivinil akohol (Shimao et al. 1986), dan gliserol (Toyama et al.
1995). Selain sumber karbon, diperlukan pula sumber-sumber senyawa
nitrogen anorganik untuk mensintesis protein sebagai produk metabolisme.
Walaupun demikian, bakteri penghasil enzim oksidoreduktase dapat hidup
dengan sumber-sumber mineral terbatas seperti fosfat, kalium, dan
magnesium (Peekhouse dan Conway1998). Selain itu, bakteri-bakteri

9
penghasil oksidoreduktase hidup pada lingkungan aerobik dengan
pH~ 7 (Anthony 1996).
Salah satu habitat yang menyediakan berbagai sumber karbon organik
adalah perairan tawar. Menurut Sobczak et al. (2002) sumber karbon organik
seperti glukosa pada perairan tawar khususnya di daerah permukaan dapat
diperoleh dari hasil fotosintesis yang dilakukan oleh fitoplankton dan
mikroalga. Selain sumber organik, daerah permukaan air tawar juga
mengandung oksigen dalam jumlah tertentu hasil fotosintesis (Tolunen
2004). Menurut Schulten (1991) pada ekosistem perairan tawar juga
memungkinkan terdapatnya sumber-sumber materi organik lain hasil
penguraian sampah menjadi humus bagi pertumbuhan bakteri. Nickerson
dan Apsedon (1992) menyatakan daerah perairan tawar masih mengandung
senyawa-senyawa anorganik seperti fosfat dan kalium dalam jumlah yang
sangat terbatas.
Salah satu daerah perairan yang kaya akan kandungan bakteri yang
belum banyak dieksplorasi adalah situ (Ronila 2005). Hingga pertengahan
2006, di kawasan UI, Depok terdapat enam situ yakni Situ Kenanga, Situ
Agathis, Situ Mahoni, Situ Puspa, Situ Ulin dan Situ Salam. Beberapa di
antaranya merupakan pengubahan dari daerah yang didominasi tumbuhan
air, persawahan tadah hujan maupun pertanian lahan kering (Prihantini
2003).

10
Situ Agathis merupakan salah satu contoh perairan tawar yang
memiliki kondisi yang memungkinkan bagi pertumbuhan bakteri-bakteri
penghasil enzim oksidoreduktase. Prihantini (2003) memperoleh 54 strain
mikroalga dari enam situ di kampus UI, Depok. Selain itu, Situ Agathis
dikelilingi oleh vegetasi pepohonan yang memungkinkan jatuhnya serasah ke
permukaan situ kemudian terdekomposisi menghasilkan humus. Oleh karena
itu, Situ Agathis berperan besar mengandung bakteri-bakteri penghasil enzim
oksidoreduktase.
Eksplorasi bakteri-bakteri penghasil enzim oksidoreduktase dilakukan
dengan mengisolasi bakteri-bakteri tersebut dari habitatnya. Beberapa
bakteri penghasil enzim oksidoreduktase seperti bakteri-bakteri dari genus
Methylophilus (Belliom dan Wu1978), Acinetobacter (Duine et al,1979),
Pseudomonas (Groen et al.1986), dan E. coli (Hommes et al.1984), serta
Bacillus subtilis (Iswantini dan Nurhidayat 2005) telah diisolasi dari kawasan
perairan. Selain bakteri-bakteri tersebut, bakteri lain seperti Hypomicrobium x
juga telah diisolasi dari kawasan daratan (Toyama et al. 1995).
Penelitian dilakukan dengan tujuan memperoleh informasi mengenai
keberadaan bakteri oksidoreduktase dan mengisolasi bakteri penghasil enzim
oksidoreduktase yang terdapat pada Situ Agathis, Kampus UI, Depok.
Melalui informasi yang diperoleh diharapkan bakteri penghasil enzim
oksidoreduktase maupun enzim yang dihasilkan dapat diaplikasikan pada

11
bidang kesehatan khususnya pemanfaatan untuk bidang biosensor dan
biofuel.
BAHAN DAN CARA KERJA
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari – Juni 2007 di
Laboratorium Rekayasa Protein, Pusat Penelitian Bioteknologi, Cibinong dan
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Universitas Indonesia,
Depok.
BAHAN
Sampel air
Sebanyak enam sampel air dengan volume masing-masing ± 250 mL
diperoleh dari Situ Agathis, Kampus UI, Depok dari dua titik sampling yang
berbeda. Lokasi titik sampling dapat dilihat pada Gambar I.1.
Mikroorganisme
Mikroorganisme yang digunakan adalah 83 isolat yang diperoleh dari
enam sampel air dari dua titik sampling pada Situ Agathis, Kampus UI,
Depok. Lima belas isolat yang dianggap mewakili seluruh isolat yang
diperoleh digunakan dalam penelitian ini. Isolat-isolat tersebut diamati
karakter fenotipik baik secara makroskopis maupun mikroskopis, dan
dilakukan pengujian enzim oksidoreduktase. Seluruh isolat yang diperoleh

12
disimpan di Laboratorium Rekayasa Protein, Pusat Penelitian Bioteknologi,
Cibinong.
T B
Situ Agathis
200 m
Gambar I.1. Peta kawasan beserta titik sampling pengambilan

sampel Situ Agathis, Kampus UI, Depok. Tanda bintang
menunjukkan titik sampling 1 dan 2. Sumber : www.ui.ac.id.

13
Bahan kimia
Bahan kimia yang digunakan dari Merck antara lain : NaCl, KNO3,
(NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H20, CaCl2. 2H2O, Tris-HCl, akrilamid,
ammonium peroksidisulfat (APS), TEMED, glisin, D(+) glukosa, Coomassie
Brilliant Blue (CBB), Bromphenol Blue (BB), etanol, dan metanol. Bahan-
bahan dari Difco yang digunakan untuk pembuatan medium antara lain :
Bacto Tryptone, Yeast Extract, Bacto Agar dan Nutrient Agar. Bahan kimia
yang digunakan dari Sigma antara lain sikloheksimida, Phenazine Metha
Sulphate (PMS), dan Nitro Blue Tetrazolium (NBT).
Bahan kimia lain yang digunakan adalah: akuades, MOPS (usb), Triton
X-100 (Promega), gliserol dan Rose Bengal (Wako). Selain itu digunakan
pula bahan kimia yang habis pakai seperti: indikator universal pH 1 - 14
(Merck), filter membran 0,2 μm (Milipore), kertas saring (Whatman No.41)
tusuk gigi, plastic wrap, alkohol teknis, spiritus dan akuades.
Medium
Medium yang digunakan untuk mengetahui populasi total bakteri pada
Situ Agathis adalah medium Plate Count Agar (PCA). Medium yang
digunakan untuk pemeliharaan isolat adalah Nutrient Agar (NA). Medium
yang digunakan untuk isolasi adalah medium basal selektif berdasarkan
Toyama et al. (1995) modifikasi.

14
Peralatan
Alat-alat yang digunakan antara lain mikropipet (Gilson dan Finnman),
tip (Axygen), alat-alat gelas (Iwaki, Schott dan Pyrex), autoklaf (Everlight), pH
meter (Lauvinder), termometer, DO meter (Hanna model 401), jarum ose,
tusuk gigi steril, lemari pendingin, plastic wrapp, bunsen, laminar air flow
(Esco), Terumo syringe, inkubator (Memmerth), refrigerated centrifuge
(Hettich), spektrofotometer (Hitachi), mikroskop (Euromax Holland), neraca
(Precisa), Buchner Funnel (Milipore) dan oven (Heraeus).
CARA KERJA
Penentuan titik sampling
Penentuan dua titik sampling Situ Agathis, Kampus UI, Depok
dilakukan secara acak. Lokasi pertama terletak pada daerah selatan situ
yang bersebelahan dengan daerah aliran outlet situ. Titik sampling pertama
mengarah ke selatan menuju kampus Politeknik Negeri Jakarta. Lokasi titik
sampling kedua berada sekitar 800 m ke arah utara dari titik sampling
pertama menuju Laboratorium Parangtopo Departemen Fisika UI. Lokasi
kedua titik sampling dapat dilihat pada Gambar I.2 dan Gambar I.3.

15
Gambar I.2. Lokasi titik sampling pertama Situ Agathis

Kampus UI, Depok (Februari, 2007). Tanda bintang
menunjukkan titik sampling pertama.
Gambar. I.3. Lokasi titik sampling kedua Situ Agathis

Kampus UI, Depok (Februari, 2007). Tanda bintang
menunjukkan titik sampling kedua.

16
Pengambilan sampel air situ
Pengambilan sampel air dilakukan pada tanggal 26 Februari 2007
pukul 08.51 WIB berdasarkan metode Gandjar et al. (1992). Sampel air
diambil dari tepi dengan jarak 25 cm pada permukaan dengan kedalaman
20 – 28 cm. Pengambilan sampel air dilakukan secara aseptis menggunakan
botol steril berukuran 250 mL.
Pengukuran parameter lingkungan situ-situ Kampus UI, Depok
Informasi mengenai waktu pengambilan sampel, lokasi dan
keterangan tentang sampel dicatat pada saat pengambilan sampel.
Pengukuran parameter lingkungan dilakukan dengan mengukur suhu,
menggunakan termometer, pH menggunakan indikator universal 1-14,
dissolved oxygen (DO) dan biochemical oxygen demand (BOD)
menggunakan DO meter pada kedua titik sampling.
Pembuatan medium
a. Medium basal selektif Toyama et al. (1995)
Komposisi medium basal selektif berdasarkan Toyama et.al (1995)
modifikasi tanpa penambahan yeast extract dalam 1 L berisi: KNO3 2 g,
(NH4)2SO4 2 g, K2HPO4 2 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 0, 2 g dan Bacto Agar
15 g. Seluruh bahan dilarutkan ke dalam 850 mL akuades dan pH medium
disesuaikan menjadi 7 menggunakan pH meter dengan NaOH 1 N.

17
Selanjutnya medium ditambahi dengan akuades sampai volume menjadi 979
mL. Medium tersebut disterilkan menggunakan autoklaf selama 15 menit
pada suhu 1210 C tekanan 2 atm. Medium yang telah steril didiamkan
hingga suhunya mencapai ± 500 C. Selanjutnya medium ditambahkan larutan
stok 10 mg/mL sikloheksimida steril sebanyak 100 µL, larutan Rose Bengal
0,3 g/mL steril sebanyak 1 mL dan ditambahkan 20 mL larutan stok sumber
karbon steril yang berupa metanol 10% v/v dan etanol 10% v/v hingga
konsentrasi akhir 0,2% v/v, dan glukosa 10% w/v hingga konsentrasi akhir
0,2% w/v secara aseptis. Selanjutnya medium dituang ke dalam cawan Petri
sebanyak ± 20 mL dan dibiarkan mengeras. Pembuatan larutan stok
sikloheksimida 10 mg/mL, Rose Bengal 0,3 g/mL, etanol 10% v/v, metanol
10% v/v, dan glukosa 10% w/v dapat dilihat pada Lampiran I.1.
b. Medium produksi enzim
Komposisi medium basal selektif berdasarkan Toyama et.al (1995)
modifikasi tanpa penambahan yeast extract dalam 250 mL berisi: KNO3 0,5
g, (NH4)2SO4 0,5 g, K2HPO4 0,5 g, KH2PO4 0,25 g, MgSO4.7H2O 0,05 g.
Seluruh bahan dilarutkan ke dalam 200 mL akuades di dalam Erlenmeyer
dan pH medium disesuaikan menjadi 7 menggunakan pH meter dengan
NaOH 1 N. Selanjutnya medium ditambahi akuades sampai volume menjadi
250 mL. Medium disterilkan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada
suhu 1210 C tekanan 2 atm. Medium yang telah steril didiamkan hingga
suhunya mencapai ± 500 C. Selanjutnya dilakukan penambahan larutan stok

18
sumber karbon yang berupa 500 μL metanol dan etanol hingga konsentrasi
akhir 0,2 %v/v dan glukosa hingga konsentrasi akhir 0,2% w/v secara
aseptis.
c. Medium NA
Pembuatan medium NA sesuai dengan petunjuk yang terdapat pada
kemasan.
d. Medium PCA
Medium PCA dibuat berdasarkan Gandjar et al, (1992) dengan
melarutkan 2 g Bacto Tryptone, 5 g Yeast Extract, 2 g glukosa dengan
akuades hingga volume akhir mencapai 1 L. Medium kemudian disterilkan
menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 0 C tekanan 2 atm.
Selanjutnya medium dituang ke dalam cawan petri sebanyak ±20 mL dan
dibiarkan mengeras.
Pengerjaan sampel air
Pengerjaan sampel air situ dari Kampus UI, Depok dilakukan dengan
tiga metode, yaitu metode pengenceran (Lampiran I. 2), metode penyaringan
menggunakan kertas saring Whatman No. 41 berukuran 60 μm (Lampiran
I.3), dan penyaringan menggunakan membran Milipore berukuran 0,2 μm
(Lampiran I. 4) berdasarkan Cappucino dan Sherman (2002).

19
Isolasi Bakteri
Pengerjaan isolasi bakteri menggunakan metode spot plate
berdasarkan Musfira (2005). Proses isolasi dilakukan setiap 24 jam sekali.
Koloni-koloni bakteri dari hasil pengerjaan sampel air diseleksi berdasarkan
penampakan morfologi makroskopik seperti warna, permukaan, tekstur, profil
atau tepi koloni. Isolasi dilakukan pada koloni-koloni yang mewakili
penampakan morfologi yang sama maksimum sebanyak tiga koloni.
Selanjutnya koloni tersebut ditumbuhkan menggunakan tusuk gigi steril pada
media basal selektif yang telah diberi kotak pada bagian bawah untuk
dijadikan pustaka koloni dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang
(± 27º C). Apabila telah tampak pertumbuhan koloni pada medium pustaka
koloni, biakan dimurnikan pada media basal selektif. Proses pengerjaan
isolasi ditampilkan pada Lampiran I. 5.
Pemurnian isolat
Pemurnian isolat bakteri dilakukan berdasarkan metode gores empat
kuadran menurut Cappucino dan Sherman (2002). Biakan diinkubasi selama
24 jam pada suhu ruang (27º C). Proses pemurnian dilakukan sebanyak tiga
kali hingga diperoleh koloni-koloni tunggal dan homogen. Selanjutnya koloni
tunggal tersebut dijadikan biakan asli (original culture). Biakan asli dipindah
dengan cara gores ke atas permukaan medium agar miring NA dan
diinkubasi pada suhu ruang (± 270 C) selama 24 jam untuk dijadikan stock

20
culture dan disimpan pada suhu suhu 40 C. Sebanyak satu ose isolat dari
stock culture NA dipindahkan ke medium agar miring NA dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu ± 270 C untuk dijadikan working culture dan
disimpan pada suhu 40 C. Selain dalam bentuk segar, dibuat pula stock
culture dalam bentuk gliserol 10% dan disimpan pada suhu -70º C.
Pemilihan isolat –isolat bakteri terpilih
Pemilihan isolat-solat terpilih dilakukan berdasarkan penampakan
morfologi makroskopis menurut Reynolds (2005) dan metode pengerjaan
sampel air. Penampakan morfologi makroskopis yang diamati adalah
permukaan koloni (mengilap, kusam), tekstur (licin, kerut), profil samping
(datar, menggunung), profil tepi (rata, bergerigi), penampakan koloni (tembus
pandang, tidak tembus pandang). Isolat-isolat bakteri terpilih selanjutnya
digunakan untuk pengujian enzim oksidoreduktase serta pengecatan Gram.
Pengujian enzim oksidoreduktase dari isolat –isolat terpilih
a. Produksi enzim
Produksi enzim dilakukan menggunakan modifikasi metode Scopes
(1994). Produksi enzim dilakukan menggunakan medium produksi enzim
sebanyak 1 mL di dalam tabung mikro 1,5 mL. Sebanyak satu ose isolat –
isolat terpilih berumur 24 jam pada medium NA diinokulasikan ke dalam

21
medium produksi lalu diinkubasi pada suhu 270 C dengan agitasi 200 rpm
(reciprocal) selama 72 jam.
b. Isolasi enzim
Proses isolasi enzim dilakukan berdasarkan Janson dan Ryden
(1998) modifikasi. Pemanenan enzim dilakukan pada inokulum setelah tiga
hari dengan cara sentrifugasi pada 14.000 rpm selama 15 menit suhu 40 C.
Sel yang diperoleh digunakan selanjutnya untuk dipecah. Pemecahan sel
dilakukan dengan cara suspensi sel dengan bufer MOPS 10 mM pH 7 yang
mengandung Triton-X 100 1% w/v sebanyak 1.000 L. Selanjutnya suspensi
sel divorteks dan diinkubasi pada suhu 270 C selama 15 menit. Pemisahan
sisa-sisa sel dilakukan dengan sentrifugasi pada 14.000 rpm selama 15 menit
suhu 40 C. Filtrat yang diperoleh dianggap sebagai ekstrak kasar enzim
oksidoreduktase.
c. Pengujian enzim oksidoreduktase
Pengujian enzim oksidoreduktase dari ekstrak kasar enzim yang
diperoleh dengan cara melakukan Native-PAGE berdasarkan Khodijah
(2001). Native PAGE dilakukan menggunakan gel poliakrilamid 7,5% .

22
Tahapan dalam pengerjaan Native-PAGE adalah sebagai berikut.
Larutan stok, resolving gel, stacking gel dan pewarna gel seperti terlampir
pada Lampiran 5, dibuat sebelum dilakukan preparasi sampel. Preparasi
sampel dilakukan dengan mencampur 64 μL sampel ekstrak kasar dengan
16 μL bufer sampel 5x di dalam tabung mikro 1,5 mL. Campuran
dihomogenkan dengan vortex lalu diaplikasikan ke dalam sumur
elektroforesis sebanyak 25 μL. Perangkat elektroforesis ditambahkan
dengan bufer Native-PAGE dingin sebanyak 250 mL, kemudian elektroforesis
dijalankan pada 110 Volt dan 30 mA selama kurang lebih 1,5 jam. Setelah
dilakukan elektroforesis, gel dikeluarkan dari perangkat elektroforesis,
kemudian dimasukkan ke dalam larutan pewarna substrat enzim sebanyak
50 mL. Pewarnaan dengan substrat dilakukan pada suhu 40 C hingga
diperoleh titik biru kehitaman (spot) pada gel. Reaksi dihentikan dengan
membuang larutan pewarna substrat dan menggantinya dengan bufer MOPS
pH 7 10 mM. sebanyak 50 mL. Selanjutnya dilakukan pewarnaan protein
dengan merendam gel di dalam larutan pewarna protein sebanyak 50 mL
pada suhu ruang (± 27º C) selama 24 jam. Gel yang telah diwarnai dengan
pewarna protein, dicuci dengan larutan pencuci hingga warna gel awal
(bening) muncul kembali. Selama pencucian, larutan pencuci yang
digunakan diganti apabila telah berubah dari bening menjadi biru pekat.

