LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK RISET MIKROBIOLOGI

PEMBUATAN MEDIUM, ISOLASI BAKTERI,
DAN IDENTIFIKASI MORFOLOGI BAKTERI

RACHMADINA
2310246498

PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIS

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS RIAU
PEKANBARU
2023
A. LANDASAN TEORI
 Untuk menegakkan diagnosis suatu penyakit infeksi, mikroorganisme harus
ditumbuhkan (kultur) di laboratorium. Untuk membudidayakan atau membiakkan
mikroorganisme, sampel yang disebut inokulum dipaparkan dengan berbagai nutrisi yang
terdapat pada suatu media. Mikroorganisme yang tumbuh dari inokulum disebut juga kultur;
dengan demikian, kultur disebut juga sebuah tindakan membudidayakan mikroorganisme
atau mikroorganisme yang dibudidayakan (1).
Kultur dapat ditumbuhkan pada media cair yang disebut kaldu atau pada permukaan
media padat. Mikroba dalam media cair dapat dilihat sebagai kekeruhan (juga dikenal sebagai
kekeruhan), sedimen, sampah, atau warna. Kultur yang terlihat pada permukaan media padat
disebut koloni. Koloni adalah kumpulan sel dalam jumlah besar. Koloni bakteri dan jamur
sering kali memiliki ciri khas—termasuk warna, ukuran, bentuk, ketinggian, tekstur, dan
tampilan tepi (tepi) koloni yang secara keseluruhan membantu mengidentifikasi spesies
mikroba yang membentuk koloni tersebut (1,2).
Ahli mikrobiologi memperoleh inokula dari berbagai sumber. Spesimen lingkungan
diambil dari sumber seperti kolam, sungai, tanah, dan udara. Spesimen klinis diambil dari
pasien dan ditangani sedemikian rupa sehingga memudahkan pemeriksaan mikroorganisme
atau pengujian keberadaannya. Sumber inokula lainnya adalah kultur yang awalnya
ditumbuhkan dari spesimen lingkungan atau klinis dan disimpan di laboratorium (1).
Dalam memanipulasi, menumbuhkan, memeriksa, dan mengkarakterisasi
mikroorganisme di laboratorium digunakan teknik lima “I”, yaitu Inokulasi, Inkubasi, Isolasi,
Inspeksi, Identifikasi. Meskipun saat ini dengan kemajuan dalam teknik molekuler, teknik
lima “I” tidak lagi diperlukan dalam semua kasus (misalnya, identifikasi mikroorganisme
dapat dilakukan tanpa menumbuhkannya), tetapi ada banyak hal yang dilakukan oleh ahli
mikrobiologi dan peneliti klinis terhadap mikroba yang memerlukan teknik lima “I” ini (2).
Inokulasi adalah memasukkan sebagian kecil sampel (inokulum) ke dalam suatu media
yang sudah berisi nutrisi yang diperlukan bakteri untuk tumbuh. Untuk menghindari
masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan ke dalam media, instrumen apa pun yang
digunakan untuk mengambil dan memindahkan sampel harus steril. Media yang diinokulasi
kemudian diinkubasi dalam kondisi yang sesuai, dan pertumbuhan yang dihasilkan pada
media ini disebut kultur (2).
Proses inkubasi merupakan penempatan media yang telah diinokulasikan dengan
specimen ke dalam ruang dengan suhu terkontrol (inkubator) untuk mendorong pertumbuhan
bakteri. Meskipun beberapa mikroba tumbuh optimal pada suhu mulai dari beku hingga
mendidih, suhu yang biasa digunakan dalam pertumbuhan laboratorium berkisar antara 20°C
dan 45°C. Inkubator juga dapat mengontrol kandungan gas atmosfer seperti oksigen dan
karbon dioksida yang mungkin diperlukan untuk pertumbuhan mikroba tertentu. Selama
masa inkubasi (mulai dari satu hari hingga beberapa minggu), mikroba berkembang biak dan
menghasilkan pertumbuhan yang terlihat oleh mata (2).
Berbagai media tersedia untuk kultur mikrobiologi, kebanyakan media tersedia dari
