1.

ACUAN
a. Maggadani, B. P., Harmita, & Lubnan, M. (2018). Validation methods for the analysis of
hydroxyproline from collagen undenatured type II collagen using high-performance
liquid chromatography fluorescence. International Journal of Applied Pharmaceutics,
10(Special Issue 1), 403–406. https://doi.org/10.22159/ijap.2018.v10s1.89

a. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Alat : KCKT SHIMADZU-LC_20AD RF 10AXL
Fasa Gerak : Natrium asetat 50 mM PH 4,15 : Asetonitril (70:30)
Flow : 0,5 mL
Volume Injeksi : 20 µL
Laju Alir : 0,5 mL/min
Waktu Analisis : 15 menit
Panjang Gelombang : Eksitasi 265 nm Emisi 320nm
Kolom : Partisil 5 ODS-3 5µm 4.6 x 250 mm

b. Pembuatan standar Hidroksiprolin ( Collactive)

Timbang masing-masing 10 mg Hidroksiprolin masukkan kedalam Labu ukur 10 mL,
tambahkan 5 mL aquadest, ultrasonic selama 15 menit, tambahakan aquadest hingga
tanda batas, kocok dan homogen kan.(1000 ppm), pipet 100 ul masukkan kedalam labu
ukur 10 mL, tambahkan aquadest hingga tanada batas, kocok dan homogenkan (10 ppm).
Pipet masing masing 200 µL, 400 µL, 600 µL, 800 µL dan 1000µL masukkan kedalam
labu ukur 10 mL cukupkan dengan aquadest hingga tanda batas, (0,2 ppm, 0,4 ppm, 0,6
ppm, 0,8 ppm dan 1ppm). Ambil 300 µL Larutan tambahkan 100 µl FMOC kemudian
votex 20 detik, tambahkan 300 µL Dapar borat dan vortek Kembali selama 20 detik.
Injek larutan kedalam alat KCKT sebanyak 20 µL
c. Preparasi Sampel
Timbang 100 mg Sampel Masukan Kedalam labu ukur 25 mL, tambahkan 2 mL HCL 1
N cukupkan dengan aquadest hingga tanda batas. Just pH menggunakan HCl 0,1 N
hingga pH 9,5. Kemudian saring. Pipet 50µL masukkan kedalam labu ukur 10 mL.
cukupkan dengan aquadest hingga tanda batas. Ambil 300µL larutan sampel tambahkan
300µL FMOC kemudian vortek 20 detik, tambahkan 300µL dapar borat vortek Kembali
selama 20 detik. Injek kedalam alaat KCKT 20 µL.

6. PERHITUNGAN
Hitung kadar Hidroksiprolin (Collactive mg/g) dalam sampel dengan menggunakan
rumus:

A spl V labu
x Cstd xFPx ( )
A std 1000
C sampel=
Bobot Sampel( g)

keterangan:
Aspl : Area sampel
Astd : Area Standar
Fp : Faktor Pengenceran
C std : Konsentrasi standar (µg/mL)