23
Pengecatan Gram isolat-isolat bakteri terpilih
Pengecatan Gram terhadap seluruh isolat-isolat terpilih dilakukan
menggunakan metode Cappucino dan Sherman (2002).
Pengamatan morfologi mikroskopik isolat-isolat bakteri terpilih
Pengamatan morfologi sel dilakukan menggunakan pengecatan
negatif berdasarkan Gandjar et al. (1992) dengan pengamatan mikroskopik
pada perbesaran 1000x (Reynolds 2005). Pengamatan dilakukan terhadap
ukuran dan bentuk sel (bulat, batang, ellips).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Parameter lingkungan pada lokasi sampling Situ Agathis
Hasil pengukuran parameter lingkungan terhadap sampel air dari Situ
Agathis di Kampus UI Depok dapat dilihat pada Tabel I. 1. Kandungan DO
kedua titik sampling berkisar pada 5,8 hingga 6,2 ppm, dan kandungan BOD
kedua titik sampling berkisar pada 11,5 hingga 12,2 ppm. Situ Agathis
memiliki rerata pH 6 dan rerata suhu air 260 C. Jika mengacu pada PP.
No.82 tahun 2001(Kementerian Lingkungan Hidup 2001), maka Situ Agathis
dapat digolongkan ke dalam kelas empat pada klasifikasi air menurut
peruntukkannya. Persyaratan air yang baik yang tergolong dalam kelas
empat menurut PP No.82 tahun 2001 adalah sebagai berikut: pH dalam

24
kisaran 5-9, suhu air berdeviasi 5 dari suhu air yang seharusnya (250 C),
kandungan DO minimum 0 ppm dan nilai BOD maksimum 12, nilai chemical
oxygen demand (COD) ≤ 200 ppm, kandungan bakteri fecal coliform ≤2000
CFU /mL, kandungan total bakteri <10000 CFU/mL, dan kandungan residu
terlarut < 2000 ppm maupun residu tersuspensi < 400 ppm. Berdasarkan
data-data lingkungan yang diperoleh pada Tabel I.1, tidak dapat dilakukan
penilaian terhadap Situ Agathis apakah berada pada kondisi yang sesuai
dengan persyaratan tersebut.
Tabel I.1. Data parameter lingkungan Situ Agathis pada tanggal 26

Februari 2007
Suhu
Waktu BOD
Titik air pH DO air Kedalaman
No pengambilan 0 air Cuaca
sampling ( C) air (ppm) (cm)
(ppm)
08.51 WIB
1 1 26 6 5,8 11,5 28 Cerah
2 09.20 WIB 2 26 6 6,6 12,2 20 Cerah
Kepadatan populasi bakteri pada Situ Agathis
Berdasarkan data TPC yang diperoleh dari sampel air, kisaran total
bakteri pada Situ Agathis adalah 2,0 x 104 ~ 2,0 x 106 CFU/mL. Kisaran
populasi bakteri pada perairan tawar secara normal adalah 10 6 – 107
CFU/mL (De Wever et al. 2005; Piccini et al. 2006). Bila dibandingkan
dengan populasi bakteri secara umum dari perairan tawar, populasi bakteri
Situ Agathis termasuk normal.

25
Populasi bakteri total pada titik sampling pertama adalah 2,0 x 104
CFU/mL, sedangkan populasi bakteri total pada titik sampling kedua adalah
2,0 x 106 CFU/mL . Perbedaan populasi bakteri total pada kedua titik
sampling dapat disebabkan oleh ketersediaan materi organik dan anorganik
yang lebih banyak pada titik sampling kedua. Menurut Church et al. (2000)
populasi bakteri dipengaruhi oleh ketersediaan materi organik yang ada di
sekitarnya. Sampah dapat menjadi sumber materi organik yang merupakan
nutrien bagi pertumbuhan bakteri (Allonso-Saez dan Gasol 2007). Sampah-
sampah organik seperti ranting pohon dan dedaunan akan terdekomposisi
menghasilkan humus pada tanah maupun perairan (Coates et al. 2002).
Humus memiliki beberapa gugus fungsional utama seperti asam karboksilat,
alkohol, kuinon, dan metanol (Schulten 1991). Gugus fungsional tersebut
dapat menjadi nutrien bagi pertumbuhan bakteri (Schulten 1991).
Berdasarkan pengamatan yang dilakukan, titik sampling kedua lebih banyak
mengandung sampah-sampah baik organik maupun anorganik seperti
plastik, kertas, barang-barang bekas, sisa-sisa makanan dan minuman
dibandingkan dengan titik sampling pertama.
Kepadatan populasi bakteri pada Situ Agathis dipengaruhi oleh
kemampuan bakteri untuk hidup pada situ tersebut. Kemampuan bakteri
untuk hidup pada suatu habitat bergantung pada faktor-faktor fisik dan kimia
seperti suhu (Simon dan Wunsch 1998), pH (Russel et al. 1980) dan
kandungan oksigen (Kotoski 1997). Berdasarkan Tabel I.1, suhu pada kedua

26
titik sampling di Situ Agathis adalah 260 C dan pH pada kedua titik sampling
adalah 6. Kondisi tersebut memungkinkan tumbuhnya berbagai jenis bakteri
di dalamnya (Moat et al. 2002). Secara umum, bakteri-bakteri mesofilik dapat
tumbuh dengan optimum pada kisaran pH 6,5 -7,5 dan suhu 30-400 C (Moat
et al. 2002).
Kepadatan populasi bakteri penghasil enzim oksidoreduktase
Berdasarkan hasil isolasi menggunakan medium selektif, diperoleh 83
isolat bakteri penghasil enzim oksidoreduktase dari Situ Agathis di Kampus
UI, Depok. Isolat-isolat bakteri tersebut diperoleh dari hasil isolasi yang
dilakukan terhadap substrat air dari dua titik sampling di Situ Agathis dengan
media seleksi menurut Toyama et al.1995 modifikasi. Menurut Ameyama et
al. (1981), bakteri penghasil enzim oksidoreduktase dapat berada pada
berbagai habitat yang memiliki sumber organik seperti perairan tawar dan
dapat mengasimilasi senyawa karbon sederhana seperti glukosa, etanol dan
metanol maupun senyawa karbon kompleks seperti polivinil alkohol dan
gliserol.
Kepadatan populasi bakteri penghasil enzim oksidoreduktase dapat
dilihat pada Tabel I.2. Nilai rerata populasi bakteri penghasil enzim etanol
dehidrogenase dari medium seleksi yang mengandung etanol pada titik
sampling pertama sebanyak 1,9 x 102 CFU/mL sampel air dan dari titik
sampling kedua sebanyak 2,1 x 102 CFU/mL sampel air. Asimilasi etanol

27
Tabel I.2. Perhitungan dan perbandingan jumlah koloni

bakteri dalam sampel air Situ Agathis pada dua titik
sampling menggunakan metode pengenceran
Titik Sumber karbon pada

Jumlah CFU/ mL
sampling medium seleksi
2
Etanol 1,9x 10
1
3
Glukosa 4,3 x 10
2
Metanol 1,1 x 10
2
Etanol 1,9 x 10
2
2
Glukosa 2,1 x 10
1
Metanol 2,4 x 10
sebagai sumber karbon tunggal oleh bakteri melibatkan oksidasi etanol
membentuk aldehid oleh enzim EDH (Anthony et al. 1986; Sulter et al.
1991). Aldehid akan dikonversikan membentuk formaldehid dengan
mengeluarkan satu molekul CO2 (Sulter et al.1991). Formaldehid yang
dihasilkan akan masuk ke dalam salah satu dari dua jalur asimilasi etanol.
Jalur pertama adalah melalui jalur Ribulosa Monofosfat (RMP) yang
menghasilkan 3-gliseraldehid dan piruvat sebagai produk akhir (Moat et al.
2002), sedangkan jalur kedua adalah jalur siklus serin yang menghasilkan
asetil-CoA yang akan masuk ke dalam siklus glioksilat untuk menghasilkan
energi (Korotkova et al. 2002; Korotkova et al. 2005). Melalui kedua siklus
tersebut, sel bakteri dapat menghasilkan ATP yang dapat digunakan untuk
biosintesis sel. Biosintesis sel dapat menghasilkan biomassa dan respirasi

28
(Giorgio dan Cole 1998) yang ditandai dengan terbentuknya koloni-koloni
bakteri pada media.
Nilai rerata populasi bakteri penghasil enzim glukosa dehidrogenase
dari medium seleksi yang mengandung glukosa pada titik sampling pertama
sebanyak 4,3 x 102 CFU/mL sampel air dan pada titik sampling kedua
sebanyak 2,1 x 102 CFU/mL sampel air. Populasi bakteri penghasil glukosa
dehidrogenase terlihat lebih banyak dibandingkan dengan bakteri penghasil
etanol dehidrogenase dan metanol dehidrogenase (Tabel I.2). Hal tersebut
disebabkan kemudahan asimilasi glukosa sebagai sumber karbon
dibandingkan dengan asimilasi sumber karbon lain seperti etanol dan
metanol (Elfiantz et al. 2005). Glukosa merupakan sumber karbon yang
paling banyak digunakan oleh bakteri perairan (Hahn 2006). Menurut Rich et
al, (1996) asimilasi glukosa oleh bakteri digunakan untuk proses respirasi
perairan sebesar 60% dan digunakan untuk produksi biomassa 40%.
Bakteri-bakteri penghasil enzim glukosa dehidrogenase mengkatalisis
glukosa dengan enzim glukosa dehidrogenase menjadi glukonat (Fliege et
al. 1998; Peekhouse dan Conway 1998). Menurut Fliege et al. (1998)
terdapat dua jalur alternatif untuk asimilasi glukosa oleh bakteri yaitu :
1) oksidasi glukosa membentuk glukonat dan 2) penambahan fosfat pada
glukosa menghasilkan glukosa-6-fosfat. Nickerson dan Apsedon (1992)
menyatakan secara umum lingkungan perairan tawar memiliki kandungan
fosfat yang rendah. Kondisi perairan dengan kandungan fosfat yang rendah

29
membuat bakteri menggunakan jalur glukosa dengan melakukan oksidasi
membentuk glukonat (Peekhouse dan Conway 1988). Glukonat dengan
bantuan enzim permease dan glukonat kinase membentuk glukonat 6-fosfat
yang akan masuk ke dalam jalur Entner-Doudoroff menghasilkan asam
piruvat dan gliseraldehid-3-posfat (Peekhouse dan Conway 1998). Proses
selanjutnya merupakan proses katabolisme secara umum dalam upaya
bakteri menghasilkan ATP yang melalui sikus tricarboxylic acid (TCA) (Moat
et al. 2002).
Nilai rerata populasi bakteri penghasil enzim metanol dehidrogenase
dari medium seleksi yang mengandung metanol pada titik sampling pertama
sebanyak 1,1 x 102 CFU/mL sampel air dan pada titik sampling kedua
sebanyak 2,4 x 101 CFU/mL sampel air. Populasi bakteri penghasil enzim
metanol dehidrogenase tidak jauh berbeda dengan populasi bakteri penghasil
enzim etanol dehidrogenase. Hal tersebut disebabkan kemudahan bakteri-
bakteri tersebut untuk mengasimilasi metanol dan etanol sebagai sumber
karbon tunggal. Metanol dan etanol akan diasimilasi pada jalur metabolisme
yang serupa sehingga peluang tumbuhnya bakteri-bakteri penghasil metanol
dan etanol dehidrogenase akan sama besarnya (Korotkova et al. 2002).
Belliom dan Wu (1978) mengemukakan enzim metanol dehidrogenase akan
mengoksidasi metanol membentuk formaldehid. Selanjutnya, formaldehid
akan diasimilasi pada jalur metabolisme yang sama seperti asimilasi
formaldehid dari enzim etanol dehidrogenase.

30
Populasi total bakteri penghasil enzim oksidoreduktase pada kedua
titik sampling Situ Agathis memiliki nilai yang relatif sama. Hal tersebut
menunjukkan perbedaan kondisi fisik kedua titik sampling tidak memengaruhi
keberadaan bakteri penghasil enzim oksidoreduktase. Ketersediaan materi
organik yang dapat diasimilasi oleh bakteri penghasil oksidoreduktase pada
kedua titik sampling kemungkinan sama banyaknya. Titik sampling pertama
relatif lebih banyak dihuni oleh fitoplankton dibandingkan titik sampling kedua
berdasarkan pengamatan yang dilakukan. Menurut Skoog et al. (1999)
fitoplankton dapat menghasilkan glukosa dari proses metabolisme yang
dilakukan. Glukosa yang dihasilkan berada dalam keadaan terlarut pada
permukaan danau (Skoog et al. 1999). Kondisi tersebut menyebabkan
bakteri-bakteri penghasil enzim oksidoreduktase dapat tumbuh. Titik
sampling kedua lebih banyak mengandung sampah-sampah organik seperti
serasah dibandingkan dengan titik sampling pertama. Menurut Schulten
(1991) serasah dapat terurai menjadi humus yang dapat didekomposisi
menghasilkan senyawa-senyawa sederhana seperti glukosa, etanol dan
metanol. Berdasarkan hal tersebut, ketersediaan nutrisi pada kedua titik
sampling memungkinkan tumbuhnya bakteri penghasil enzim
oksidoreduktase dalam kisaran populasi yang relatif sama.

31
Karakteristik isolat-isolat terpilih bakteri penghasil enzim

oksidoreduktase
Pemilihan isolat dilakukan pada koloni-koloni yang tumbuh pada
medium seleksi. Pemilihan tersebut dilakukan berdasarkan morfotipe yang
berbeda pada warna, profil, tekstur dan tepi koloni. Isolat-isolat yang terpilih
berjumlah 15 isolat dengan rincian enam isolat dipilih dari medium yang
mengandung etanol, lima isolat dari medium yang mengandung glukosa, dan
empat isolat dari medium yang mengandung metanol. Perincian isolat-isolat
terpilih beserta morfologi makroskopisnya terlampir pada Gambar I.4 dan
Tabel I.3. Karakteristik morfologi makroskopik isolat-isolat penghasil etanol
dehidrogenase dan glukosa dehidrogenase cukup beragam. Isolat-isolat
tersebut memiliki kisaran warna putih kehijauan, kekuningan, putih, krem
hingga kemerahan. Selain itu, permukaan tekstur isolat-isolat terpilih
bervariasi dari kusam, mengilap dan licin. Penampakan koloni tampak tidak
tembus pandang dan tembus pandang. Profil samping koloni isolat-isolat
terpilih tampak menggunung dan datar, sedangkan tepi koloni isolat-isolat
terpilih tampak rata dan bergerigi. Menurut Hahn (2006) keragaman
morofologi bakteri yang terdapat pada suatu perairan menunjukkan
keragaman jenis bakteri yang terkandung di dalamnya. Jenis bakteri-bakteri
pengasimilasi etanol sebagai sumber karbon antara lain dari genus
Pseudomonas yang memiliki warna pigmen kehijauan (Anthony et al. 1996),
dan Rhodopseudomonas (Bamforth dan Quayle 1979). Selain itu bakteri-

32
bakteri metilotropik seperti Methylobacterium extorquens (Korotkova dan
Lidstrom. 2001) Methylophillus (Anesti et al. 2005) ataupun Hipomichrobium
x (Belliom dan Wu 1978) juga dapat mengasimilasi etanol sebagai sumber
karbon tunggal. Bakteri yang menghasilkan enzim GDH yang hidup pada
perairan meliputi genus Bacillus (Lampel et al. 1986), E. coli (Peekhouse dan
Conway1998), Pseudomonas (Van Schie et al. 1985), Acinetobacter (Dokter
et al. 1986), dan Gluconobacter (Ameyama et al. 1981).
A1H1D26 A1H2D56 A1H2D60 A2H2D14 A2H2D19
A2H3D4 G1H1D30 G1H3D10 G2H2D21 G2H2D22
G2H3D20
G2H3D20 M1H2D5 M1M3 M2M2 M2M4 11 cm
cm
Gambar I.4. Morfologi makroskopis isolat-isolat bakteri terpilih penghasil

enzim oksidoreduktase dari Situ Agathis di Kampus UI, Depok pada umur
24 jam.
10 µm

33
10 µm
G2H3D20 M1H2D5 M1M3 M2M2 M2M4
Gambar I.5. Hasil pewarnaan Gram isolat-isolat bakteri terpilih penghasil

enzim oksidoreduktase dari Situ Agathis di Kampus UI, Depok pada umur 24
jam. Perbesaran 1000x.
G2H3D20 M1H2D5 M1M3 M2M2 M2M4
Gambar I.6. Morfologi mikroskopis isolat-isolat terpilih bakteri penghasil

enzim oksidoreduktase dari Situ Agathis Kampus UI, Depok pada umur
24 jam. Perbesaran 1000x.

