Penentuan Kadar

Protein dengan FPLC

dan Spektrofotometri
Laboratorium Biokimia (BIO 114 & BTP 122)

Jumat, 9 & 16 April 2021

Pricylia & Daniel

Laboratorium Biokimia 2021

Fakultas Teknobiologi
Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya
Tujuan Praktikum
Menganalisis kadar
Menganalisis data protein di sampel
kromatogram fraksi menggunakan
protein yang didapat spektrofotometri

01 02 03 04

Memahami pemisahan Memahami prinsip,

protein dengan FPLC metode, dan
berdasarkan karakteristik aplikasi Lowry dan
proteinnya metode Bradford
Apa saja yaa yang akan dibahas?

01
Penjelasan
Materi Praktikum 02 Prosedur Kerja

03 Penjelasan Laporan
04 Tanya Jawab
 01
Penjelasan
Materi Praktikum
 Protein
Merupakan kumpulan dari beberapa jenis asam
amino yang membentuk polimer melalui ikatan
peptida.
Fungsi protein:
- Reseptor
- Transpor senyawa
- Enzim
Jenis protein:
- Integral
- Periferal
- Amphitrophic
 Bradford Lowry
Pewarna Coomasie Briliant Blue Biuret: CuSO4
(CBB G-250) Folin Ciocalteu: Fosfotungstat dan
Fosfomolibdat
Sensitivitas 1-20 µg Sensitivitas 1-5 µg

Senyawa penganggu: Senyawa penganggu:

Amonium Sulfat Sodium Dodesil Sulfat (SDS)
Glisin (>0,5%) Triton X-100
Merkaptan
Panjang gelombang: 595 nm Panjang gelombang: 650 nm
Spektrofotometri
Infinite M200 Pro
Prinsip
Didasarkan hukum Lambert-Beer
Absorbansi tinggi, konsentrasi tinggi
Absorbansi rendah, konsentrasi
rendah

Panjang gelombang :
280-850 nm
 FPLC
Fast Protein Liquid Chromatography

Prinsip
Pemisahan berdasarkan afinitas substansi dengan
kolom
Fase FPLC:
1. Fase gerak (mobile phase): buffer
2. Fase diam (stationary phase): kolom
Pemisahan FPLC berdasarkan
karakteristik proteinnya:
1. Ion exchange (kation dan anion)
2. Reverse phase
3. Hydrophobic interaction
4. Size exclusion
5. Affinity
6. Chromatofocusing
FPLC
Fast Protein Liquid Chromatography

Reverse phase & hydrophobic interaction

FPLC
Fast Protein Liquid Chromatography

Size exclusion
FPLC
Fast Protein Liquid Chromatography

Affinity
FPLC
Fast Protein Liquid Chromatography

Chromatofocusing
FPLC.cont
Fast Protein Liquid Chromatography

Tahapan proses pemurnian protein dengan FPLC

FPLC.cont
Fast Protein Liquid Chromatography

Tahapan proses pemurnian protein dengan FPLC

FPLC.cont
Fast Protein Liquid Chromatography

ION EXCHANGE

Cation exchange Anion exchange

Kolom Penukar
Ion
DEAE FF (Anion
Exchange) CM FF (Cation Exchange)
Fraction Collector

FRAC-950
yang digunakan
dalam lab
 02
Prosedur
Kerja
 Larutan sampel protein dengan konsentrasi 10% b/v disediakan dalam buffer fosfat
50 mM pH 7,0.

Larutan sampel disaring menggunakan mikrofilter 0,45 nm, lalu hasil saringan
dimasukkan ke dalam tabung vial.

Sample 10% b/v +

buffer phosphate
50 mM pH 7,0

FPLC
 @

Perangkat FPLC diset dengan kondisi volume loading sampel 1 mL, laju alir 1
mL/menit, dan elusi gradien.

Sampel diinjeksikan ke dalam kolom penukar ion HiTrap DEAE FF untuk penukar anion
atau CM FF untuk penukar kation, dan dipastikan tidak ada gelembung.

FPLC
 @

Kolom kromatografi diekuilibrasi dengan menggunakan buffer fosfat 50 mM pH 7,0.

Elusi sampel dilakukan dengan menggunakan gradien NaCl 0,5 M dalam akuades.

Setiap fraksi eluat dikumpulkan sebanyak 1 mL dalam fraction collector.