sumber komersial dan berbentuk bubuk yang hanya memerlukan penambahan air untuk
membuat kaldu. Dengan menambahkan 1,5% agar ke dalam kaldu, maka dapat dibuat media
agar. Media agar digunakan karena beberapa alasan, yaitu : (1)
1. Kebanyakan mikroba tidak dapat mencerna agar-agar, oleh karena itu, media agar
tetap padat meskipun terdapat bakteri dan jamur yang tumbuh di dalamnya.
2. Agar-agar bubuk larut dalam air pada suhu 100°C, suhu di mana sebagian besar
nutrisi tidak akan rusak.
3. Agar-agar membeku pada suhu di bawah 40°C, sehingga nutrisi steril dan sensitif
terhadap suhu seperti vitamin dan darah dapat ditambahkan tanpa merusak agar-agar
yang didinginkan sebelum membeku. Selanjutnya, agar cairan pendingin dapat
dituangkan ke sebagian besar sel bakteri tanpa merusaknya. Teknik yang terakhir
berperan dalam teknik isolasi pour-plate.
4. Agar padat tidak meleleh di bawah 100°C; dengan demikian, agar dapat digunakan
untuk membiakkan beberapa mikroorganisme hipertermofil.
Teknik yang digunakan dan jenis media yang dipilih bergantung pada kebutuhan petugas
dalam menginvestigasi bakteri. Secara umum, ada tiga situasi yang menjadi bahan
pertimbangan, yaitu: (1) Untuk mengamplifikasi klon bakteri tertentu dengan tujuan
meningkatkan jumlah produk yang diinginkan (misalnya, asam nukleat atau protein); (2)
Untuk menentukan jumlah dan jenis organisme yang ada dalam suatu spesimen; atau (3)
Untuk mengisolasi jenis mikroorganisme tertentu dari sumber alami (3).
Medium buatan (medium mati) dapat dibagi berdasarkan tiga jenis sifat, yaitu : bentuk
fisik, komposisi kimia dan tipe fungsional (tujuan isolasi).
a. Pembagian media berdasarkan bentuk fisiknya yaitu:
1. Media cair
Media cair adalah larutan berbahan dasar air yang tidak membeku pada suhu di atas
titik beku dan cenderung mengalir bebas ketika wadah dimiringkan. Media ini,
disebut kaldu, susu, atau infus, dibuat dengan melarutkan berbagai zat terlarut dalam
air steril. Media yang umum contohnya kaldu nutrisi (nutrient broth), mengandung
ekstrak daging sapi dan pepton yang dilarutkan dalam air. Susu metilen biru dan susu
 lakmus adalah cairan buram yang mengandung susu murni dan pewarna.
Thiogliykolat broth adalah kaldu sedikit kental yang digunakan untuk menentukan
kebutuhan oksigen berbagai mikroba (2).
2. Media semisolid
Pada suhu ruangan biasa, media semisolid menunjukkan konsistensi seperti
gumpalan, karena mengandung sejumlah bahan pemadat (agar atau gelatin) yang
mengentalkannya tetapi tidak menghasilkan permukaan yang kokoh. Media
semisolid digunakan untuk menentukan motilitas bakteri dan melokalisasi reaksi
pada tempat tertentu (2).
3. Media solid
Media solid memberikan permukaan kokoh di mana sel dapat membentuk koloni
tersendiri dan berguna untuk mengisolasi dan membiakkan bakteri dan jamur. Media
solid yang dapat dicairkan kembali, disebut reversible solid media, mengandung zat
pemadatan yang dapat mengubah sifat fisiknya sebagai respons terhadap suhu.
Sejauh ini agen yang paling banyak digunakan dan efektif adalah agar, suatu
polisakarida kompleks yang diisolasi dari alga merah Gelidium. Agar berbentuk
padat pada suhu kamar, dan meleleh (mencair) pada suhu mendidih air (100°C).
Setelah dicairkan, agartidak akan mengeras kembali hingga mencapai suhu 42°C (2).
b. Pembagian media berdasarkan kompisisi kimia
1. Media sintetis
Media sintetis adalah media yang komposisi kimianya diketahui secara pasti disebut.