34
Tabel I.3. Perincian isolat-isolat tepilih beserta morfologi makroskopis
No
Metode Pengerjaan
Media Profil
Lokasi Permukaan dan
pertum Wana koloni samping
sampling tekstur
buhan Filtrasi dan tepi
Dilusi
Milipore
Agak kusam,
Titik
Putih agak berlendir dan Datar,tepi
1 Etanol A1H1D26 - sampling
kehijauan agak tembus bergerigi
1
pandang
- Licin, mengilap,
Titik
Kuning agak berlendir, dan Menggunung,
2 Etanol A1H2D56 sampling
kehijauan tidak tembus rata
1
pandang
- Licin, mengilap,
Titik
berlendir dan
3 Etanol A1H2D60 sampling Kekuningan Datar;rata
tidak tembus
1
pandang
- Licin, mengilap,
Titik
Kuning agak berlendir, dan
4 Etanol A2H2D14 sampling Datar;rata
krem tidak tembus
2
pandang
- Titik Mengilap, licin,
5 Etanol A2H2D19 sampling Krem keputihan berlendir, tidak Datar;rata
2 tembus pandang
- Licin, mengilap,
Titik
berlendir, dan Menggunung,
6 Etanol A2H3D4 sampling Kekuningan
tidak tembus tepi bergerigi
2
pandang
- Licin, mengilap,
Titik
Kuning agak berlendir, dan
7 Glukosa G1H1D30 sampling Datar;rata
kemerahan tidak tembus
1
pandang
Titik Kusam, kering, Datar,

Glukosa
8 G1H3D10 - sampling Putih agak krem tidak tembus bergerigi
1 pandang
-
Licin, mengilap,
Titik
berlendir, dan Menggunung;
9 Glukosa G2H1D21 sampling Putih agak krem
tidak tembus rata
2
pandang
Licin, mengilap,
Titik
berspora,dan
10 Glukosa G2H2D22 - sampling Kekuningan Datar;rata
tidak tembus
2
pandang
Datar; rata
Licin, mengilap,
Titik
berspora,dan
11 Glukosa G2H3D20 - sampling Krem
tidak tembus
2
pandang

35
Tabel I.3. lanjutan

No
Metode Pengerjaan
Media Profil
Lokasi Permukaan dan
partum Wana koloni samping
sampling tekstur
buhan Filtrasi dan tepi
Dilusi
Milipore
Titik Licin, mengilap,

Putih Menggunung.
12 Metanol - sampling dan tidak
M1H2D5 kekuningan rata
1 tembus pandang
Titik Licin, mengilap,
Putih Menggunung,
13 Metanol - M1M3 sampling dan tidak
kekuningan rata
1 tembus pandang
Agak kusam,
Titik
Putih berlendir, dan Datar ;
14 Metanol - M2M2 sampling
kekuningan tidak tembus bergerigi
2
pandang
Licin,
Titik
mengilap,dan
15 Metanol - M2M4 sampling Krem Datar ; rata
tidak tembus
2
pandang
Tabel I.4. Karakteristik morfologi mikroskopis dan hasil pewarnaan gram isolat-
isolat bakteri terpilih penghasil enzim oksidoreduktase dari Situ Agathis di kampus
UI, Depok pada medium NA dengan umur 24 jam.
Ukuran sel
Hasil pewarnaan Gram dan
No. Kode Isolat (panjang; lebar; diameter
bentuk sel
dalam µm)
1 A1H1D26 Negatif ; bulat d=1
2 A1H2D56 Negatif ; bulat d = 0.5-1
3 A1H2D60 Positif; ellips p=2;l=1
4 A2H2D14 Negatif ; bulat d=1
5 A2H2D19 Positif; ellips p = 1.5 ; l = 1
6 A2H3D4 Positif; ellips p= 0.5; l = 1
7 G1H1D30 Negatif ; batang p=2 ;l=1
8 G1H3D10 Negatif ; ellips p = 1.5 ; l = 1
9 G2H1D21 Negatif; bulat d=1
10 G2H2D22 Positif; ellips p=2 ;l=1
11 G2H3D20 Negatif ; ellips p = 1.5 ; l = 1
12 M1H2D5 Negatif ; bulat d = 0.5
13 M1M3 Negatif ; bulat d = 0.5
14 M2M2 Negatif ; bulat d = 0.5-1
15 M2M4 Negatif ; bulat d = 0.5-1

36
Berdasarkan hal tersebut, dapat diketahui jenis-jenis bakteri penghasil enzim
oksidoreduktase cukup beragam.
Berbeda dengan bakteri-bakteri penghasil etanol dehidrogenase dan
glukosa dehidrogenase, bakteri penghasil enzim metanol dehidrogenase
tampak lebih homogen. Bakteri-bakteri yang dapat mengasimilasikan
senyawa karbon tunggal seperti metanol dan metilamin dikategorikan
sebagai bakteri metilotropik (Doronina et al. 2002). Menurut Doronina et al.
(2002) bakteri-bakteri metilotropik memiliki variasi morfologi yang rendah
yang menunjukkan rendahnya keragaman jenis bakteri-bakteri tersebut.
Beberapa bakteri metilotropik yang telah diisolasi dari perairan antara lain:
Hypomicrhobium x (Duine dan Frank 1979), Methylophillus methylotropus,
Methylobacterium extorquens (Christoserdova et al. 2003), dan Beijerinckia
mobilis (Dedish et al. 2005).
Selain pengamatan secara makroskopis, dilakukan pula pengecatan
Gram dan pengamatan mikroskopis terhadap 15 isolat terpilih. Hasil
pengecatan Gram terlampir pada Gambar I.5 dan pengamatan mikroskopis
terlampir pada Gambar I.6. Rincian hasil pengecatan Gram dan pengamatan
mikroskopis terlampir pada Tabel I.4. Hasil pada Gambar I.6 dan Tabel I.4.
menunjukkan bahwa empat isolat (A1H2D60, A2H2D19, A2H3D4, dan
G2H2D22) merupakan bakteri Gram positif, sedangkan 11 isolat lainnya
(A1H1D26, A1H2D56, G1H3D10, G2H3D20, G2H2D21, M1H2D5, M1M3,
M2M2, dan M2M4) adalah bakteri Gram negatif. Menurut Ameyama et al.

37
(1981) bakteri penghasil enzim oksidoreduktase tidak bergantung kepada
sifat pewarnaan Gram.
Hasil pengamatan mikroskopik seperti yang terlihat pada Gambar I.6
dan Tabel I. 4 menunjukkan bentuk bulat merupakan bentuk dominan dari
keseluruhan isolat-isolat terpilih (delapan isolat dari 15 isolat terpilih).
Namun, beberapa isolat juga memiliki bentuk ellips (enam isolat dari 15 isolat
terpilih) dan bentuk batang (satu isolat dari 15 isolat terpilih). Morfotipe yang
beragam yang ditunjukkan pada Tabel I.3 dan Tabel I.4 juga mengindikasikan
kemungkinan-kemungkinan variasi jenis bakteri penghasil oksidoreduktase
khususnya penghasil enzim GDH dan EDH dari Situ Agathis. Bakteri-bakteri
yang dapat dijumpai pada perairan tawar seperti danau dan dapat
menghasilkan enzim oksidoreduktase antara lain Actinobacteria (Glockner et
al. 2000; Hahn 2003; Zwart et al. 2003) dan Proteobacteria (Hiorns et al.
1997; Zwart et al. 2003), Cyanobacteria (De Wever et al. 2005). Akan tetapi
karena keterbatasan penelitan yang dilakukan, identifikasi terhadap isolat-
isolat penghasil enzim oksidoreduktase tidak dilakukan. Oleh karena itu perlu
dilakukan identifikasi untuk dapat mengetahui isolat-isolat bakteri penghasil
oksiodreduktase yang diperoleh dari Situ Agathis.

38
Pengujian enzim etanol dehidrogenase (EDH), glukosa dehidrogenase

(GDH) dan metanol dehidrogenase (MDH) berdasarkan hasil Native-
PAGE
Pengujian enzim oksidoreduktase menggunakan Native-PAGE
dilakukan terhadap ekstrak kasar enzim isolat-isolat terpilih dan dari medium
produksi enzim dari isolat-isolat terpilih. Hasil pengujian medium isolat-isolat
terpilih menunjukkan tidak terdapat enzim oksidoreduktase pada medium
yang menandakan enzim oksidoreduktase tidak diekskresikan keluar sel
(data tidak ditampilkan). Hal tersebut mengindikasikan enzim
oksidoreduktase tidak diekskresikan ke dalam medium. Menurut Ellias et al.
(2005) enzim oksidoreduktase umumnya terdapat pada sitoplasma yang
melibatkan akseptor-akseptor elektron seperti ubiquinon maupun sitokrom.
Pengujian enzim oksidoreduktase dilakukan terhadap ekstrak kasar
enzim yang diperoleh dengan melakukan isolasi enzim. Isolasi enzim yang
digunakan menggunakan Triton-X 100 sebagai agen untuk melisis sel.
Cornett dan Shockman (1978) menyatakanTriton-X 100 dalam proses lisis
sel berfungsi untuk menginduksi terjadinya autolisis oleh aktivitas enzim
hidrolisis autolitik. Proses lisis sel yang dilakukan menyebabkan enzim-
enzim intraselular dapat diisolasi karena sitoplasma sel telah dipecah.
Penggunaan Triton-X 100 mungkinkan enzim yang diisolasi dalam keadaan
native sehingga masih memiliki aktivitas katalisis (Sigma 2001).

39
Hasil pengujian enzim EDH, GDH, dan MDH dari ekstrak kasar enzim
isolat-isolat terpilih terlihat pada Gambar I. 7. Gambar I.7 A dan B
menunjukkan hasil Native-PAGE dari ekstrak kasar enzim EDH. Gambar I.7
C dan D menunjukkan hasil Native-PAGE dari ekstrak kasar enzim GDH.
Gambar I.7 E dan F menunjukkan hasil Native PAGE dari ekstrak kasar
enzim MDH. Berdasarkan Gambar I.10 terlihat bahwa seluruh isolat terpilih
menghasilkan enzim oksidoreduktase EDH, GDH, dan MDH. Hasil tersebut
terlihat dari spot biru kehitaman di area gel yang bening pada Gambar I.7 A,
C, dan E. Spot biru kehitaman terbentuk akibat tereduksinya pewarna NBT
yang digunakan membentuk diformazan. Secara umum, reaksi yang terjadi
adalah sebagai berikut :
Enzim
oksidoreduktase
Substrat + PMS(reduksi) Produk + PMS(oksidasi)
PMS(oksidasi) + NBT(reduksi) PMS(reduksi) + diformazan
Sumber : (Matsushita et al. 1998)
Menurut Toyama et al. (1995) bakteri penghasil GDH, EDH, dan MDH dapat
dideteksi menggunakan metode Native-PAGE. Selain enzim
oksidoreduktase, pewarna seperti PMS dan NBT juga dapat tereduksi oleh
senyawa-senyawa mikromolekul seperti sitokrom ataupun ubiquinon
(Laurinavicius et al. 2003). Reaksi oksidasi reduksi yang disebabkan oleh
senyawa-senyawa mikromolekul tersebut tidak dapat terdeteksi dengan

40
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8
kDa
116
76
53
A B
9 10 11 12 13 14 15 kDa
9 10 11 12 13 14 15
116
76
53
C D
16 17 18 19 20 21 16 17 18 19 20 21 kDa
116
76
F 53
E
F
E
Gambar I.7. Hasil Native PAGE 15 ekstrak kasar enzim

oksidoreduktase . A) Ekstrak kasar enzim EDH dengan pewarnaan
substrat etanol dan B) CBB. Lajur (1,9,16) kontrol negatif, (2) isolat
A1H1D26,(3) isolat A1H2D56, (4) isolat A1H2D60, (5) isolat A2H2D14
,(6) isolat A2H2D19, (7) isolat A2H3D4 (8,15,21) HMW. C) Ekstrak
kasar enzim GDH dengan pewarnaan substrat glukosa dan D) CBB.
Lajur (10) isolat G1H1D30, (11) isolat G1H3D10,(12) isolat G2H1D21,
(13) isolat G2H2D22, (14) isolat G2H3D20 dan E) Ekstrak kasar enzim
MDH dengan pewarnaan substrat metanol dan F) CBB. Lajur (17) isolat
M2M4, (18) isolat M2M2, (19) isolat M1H2D19, dan (20) isolat M1M3.
HMW berurut dari atas ke bawah β-galaktosidase (116 kDa),
transferrin (76 kDa), dan glutamat dehidrogenase (53 kDa).
Tanda panah menunjukkan enzim target.

41
metode elektroforesis. Hal tersebut dikarenakan metode elektroforesis hanya
dapat mendeteksi perubahan-perubahan senyawa yang disebabkan oleh
makromolekul seperti enzim (Westermeier 2004). Dengan demikian, metode
elektroforesis dapat mengkonfirmasi proses oksidasi-reduksi yang terjadi
disebabkan oleh reaksi katalitik enzim.
Hasil Native-PAGE pada Gambar I. 7 B, D, dan F juga mengkonfirmasi
enzim EDH, GDH dan MDH yang diperoleh merupakan protein karena
menunjukkan warna biru pada gel akrilamid. Menurut Schagger (2006)
protein dapat berikatan dengan Coomassie Brilliant Blue shingga
menimbulkan warna biru pada gel akrilamid.
Hasil Native-PAGE pada ekstrak kasar enzim GDH, EDH, dan MDH
menunjukkan seluruh isolat terpilih menghasilkan enzim oksidoreduktase
tersebut. Walaupun demikian, elektroforesis yang dilakukan belum optimal
karena tidak dapat dilakukan estimasi pengukuran berat molekul enzim terkait.
Kondisi elektroforesis yang tidak optimal dapat disebabkan oleh beberapa
faktor, antara lain: ukuran pori gel akrilamid yang terlalu besar, arus listrik yang
digunakan tidak sesuai, maupun waktu elektroforesis yang terlalu singkat.
KESIMPULAN
1. Sebanyak 83 isolat bakteri penghasil enzim oksidoreduktase dari Situ
Agathis di Kampus UI telah diperoleh menggunakan media selektif.
Sebanyak 44 isolat tumbuh pada medium dengan etanol (0,2% v/v)

42
sebagai sumber karbon tunggal, 16 isolat tumbuh pada medium
dengan glukosa (0,2% w/v) sebagai sumber karbon tunggal, dan 23
isolat diperoleh dari medium dengan metanol (0,2% v/v) sebagai
sumber karbon tunggal.
2. Sebanyak15 isolat terpilih yang diujikan dengan metode Native-PAGE
menunjukkan isolat-isolat tersebut menghasilkan enzim
oksidoreduktase intraselular.

DAFTAR ACUAN
Adachi, O., N.Yoshihara, S. Tanasupawat, H. Toyama & K. Matsushita. 2003.
Purification and characterization of membrane-bound quinate
dehydrogenase. Biosc. Biotechnol. Biochem. 67(10): 2115-2123.
Adamowicz, M., T. Conway & K. W. Nickerson. 1991. Nutritional
Complementation of oxidative glucose metabolism in Escherichia coli
via Pyrroloquinoline Quinone-dependent glucose dehydrogenase and
the Entner-Doudoroff pathway. App.Env.Micro. 57: 2012-2015.
Ameyama, M., E. Shinagawa, K. Matsushita & O. Adachi. 1981. Glucose
dehydrogenase of Gluconobacter suboxydans: Solubilization,
purification and characterization. Agric.Biol.Chem. 45(4): 851-861.
Anthony, C. 1996. Quinoprotein-catalysed reactions. Biochem.Journal. 320:
697-671.
Anesti, V., S.Goonetilleka, I. McDonald, R., D. P. Kelly & A. P. Wood.
(2005). Isolation of facultatively methylotrophic bacteria, including
Methylobacterium podarium sp. nov., from the human foot. J. Environ.
Microbiol. 7 (8): 1227-1238.
Bamforth, C.W. & J. R. Quayle. 1979. Structural aspects of the dye-linked
alcohol dehydrogenase of Rhodopseudomonas acidophila. Biochem.J.
181: 517-524.

44
Belliom, E. & G. T. Wu. 1978. Alcohol dehydrogenase from a facultative
methylotropic bacterium. J. Bacteriology. 135(1): 251 – 258.
Bishop, A., P. M. Gallop & M. L. Karnovsky. 1998. Pyrroloquinoline quinine :
A novel vitamin? Lead Review Article 41: 287-293.
Cappucino & Sherman. 2002. Microbiology. A Laboratory Manual. Benjamin
Cumming Publishing Company,Inc.. New York : xvii+491 hlm.
Christoserdova, L., S. Chen, A. Lapidus & Mary E. Lidstrom. 2003.
Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1 from a
Genomic Point of View. J. Bacteriology. 23: 2980-2987.
Conway, T. & L. O. Ingram. 1989. Similarity of E. coli propanediol
oxidoreductase (fucO product) and an unusual alcohol dehydrogenase
from Zymomonas mobilis and Saccharomyces cerevisae.
J. Bacteriology. 122:1189-1199.
Coates, J., D. Cole, K. A. Chakraborty, R. O’Connor & L. A. Achenbach.
2002. Diversity and ubiquity of bacteria capable of utilizing humic
substances as electron donors for anaerobic respiration. Amec. Soc
Mic. 68(5): 2445-2452
Cornett, J. B. & G. D. Shockman. 1978. Cellular lysis of Streptococcus
faecalis induced with Triton X-100. J. Bacteriology. 135(1): 153 –160.
Cox, R. 2003. Correlation of the rate of protein synthesis and the
third power of the RNA : protein ratio in Escherichia coli and
Mycobacterium tuberculosis. Microbiology. 149: 729-737.

45
Christen, P., R. Auria, R. Marcos, E. Villages & S. Revah. 1996. Growth of
Candida utilis on amberlite with glucose and ethanol as sole carbon
sources (in) Advances in Bioprocess engineering. E. Galintlo dan T.
Ramirez (eds). Kluver Academic Publishers. pp: 87-93.
Church, M. W., D. A. Hutchins & H. W. Ducklow. 2000. Limitations of bacterial
growth by dissolved organicmatter and iron in the southern ocean.
App.Env.Micro. 66: 455-466.
De Wever, A., K. Muylaert, K.Van der Gucht, S. Pirlot, C. Cocqyut, J. Descy,
P. Plisnier & V. Wim. 2005. Bacterial community composition in Lake
Tanganyika: vertical and horizontal heterogeneity. App.Env.Micro
71(9): 5029-5037.
Dedysh, S. N., K. V. Smirnova, V. N. Khmelenina, N. E Suzina, W. Liesack &
Y. A . Trotsenko. 2005. Methylotrophic autotrophy in Beijerinckia
mobilis. J. Bacteriology. 187: 3884–3888.
Dokter, P. J. Frank & J. A. Duine. 1986. Purification and characterization of
quinoprotein glucose dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus
L.M.D. 79.41. Biochem.J. 239: 163-167.
Dokter, P., J. E. Wielink, M. Van Kleef & J. A. Duine. 1988. Cytochrome b-
562 from Acinetobacter calcoaceticus L.M.D. 79.41. Biochem.J. 254:
131-138.