Data kromatogram dianalisis, lalu setiap fraksi diuji menggunakan metode Lowry dan
Bradford

FPLC
 JANGAN
LUPA
1 mg/mL BSA: 0,8 mg/mL BSA: 0,6 mg/mL BSA:
2,5 mL BSA 2 mL BSA 1,5 mL BSA SEMUA
0 mL akuades 0,5 mL akuades 1 mL akuades
TABUNG
DI ALUFO
TERLEBIH
DAHULU!!

0,4 mg/mL BSA: 0,2 mg/mL BSA: 0,1 mg/mL BSA:

1 mL BSA 0,5 mL BSA 0,25 mL BSA
1,5 mL akuades 2 mL akuades
Lowry
2,25 mL akuades
 1 mg/mL BSA 0,8 mg/mL BSA 0,6 mg/mL BSA 0,4 mg/mL BSA
1,2 mL 1,2 mL 1,2 mL 1,2 mL
Biuret 6 mL Biuret 6 mL Biuret 6 mL Biuret 6 mL !!ALUFO
JANGAN
DILEPAS!!

0,2 mg/mL BSA 0,1 mg/mL BSA Sampel protein Akuades 1,2 mL
1,2 mL 1,2 mL 1,2 mL Biuret 6 mL
Biuret 6 mL Biuret 6 mL Biuret 6 mL
Lowry
 Diamkan 10 menit Folin
0,3 mL pereaksi
suhu ruang
Folin Ciocalteu

Diamkan 30 menit
suhu ruang
Lowry
 MICROPLAT
E 96-WELL
DIALUFO!! 0,2 mL

650 nm

Kurva standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada sumbu Y dan konsentrasi
protein pada sumbu X, lalu konsentrasi protein dalam sampel ditentukan (mg/mL).

Lowry
 JANGAN
LUPA
1 mg/mL BSA: 0,8 mg/mL BSA: 0,6 mg/mL BSA:
2,5 mL BSA 2 mL BSA 1,5 mL BSA SEMUA
0 mL akuades 0,5 mL akuades 1 mL akuades
TABUNG
DI ALUFO
TERLEBIH
DAHULU!!

0,4 mg/mL BSA: 0,2 mg/mL BSA: 0,1 mg/mL BSA:

1 mL BSA 0,5 mL BSA 0,25 mL BSA
1,5 mL akuades 2 mL akuades
Bradford
2,25 mL akuades
 1 mg/mL BSA 0,8 mg/mL BSA 0,6 mg/mL BSA 0,4 mg/mL BSA
0,4 mL 0,4 mL 0,4 mL 0,4 mL
Bradford 8 mL Bradford 8 mL Bradford 8 mL Bradford 8 mL
!!ALUFO
JANGAN
DILEPAS!!

0,2 mg/mL BSA 0,1 mg/mL BSA Sampel protein Akuades 0,4mL
0,4 mL 0,4 mL 0,4 mL Bradford 8 mL
Bradford 8 mL Bradford 8 mL Bradford 8 mL

Bradford
 MICROPLATE
96-WELL
DIALUFO!! 0,2 mL

Diamkan 5 menit
suhu ruang

Kurva standar BSA dibuat dengan

absorbansi (A) pada sumbu Y dan
konsentrasi protein pada sumbu X, lalu
konsentrasi protein dalam sampel
ditentukan (mg/mL).

Bradford 595 nm
 Pembagian Kerja Bio
Kelompok BSA Jenis Fraksi Jenis Ekstrak Jenis Uji Jenis Kolom

1 √ A Bradford

2 √ A Lowry

3 √ B Bradford

4 √ B Lowry
DEAE
5 √ A Bradford

6 √ A Lowry

7 √ B Bradford

8 √ B Lowry
 Pembagian Kerja Pangan
Kelompok BSA Jenis Fraksi Jenis Ekstrak Jenis Uji Jenis Kolom

1 √ A Bradford

2 √ A Lowry

3 √ B Bradford

4 √ B Lowry
CM FF
5 √ A Bradford

6 √ A Lowry

7 √ B Bradford

8 √ B Lowry
WARNING!!!