Media tersebut mengandung senyawa organik dan anorganik murni yang sedikit
berbeda dari satu sumber ke sumber lainnya dan memiliki kandungan molekul yang
ditentukan melalui rumus yang tepat. Media tertentu mungkin mengandung tidak
lebih dari beberapa senyawa esensial seperti garam dan asam amino yang dilarutkan
dalam air, atau mungkin terdiri dari berbagai bahan kimia organik dan anorganik
tertentu. Media yang terstandarisasi dan dapat direproduksi seperti itu paling berguna
dalam penelitian ketika kebutuhan nutrisi untuk organisme yang akan uji diketahui.
2. Media kompleks
Media kompleks adalah media yang mengandung salah satu komponen tertentu tidak
dapat diketahui secara pasti kadar ataupun susunannya secara kimia. Media kompleks
mengandung ekstrak hewan, tumbuhan, atau ragi, termasuk bahan-bahan seperti sel,
jaringan, dan sekresi. Contohnya adalah ekstrak atau infus darah, serum, dan daging.
 Bahan non-sintetis lainnya adalah susu, ekstrak ragi, intisari kedelai, dan pepton
(1,2).
Media yang kompleks memiliki keunggulan dibandingkan media sintetis. Karena
media yang kompleks mengandung beragam nutrisi, termasuk faktor pertumbuhan,
maka dapat mendukung untuk pertumbuhan lebih banyak variasi mikroorganisme
yang berbeda. Media kompleks juga digunakan untuk membiakkan organisme yang
kebutuhan nutrisi pastinya tidak diketahui. Kaldu nutrisi, agar kedelai Trypticase, dan
agar MacConkey adalah beberapa media kompleks yang umum. Darah sering kali
ditambahkan ke media kompleks untuk menyediakan faktor pertumbuhan tambahan,
seperti NADH dan heme (1,2).
c. Pembagian media berdasarkan tipe fungsional (tujuan isolasi)
1. Media serbaguna (general-purpose media)
Media serba guna dirancang untuk menumbuhkan sebanyak mungkin jenis mikroba
yang berbeda. Biasanya, jenisnya kompleks dan mengandung campuran nutrisi yang
dapat mendukung pertumbuhan berbagai kehidupan mikroba. Contohnya termasuk
agar nutrisi dan kaldu, infus otak-jantung, dan trypticase soy agar (TSA) (2).
2. Media yang diperkaya (enrichment medium)
Media yang diperkaya mengandung zat organik kompleks seperti darah, serum,
hemoglobin, atau faktor pertumbuhan khusus (vitamin spesifik, asam amino) yang
dibutuhkan spesies tertentu untuk tumbuh. Bakteri yang membutuhkan faktor
pertumbuhan dan nutrisi kompleks disebut fastidiuous. Agar darah, yang dibuat
dengan menambahkan darah domba, kuda, atau kelinci steril ke dalam dasar agar
steril, sering digunakan untuk menumbuhkan streptokokus yang berbahaya dan
patogen lainnya (2).
3. Media selektif
Media selektif mengandung satu atau lebih agen yang menghambat pertumbuhan
mikroba atau mikroba tertentu. Media selektif sangat penting dalam isolasi awal
suatu jenis mikroorganisme tertentu dari sampel yang mengandung puluhan spesies
berbeda—misalnya feses, air liur, kulit, air, dan tanah. Media ini mempercepat isolasi
dengan menekan organisme yang tidak diinginkan dan mendukung pertumbuhan
organisme yang diinginkan (2).
Mannitol salt agar (MSA) mengandung NaCl konsentrasi tinggi (7,5%) yang
menghambat sebagian besar patogen manusia, tetapi genus Staphylococcus tumbuh
 dengan baik pada media ini, dan melapisi sampel campuran pada MSA adalah cara
cepat untuk menemukan bakteri ini (2).
Media untuk mengisolasi patogen usus gram negatif (agar MacConkey, agar Hektoen
enterik [HE]) mengandung garam empedu, salah satu komponen feses, sebagai zat