46
Doronina, N.V., Y. A. Trotsenko, B. B. Kuznetov, T.P. Tourova & M.S.S.
Salonen. 2002. Methylobacterium suomiense sp. nov. and
Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic,
pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. International J
Sys. Evol. Biol. 52: 773-776.
Duine, J. A. 1981. Quinoprotein alcohol dehydrogenase from a non-
methylotroph, Acinetobacter calcoaceticus. J. Gen. Microbiol. 122:
201-209.
Duine, J. A. & J. Frank. 1980. Studies on methanol dehydrogenase from
Hypomichrobium X. Biochem.J. 187: 213 -219.
Elfiantz, H., R. R. Malstorm, M. T. Cottrell & D. L. Kirchman. 2005.
Assimilation of polysaccharides and glucose by major bacterial
groups in the Delaware Estuary. App.Env.Micro. 71: 7799-7805.
Fliege, R., S. Tong, A. Shibata, K. W. Nickersen & T. Conway. 1992. The
Entner-Doudoroff Pathway in Eschericia coli Is Induced for Oxidative
Glucose Metabolism via Pyrroloquinoline Quinone-Dependent Glucose
Dehydrogenase. App.Env.Micro. 58: 3826-3829.
Gallego, V., M. T. Garcia & A. Ventosa. 2005. Methylobacterium hispanicum
sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from
drinking water. J. Sys. Evol. Microbiol. 55: 281-287.

47
Gandjar,I., R.Koentjoro, W. Mangunwardoyo & L. Soebagya. 1992. Pedoman
praktikum mikrobiologi dasar. Jurusan Biologi FMIPA UI, Depok: vii +
87 hlm.
Giorgio, P. A & J. J. Cole. 1998. Bacterial growth efficiency in natural aquatic
systems. Annu.Rev. Ecol. Syst. 29: 503 -54.
Glockner, F. O., E. Zaichikov, N. Belkova, L. Denissova, J. Pernthaler, A.
Pernthaler & R. Amann. 2000. Comparative 16S rRNA Analysis of
Lake Bacterioplankton Reveals Globally Distributed Phylogenetic
Clusters Including an Abundant Group of Actinobacteria.
App.Env.Micro. 66(11): 5053 -5065.
Groen, B.W., J. Frank & J. A. Duine. 1986. Quinoprotein alcohol
dehydrogense from ethanol-grown Pseudomonas aueruginosa.
Biochem. J. 2234: 921-924.
Groen, B.W., M. van Kleef & J. A. Duine. 1986. Quinohaemoprotein alcohol
dehydrogense apoenzyme from Pseudomonas testosteroni. Biochem.
J. 234: 611-615.
Gumaste, U. R., M. M. Joshi, D. T. Mourya, P. V. Barde, G. K. Shrivastav &
V. S. Ghloe. 2005. Alcohol dehydrogenase: A potential new marker for
diagnosis of intestinal ischemia using rat as a model. World J. Gastro.
11(6): 912-916.

48
Hahn, M. W. 2003. Isolation of Strains Belonging to the Cosmopolitan
Polynucleobacter necessarius Cluster from Freshwater Habitats
Located in Three Climatic Zones. App.Env.Micro. 69 (9): 5248-5254.
Hahn, M. W., H.Lunsdrof, Q. Wu, M. Schauer, M.G. Hofle, J. Boenigk & P.
Stadler. 2003. Isolation of novel ultramicrobacteria classified as
Actinobacteria from five freshwater habitats in Europe and Asia.
App.Env.Micro. 69 (39): 1442-1451.
Hahn, M. W. 2006. The Microbial diversity of inland waters. Current Opinion
in Biotechnology. 17: 256 -261.
Hiorns, W. D., B. A. Methe, S. A. Nierzwicki-Bauer & J.P. Zehr. 1997.
Bacterial diversity in Adirondack Mountain Lakes as revealed by 16S
rRNA gene sequences. App.Env.Micro. 63 (7): 2957-2960.
Hommes, R. W. J., P. W. Postma, O. M. Neyssel, D. W. Tempest, P. Dokter
& J. A. Duine. 1984. Evidence of a quinoprotein glucose
dehydrogenase apoenzyme in several strains of Escherichia coli.
FEMS Microbiol. Lett. 24: 329-333.
Iswantini, D. & N. Nurhidayat. 2006. Indonesian microbes for biosensor of
glucose. Proceedings: ITSF Seminar on Science and Technology: 54
hlm.
Kasahara, T. & T. Kato. 2003. A new redox-cofactor vitamin for mammals,
pyrolloquinoline quinine. Nature. 422: 832.

49
Kementrian Negara Lingkungan Hidup. 2001. Peraturan Pemerintah Republik
Indonesia Nomor 82 tahun 2001 tentang pengelolaan kualitas air dan
pengendalian pencemaran air . www.klh.go.id. 10 Januari 2008.
Pukul : 14.08 WIB.
Korotkova, N. & M. E. Lidstorm. 2001. Connection between Poly-b-
hydroxybutyrate biosynthesis and growth on C1 and C2 compounds in
the Methylotroph Methylobacterium extorquens AM. J. Bacteriology.
183 (3): 1038-1046.
Korotkova, N., L.Christoserdova, V. Kuksa & Lidstorm, M. E. 2002.
Glyoxylate regeneration pathway in the methylotroph
Methylobacterium extorquens AM1. J. Bacteriology. 184 (6): 1750-
1758.
Korotkova, N., M. E. Lidstorm & L. Christoserdova. 2005. Identification of
genes involved in the glyoxylate regeneration cycle
in Methylobacterium extorquens AM1, including two new genes,
meaC and mead. J. Bacteriology. 187 (4): 1523 -1526.
Kotoski, J. E. 1997. Oxygen minifact and analysis. Spring Harbor
Environmental Magnet Middle School. pp: 1-4.
Lampel, K. A., K. Uratani, Chaudry, G. R., Ramaley, R. F. & S. Rudikoff.
1986. Characterization of the developmentally regulated Bacillus
subtilis glucose dehydrogenase gene. J. Bacteriology. 166: 238-243.

50
Laurinavicius, V., J. Razumiene, B. Kurtinaitiene, V. Gureviciene, L.
Marcinkeviciene & I. Bachmatova. 2003. Comparative characterization
of soluble and membrane-bound PQQ-glucose dehydrogenase.
Biologija. 2: 441-450.
Ludwig, L., A. Akundi & K. Kendall. 1995. A long-chain secondary alcohol
dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis ATCC 4277.
App.Env.Micro. 61(10): 3729-3733.
Matsushita, K. , H. Toyama , M. Yamada & O. Adachi. 1995. Quinoproteins:
structure, function, and biotechnological applications. App.Env.Micro.
32(10): 2722-2733.
Moat, A., J. W. Foster & M. P. Spector. 2002. Microbial Physiology. 4ed.
Wiley-Liss, New York.:xviii+715 hlm.
Musfira, A. 2005. Inventarisasi dan identifikasi khamir dari Sungai Cikaniki
dan Sungai Cikurutug di Taman Nasional Gunung Halimun. Skripsi.
FMIPA, Universitas Indonesia, Depok: xii+173 hlm.
Nickerson, K. W. & A. Apsedon. 1992. Detergent-shock response in enteric
bacteria. Mol. Microbiol. 6:957-961.
Oubrie, A., J. R. Henriette, H. K. Kor, J. J. O. Arjen, J. A. Duine & W. D.
Bauke.1999. The 1.7 Ȃ crystal structure of the apo form of the soluble
reveals a novel internal conserved sequence repeat. EMBO Journal.
18 (19): 5187-5194.

51
Oubrie, A. & B. W. Dijkstra. 2000. Structural requirements of pyrroloquinoline

quinone dependent. Prot. Sci. 9: 1265 -1273
Peekhause, N. & T. Conway. 1998. What’s for Dinner? : Entner-Doudoroff
Metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriology. 180:3495-3502.
Piccini, C., D. Conde, C. Alonso, R. Sommaruga & J. Pernthaler. 2006.
Blooms of Single Bacterial Species in a Coastal Lagoon of the
Southwestern Atlantic Ocean. App.Env.Micro. 72(10): 6560-6568.
Prihantini, N. B. 2003. Mikroalga di Perairan Kampus UI Depok. Prosiding.
Pusat Penelitian Limnologi LIPI hal: 245-253.
Reynolds, J. 2005. Bacterial Colony Morphology. Microbiology experiment.
www.colony_morph.rc.au.id. 11 Januari 2007. Pukul: 16.04 WIB.
Rich, J.I., H. W. Ducklow & D. L. Kirchman. 1996. Concentrations and uptake
of neutral monosaccharides along 140O in the equatorial Pacific:
Contribution of glucose to heterotrophic bacterial activity and the DOM
flux. Amec. Soc. Lim. Ocean. 41(4): 595-604.
Russel, J. B., W. M. Sharp & R. L. Baldwin. 1980. The effect of pH on
maximum bacterial growth rate and iys possible role as adeterminant
of bacterial competition. J. Animal Sci. 48 (2):301-307.
Schagger, H. & G. von Jagow. 2006. Tricine-sodium dodecyl
sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins
in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166: 368–379.
Schulten, H. R., B. Plage & M. Schnitzer. 1991. A chemical structure for
humic substances. Naturwissenschaften .78: 311–312

52
Sigma-Aldrich. 1999. www.sigma-aldrich.com. 14 Februari 2008.
Pukul: 14. 09 WIB.
Simon, M. & C. Wunsch. 1998. Temperature control of bacterioplankton
growth in temperate large lake. Aquatic Microbial Ecology. 16: 119-
130.
Skoog, A., B. Biddanda & R. Benner. 1999. Bacterial utilization of dissolved
glucose in the upper water column of the Gulf of Mexico. Amec. Soc.of
Lim. Oceano. 44(7): 1625-1633.
Sobczak, W.V., J. E. Cloern, A. D. Jassby & A. B. Muller-Solger. 2002.
Bioavailability of organic matter in a highly disturbed estuary: The role
of detrital and algal resources. PNAS. 99(12): 8101 – 8105.
Sulter, G.J., V. Klei, J. P. Schanstra, W. Harder & M. Veenhuis. 1991. Ethanol
metabolism in a peroxisome-deficient mutant of the yeast Hansenula
polymorpha. FEMS Microbiol. Let. 297-302.
Toyama, H., F. Akiko, K. Matsushita., Emiko S., Asahi, M. & O. Adachi.1995.
Three distinct quinoprotein alcohol dehydrogenases are expressed
when Pseudomonas putida is grown on different alcohols. J.
Bacteriology. 177(9): 2442-2450.
Toyama H, W.Soemphol, D. Moonmangmee, O. Adachi & K. Matsushita.
2005. Molecular properties of Membran-bound FAD-containing
sorbytol dehydrogenase from thermotolerant Gluconobacter frateurii
isolated from Thailand. Biosci. Biotech. Biochem. 69 (6):1120-1129.

53
Van Schie, B., Hellingwerf, K.J., Van Dijken, J.P., Elferink, M.G.L., Van Dijl,
J., Kuenen, J.G. & W. N. Konings. 1985. Energy transduction by
electron transfer via a pyrrolo-quinoline quinone-dependent glucose
dehydrogenase in Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and
Acinetobacter calcoaceticus (var. lwoffi). J. Bacteriology. 163 (2): 493-
499.
Van Ophem, P.W., G.J.W. Euvrink, L. Dijkhuizen & J.A. Duine. 1991. A novel
dye linked alcohol dehydrogenase activity present in some Gram-
positive bacteria. FEMS Microbiol. Let. 80: 57-64.
Veletrop, J.S., E. Sellink, J. J. M. Meulenber, S. David, I. Bulder & P.W.
Postma. 1995. Synthesis of pyrroloquinoline quinone in vivo and in
vitro and detection of an intermediate in the biosynthetic pathway.
PAMS .177: 5088-5098.
Westermeier, R. 2004. Electrophoresis in Practice.4 ed. Willey-VCH,
Weinheim: XX + 406 hlm.
Witarto, A.B. 1997. From bench to business: The story of glucose sensor.
JISTECS. 10: 20-28.
Yuhashi, N., M.Tomiyama, J. Okuda, S. Igarashi, K. Ikebukuro & K. Sode.
2005. Development of a novel glucose enzyme fuel cell system
employing protein engineered PQQ glucose dehydrogenase.
Biosen. Bioelec. 20: 2145–2150.

54
Yoch, D., C. Chen, & M. G. Hardin. 1990. Formate dehydrogenase from the
methane oxidizer Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriology.
172: 4456-4463.
Zwart, G., B.C. Crump, M.P. Agterveld, Van der Gucht, F. Hagen & Suk-
Kyun H. 2002. Typical freshwater bacteria: an analysis of available16S
rRNA gene sequences from plankton of lakesand rivers. Aqua. Micro.
Eco. 28: 141-155.
Zwart, G., E. Van Hannen, M. P. Agterveld, Van der Gucht, K. Lindstrorm,
E.S. Wichelen, J.V. Lauridsen, T. Crump, B.C. Ha n & Steven D. 2003.
Rapid screening for freshwater bacterial groups by using reverse line
blot hybridization. App.Env.Micro. 69(10): 5875-5878.

MAKALAH II
KARAKTERISASI PARSIAL ENZIM OKSIDOREDUKTASE DARI SITU

AGATHIS KAMPUS UNIVERSITAS INDONESIA, DEPOK
Suwarti
atiesuwarti@yahoo.com
ABSTRACT
Partial characterization of glucose dehydrogenase and ethanol

dehydrogenase from two selected bacteria isolates of Situ Agathis in University of
Indonesia, Depok has been conducted. Molecular weight using Native-PAGE and
Sodium Dedocyl Sulphate PAGE (SDS-PAGE), enzyme activity, and cofactor effect
(Pyrolloquinolinequinone {PQQ}) were examined to both of enzymes. The glucose
dehydrogenase activity was detected from cell-free extracts of isolate G1H3D10
while ethanol dehydrogenase activity was detected from cell-free extracts of isolate
A1H2D60. Cell-free extracts were further purified with dialysis and Dietilaminoetil
(DEAE) cellulose open column chromatography. Both enzymes were adsorbed to
DEAE column. The molecular weight of glucose dehydrogenase is about 46 kDa in
denatured form while molecular weight of ethanol dehydrogenase could not be
detected. The addition of PQQ caused 8 fold higher activity of glucose
dehydrogenase crude enzyme than control. Hence, glucose dehydrogenase from
isolate G1H1D30 can be assumed as a PQQ-dependent enzyme. In contrast, no
significant effect was observed from PQQs’ presence in ethanol dehydrogenase
activity. Further investigation should be performed to determine the cofactor of
ethanol dehydrogenase of isolate A1H2D60.
Keywords: characterization; cofactor; electrophoresis; ethanol dehydrogenase;

glucose dehydrogenase.
PENDAHULUAN
Situ Agathis merupakan salah satu habitat yang menyediakan nutrisi
bagi bakteri penghasil enzim oksidoreduktase. Berdasarkan penelitian
55

56
sebelumnya, terdapat 15 isolat bakteri penghasil enzim oksidoreduktase yang
diisolasi dari Situ Agathis Kampus UI, Depok. Enzim oksidoreduktase yang
dihasilkan dari seluruh isolat tersebut adalah enzim etanol dehidrogenase
(EDH), glukosa dehidrogenase (GDH), dan metanol dehidrogenase (MDH).
Enzim-enzim EDH, GDH dan MDH membutuhkan kofaktor agar dapat
berfungsi optimal sebagai katalisator. Menurut Ameyama et al. (1981)
aktivitas enzim GDH mengalami peningkatan empat kali lipat setelah
dilakukan penambahan kofaktor ekstraselular. Menurut Lehninger (1982)
beberapa contoh kofaktor enzim adalah logam, senyawa nikotinamid,
senyawa flavonoid, dan senyawa kinon.
Senyawa kinon merupakan kofaktor yang paling akhir ditemukan
dibandingkan dengan kofaktor lainnya (Anthony 1996). Salah satu kofaktor
anggota kelompok kinon adalah Pyrollo Quinoline Quinone (PQQ) (Duine et
al.1979) seperti yang terlihat pada Gambar II.1. Berbeda dengan kofaktor-
kofaktor lainnya, PQQ tidak menggunakan ikatan kovalen dengan enzimnya.
Hal tersebut menyebabkan PQQ dapat diisolasi secara relatif mudah.
Menurut Kasahara dan Kato (2003), PQQ berpeluang besar menjadi vitamin
ke-13 karena terbukti berpengaruh dalam menjaga fertilitas dan anti-
neurodegeneratif sindrom pada mamalia.

57
Gambar II.1. Struktur kimia PQQ

(Magnusson et al. 2004)
Enzim PQQ-GDH dan enzim PQQ-EDH telah banyak digunakan
sebagai objek studi mengingat potensi aplikasinya yang menjanjikan. Enzim
PQQ-GDH telah menggantikan posisi enzim glukosa oksidase sebagai agen
biosensor glukosa karena sifatnya yang tidak dipengaruhi oleh oksigen dalam
darah (Yuhashi et al. 2005). Enzim PQQ-EDH memiliki keunikan tersendiri
karena kofaktornya lebih stabil kepada enzim dibandingkan ikatan antara
PQQ dengan enzim GDH (Avezoux et al. 1995). Enzim EDH juga memiliki
kesamaan spesifitas substrat dengan enzim MDH (Groen et al. 1986). Enzim
GDH dan EDH juga dianggap mewakili enzim-enzim oksidoreduktase yang
memiliki struktur seperti baling-baling (β-propeller) sehingga banyak menarik
minat peneliti (Reddy dan Bruice 2004). Mengingat potensi yang dimiliki oleh
enzim GDH dan enzim EDH maka perlu dilakukan karakterisasi dari kedua
enzim tersebut.