● Hemat bahan!
● Kurangi berbicara
● Kerja cepat dan efisien
● Hati-hati menggunakan peralatan laboratorium
● Semua tabung yang di alufo tidak boleh terkena cahaya
lampu secara langsung
● Setelah memipet, langsung ditutup dengan alufo
● Label setiap tabung reaksi yang digunakan!
03
Laporan
Hasil
Pengamatan
Kromatogram
Gambar 1 Kromatogram
kacang kedelai 10% DEAE.
Gambar 2 Kromatogram
kacang kedelai 10% CM FF.
Gambar 3 Kromatogram
kacang hijau 10% DEAE.
Gambar 4 Kromatogram
kacang hijau 10% CM FF.
 Hasil Pengamatan
Tabel 1 Absorbansi BSA metode Bradford.
Gambar 5 Kurva standar Bradford.
Tabel 2 Absorbansi BSA metode Lowry.
Gambar 6 Kurva standar Lowry.
Tabel 3 Absorbansi fraksi kacang kedelai 10% dan kacang hijau 10% kolom DEAE metode
Bradford.
Tabel 4 Absorbansi fraksi kacang kedelai 10% dan kacang hijau 10% kolom CM FF metode
Bradford.
Tabel 5 Absorbansi sampel ekstrak kacang kedelai 10% dan kacang hijau 10% metode Bradford.
Tabel 6 Absorbansi fraksi kacang kedelai 10% dan kacang hijau 10% kolom DEAE metode
Lowry.
Tabel 7 Absorbansi fraksi kacang kedelai 10% dan kacang hijau 10% kolom CM FF metode
Lowry.
Tabel 8 Absorbansi sampel ekstrak kacang kedelai 10% dan kacang hijau 10% metode Lowry.
Hasil Pengamatan-Tabel Kurva Standar

1
 Hasil Pengamatan

Gambar 6 Kurva standar Lowry (Asisten Laboratorium Biokimia 2021).

Hasil Pengamatan-Tabel Absorbansi
Sampel
Contoh
Perhitungan
Contoh perhitungan
1 saja tiap metode
(Bradford 1,
Lowry 1)
 Pembahasan
1. Bahas hasil per sampel dan per kolom beserta hasil microplate reader!
Hubungkan dengan data di literatur, apabila tidak sesuai, bahas kesalahan!
(Clue: Pertama-tama jabarkan data kromatogram dan analisis jenis protein
berdasarkan waktu retensi dan jenis kolom yang digunakan, lalu buktikan
dengan data absorbansi dari microplate reader. Setelah itu, bandingkan hasil
kadar protein yang didapat dengan kadar protein secara teoritis).
1. Bagaimana cara agar kromatogram yang dihasilkan tidak menghasilkan noise
dan baseline drift?
2. Mengapa peak yang dihasilkan berbeda-beda?
3. Mengapa BSA digunakan sebagai kurva standar?
4. Apa saja hal yang harus diperhatikan dalam metode Lowry dan Bradford?*
5. Sebutkan dan jelaskan aplikasi sehari-hari metode Lowry dan Bradford!*
 BONUS PEMBAHASAN

1. Mengapa pada praktikum ini digunakan Coomassie

Brilliant Blue G-250, bukan Coomassie Brilliant Blue R-
250?*
TUGAS PENGGANTI BAGI YANG TIDAK
MENGIKUTI SECARA OFFLINE

Buatlah poster mengenai FPLC yang berisi tentang:

1. Prinsip kerja
2. Alat-alat FPLC beserta fungsinya
3. Aplikasi dalam studi kasus
4. Daftar pustaka

Dikerjakan secara pribadi, ukuran kertas A3, dibuat

sekreatif mungkin
 Pengumpulan

Pengumpulan laporan dan tugas pengganti dilakukan melalui

assignment Ms. Teams pada tanggal Jumat, 23 April
2021 pukul 23.59 WIB.
Format nama pengumpulan:
Laporan 4_BIO/BTP*_Kelompok X_Nama Bab
Tugas Pengganti_BIO/BTP*_Nama_Kelompok X
*Pilih salah satu
 Pengumuman
- Silahkan tentukan 2 anggota perwakilan tim yang akan
datang lebih awal (12.30 WIB) untuk melakukan alufo.
- Setiap prodi diharapkan membawa aluminium foil masing-
masing 1 gulung yang akan diberikan kepada PJ bab.
- Setiap praktikan wajib mengisi link self assesment dan
mematuhi protokol kesehatan yang ada.
- Setiap praktikan wajib membawa lab kit secara lengkap
sesuai dengan yang telah diumumkan sebelumnya.
- Bekerja dengan kondusif, kurangi berbicara, baca prosedur
terlebih dahulu sebelum praktikum
Thank
You!