selektif untuk menghambat sebagian besar bakteri gram positif (2).
Agar Sabouraud dekstrosa memiliki pH yang agak rendah, yang dengan menghambat
pertumbuhan bakteri bersifat selektif terhadap jamur. Suatu media juga dapat
menjadi media selektif ketika satu unsur hara penting tidak dimasukkan ke dalam
media tersebut. Misalnya, dengan tidak memasukkan glukosa Trypticase soy agar
(TSA), media yang dihasilkan menjadi selektif bagi organisme yang dapat memenuhi
semua kebutuhan karbonnya dengan mengkatabolisme asam amino (1).
Agar Thayer-Martin digunakan untuk mengisolasi Neisseria gonorrhoeae dari
spesimen vagina yang mengandung flora kompleks serviks. Media ini mengandung
vankomisin yang mampu membunuh sebagian besar organisme Gram positif, colistin
yang ditambahkan untuk membunuh sebagian besar organisme Gram negatif kecuali
Neisseria, dan nistatin yang membunuh sebagian besar jamur. Usap vagina yang
dilapisi agar Thayer-Martin dari pasien yang menderita gonore sebagian besar hanya
akan menumbuhkan strain N.gonorrhoeae yang menyebabkan gejala pada pasien
tersebut (Riedel et al., 2019 ).
4. Media diferensial
Media diferensial memungkinkan berbagai jenis mikroorganisme tumbuh tetapi
dirancang untuk menampilkan perbedaan yang dapat dilihat secara visual pada
beberapa koloninya. Diferensiasi muncul sebagai variasi dalam ukuran atau warna
koloni, perubahan warna media, atau dalam pembentukan gelembung atau endapan
gas. Variasi ini sering kali berasal dari jenis bahan kimia yang dikandung media
tersebut dan cara mikroba bereaksi terhadapnya. Misalnya, ketika mikroba X
memetabolisme suatu zat tertentu dalam medium yang tidak dapat digunakan oleh
organisme Y, X akan menyebabkan perubahan warna koloni atau medium yang
terlihat, dan organisme Y tidak (2).
Pewarna sering digunakan sebagai zat pembeda karena banyak di antaranya
merupakan indikator pH yang berubah warna sebagai respons terhadap produksi
asam atau basa. Misalnya, agar garam manitol mengandung fenol merah, pewarna
yang berubah menjadi kuning ketika mikroba mengasamkan media dengan
memfermentasi mannitol. Koloni E. coli mempunyai karakteristik kemilau warna-
 warni pada agar-agar yang mengandung pewarna eosin dan metilen biru (Agar
EMB). Agar-agar EMB yang mengandung satu gula konsentrasi tinggi juga akan
menyebabkan gula tersebut terfermentasi dan membentuk koloni berwarna
kemerahan Agar MacConkey mengandung pewarna yang berubah menjadi merah
muda atau merah ketika mikroba memetabolisme laktosa dalam medium (2,3).
Meskipun agar darah adalah jenis media yang diperkaya yang digunakan untuk
pertumbuhan mikroba yang fastidiuous, keberadaan sel darah merah yang utuh
memungkinkannya berfungsi sebagai media diferensial juga. Hemolisin adalah enzim
yang berfungsi untuk melisiskan (memecah) sel darah merah dengan tujuan
melepaskan hemoglobin kaya zat besi untuk pertumbuhan. Ketika ditumbuhkan pada
agar darah, beberapa bakteri penghasil hemolisin akan melisiskan seluruh sel darah
merah di media yang berdekatan, disebut beta-hemolisis (contonya Streptococcus
pyogenes), pembersihan menyeluruh di sekitar koloni bakteri. Spesies lain hanya
melisiskan sebagian sel darah merah, disebut alfa-hemolisis (contohnya
Streptococcus pneumoniae), yang tampak sebagai agar-agar yang menghijau di
sekitar koloni. Bakteri yang tidak memiliki hemolisin tidak menyebabkan reaksi pada
agar, yang disebut hemolisis gamma (contohnya Enterococcus faecalis) (1–3).