58
Karakterisasi enzim oksidoreduktase dilakukan dengan tiga metode
yakni Native-PAGE, SDS-PAGE, dan pengaruh penambahan kofaktor
terhadap aktivitas enzim. Proses Native-PAGE melibatkan migrasi enzim
pada gel akrilamid pada ukuran pori tertentu dengan bantuan arus listrik
(Berkelman dan Stensted dalam Khodijah 2001). Enzim yang bermigrasi
berada dalam keadaan native sehingga interaksi enzim-substrat dapat
tedeteksi pada gel akrilamid.
SDS-PAGE berdasarkan Laemli (1976) dilakukan untuk
mengidentifikasi enzim yang diperoleh. Berbeda dengan Native-PAGE yang
menganalisis enzim dalam keadaan native, enzim yang dianalisis pada SDS-
PAGE berada dalam keadaan terdenaturasi. Informasi yang diperoleh
dengan SDS-PAGE adalah berat molekul enzim berdasarkan subunit-subunit
penyusunnya apakah monomer, dimer, dan tetramer (Westermeier 2004).
Proses karakterisasi lain yang dilakukan pada enzim oksidoreduktase
adalah pengujian kofaktor enzim untuk memberikan informasi mengenai
kofaktor fisiologis dari enzim oksidoreduktase berdasarkan Tanaka et al.
(2005). Kofaktor fisiologis enzim oksidoreduktase yang ditambahkan
ekstraselular dapat meningkatkan aktivitas enzim tersebut (Shimao et al.
1986).
Karakterisasi dilakukan pada enzim GDH diisolasi dari isolat bakteri
G1H3D10 dan enzim EDH diisolasi dari bakteri A1H2D60. Kedua isolat
tersebut merupakan hasil isolasi enzim oksidoreduktase dari Situ Agathis

59
Kampus UI, Depok. Penelitian bertujuan untuk mengkarakterisasi secara
parsial enzim GDH dan EDH yang diperoleh. Informasi yang didapat
diharapkan menjadi informasi dasar guna penelitian lebih lanjut dalam rangka
pemanfaatan enzim GDH dan EDH yang diperoleh.
BAHAN DAN CARA KERJA
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli – Agustus 2007 di
Laboratorium Rekayasa Protein, Pusat Penelitian Bioteknologi, Cibinong.
Bahan
Mikroorganisme
Dua isolat bakteri terpilih yang digunakan dalam penelitian adalah
isolat G1H1D30 dan A1H2D60 hasil isolasi bakteri penghasil enzim
oksidoreduktase dari Situ Agathis Kampus UI, Depok pada tanggal 26
Februari 2007.
Bahan kimia
Bahan kimia yang berasal dari Merck antara lain :Tris-HCl, glisin,
akilamid, metilen-bis akrilamid, amonium peroksidisulfat (APS), coomassie
brilliant blue (CBB), bromphenol blue (BB), gliserol, metanol, asam asetat
glasial, asam fosforat, D(+) glukosa, etanol, CaCl2. 2H2O, MgCl2. 2H2O,

60
Pyrollo Quinoline Quinone (PQQ), dan Dichlorophenol Indophenol (DCIP).
Bahan kimia yang digunakan dari Sigma antara lain, membran dialisis
niitroselulosa asetat, Phenazine Methosulphate (PMS), dan Nitro Blue
Tetrazolium (NBT).
Bahan kimia lain yang digunakan adalah : MOPS (usb), Bovine Serum
Albumin dan Triton X-100 (Promega), gliserol (Wako), High Molecular Weight
(HMW) dan Low Molecular Weight (LMW) (Amersham). Bahan kimia habis
pakai lain yang adalah alkohol teknis, spirtus teknis, dan akuades.
Peralatan
Alat-alat yang digunakan antara lain mikropipet Gilson dan Finnman,
tip (Axygen), alat-alat gelas (Iwaki, Schott dan Pyrex), autoklaf (Everlight), pH
meter (Lauvinder), jarum ose, bunsen, laminar air flow (Esco), inkubator
(Memmerth), sonikator (Erma), refrigerated sentrifuge (Hettich), alat
elektroforesis (Atto), spektrofotometer (Hitachi), neraca (Precisa), dan oven
(Heraeus).
Cara kerja
Pembuatan medium
a) Medium produksi enzim menurut Toyama et al. (1995)
Komposisi medium produksi enzim berdasarkan Toyama et al. (1995)
modifikasi dalam 250 mL berisi: KNO3 0,5 g, (NH4)2SO4 0,5 g, K2HPO4 0,5 g,

61
KH2PO4 0,25 g, MgSO4.7H2O 0,05 g. Seluruh bahan dilarutkan ke dalam 240
ml H2O di dalam Erlenmeyer flask dan pH medium disesuaikan menjadi 7
dengan pH meter menggunakan NaOH 1 N. Medium ditambahi akuades
hingga volume total menjadi 245 mL. Medium disterilkan menggunakan
autoklaf selama 15 menit pada suhu 1210 C tekanan 2 atm. Penambahan
sumber karbon yang telah disterilkan berupa larutan glukosa 0,2 % w/v dan
etanol 0,2 % v/v sebanyak 5 mL. Penambahan sumber karbon dilakukan bila
medium telah steril dan bersuhu ±500 C .
2) Medium starter
Medium starter dibuat dengan cara memindahkan 25 mL medium
produksi enzim yang telah steril ke dalam Erlenmeyer flask 100 mL.
Pembuatan kurva pertumbuhan
Pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan menggunakan metode
Pellizer et al. (2002) pada dua isolat yakni G1H1D30 dan A1H2D60.
Sebanyak satu ose dari setiap isolat terpilih diinokulasikan ke dalam medium
starter. Inokulum diinkubasi pada suhu ruang (±270 C) dengan agitasi 200
rpm selama 24 jam. Selanjutnya seluruh medium starter diinokulasi ke dalam
medium produksi enzim, dan diinkubasi pada kondisi yang sama dengan
kondisi inkubasi starter. Selama proses inkubasi dilakukan pengukuran nilai
optical density (OD) setiap 2 jam pada λ 600 nm hingga nilai OD tidak
mengalami perubahan.

62
Isolasi enzim
Berdasarkan data yang diperoleh dari kurva pertumbuhan, dilakukan
pemanenan sel apabila nilai OD medium produksi telah mencapai fase log
pada λ 600 nm. Pemanenan enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi
medium pada kecepatan 14.000 rpm suhu 40 C selama 15 menit.
Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, sedangkan pelet digunakan untuk
proses isolasi enzim. Isolasi enzim dilakukan berdasarkan Sigma (1999)
dengan melakukan lisis sel menggunakan Triton-X 100. Proses lisis
dilakukan dengan menambahkan bufer MOPS 10 mM pH 7 yang
mengandung Triton-X 1 % w/v sebanyak 5 % w/v pada pelet yang diperoleh.
Campuran sel divorteks dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 270 C lalu
disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm suhu 40 C selama 15 menit. Filtrat
yang diperoleh digunakan sebagai ekstrak kasar enzim dan disimpan pada
suhu -200 C.
Purifikasi enzim
Ekstrak kasar yang telah diperoleh selanjutnya dipurifikasi dengan dua

tahapan.
1. Dialisis
Proses dialisis dilakukan berdasarkan metode Boyer (1993). Membran
dialisis yang memiliki cut-off 12 kDa dipotong dengan ukuran 20 cm,

63
direndam asam asetat 1 % selama satu jam dan direndam kembali dalam air
destilasi untuk menghilangkan ion-ion logam. Membran dialisis direbus
dengan larutan EDTA (1% sodium karbonat, 10-3 M EDTA) selama satu jam.
Perebusan dilakukan kembali dengan larutan EDTA segar. Membran dialisis
kembali direbus dengan akuades sebanyak lima kali. Membran dialisis
disimpan dalam air destilasi yang telah ditambahkan beberapa tetes
kloroform sebelum digunakan di lemari es.
Ekstrak kasar enzim dimasukkan ke dalam membran dialisis.
Selanjutnya membran dialisis yang berisi enzim direndam dalam beaker glass
1 l yang berisi bufer MOPS 10 mM pH 7 sebanyak 800 ml hingga membran
terendam. Proses dialisis dilakukan pada suhu 40 C selama ± 24 jam
dengan agitasi menggunakan magnetic stirrer. Selama proses dialisis
dilakukan pergantian bufer sebanyak 3 kali.
2. Kromatografi kolom terbuka
Purifikasi enzim dengan kromatografi kolom terbuka berdasarkan
metode Bellion dan Wu (1978). Ekstrak kasar enzim yang telah didialisis
dilewatkan pada matriks DEAE selulosa dengan menggunakan kolom
terbuka. Matriks yang digunakan pada kromatografi kolom terbuka adalah
sebanyak 1 mL. Proses kromatografi dilakukan dengan tiga tahapan yakni
ekuilibrasi menggunakan bufer MOPS 10 mM pH 7 sebanyak 10 mL, aplikasi
sampel sebanyak 25 mL untuk masing-masing ekstrak kasar, pencucian
dengan bufer MOPS 10 mM pH 7sebanyak 10 mL dan elusi dengan bufer

64
MOPS NaCl dengan gradien konsentrasi 0,1- 1 M MOPS NaCl sebanyak 1
mL untuk setiap konsentrasi bufer MOPS NaCl yang digunakan. Seluruh
fraksi yang tidak terikat maupun hasil eluen ditampung pada tempat yang
berbeda untuk dianalisis selanjutnya.
Pengujian enzim oksidoreduktase
Enzim oksidoreduktase yang diperoleh diuji dengan menggunakan
Native-PAGE dengan konsentrasi akrilamid 7,5 % menurut Khodijah (2003).
Tahapan dalam pengerjaan Native-PAGE adalah sebagai berikut. Larutan
stok, resolving gel, stacking gel dan pewarna gel seperti terlampir pada
Lampiran 5, dibuat sebelum dilakukan preparasi sampel. Preparasi sampel
dilakukan dengan mencampur 64 μL sampel ekstrak kasar dengan 16 μL
bufer sampel 5x di dalam tabung mikro 1,5 mL. Campuran dihomogenkan
dengan vortex lalu diaplikasikan ke dalam sumur elektroforesis sebanyak 25
μL. Perangkat elektroforesis ditambahkan dengan bufer Native-PAGE dingin
sebanyak 250 mL, kemudian elektroforesis dijalankan pada 110 Volt dan 30
mA selama kurang lebih 1,5 jam. Setelah dilakukan elektroforesis, gel
dikeluarkan dari perangkat elektroforesis, kemudian dimasukkan ke dalam
larutan pewarna substrat enzim sebanyak 50 mL. Pewarnaan dengan
substrat dilakukan pada suhu 40 C hingga diperoleh titik biru kehitaman (spot)
pada gel. Reaksi dihentikan dengan membuang larutan pewarna substrat
dan menggantinya dengan bufer MOPS pH 7 10 mM. sebanyak 50 mL.

65
Selanjutnya dilakukan pewarnaan protein dengan merendam gel di dalam
larutan pewarna protein sebanyak 50 mL pada suhu ruang (±27º C) selama
24 jam. Gel yang telah diwarnai dengan pewarna protein, dicuci dengan
larutan pencuci hingga warna gel awal (bening) muncul kembali. Selama
pencucian, larutan pencuci yang digunakan diganti apabila telah berubah dari
bening menjadi biru pekat.
Analisis enzim dengan SDS-PAGE
Selain dilakukan pengujan menggunakan Native-PAGE, dilakukan
pula analisa enzim-enzim oksidoreduktase dengan SDS-PAGE menurut
Laemmli (1970) pada konsentrasi akrilamid 12%. Beberapa tahapan yang
dilakukan selama proses SDS-PAGE adalah sebagai berikut. Tahapan
dalam pengerjaan SDS-PAGE adalah sebagai berikut. Larutan stok,
resolving gel, stacking gel dan pewarna gel seperti terlampir pada Lampiran
5, dibuat sebelum dilakukan preparasi sampel. Preparasi sampel dilakukan
dengan mencampur 64 μL sampel ekstrak kasar dengan 16 μL bufer sampel
SDS-PAGE 5x di dalam tabung mikro 1,5 mL. Campuran dihomogenkan
dengan vortex lalu diapnasakn dalam suhu 900 C selama lima menit. Sampel
diaplikasikan ke dalam sumur elektroforesis sebanyak 25 μL. Perangkat
elektroforesis ditambahkan dengan bufer SDS-PAGE dingin sebanyak 250
mL, kemudian elektroforesis dijalankan pada 110 Volt dan 30 mA selama
kurang lebih 1,5 jam. Setelah dilakukan elektroforesis, gel dikeluarkan dari
perangkat elektroforesis, kemudian dimasukkan ke dalam larutan pewarna

66
protein sebanyak 50 mL pada suhu ruang (±27º C) selama 24 jam. Gel yang
telah diwarnai dengan pewarna protein, dicuci dengan larutan pencuci hingga
warna gel awal (bening) muncul kembali. Selama pencucian, larutan pencuci
yang digunakan diganti apabila telah berubah dari bening menjadi biru pekat.
Pengukuran konsentrasi protein
Pengukuran konsentrasi protein dilakukan dengan menggunakan
metode Bradford di dalam Toyama et al. (1995). Bovine Serum Albumin
(BSA) digunakan sebagai standar dengan konsentrasi stok 0,5 mg/mL.
Larutan BSA stok diencerkan hingga diperoleh variasi konsentrasi akhir
protein 0, 19, 29, 39, dan 49 µg/mL dengan menggunakan akuades. Larutan
standar dicampurkan pereaksi Bradford sebanyak 3 mL. Selanjutnya
campuran divorteks dan diinkubasi pada suhu ruang (±270 C) selama lima
menit. Preparasi sampel dibuat dengan cara mencampurkan 100 µl sampel
dengan tiga mL pereaksi Bradford, dan dilakukan inkubasi pada suhu ruang
(270 C) selama lima menit. Seluruh standar dan sampel diukur
absorbansinya pada λ 595 nm. Hasil pengukuran absorbansi pada standar
diplot untuk mendapatkan kurva standar dan persamaan kurva. Hasil
pengukuran absorbansi pada sampel diplotkan ke dalam persamaan yang
diperoleh sehingga dapat diketahui konsentrasi sampel yang diukur.

67
Pengukuran aktivitas GDH dan EDH
1. Pembuatan larutan untuk pengukuran aktivitas.
Pembuatan larutan untuk pengukuran aktivitas dapat dilihat pada
Lampiran 8.
2. Pengukuran aktivitas
Pengukuran aktivitas dilakukan dengan cara mencampurkan 2,5 mL
larutan A, 50 µL larutan B, 50 µL larutan C dan 300 µL larutan D (untuk
GDH) atau 300 µL larutan E (untuk EDH) ke dalam kuvet. Selanjutnya
campuran divorteks kemudian diinkubasi selama lima menit pada suhu
270 C. Sebanyak 100 µL sampel enzim hasil fraksinasi ditambahkan pada
campuran dan dikocok hingga homogen. Sebagai blanko digunakan 100 .µL
akuades sebagai pengganti sampel. Pengukuran absorbansi pada λ 600 nm
dilakukan tepat setelah satu menit dan tiga menit penambahan sampel pada
campuran. Nilai aktivitas enzim diperoleh dengan perhitungan nilai
absorbansi sampel mengikuti persamaan sebagai berikut :
Aktivitas (Unit/mL) = [(A1-A3)-(Ab1-Ab3)]/2 x 3 x FP

22 x 0.1

68
Keterangan :
A1 : Absorbansi sampel pada menit pertama setelah ditambahkan sampel
A3 : Absorbansi sampel pada menit ketiga setelah ditambahkan sampel
Ab1: Absorbansi blanko pada menit pertama setelah ditambahkan blanko
Ab3: Absorbansi blanko pada menit ketiga setelah ditambahkan blanko
FP : Faktor Pengenceran
Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat
mereduksi satu μmol DCIP per menit pada kondisi tertentu.
Pengujian kofaktor PQQ pada sampel
Pengujian kofaktor PQQ dilakukan untuk mengetahui keberadaan
kofaktor PQQ pada enzim. Pengujian kofaktor PQQ dilakukan berdasarkan
metode Tanaka et al. (2005) modifikasi. Sebanyak 100 µL larutan MOPS
10 mM pH 7 yang mengandung 1 µM PQQ dan 1 µM CaCl2.7H2O
ditambahkan ke dalam 100 µL sampel (larutan F). Selanjutnya dilakukan
inkubasi pada suhu 270 C selama 30 menit. Sampel yang telah ditambahkan
PQQ diukur aktivitasnya menggunakan metode pengukuran aktivitas enzim
GDH dan EDH. Pengukuran aktivitas dilakukan dengan cara mencampurkan
2,4 mL larutan A, 50 µL larutan B, 50 µL larutan C dan 300 µL larutan D
(untuk GDH) atau 300 µL larutan E (untuk EDH) dan 200 µL larutan F ke
dalam kuvet.

69
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva pertumbuhan
Kurva pertumbuhan dibuat untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan
oleh bakteri untuk mencapai akhir fase logaritmik sehingga waktu
pemanenan enzim dapat ditentukan. Kurva pertumbuhan dari isolat bakteri
terpilih G1H1D30 dapat dilihat pada Gambar II.2. dan Gambar II.3 untuk
isolat bakteri terpilih A1H2D60. Akhir fase logaritmik dari kurva pertumbuhan
isolat G1H1D30 dan isolat A1H2D60 dicapai setelah jam ke-22 dan jam ke-
28 waktu inkubasi .
Gambar II.2 Kurva Pertumbuhan isolat G1H1D30

70
Gambar II.3 Kurva Pertumbuhan isolat A1H2D60
Menurut Alves et al. (1994) enzim GDH dapat mencapai jumlah yang
optimum pada akhir fase logaritmik. Menurut Adamowicz et al. (1991) akhir
fase logaritmik beberapa bakteri penghasil enzim GDH seperti E. coli dan
A. calcoaceticus dicapai setelah jam ke-20. Menurut Christen (et al. 1991)
bakteri penghasil enzim EDH membutuhkan waktu 24 jam untuk mencapai
akhir fase logaritmik. Berdasarkan hal tersebut, pemanenan enzim GDH
dilakukan setelah jam ke-22 masa inkubasi dan pemanenan enzim EDH
dilakukan setelah jam ke-28 masa inkubasi.
Pengujian enzim GDH dan EDH menggunakan Native-PAGE
Gambar II.4. A dan II.4. B. menunjukkan hasil pengujian enzim GDH
menggunakan metode Native-PAGE. Gambar II.4. C dan II.4. D
menunjukkan hasil pengujian enzim EDH . Enzim GDH terdapat pada tiga
fraksi yakni ekstrak kasar (lajur satu), fraksi hasil dialisis (lajur dua), dan fraksi

71
elusi kromatografi kolom terbuka pada konsentrasi 0,3 M NaCl (lajur tiga).
Enzim EDH terdapat pada fraksi ekstrak kasar enzim (lajur sembilan) , fraksi
enzim hasil dialisis (lajur 10) , dan fraksi enzim elusi kromatografi 0,1 M NaCl
(lajur 12). Kedua fraksi dialisis mengindikasikan adanya enzim GDH dan
enzim EDH. Menurut Dokter et al. (1986) proses dialisis dapat membantu
pendeteksian keberadaan enzim GDH dari bakteri. Menurut Toyama et al.
(1995) enzim EDH yang telah mengalami perlakuan dialisis dapat terdeteksi
dengan metode Native-PAGE. Proses dialisis akan menghilangkan
mikromolekul seperti ubiquinon (Ellias et al. 2005) dan sitokrom (Dokter et al.
1988). Kedua mikromolekul tersebut dapat menunjukkan aktivitas oksidasi-
reduksi pada pengukuran aktivitas dengan metode spektrofotometri. Fraksi
elusi hasil kromatografi kolom DEAE pada konsentrasi NaCl 0,3 M untuk
enzim GDH dan 0,1 M NaCl untuk enzim EDH pada Gambar II. 4
menunjukkan pita protein pada Native PAGE dengan pewarnaan aktivitas
maupun CBB. Matriks DEAE selulosa yang digunakan mengandung gugus
amina (NH+) yang bermuatan positif (Scopes 1998). Protein-protein yang
terikat pada matriks DEAE selulosa adalah protein-protein yang bermuatan
negatif. Protein tersebut merupakan protein yang bersifat basa dan memiliki
titik isolelektrik (pI) lebih dari tujuh (Lehninger 1982).