Gambar 1. Perbedaan hemolysis pada agar darah ( (1)

5. Media pereduksi
Media pereduksi mengandung zat (asam tioglikolat atau sistin) yang menyerap
oksigen atau memperlambat penetrasi oksigen dalam media, sehingga mengurangi
keberadaan oksigen di dalam media. Media pereduksi penting untuk menumbuhkan
 bakteri yang tidak memerlukan oksigen (anaerobik) atau untuk menentukan
kebutuhan oksigen pada isolat. (1,2).
6. Media transport
Media transportasi digunakan untuk memelihara dan mengawetkan spesimen yang
harus disimpan selama jangka waktu tertentu sebelum analisis klinis atau untuk
mempertahankan spesies halus yang mati dengan cepat jika tidak disimpan dalam
kondisi stabil (1,2).
7. Assay media (media penguji)
Media pengujian digunakan oleh para ahli teknologi untuk menguji efektivitas obat
antimikroba dan oleh produsen obat untuk menilai pengaruh disinfektan, antiseptik,
kosmetik, dan pengawet terhadap pertumbuhan mikroorganisme (2).
8. Media enumerasi
Media enumerasi digunakan oleh ahli mikrobiologi industri dan lingkungan untuk
menghitung (mencacah) jumlah organisme dalam susu, air, makanan, tanah, dan
sampel lainnya (2).

ISOLASI BAKTERI
Isolasi yang tepat memerlukan sejumlah kecil sel yang diinokulasi ke dalam volume
yang relatif besar atau pada area media yang luas dan dipilih untuk mendorong pertumbuhan
mikroba yang diinginkan. Umumnya memerlukan bahan-bahan berikut: media yang
permukaannya relatif kokoh (seperti agar-agar), cawan Petri (cawan datar bening dengan
penutup), dan alat inokulasi. Ada tiga cara utama dalam melakukan isolasi, yaitu:
1. Teknik streak plate
Dalam metode streak plate, tetesan kecil kultur atau sampel disebarkan ke permukaan
medium dengan menggunakan inoculation loop (jarum ose) dalam pola yang secara
bertahap menipiskan sampel dan memisahkan sel secara spasial pada beberapa bagian
pelat. Seiring dengan berlanjutnya coretan (streaking), semakin sedikit sel yang tersisa
pada loop (ose), dan akhirnya loop(ose) tersebut dapat menyimpan sel tunggal pada agar
(1–3).

2. Teknik pour plate

Dalam metode pour plate, sampel diinokulasi secara bertahap ke dalam serangkaian
tabung agar yang didinginkan namun masih cair sehingga dapat mengencerkan jumlah
sel dalam setiap tabung berturut-turut dalam rangkaian tersebut. Tabung yang diinokulasi
 kemudian dilapisi (dituangkan) ke dalam cawan Petri steril dan dibiarkan memadat. Hasil
akhirnya (biasanya pada lempeng kedua atau ketiga) adalah jumlah sel per volume sangat
berkurang sehingga sel mempunyai ruang yang cukup untuk tumbuh menjadi koloni
terpisah. Salah satu perbedaan antara metode ini dan metode streak plate adalah bahwa
dalam teknik ini beberapa koloni akan berkembang jauh di dalam medium itu sendiri dan
tidak hanya di permukaan (1,2).

Gambar 2. Cara melakukan isolasi dengan teknik pour plate ( (1)

3. Teknik spread plate
Dengan teknik spread plate, sejumlah kecil sampel cair dan encer diteteskan ke
permukaan medium dan disebarkan secara merata dengan alat oles steril. Seperti teknik
streak plate, sel-sel didorong ke area terpisah di permukaan sehingga dapat membentuk
koloni tersendiri. Karena jumlah koloni harus sama dengan jumlah organisme yang hidup
dalam suatu sampel, pelat sebar dapat digunakan untuk menghitung populasi mikroba
(2,3).
 Gambar 3. Metode Isolasi Bakteri