72
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 kD
a
76
53
A B
7 8 9 10 1112 kDa 7 8 9 10 11 12
76
53
C D
Gambar II.4 Hasil Native-PAGE (A) enzim GDH dari isolat

G1H1D30 dengan pewarnaan larutan yang mengandung
glukosa dan (B) pewarnaan CBB. Lajur 1) Ekstrak kasar
enzim, 2) hasil dialisis,3) fraksi enzim yang tak terikat matriks,
4) fraksi elusi 0,3 M NaCl, 5) bufer MOPS 10 mM pH 7,
6 dan 7) penanda protein HMW, (C) enzim EDH dari isolat
A1H2D60 dengan pewarnaan menggunakan larutan
pewarna yang mengandung etanol dan (D) pewarnaan CBB
Lajur 8) fraksi enzim yang tak terikat matriks, 9) ekstrak
kasar enzim, 10) hasil dialisis, 11) buffer MOPS 10 mM
pH 7, dan 12) fraksi elusi 0,1 M NaCl. HMW berurut dari atas
ke bawah transferrin (76 kDa) dan glutamat dehidrogenase
(53 kDa). Tanda panah menunjukkan enzim target.
Gambar II.4. lajur empat dan lajur 12 mengindikasikan enzim GDH dan
enzim EDH yang diperoleh merupakan protein basa. Enzim GDH dalam
bentuk protein basa diisolasi dari Acinetobacter calcoaceticus dengan

73
pI ~9,5 (Dokter et al.1986). Menurut Groen et al. (1984) enzim EDH terikat
pada matriks DEAE dan memiliki pI ~8,6.
Analisis enzim GDH dan EDH dengan SDS PAGE
Analisis enzim GDH dengan SDS-PAGE dilakukan terhadap 10 fraksi
yakni 1) fraksi ekstrak kasar, 2) fraksi hasil dialisis 3) fraksi enzim yang tak
terikat matriks DEAE selulosa, 4) fraksi elusi kromatografi 0,1 M NaCl, 5)
fraksi elusi kromatografi 0,2 M NaCl, 6) fraksi elusi kromatografi 0,3 M NaCl,
7) fraksi elusi kromatografi 0,5 M NaCl, 8) fraksi elusi kromatografi 0,7 M
NaCl, 9) fraksi elusi kromatografi 0,9 M NaCl dan 10) fraksi elusi kromatografi
1 M NaCl. Hasil SDS-PAGE enzim GDH tampak pada Gambar II.5.
kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
97
66
45
30
20.1
Gambar II.5. Hasil SDS-PAGE glukosa dehidrogenase

dari isolat G1H1D30 dengan pewarnaan CBB. Lajur (1)
ekstrak kasar enzim, 2) hasil dialisis 3) fraksi enzim
tak terikat matriks, 4) penanda protein LMW 5) fraksi elusi
0,1 M NaCl, 6) fraksi elusi 0,2 M NaCl, 7) fraksi elusi
0,3 M NaCl, 8) fraksi elusi 0,5 M NaCl, 9) fraksi elusi 0,7 M
NaCl, 10) fraksi 0,9 M NaC dan 11) fraksi elusi 1 M NaCl.
Tanda lingkaran menunjukkan enzim target.

74
Berdasarkan hasil yang tampak pada Gambar II.5, pita protein enzim GDH
ditunjukkan oleh fraksi ekstrak kasar (lajur satu), fraksi hasil dialisis (lajur
dua), dan fraksi elusi 0,3 M NaCl (lajur tujuh), fraksi elusi 0,4 M NaCl (lajur
delapan), serta protein penanda LMW (lajur empat). Selain pita protein yang
terlihat dari warna biru pada gel akrilamid SDS-PAGE dari fraksi-fraksi protein
yang diisolasi dari G1H1D30 (Gambar II.5), pita protein penanda LMW juga
terdeteksi. Pita protein penanda diukur pergerakannya dalam gel akrilamid
yang ditunjukkan oleh nilai Retardation factor (Rf) (Gambar II.5). Nilai Rf
adalah perbandingan jarak migrasi protein total dengan jarak migrasi protein
target pada gel akrilamid (Westermeier 2004). Selanjutnya nilai Rf LMW
diplotkan dengan log berat molekul dari pita protein LMW pada kurva linear
Gambar II.6. Kurva standar nilai Rf dan log berat molekul

LMW.

75
seperti terlihat pada Gambar II.6. Berdasarkan kurva tersebut, diperoleh
persamaan linear yang juga terlihat pada Gambar II.6. Hasil konversi nilai Rf
pita protein fraksi-fraksi enzim GDH dari isolat G1H1D30 menunjukkan berat
molekul enzim GDH yang diperoleh sekitar 46 kDa. Analisis dengan SDS-
PAGE dapat memberikan informasi mengenai berat molekul protein dalam
keadaan terdenaturasi sehingga interaksi subunit protein diperkirakan sudah
tidak ada lagi (Laemmli 1970). Menurut Dokter et al. (1986) enzim GDH
memiliki berat molekul subunit sebesar ~48 kDa.
Analisis enzim EDH dengan SDS-PAGE dilakukan terhadap 10 fraksi
yakni 1) ekstrak kasar, 2) hasil dialisis, 3) fraksi enzim yang tak terikat matriks
DEAE, 4) fraksi elusi 0,1 M NaCl, 5) fraksi elusi 0,2 M NaCl, 6) fraksi elusi 0,3
M NaCl, 7) fraksi elusi 0,5 M NaCl, 8) fraksi elusi 0,7 M NaCl, 9) fraksi 0,9 M
NaCl dan 10) fraksi elusi 1 M NaCl. Hasil SDS-PAGE enzim EDH tampak
pada Gambar II.7. Berdasarkan Gambar II.7, tidak terdeteksi adanya pita
protein dari seluruh fraksi protein isolat A1H2D60. Pita protein yang tidak
terdeteksi menyebabkan tidak dapat dilakukan analisa pada protein EDH
khususnya mengenai berat molekul enzim EDH yang diperoleh. Hal tersebut
dapat disebabkan oleh konsentrasi protein yang terkandung di dalam protein
hasil isolasi lebih rendah, sehingga protein yang terikat dengan CBB lebih
sedikit (Tabel II.1).

76
kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
96
60
45
30
20.1
Gambar II.7. Hasil SDS-PAGE etanol dehidrogenase dari

isolat A1H2D60 dengan pewarnaan CBB. Lajur 1) Ekstrak
kasar enzim, 2) hasil dialisis, 3) fraksi elusi 0,1 M, 4) fraksi
elusi 0,2 M NaCl, 5) fraksi elusi 0,3 M NaCl, 6) fraksi elusi
0,5 M NaCl, 7) penanda protein LMW, 8) fraksi elusi
0,7 M NaCl, 9) fraksi 0,9 M NaCl dan 10) fraksi elusi
1 M NaCl.
Konsentrasi protein yang lebih sedikit dapat disebabkan oleh proses lisis sel
yang tidak sempurna. Proses lisis sel dilakukan pada enzim EDH dari isolat
A1H2D60 yang merupakan bakteri Gram positif. Menurut Cornett dan
Shockman (1978) proses autolisis yang diinduksi Triton-X 100 oleh enzim
hidrolisis pada bakteri Gram positif akan sulit.karena bakteri tersebut memiliki
lapisan peptidoglikan yang lebih tebal dibandingkan bakteri Gram negatif.
Birdsell (1968) menyatakan penambahan lisozim dan EDTA dapat membantu
proses lisis oleh Triton-X baik untuk bakteri Gram positif maupun bakteri
Gram negatif. Selain itu, proses fisik seperti sonikasi maupun French
pressure (Alves 1991) dapat dijadikan alternatif untuk memecah sel isolat

77
A1H2D60. Proses tersebut diharapkan dapat memberikan data yang lebih
jelas pada proses SDS-PAGE sehingga informasi berat molekul enzim EDH
dalam keadaan terdenaturasi dapat diketahui.
Perhitungan konsentrasi protein total
Nilai konsentrasi protein total fraksi-fraksi GDH dari isolat G1H1D30
dan fraksi-fraksi EDH dari isolat A1H2D60 dapat dilihat pada Tabel II.1. Nilai
tersebut diperoleh berdasarkan konversi nilai OD seluruh fraksi enzim GDH
dan enzim EDH dengan persamaan linear yang diperoleh dari kurva standar
seperti terlihat pada Gambar II.8.
Gambar II.8. Kurva absorbansi protein standar

BSA pada λ 595 nm.
Berdasarkan Tabel II.1. terlihat bahwa konsentrasi protein total berbanding
terbalik dengan tingkat kemurnian enzim. Hal tersebut menandakan enzim
yang dipurifikasi akan mengalami penurunan konsentrasi enzim. Menurut

78
Toyama (et al. 1995) konsentrasi pada fraksi-fraksi protein enzim GDH dan
EDH akan semakin berkurang pada fraksi yang lebih murni. Hal tersebut
dikarenakan proses purifikasi meliputi dialisis dan kromatografi kolom terbuka
mereduksi jumlah protein total pada setiap fraksinya. Menurut Shimao et al.
(1986) fraksi enzim yang lebih murni akan mengandung sedikit konsentrasi
protein total. Menurut Alves et al. (1994) penurunan konsentrasi protein total
pada fraksi dialisis dan kromatografi dapat mencapai 10x lipat dari
konsentrasi ekstrak kasar enzim.
Tabel II.1. Nilai Absorbansi dan Konsentrasi Protein Total dari Isolat bakteri
G1H1D30 dan A1H2D60 pada λ 595 nm
Konsentrasi
No Sampel Absorbansi (µg/mL)
1 Ekstrak kasar sel G1H1D30 0,76 143,0
2 Ekstrak dialisis sel G1H1D30 0,72 130,0
3 Fraksi tak terikat matriks DEAE sel G1H1D30 0,64 104,0

Fraksi elusi 0,3 M NaCl matriks DEAE sel
4 G1H1D30 0,46 30,1
5 Ekstrak kasar sel A1H2D60 0,7 123,6
6 Ekstrak dialisis sel A1H2D60 0,68 117,2
7 Fraksi tak terikat matriks DEAE sel A1H2D60 0,6 91,3

Fraksi elusi 0,1 M NaCl matriks DEAE sel
8 A1H2D60 0,37 17,2

79
Pengukuran aktivitas enzim GDH dan pengaruh penambahan PQQ pada

aktivitas enzim GDH
Pengukuran aktivitas enzim GDH dilakukan pada fraksi-fraksi enzim
yang terdeteksi mengandung enzim GDH yakni fraksi ekstrak kasar enzim,
fraksi enzim hasil dialisis, dan fraksi elusi kromatografi 0,3 M NaCl (hasil
Native PAGE Gambar II.4.A). Hasil pengukuran aktivitas fraksi-fraksi enzim
GDH tersebut diperlihatkan pada Gambar II.9. Berdasarkan gambar tersebut
dapat diketahui fraksi enzim hasil elusi kromatografi kolom terbuka 0,3 M
NaCl memiliki aktivitas enzim GDH tertinggi (0,695 U/mL) dibandingkan
dengan aktivitas fraksi-fraksi enzim lain dari isolat G1H1D30 untuk perlakuan
tanpa penambahan PQQ. Aktivitas enzim GDH terendah pada perlakuan
yang sama dari fraksi-fraksi enzim isolat G1H1D30 terlihat pada fraksi ekstrak
kasar enzim yakni sebesar 0,102 U/mL, sedangkan nilai aktivitas fraksi enzim
hasil dialisis berada di antara fraksi ekstrak kasar enzim dan fraksi elusi
kromatografi 0,3 M NaCl sebesar 0,143U/mL. Proses purifikasi dapat
meningkatkan aktivitas enzim GDH seperti yang dilakukan oleh Dokter et al.
(1986), Alves et al. (1994) dan Sode et al. (2000).

80
Gambar II. 9. Aktivitas enzim GDH tanpa dan dengan

penambahan PQQ dari fraksi-fraksi enzim isolat G1H3D10.
Berdasarkan Gambar II.10, diketahui PQQ meningkatkan aktivitas fraksi
enzim dari isolat G1H1D30. Aktivitas fraksi ekstrak kasar meningkat delapan
kali lipat setelah ditambahkan PQQ (0,102 U/mL menjadi 0,941 U/mL).
Kenaikan aktivitas fraksi enzim hasil dialisis setelah ditambahkan PQQ juga
terjadi sebesar hampir delapan kali dari 0,143 U/mL menjadi 1,084 U/mL.
Kenaikan aktivitas sebanyak 1,5 kali terjadi pada fraksi elusi 0,3 M NaCl
kromatografi dari 0,695 U/mL menjadi 1,002 U/mL setelah ditambahkan PQQ.
Peningkatan aktivitas enzim tersebut dikarenakan meningkatnya aktivitas
katalitik setelah ditambahkan PQQ. PQQ yang terikat pada enzim GDH akan
mengaktifkan sisi aktif dari enzim GDH sehingga reaksi katalitik enzim GDH
dapat terjadi (Oubrie et al. 1999). Terdapat dua kemungkinan penyebab
kenaikan aktivitas setelah ditambahkan PQQ. Kemungkinan pertama, enzim
GDH yang diperoleh merupakan apoenzim. Menurut Ameyama et al. (1981)

81
beberapa enzim GDH berada dalam bentuk apoenzim dan akan membentuk
holoenzim setelah dilakukan penambahan PQQ ekstraselular. Apoenzim
GDH kebanyakan diperoleh dari bakteri-bakteri Gram negatif seperti E. coli
(Matsushita et al. 1997), Gluconobacter dan Erwinia (Ameyama et al. 1981).
Kemungkinan kedua, enzim GDH yang diperoleh sudah dalam bentuk
holoenzim. Namun, akibat perlakuan isolasi dan purifikasi yang dilakukan,
PQQ yang sebelumnya terikat melalui ikatan hidrogen dan interaksi ionik
antar residu asam amino terlepas dari enzim GDH (Reddy dan Bruice, 2004).
Hal tersebut disebabkan oleh sebagian molekul PQQ pada enzim GDH yang
terekspos ke lingkungan pelarut, sehingga ikatan PQQ dengan GDH tidak
stabil (Oubrie et al. 1999). Penambahan PQQ ekstraselular akan
meningkatkan aktivitas katalitik baik bagi apoenzim GDH maupun bagi
holoenzim GDH yang tidak stabil karena melibatkan ion Ca2+ (Sato et al.
2001). Ion Ca2+ dapat menstabilkan pembentukan semikuinon akibat
aktivitas katalitik enzim tersebut. (Sato et al. 2001)
Pengukuran aktivitas enzim EDH dan pengaruh penambahan PQQ pada

aktivitas enzim EDH
Pengukuran aktivitas enzim EDH dari isolat A1H2D60 dilakukan pada
fraksi-fraksi enzim yang terdeteksi mengandung enzim EDH yakni fraksi
ekstrak kasar, fraksi enzim hasil dialisis, dan fraksi elusi kromatografi 0,1 M
NaCl (hasil Native PAGE Gambar II.4). Hasil pengukuran aktivitas fraksi-
fraksi enzim EDH dari isolat A1H2D60 tersebut diperlihatkan pada Gambar

82
II.10. Berdasarkan gambar tersebut dapat diketahui fraksi ekstrak kasar
enzim dan fraksi enzim hasil dialisis isolat A1H2D60 memiliki aktivitas
terendah (0.082 U/mL) dibandingkan dengan fraksi elusi 0,1 M NaCl
kromatografi dari isolat A1H2D60 untuk perlakuan tanpa penambahan PQQ
Gambar II.10 Aktivitas enzim EDH tanpa dan dengan

penambahan PQQ dari fraksi-fraksi enzim isolat A1H2D60.
Aktivitas enzim EDH tertinggi pada perlakuan yang sama dari fraksi-fraksi
enzim isolat A1H2D60 terlihat pada enzim fraksi elusi kromatografi 0,1 M
NaCl yakni sebesar 0,45 U/mL. Proses purifikasi dapat meningkatkan
aktivitas enzim EDH seperti yang dilakukan oleh Groen et al. (1986) dan
Toyama et al. (1995).
Berdasarkan Gambar II.10 diketahui PQQ hanya meningkatkan
aktivitas enzim fraksi elusi kromatografi 0.1 M NaCl. dari isolat A1H2D60.