IDENTIFIKASI MORFOLOGI BAKTERI

Cara menentukan mikroorganisme apa yang telah diisolasi dalam kultur adalah dengan
melakukan inspeksi dan identifikasi. Inspeksi merupaka memberikan titik awal, meliputi hal-
hal seperti melihat morfologi (bentuk) dan warna koloni, serta memeriksa pertumbuhan di
dalam tabung kaldu. Beberapa spesies bakteri tumbuh merata di seluruh cairan, sementara
spesies lainnya cenderung tumbuh di bagian atas cairan saat bertemu dengan udara atau
dalam gumpalan di seluruh kaldu. Inspeksi juga mencakup penggunaan mikroskop untuk
memeriksa sel tunggal. Secara umum, penampakan mikroskopisnya memiliki nilai yang
terbatas karena banyak bakteri yang memiliki bentuk serupa. Mikroskop dapat berguna dalam
membedakan sel bakteri yang lebih kecil dan sederhana dari sel eukariotik yang lebih besar
dan lebih kompleks. Tampilan koloni dapat berguna dalam mengidentifikasi mikroorganisme
eukariotik hingga tingkat genus atau spesies karena ciri morfologinya yang khas. Selain itu
dapat digunakan teknik lain untuk mengidentifikasi bakteri, seperti uji biokimia, yang dapat
menentukan karakteristik kimia dasar termasuk kebutuhan nutrisi, produk yang dilepaskan
selama pertumbuhan, keberadaan enzim, dan mekanisme perolehan energi. Sifat genetik
dapat mengidentifikasi mikroba berdasarkan DNA atau RNA-nya (genotypic test).
Identifikasi juga dapat dilakukan dengan menguji isolat terhadap antibodi yang diketahui (uji
imunologi) (2).
 Identifikasi bakteri juga dapat dilakukan dengan melihat bentuk koloni pada hasil kultur,
yaitu (1) :
1. Bentuk : sirkular, rizoid, irregular, filamentous, spindle
2. Pinggir : rata, bergelombang, bergerigi, berfiliform
3. Elevasi : datar, naik, cembung, pulvinate, umbonate
4. Ukuran : pinpoint, kecil, medium, besar
5. Tekstur : halus atau kasar
6. Tampilan : Berkilau (mengkilap) atau kusam
7. Pigmentasi : nonpigmented (warna cream, coklat, atau putih), pigmented (warna
ungu, kuning atau merah)
8. Bentuk optic : Opaque, translucent, transparen

B. ALAT DAN BAHAN

ALAT
1. Cawan petri / petri dish yang sudah disterilkan
2. Tabung reaksi dan rak
3. Bunsen
4. Ose
5. Tabung Erlenmeyer
6. Jangka sorong
7. Autoklaf
8. Inkubator
9. Timbangan
10. Gelas ukur
11. Handscoen
12. Kapas + Aluminium foil.

BAHAN
1. Media agar instan : Agar Darah, TSIA, Mueller Hinton Agar, Mac Conkey Agar,
Nutrient Agar, Lactobacillus MRS Agar
2. Bahan kaldu (broth) Thioglycolate, Lactose broth
3. Aquadest
4. Darah domba
5. Isolat bakteri Salmonella typhi
 6. Isolat bakteri Proteus spp
7. Isolat bakteri Klebsiella spp
8. Isolat bakteri Eschericia colli
9. Isolat bakteri Pseudomonas aeuriginosa

C. PROSEDUR KERJA
PEMBUATAN MEDIUM
1. Campurkan 4 gr bubuk agar darah dan 93 mL aquadest di dalam tabung Erlenmeyer,
tutup tabung dengan sumbat kapas+alumunium foil;
2. Campurkan 6,5 gr bubuk agar TSIA dan 100 mL aquadest di dalam tabung
Erlenmeyer, tutup tabung dengan sumbat kapas+alumunium foil;
3. Campurkan 3,8 gr bubuk agar Mueller Hinton dan 100 mL aquadest di dalam tabung
Erlenmeyer, tutup tabung dengan sumbat kapas+alumunium foil;
4. Campurkan 5,15 gr bubuk agar Mac Conkey dan 100 mL aquadest di dalam tabung
Erlenmeyer, tutup tabung dengan sumbat kapas+alumunium foil;
5. Campurkan 2,8 gr bubuk agar Nutrient dan 100 mL aquadest di dalam tabung
Erlenmeyer, tutup tabung dengan sumbat kapas+alumunium foil;
6. Campurkan 6,715 gr bubuk agar Lactobacillus MRS Agar dan 100 mL aquadest di
dalam tabung Erlenmeyer, tutup tabung dengan sumbat kapas+alumunium foil;
7. Campurkan 1,3 gr bubuk Lactose Broth dan 100 mL aquadest di dalam tabung
Erlenmeyer. Pindahkan campuran larutan ke dalam tabung reaksi, masing-masing
tabung berisi 7mL, tutup tabung reaksi dengan sumbat kapas+alumunium foil;
8. Campurkan 2,975 gr bubuk Thioglicolate broth dan 100 mL aquadest di dalam
tabung Erlenmeyer. Pindahkan campuran larutan ke dalam tabung reaksi, masing-
masing tabung berisi 7mL, tutup tabung reaksi dengan sumbat kapas+alumunium
foil;
9. Sterilkan seluruh tabung berisi medium di dalam autoclave pada suhu 121 oC selama
15 menit;
10. Keluarkan seluruh tabung dari autoclave biarkan dingin hingga suhu 50oC;
11. Untuk agar darah, tambahkan 7 mL darah domba, aduk hingga homogen;
12. Di dalam biosafety cabinet, tuangkan masing-masing larutan medium ke dalam
cawan petri dengan volume 15ml, hingga terbentuk ketebalan agar 3 mm
(didapatkan 6 cawan petri untuk setiap jenis medium);
13. Tunggu hingga agar mengeras dan simpan di dalam lemari pendingin.
 14. Setelah mengeras, simpan 1 medium yang dibuat di dalam inkubator sebagai
kontrol.

ISOLASI dan IDENTIFIKASI MORFOLOGI BAKTERI

1. Siapkan medium yang sudah mengeras di dalam biosafety cabinet;
2. Lakukan inokulasi bakteri pada cawan petri dengan teknik Streak-plate yaitu sebagai
berikut :
a. Panas kan ose di atas api bunsen hingga terbentuk pijar;
b. Tunggu pijar pada ose hilang;
c. Ambil isolat bakteri sebanyak satu bulatan ose
d. Inokulasikan pada medium agar dengan teknik Streak-plate yaitu dengan
menggoreskan pada empat kuadran medium agar.
3. Bakteri di inokulasikan sesuai dengan jenis bakteri dan jenis medium, yaitu sebagai
berikut :
a. Bakteri Klebsiella sp pada medium Mac Conkey
b. Bakteri Salmonella thypi pada medium Mac Conkey
c. Bakteri Proteus spp pada agar darah
d. Bakteri Eschericia colli pada agar endo
e. Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada agar endo
f. Bakteri Proteus spp pada TSIA
g. Bakteri Klebsiella spp pada lactose broth
h. Bakteri Salmonella thypi pada thiglycolate broth
4. Cawan petri yang sudah diinokulasikan bakteri disimpan di dalam inkubator kurang
lebih selama 24 jam dengan suhu 37oC.
5. Setelah 24 jam dilakukan identifikasi morfologi bakteri, dengan cara menilai hasil
kultur berdasarkan kriteria sebagai berikut :
a. Ukuran koloni (diukur dengan satuan milimeter menggunakan jangka sorong,
atau digambarkan dengan bentuk seperti pinpoint, kecil, medium, besar, dll).
b. Pigmentasi koloni.
c. Bentuk koloni : menonjol atau rata, pinggi rata atau tidak, berlendir atau tidak,
menjalar atau tidak.
d. Permukaan koloni : transparan atau tidak, mengkilat atau opak, rata atau tidak.
e. Perubahan pada media agar yang dihasilkan pertumbuhan bakteri (seperti
gambaran hemolisis pada agar darah, perubahan warna pada indikator pH).
 f. Bau (beberapa bakteri tertentu mengeluarkan bau yang khas
g. Semua hasil identifikasi dicatat di dokumentasikan dengan foto

D. HASIL
PEMBUATAN MEDIA

Gambar 3. Hasil Pembuatan Media

Setelah media dibuat, diambil sebanyak satu cawan petri masing-masing jenis media
disimpan di dalam inkubator sebagai kontrol. Dalam praktikum ini media yang digunakan
sebagai kontrol setelah diamati selama 24 jam tidak menunjukkan adanya pertumbuhan
mikroorganisme, yang artinya pembuatan media tidak terkontaminasi mikroorganisme lain.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MORFOLOGI BAKTERI
1. Eschericia coli
Jenis media: Agar Endo
Ciri-ciri: Ukuran 2mm, bentuk bulat menonjol, pinggiran rata, warna kekuningan seperti
logam, permukaan rata dan mengkilat, sifat mengubah warna medium (agar endo)
menjadi merah (lactose fermented).