83
Aktivitas fraksi elusi kromatografi 0.1 M NaCl meningkat satu setengah kali
setelah ditambahkan PQQ ( 0,450 U/mL menjadi 0,645 U/mL). Penambahan
PQQ tidak memberikan pengaruh kepada aktivitas fraksi ekstrak kasar enzim
isolat A1H2D60 (nilai aktivitas tetap 0,082 U/mL). Sebaliknya penambahan
PQQ menurunkan aktivitas enzim pada fraksi hasil dialisis enzim isolat
A1H2D60 dari 0,082 menjadi 0,0204 U/mL. Hal tersebut dapat disebabkan
oleh dua kemungkinan. Kemungkinan pertama, berbeda dengan enzim
PQQ-GDH, molekul PQQ terikat lebih stabil pada enzim EDH. Menurut
Avezoux et al. (1995) pada enzim EDH terdapat cincin disulfid yang terbentuk
dari ikatan residu-residu sistein yang berdekatan. Avezoux et al. (1995)
menambahkan, cincin disulfid tersebut melindungi ikatan antara PQQ dengan
enzim EDH dari solven sehingga ikatan keduanya relatif stabil. Ikatan yang
relatif stabil menyebabkan aktivitas enzim EDH relatif tetap dan tidak
dipengaruhi oleh penambahan PQQ ekstraselular. Kemungkinan lain adalah
enzim EDH yang diperoleh bukan enzim PQQ (PQQ-independent) sehingga
penambahan PQQ ekstraselular tidak akan memengaruhi aktivitas
katalitiknya. Menurut Van Ophem et al. (1991) enzim EDH yang diisolasi dari
bakteri Gram positif dapat menggunakan kofaktor dari golongan senyawa
nikotinamid dan flavonoid. Oleh karena itu diperlukan studi lebih lanjut
dengan melakukan pengujian kofaktor lain untuk mengetahui kofaktor apa
saja yang dapat memengaruhi aktivitas enzim EDH yang diperoleh.

84
KESIMPULAN
1. Fraksi purifikasi enzim GDH dari isolat G1H1D30 dan enzim EDH dari
isolat A1H2D60 yang diuji menggunakan metode Native-PAGE
menunjukkan fraksi ekstrak kasar, fraksi dialisis, dan fraksi elusi
kromatografi mengandung enzim oksidoreduktase.
2. Enzim GDH dari isolat G1H1D30 diduga memiliki berat molekul ~46
kDa, sedangkan informasi berat molekul enzim EDH dari isolat
A1H2D60 belum berhasil diketahui dengan metode SDS-PAGE.
3. Enzim GDH dari isolat G1H1D30 merupakan enzim-PQQ karena
aktivitasnya dipengaruhi oleh penambahan PQQ ekstraselular.
Aktivitas enzim GDH meningkat hampir delapan kali lipat setelah
ditambahkan PQQ (dari 0,102 U/mL menjadi 0,940 U/mL ekstrak kasar
enzim). Enzim EDH dari isolat A1H2D6 belum diketahui secara pasti
apakah berkofaktor PQQ atau tidak.

DAFTAR ACUAN
Alves, A. M. C. R., G. J. W. Euverink, H. J. Hektor, G. I. Hessels, J. V. Vlag,
J. W. D. Vrijbloed, D. Hondmann, J. Visser & L. Dijkhuizen. 1994.
Enzymes of glucose and methanol metabolism in the
Actinomycete Amycolatopsis methanolica. J. Bacteriology. 176: 6827 –
6835.
Ameyama, M, E. Shinagawa, K. Matsushita & O. Adachi. 1981. Glucose
dehydrogenase of Gluconobacter suboxydans: Solubilization,
purification and characterization. Agric.Biol.Chem. 45 (4): 851-861.
Anthony, C. 1996. Quinoprotein-catalysed reactions. Biochem.Journal.
320: 697-671.
Avezoux, A., M.G. Goodwin & C. Anthony. 1995. The role of the novel
disulphide ring in the active site of the quinoprotein methanol
dehydrogenase from Methylobacterium extorquens. Biochem. J. 307:
735-741.
Birdsell, D. C. & E. H. Cota-Robles. 1968. Lysis of spheroplasts of
Escherichia coli by a non-ionic detergent. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 31:438-446.
Belliom, E. & G. T. Wu. 1978. Alcohol dehydrogenase from a facultative
methylotropic bacterium. J. Bacteriology. 135 (1): 251 – 258.
Boyer, F. R. 1993. Modern experimental biochemistry. The Benjamin
Cummings Publishing Company. Brooks/Cole. Canada.xxv+626 hlm.
55

86
Cornett, J. B. & G. D. Shockman. 1978. Cellular lysis of Streptococcus
faecalis induced with Triton X-100. J. Bacteriology. 135 (1): 153 – 160.
Dokter, P., J. Frank & J. A. Duine. 1986. Purification and characterization of
L.M.D. 79.41. Biochem. J. 239: 163-167.
Elias, M. D., M. Tanaka, H. Izu, K. Matsushita, O. Adachi & M. Yamada.
2004. Functions of amino acid residues in the active site of
Escherichiacoli pyrroloquinoline quinone-containing quinoprotein
glucose dehydrogenase Journal Biol. Chem. 275: 7321-7326.
Geerlof, A., J. A. Jongejan, T. J. G. M. van Dooren, P. C.Racemakers-
Franken, W. J. J. Tweel & J. A. Duine. 1994. Factors relevant to the
production of (R)-(1)-glycidol (2,3-epoxy-1-propanol) from racemic
glycidolby enantioselective oxidation with Acetobacter pasteurianus
ATCC 12874. Enzyme. Microb. Technol. 16:1059–1063.
systems. Annu.Rev. Ecol.Syst. 29: 503 -54.
Groen, B.W., Frank, J. & J.A. Duine. 1984. Quinoprotein alcohol
dehydrogense from ethanol-grown Pseudomonas aueruginosa.
Biochem. J. 2234: 921-924.
Groen, B.W., M. van Kleef & J.A. Duine. 1986. Quinohaemoprotein alcohol
dehydrogense apoenzyme from Pseudomonas testosteroni. Biochem.
J. 234: 611-615.

87
Gumaste, U. R., M. M. Joshi, D. T. Mourya, P. V. Barde, G. K. Shrivastav &
V. S. Ghloe. 2005. Alcohol dehydrogenase: A potential new marker for
diagnosis of intestinal ischemia using rat as a model. World J. Gastro.
11(6): 912-916.
Kasahara, T. & T. Kato. 2003. A new redox-cofactor vitamin for mammals,
Khodijah, S. 2003. Pola elektroforesis protein globulin 7S dan 11S dari
kacang komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Skripsi. Fakultas
Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor: xi+76 hlm.
Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of
the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680–685.
Lehninger, A. J. 1982. Basics of Biochemistry I. 8th ed. McGraw Hill, New
York: x+306 hlm.
Madigan, M. T., J. M. Martinko & J. Parker. 2000. Biology of Microorganisms.
9th ed. Prentice Hall international, Inc, New Jersey: xix +991 hlm.
Magnusson, O. T., H.Toyama, M. Saeki, A. Rojas, J. C. Reed, R. Liddington,
J. P. Klinman & R. Schwarzenbacher. 2004. Quinone biogenesis
structure and mechanism of PqqC, the final catalyst in the production
of pyrroloquinoline quinone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 7913–
7918.

88
Matsushita, K., J. C.Arents, R. Bader, M. Yamada, O. Adachi & P. W.
Postma. 1997. Escherichia coli is unable to produce pyrroloquinoline
quinine (PQQ). Microbiol. 143: 3149-3156.
Moat, A., J. W. Foster & M. P. Spector. 2002. Microbial Physiology. 4ed.
Wiley-Liss, New York: xviii+715 hlm.
Oubrie, A., J. R. Henriette, H.K.Kor, J. J. O. Arjen, J. A. Duine & Bauke W.
D.1999. The 1.7 Å crystal structure of the apo form of the soluble
reveals a novel internal conserved sequence repeat. EMBO Journal.
18 (19): 5187-5194.
Oubrie, A., H. J. Rozeboom & B. W. Dijkstra. 1999. Active-site structure of the
soluble quinoprotein glucose dehydrogenase complexed with
methylhydrazine: A covalent cofactor-inhibitor complex. Proc Natl Acad
Sci USA 96: 11787–11791.
Pelczar, J. M., R. D. Reid & E. C. S. Chan. 1988. Microbiology. 5th ed.
McGraw-Hill, New York: 951 hlm.
Protocols online, www.protocols-online.com. 14 Februari 2008.
Pukul: 16.00 WIB.
Scopes, 1998. Protein Purification, Principles and Practice, Springer
Advanced Texts in Chemistry. Springer Verlag, New York Inc. 201 hlm.
Sode, K., T. Ootera, M. Shirahane, A. B. Witarto, S. Igarashi & H. Yoshida.
2000. Increasing the thermal stability of the water-soluble

89
pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase by single amino acid
replacement. Enzyme. Microb.Tech. 26: 491–496.
Suhartono, M. T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Pusat Antar Universitas
Bioteknologi, IPB. Bogor: 322 hlm.
Sulter, G. J. V. D. Klei, J. P. Schanstra, W. Harder & M. Veenhuis. Ethanol
metabolism in a peroxisome-deficient mutant of the yeast Hansenula
polymorpha. FEMS Microbiol. Lett. 82: 297 – 302.
Tanaka, S., S. Igarashi, S. Ferri & K.Sode. 2005. Increasing stability of water-
soluble PQQ glucose dehydrogenase by increasing hydrophobic
interaction at dimeric interface. BMC Biochem. 6: 141-147.
Todar, K. 2007. Todar’s Online Textbook of Bacteriology. www.uwm.edu. 17
Februari 2008. Pukul 13.58 WIB.
Toyama, H., F. Akiko, K. Matsushita, S. Emiko, M. Asahi. & O.Adachi.1995.
Three distinct quinoprotein alcohol dehydrogenases are expressed
when Pseudomonas putida is grown on different alcohols. J.
Bacteriology. 177(9): 2442-2450.
Unemoto, T. & R.A. Macleod. 1975. Capacity of the outer membrane of a
gram-negative marine bacterium in the presence of cations to prevent
lysis by Triton X-100. J. Bacteriology. 121: 800-806.
Van Ophem, P.W., G.J.W. Euvrink, L. Dijkhuizen & J.A. Duine. 1991. A novel
dye linked alcohol dehydrogenase activity present in some Gram-
positive bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 80: 57-64.

90
Westermeier, R. 2004. Electrophoresis in Practice.4 ed. Willey-VCH,
Weinheim: XX + 406 hlm.
Witarto, A.B. 1997. From bench to business: The story of glucose sensor.
JISTECS. 10: 20-28.
Wollenberger, U. & B. Neumann. 1997. Quinoprotein glucose dehydrogenase
modified carbon paste electrode for the detection of phenolic
compounds. Electroanalysis. 9: 366–371.
Yuhashi, N., M. Tomiyama, J. Okuda, S. Igarashi, K. Ikebukuro & K. Sode.
Biosensor . Bioelec. 20: 2145–2150.

DAFTAR ACUAN
Adamowicz, M., T. Conway, & K. W. Nickerson. 1991. Nutritional
complementation of oxidative glucose metabolism in Escherichia coli via
Pyrroloquinoline Quinone-dependent glucose dehydrogenase and the
Entner-Doudoroff pathway . App. Env. Micro. 57: 2012-2015.
Ameyama, M., E. Shinagawa, K. Matsushita, & O. Adachi. 1981. Glucose
dehydrogenase of Gluconobacter suboxydans: Solubilization, purification
and characterization. Agric. Biol. Chem. 45(4): 851-861.
Anthony, C. 1996. Quinoprotein-catalysed reactions. Biochem.J. 320 : 697-671.
Avezoux, A., M. G. Goodwin & C. Anthony. 1995. The role of the novel disulphide
ring in the active site of the quinoprotein methanol dehydrogenase from
Methylobacterium extorquens. Biochem. J. 307: 735-741.
Belliom, E. & G.T. Wu. 1978. Alcohol dehydrogenase from a facultative
methylotropic bacterium.J. Bacteriology. 135 (1) : 251 – 258.
Cappucino & Sherman. 2002. Microbiology. A Laboratory Manual. Benjamin
Cumming Publishing Company,Inc.. New York : xvii+491 hlm.
Christoserdova, L., S. Chen, A. Lapidus & Mary E. Lidstrom. 2003. Methylotrophy
in Methylobacterium extorquens AM1 from a Genomic Point of View. J.
Bacteriology. 23: 2980-2987.
Coates, J.D., K. A. Cole, R. Chakraborty, S. M. O;Connor & L. A. Achenbach.
2002. Diversity and ubiquity of bacteria capable of utilizing humic
99

100
substances as electron donors for anaerobic respiration. Amec. Soc.
Microb. 68(5): 2445-2452.
Cornett , J.B. & G.D. Shockman. 1978. Cellular lysis of Streptococcus faecalis
induced with Triton X-100. Journal of Bacteriology. 135(1) : 153 – 160.
De Wever, A., K. Muylaert, K. Van der Gucht, S. Pirlot, C. Cocqyut, J. Descy, P.
Plisnier, & Wim V. 2005. Bacterial community composition in Lake
Tanganyika: vertical and horizontal heterogeneity. App. Env. Microb. 71 (9):
5029-5037.
Dokter, P., J. Frank & J.A. Duine. 1986. Purification and characterization of
L.M.D. 79.41. Biochem.J. 239: 163-167.
Doronina, N.V., Y. A. Trotsenko, B. B.Kuznetov, T. P. Tourova & M. S. S. Salonen,
, 2002. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium
lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic
bacteria. Int. Journal Sys. Evol. Biol. 52: 773-776.
Duine, J.A. & J. Frank. 1980. Studies on methanol dehydrogenase from
Hypomichrobium X. Biochem.J. 187: 213 -219.
systems. Annu.Rev. Ecol. Syst. 29: 503 -54.
Groen, B.W., M. van Kleef & J. A. Duine. 1986. Quinohaemoprotein alcohol
dehydrogense apoenzyme from Pseudomonas testosteroni. Biochem. J.
234: 611-615.

101
Hiorns, W. D., B. A. Methe, S. A. Nierzwicki-Bauer & J. P. Zehr.,1997. Bacterial
diversity in Adirondack Mountain Lakes as revealed by 16S rRNA gene
sequences. Appl. Env. Microbiology. 63(7): 2957-2960.
Hommes, R. W. J., P. W. Postma, 0. M. Neyssel, D. W.Tempest, P. Dokter, & J. A.
Duine. 1984. Evidence of a quinoprotein glucose dehydrogenase
apoenzyme in several strains of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 24:
329-333.
Kasahara, T. & T.Kato. 2003. A new redox-cofactor vitamin for mammals,
Khodijah, S. 2003. Pola elektroforesis protein globulin 7S dan 11S dari kacang
komak (Lablab purpureus (L.) sweet). Skripsi Fakultas Teknologi Pertanian.
Institut Pertanian Bogor: xi+76 hlm.
Laemmli, U. K. 1976. Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature. 227:680–685.
Lampel, K.A., K. Uratani, G. R. Chaudry, R. F. Ramaley & S. Rudikoff. 1986.
Characterization of the developmentally regulated Bacillus subtilis glucose
dehydrogenase gene. J. Bacteriology. 166: 238-243.
Laurinavicius, V., J. Razumiene, B. Kurtinaitiene, V. Gureviciene, L.
Marcinkeviciene & I. Bachmatova. 2003. Comparative characterization of
soluble and membrane-bound PQQ-glucose dehydrogenase. Biologija. 2:
441-450.

102
Lehninger , A. J. 1982. Basics of Biochemistry I. 8th ed. McGraw Hill, New York :
x+306 hlm.
Oubrie, A. & B.W. Dijkstra. 2000. Structural requirements of pyrroloquinoline
quinone dependent. Prot. Sci. 9: 1265 -1273.
Oubrie, A., J. R. Henriette, H. K. Kor Arjen, J. A.Duine. & Bauke W. D.1999. The
1.7 Ȃ crystal structure of the apo form of the soluble quinoprotein glucose
dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus reveals a novel internal
conserved sequence repeat. EMBO Journal. 18 (19): 5187-5194.
Prihantini, N.B. 2003. Mikroalga di Perairan Kampus UI Depok. Prosiding. Pusat
Penelitian Limnologi LIPI hal 245-253.
Ronila. 2005. Peralihfungsian wilayah perairan di daerah Jawa Barat. Skripsi.
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB, Bogor.
Schulten, H. R., B. Plage & M. Schnitzer. 1991. A chemical structure for humic
substances. Naturwissenschaften .78: 311–312.
Scopes, 1998. Protein Purification, Principles and Practice, Springer Advanced
Texts in Chemistry. Springer Verlag, New York Inc. 201 hlm.
Skoog, A., B. Biddanda & R. Benner. 1999. Bacterial utilization of dissolved
glucose in the upper water column of the Gulf of Mexico. Amec. Soc. Limnol
Ocean. 44(7): 1625-1633.
Toyama H., W. Soemphol, D. Moonmangmee, O. Adachi & K. Matsushita. 2005.
Molecular properties of Membran-bound FAD-containing sorbytol

103
dehydrogenase from thermotolerant Gluconobacter frateurii isolated from
Thailand. Biosci. Biotech. Biochem. 69(6):1120-1129.
Toyama, H., F. Akiko, K. Matsushita, S. Emiko, M. Asahi & O. Adachi.1995. Three
distinct quinoprotein alcohol dehydrogenases are expressed when
Pseudomonas putida is grown on different alcohols. J. Bacteriology. 177(9):
2442-2450.
Van Ophem, P.W., G.J.W. Euvrink, L. Dijkhuizen, J.A. Duine. 1991. A novel dye
linked alcohol dehydrogenase activity present in some gram- positive
bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 80: 57-64.
Westermeier, R. 2004. Electrophoresis in Practice.4 ed. Willey-VCH, Weinheim :
XX + 406 hlm.
Yuhashi, N., M. Tomiyama, J. Okuda, S. Igarashi, K. Ikebukuro & K. Sode.
Biosensors and Bioelectron. 20: 2145–2150.
Zu, Z., C. Momeu, M. Zakhartsev & U. Schwaneberg. 2006. Making glucose
oxidase fit for biofuel cell applications by directed protein evolution.
Biosensors and Bioelectron. 21: 2046–2051.
Zwart, G., E. Van Hannen, M. P. Agterveld, K. Van der Gucht, E. S. Lindstrorm,
J.V. Wichelen, T. Lauridsen, B. C. Crump, S. Han & Steven D. 2003. Rapid
screening for freshwater bacterial groups by using reverse line blot
hybridization. App. Env. Microbiol.69 (10): 5875-5883.

LAMPIRAN

105
Lampiran I. 1. Tabel Pembuatan larutan stok sumber karbon dan antibiotik.
No Larutan Stok Cara Pembuatan
Glukosa 10% w/v dibuat dengan melarutkan 10 g

Larutan stok glukosa dan ke dalam akuades hingga volume
1 glukosa 10% w/v
larutan 100 mL. Larutan disterilkan menggunakan
membran nitroselulosa asetat berpori 0,2 µm.
Etanol 10% v/v dibuat dengan melarutkan 10,5 mL
Larutan stok etanol etanol ke dalam akuades hingga volume larutan100
2 10% v/v
mL. Larutan disterilkan menggunakan membran
nitroselulosa asetat berpori 0,2 µm.
Metanol 10% v/v dibuat dengan melarutkan 10,5 mL
Larutan stok metanol ke dalam akuades hingga volume
3 metanol 10% v/v
larutan100 mL. Larutan disterilkan menggunakan
Rose Bengal 0,3 g/mL dibuat dengan melarutkan
0,3 g Rose Bengal ke dalam akuades hingga volume
4 Larutan Rose
Bengal 0,3 g/mL larutan100 mL. Larutan disterilkan menggunakan
Sikloheksimida 10 mg/mL dibuat dengan melarutkan
0.01 g sikloheksimida ke dalam akuades hingga
Larutan
5 sikloheksimida 10 volume larutan100 mL. Larutan disterilkan
mg/mLl menggunakan membran nitroselulosa asetat berpori
0,2 µm.

106
Lampiran I. 2. Skema pengerjaan sampel air dengan metode

pengenceran berdasarkan Cappucino dan Sherman, 2002.
1 mL 1 mL
ml
9 mL
akuades
Vortex
steril
Vortex Vortex
0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL Spatel Drygalski
Sampel air Dibuat

situ 200 0 -1 -2 tiga
10 10 10 ulangan
mL
Medium seleksi Toyama et al. (1995)
Selanjutnya
digunakan Inkubasi pada suhu 250 C selama 72
untuk metode jam
penyaringan Isolasi dilakukan
pada interval
24 jam
Lampiran I.3. Skema pengerjaan sampel air menggunakan

metode penyaringan dengan kertas saring berdasarkan
Cappucino dan Sherman, 2002.
250 mL
Kertas Saring
Whatman
No.41
Filtrat
Sampel sisa 1
pengerjaan dengan
metode
pengenceran,
Lampiran I.3 Medium seleksi Toyama et al, (1995)
Isolasi dilakukan
pada interval
24 jam
0
Inkubasi pada suhu ruang (27 C)
selama 120 jam

107
Lampiran I. 4. Skema pengerjaan sampel air menggunakan

metode penyaringan dengan membran Milipore
berdasarkan Cappucino dan Sherman, 2002.
Buchner funnel
Membran Milipore
0,2 μm
Pompa
vakum
Filtrat 1 sisa
penyaringan
dengan kertas Medium seleksi
saring, Toyama et al. (1995)
Lampiran I.3
0
Inkubasi pada suhu ruang (27 C) selama 120 jam
Isolasi dilakukan pada

interval 24 jam
Iso
lasi
Lampiran I. 5. Skema pengerjaan isolasi bakteri menggunakan

metode Spot Plate berdasarkan Musfira, 2005.
Medium seleksi Toyama et al.

(1995) diberi garis kotak pada
bagian bawah dan diberi nomor
Isolat hasil inkubasi
Metode Pengenceran
Tusuk gigi
steril
-2
10
0
10
-1 10
Metode Penyaringan
Kertas saring Membran

Whatman No.41 milipore 0.2 µm
0
Inkubasi suhu ruang (27 C)selama 24 jam
Isolat yang tumbuh kemudian dimurnikan dengan

metode gores empat kuadran

108
Lampiran I.6. Tabel Pembuatan Bufer dan Larutan untuk Native-PAGE
Larutan stok akrilamid 30 % dibuat dengan melarutkan

Larutan stok 28,2 g akrilamid dan 0,8 g n,n,metilen-bis-akrilamid
1 akrilamid 30% dengan akuades hingga volume akhir larutan menjadi
100 mL. Larutan disimpan di wadah gelap pada suhu
40 C.
Larutan Amonium Larutan APS dibuat dengan melarutkan 0,45 g APS
2 Peroksi Disulfat dengan akuades hingga volume akhir 50 mL.
(APS) 0,9% Kemudian dibuat aliquot sebanyak 2 mL dan disimpan
pada suhu -200 C.
Larutan Larutan BB dibuat dengan melarutkan 1 mg BB ke
3 Bromphenol Blue dalam akuades hingga volume akhir larutan menjadi
(BB) 1% 10 mL. Larutan diaduk hingga homogen.
Larutan gliserol Gliserol 50 % dibuat dengan mencampurkan 32 mL
4 50% gliserol 80% dengan 18 mL akuades. Campuran
diaduk hingga homogen.
Bufer Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 dibuat dengan melarutkan
6 g Tris-base ke dalam 80 mL akuades. Selanjutnya
5 Bufer Tris-HCl pH larutan disesuaikan menjadi 6,8 dengan
0,5 M pH 6,8 menambahkan HCl 1 Nmenggunakan pH meter.
Kemudian volume larutan ditambahi akuades hingga
volume total 100 mL dan disimpan pada suhu 40 C.
18,15 g Tris-base ke dalam 80 ml akuades.
Selanjutnya pH larutan disesuaikan menjadi 8,8
6 Bufer Tris-HCl dengan menambahkan HCl 1 N menggunakan pH
1,5 M pH 8,8
meter. Kemudian volume larutan ditambahi akuades
hingga volume total 100 mL dan disimpan pada suhu
40 C.
Bufer Native PAGE 5x dibuat dengan melarutkan 15 g
Bufer Native-PAGE Tris base, dan 72 gram glisin ke dalam 900 mL
5x akuades. Selanjutnya pH bufer disesuaikan menjadi
7
8,3 menggunakan pH meter dengan menambahkan
HCl 1 N, kemudian volume campuran ditambahi
akuades hingga volume total bufer 1 L.

109
Lampiran I. 6. Tabel Pembuatan Bufer dan Larutan untuk Native-PAGE

(lanjutan)
Pemakaian bufer dilakukan dengan cara

mencampurkan 200 mL stok bufer 5x dengan 800 mL
akuades sehingga diperoleh bufer Native-PAGE 1X.
Bufer Native-PAGE disimpan pada suhu 40C.
Bufer sampel dibuat dengan mencampurkan 0,6 mL

Bufer sampel 5x Tris HCl pH 6,8, gliserol stok 50% 5 mL, dan 1mL 1 %
8
BB. Kemudian larutan ditambahi akuades
hingga volume akhir menjadi 10 mL.
Resolving buffer dibuat dengan cara mencampurkan
10 mLl Tris HCl pH 8,8 1,5 M dengan 12,4 mL
9 Resolving Buffer akuades. Selanjutnya campuran disimpan pada suhu
-200C.
Stacking buffer dibuat dengan cara mencampurkan

Stacking buffer 8 mL Tris HCl pH 6,8 0,5 M dengan 12 mL akuades.
10
Selanjutnya campuran disimpan pada suhu -200 C.
Larutan pewarna substrat dibuat dengan cara

mencampurkan 10 mL bufer MOPS 10 mM pH 7,
30 µL PMS 600 mM, 160 µL NBT 10 mg/mL dan 6 mL
Larutan pewarna
11 glukosa 2 M untuk pewarna glukosa dehidrogenase
substrat
dan 140 µL etanol 96 %, untuk pewarna etanol
dehidrogenase, dan 250 µL metanol 96 %, untuk
pewarna metanol dehidrogenase,
Larutan pewarna protein dibuat dengan cara

Larutan pewarna mencampurkan 500 mL metanol, 100 mL asam asetat
protein glasial dan melarutkan 0,5 g CBB. Selanjutnya
12
larutan ditambahi akuades hingga volume akhir
menjadi 1 L. Larutan pewarna protein disimpan dalam
wadah gelap.
Larutan pencuci gel dibuat dengan mencampurkan

250 mLmetanol, 70 mL asam asetat glasial dan 680
13 Larutan pencuci
gel mL akuades. Larutan pencuci gel disimpan dalam
wadah

110
Lampiran I. 6. Tabel Pembuatan Bufer dan Larutan untuk Native-PAGE

(lanjutan)
Resolving gel dibuat dengan cara mencampurkan

7 mL resolving buffer, 2 mL larutan stok akrilamid
30 %, 1 mL larutan stok APS 0.9 % dan 10 μL
TEMED. Campuran kemudian dihomogenkan
kemudian dituang ke dalam pelat kaca pencetak gel.
Alkohol teknis disemprotkan pada permukaan gel
14 Resolving gel
yang telah dicetak guna menghindari masuknya
kotoran ke dalam gel selama pembuatan gel
berlangsung. Gel dibiarkan mengeras selama .
kurang lebih 10 menit. Bila gel telah mengeras
alkohol dibuang dan dibilas dengan akuades lalu
dikeringkan dengan kertas saring.
Stacking gel dibuat dengan cara mencampurkan 2 mL

stacking buffer, 0,5 mL larutan stok akrilamid 30 %,
0,3 mL larutan stok APS 0,9 % dan 4 μL TEMED.
Campuran tersebut dihomogenkan, dan dituang di
15 Stacking gel atas resolving gel yang telah mengeras. Selanjutnya
dimasukkan sisir pembentuk sumur di atas stacking
gel. Bila campuran telah menjadi gel, sisir dilepas,
dan gel masuk ke dalam perangkat elektroforesis

111
Lampiran I.7. Tabel Pembuatan Bufer dan Larutan untuk SDS-PAGE

Larutan stok Larutan stok akrilamid 30 % dibuat dengan melarutkan
akrilamid 30% 28,2 g akrilamid dan 0,8 g n,n,metilen-bis-akrilamid
dengan akuades hingga volume akhir larutan menjadi
1
100 mL. Larutan disimpan di wadah gelap pada suhu
40 C.
Larutan Amonium Larutan APS dibuat dengan melarutkan 0,45 g APS

Peroksi Disulfat dengan akuades hingga volume akhir 50 mL.
2 (APS) 0,9% Kemudian dibuat aliquot sebanyak 2 mL dan disimpan
pada suhu -20 0 C.
Larutan Larutan BB dibuat dengan melarutkan 1 mg BB ke

Bromphenol Blue dalam akuades hingga volume akhir larutan menjadi
3
(BB) 1% 10 mL. Larutan diaduk hingga homogen.
Gliserol 50 % dibuat dengan mencampurkan 32 mL

Larutan gliserol
gliserol 80% dengan 18 mL akuades. Campuran
4 50%
diaduk hingga homogen.

6 g Tris-base ke dalam 80 mL akuades. Selanjutnya
Bufer Tris-HCl pH larutan disesuaikan menjadi 6,8 dengan
5
0,5 M pH 6,8 menambahkan HCl 1 N menggunakan pH meter.
Kemudian volume larutan ditambahi akuades hingga
volume total 100 mL dan disimpan pada suhu 40 C.
18,15 g Tris-base ke dalam 80 ml akuades.
Selanjutnya pH larutan disesuaikan menjadi 8,8
Bufer Tris-HCl 1,5
6 dengan menambahkan HCl 1 N menggunakan pH
M pH 8,8
meter. Kemudian volume larutan ditambahi akuades
hingga volume total 100 mL dan disimpan pada suhu
40 C.
Bufer SDS PAGE 5x dibuat dengan melarutkan 15 g
Tris base, dan 72 g glisin dan 6 g SDS ke dalam 900
mL akuades. Selanjutnya pH bufer disesuaikan
Bufer SDS-PAGE
menjadi 8,3 menggunakan pH meter dengan
7 5x
menambahkan HCl 1 N, kemudian volume campuran
ditambahi akuades hingga volume total bufer 1 L.

112
Lampiran I.7. Tabel Pembuatan Bufer dan Larutan untuk SDS-PAGE

(lanjutan)
Pemakaian bufer dilakukan dengan cara

mencampurkan 200 mL stok bufer 5x dengan 800 mL
akuades sehingga diperoleh bufer SDS-PAGE 1X.
Bufer SDS-PAGE disimpan pada suhu 40C.
Bufer sampel 5x Bufer sampel dibuat dengan mencampurkan 0,6 mL

8 Tris HCl pH 6,8, gliserol stok 50% 5 mL, dan 1 mL 1%
BB. Kemudian larutan ditambahi akuades
hingga volume akhir menjadi 10 mL.
Resolving Buffer Resolving buffer dibuat dengan cara mencampurkan
9 10 mL Tris HCl pH 8,8 1,5 M, 4 mL SDS 10% dengan
12,4 mL akuades. Selanjutnya campuran disimpan
pada suhu -200C.
Stacking buffer dibuat dengan cara mencampurkan
Stacking buffer 8 mL Tris HCl pH 6,8 0,5 M, 2 mL SDS 10% dengan
10
12 mL akuades. Selanjutnya campuran disimpan pada
suhu -20 0C.
Larutan pewarna protein dibuat dengan cara
Larutan pewarna mencampurkan 500 mL metanol, 100 mL asam asetat
protein glasial dan melarutkan 0,5 g CBB. Selanjutnya
11
larutan ditambahi akuades hingga volume akhir
menjadi 1 L. Larutan pewarna protein disimpan dalam
wadah gelap.

12 Larutan pencuci
wadah

13 Larutan pencuci
wadah

113
Lampiran I.4. Tabel Pembuatan Larutan Untuk Uji Aktivitas
1 Larutan A Larutan A yang berisi bufer MOPS 20 mM pH 7 yang

mengandung 1 mM CaCl2.7.H20
Larutan B yang berisi 20 mM PMS dibuat dengan
2 Larutan B melarutkan 6,13 mg PMS ke dalam 1 mL, disimpan
pada suhu 40 C dan dilindungi dari cahaya
Larutan C yang berisi 4mM DCIP dibuat dengan cara
3 Larutan C melarutkan 1,3 mg DCIP ke dalam 1 mL akuades,
disimpan pada suhu 40 C dan dilindungi dari cahaya
4 Larutan D Larutan D yang berisi 1,2 M glukosa
5 Larutan E Larutan E yang berisi 1,2 M etanol

Isolasi Bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Isolasi Bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

ISOLASI BAKTERI DAN KARAKTERISASI PARSIAL ENZIM

OKSIDOREDUKTASE DARI SITU AGATHIS, KAMPUS UNIVERSITAS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Isolasi bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008.

Judul : Isolasi bakteri dan karakterisasi parsial

Dr. Arief Budi Witarto Dr. Wellyzar Sjamsuridzal

Ariyanti Oetari, Ph.D Dr . Wibowo Mangunwardoyo

3. Ketua Departemen Biologi 4. Ketua Program

Dr. Rer.Nat. Mufti P. Patria Dr. Adi Basukriadi

Isolasi bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008.

Alhamdulillahirobbil alamin. Penulis menyampaikan segala puji dan rasa syukur

kepada beberapa pihak antara lain :

Rekayasa Protein, Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong untuk bimbingan,

bisa memiliki kesempatan untuk melaksanakan studi dan penelitian pada

program Magister Biologi di Universitas Indonesia.

2. Ibu Dr. Wellyzar Sjamsuridzal, selaku pembimbing II yang dengan penuh

ketelitian dan kesabaran membimbing penulis dalam penyelesaian penelitian dan

penulisan tesis dalam kurun waktu yang cukup lama.

yang membangun untuk penyempurnaan tesis.

dan masukan yang diberikan kepada penulis.

5. Ibu Dr. Susiani Purbaningsih, sebagai perwakilan dari Program Pascasarjana

6. ASEA-UNINET Foundation yang memberikan bantuan finansial, sehingga

penulis dapat menyelesaikan studi di Departemen Biologi UI.

Isolasi bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008.

7. Nina Maryana dan Dwi Pangestu atas bantuannya selama penelitian di

Laboratorium Rekayasa Protein.

8. Rekan-rekan sesama mahasiswa pascasarjana Biologi angkatan 2005, Ibu

Depok, Juli 2008

Isolasi bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008.

DAFTAR ISI ....................................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ ix

DAFTAR TABEL ................................................................................................ x

PENGANTAR PARIPURNA ............................................................................... 1

MAKALAH I ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM OKSIDOREDUKTASE

MAKALAH II KARAKTERISASI ENZIM OKSIDOREDUKTASE DARI SITU

DISKUSI PARIPURNA ....................................................................................... 91

RANGKUMAN KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 97

DAFTAR ACUAN ............................................................................................... 99

Isolasi bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008.

Title : ISOLATION OF OXYDOREDUCTASE-PRODUCING

Oxydoreductases are enzymes which catalyze oxidation-reduction

reaction of their corresponding substrates. Oxydoreductase enzymes from

many microorganisms had become major focus of research during last

biotransformation and biofuel (Zu et al. 2006). In the field of biosensor,

glucose dehydrogenase application as self-blood glucose monitoring had

evolved through several generation to enhance its sensitivity and specificity

(Witarto et al. 1997).

Oxydoreductase involve cofactor in their active sites. According to

Anthony (1996) among several known cofactors such nicotinamide, flavonoid,

and quinone, Pyrollo Quinoline Qinone (PQQ) as the member group of

ubiquitously found in all organisms from prokaryote to eukaryote (Bishop et

Isolasi bakteri..., Suwarti, FMIPA UI, 2008.

Bacteria is the largest group of PQQ-oxydoreductase producing

microorganisms. They successfully isolated from many habitats such: soil,

mouth (Anesti et al. 2005). However, study on PQQ-oxydoreductase

producing bacteria isolation had never been reported in Indonesia.

PQQ-Oxydoreductase bacteria are able to utilize organic substrates

such glucose, ethanol, methanol, up to polyvinyl alcohol (Ameyama et al.

Agathis located in University of Indonesia Depok. Situ Agathis contain humic

substances that could be degraded in to glucose, ethanol, methanol, also

In this study, isolation of oxydoreductase-producing bacteria from

Situ Agathis University of Indonesia, Depok and characterization of

oxydroreductases of selected isolates were performed. The objectives of this