Gambar 4. Koloni Eschericia coli Pada Agar Endo

2. Salmonella thypi
Jenis media: Agar Endo
Ciri-ciri: Ukuran 1mm, bentuk bulat kecil, warna keabuan, permukaan semi opak, sifat
tidak mengubah warna medium (agar endo) menjadi merah (non lactose fermented).
 Gambar 5. Koloni Salmonella tyhphi Pada Agar Endo
Jenis media : Thioglycolate Broth
Ciri-ciri : koloni bakteri tumbuh di permukaan media

Gambar 6. Perbandingan Medium Thiglycolate Broth Yang Ditumbuhi Bakteri

Salmonella thypi (kanan) dan medium kontrol (kiri)
3. Proteus sp
Jenis media: Agar Darah
Ciri-ciri: Ukuran 2mm, bentuk swarming (menjalar ke seluruh medium), warna putih
keabuan, permukaan rata mengkilat, sifat mengeluarkan bau has (seperti coklat dibakar).
 Gambar 7. Koloni Proteus sp Pada Agar Darah

Jenis media: Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Ciri-ciri: Ukuran 3mm, bentuk swarming (menjalar ke seluruh medium), warna hitam,
permukaan rata mengkilat, sifat mengeluarkan bau khas (seperti coklat dibakar).

Gambar 8. Koloni Proteus sp Pada Agar TSIA

4. Pseudomonas aeruginosa
Jenis media: Agar MH
Ciri-ciri: Ukuran 1mm, bentuk bulat tepi rata, warna kehijauan, permukaan rata
mengkilat
 Gambar 9. Koloni Pseudomonas aeruginosa Pada Agar MH

5. Staphylococcus aureus
Jenis media: Agar Darah
Ciri-ciri: Ukuran 2mm, bentuk bulat tepi rata, warna keabuan, permukaan rata mengkilat,
sifat hemolitik sempurna pada agar darah (beta hemolotikus)

Gambar 10. Koloni Staphylococcus aureus Pada Agar Darah

Jenis media: Agar MH
Ciri-ciri: Ukuran 2mm, bentuk bulat tepi rata, warna kekuningan emas, permukaan rata
dan kering.
 Gambar 11. Koloni Staphylococcus aureus Pada Agar MH

6. Klebsiella sp
Jenis media: Agar Mac Conkey
Ciri-ciri: Ukuran 2mm, bentuk bulat tepi rata, warna putih merah muda, permukaan
menonjol dan mucoid, sifat mengubah warna medium (lactose fermented).

Gambar 12. Koloni Klebsiella sp Pada Agar Mac Conkey

Jenis Media : Lactose Broth

Ciri-ciri : bakteri tumbuh pada permukaan media
 Gambar 13. Perbandingan Medium Lactose Broth Yang Ditumbuhi Bakteri Klebsiella sp
(kiri) dan medium kontrol (kanan)

E. PEMBAHASAN
Hasil inokulasi Escherichia coli pada agar endo yang dilakukan pada praktikum ini
menunjukkan bentuk koloni dengan warna kekuningan seperti logam dan mengubah warna
medium (agar endo) menjadi merah (lactose fermented). Sementara hasil inokulasi
Salmonella thypi pada agar endo menunjukkan ciri khas tidak ada nya perubahan warna pada
medium menjadi warna merah yang artinya bakteri ini adalah non lactose fermented. Endo
Agar adalah media lama yang awalnya dirancang untuk isolasi basil tifoid. Media yang lebih
dapat diandalkan untuk tujuan ini telah dikembangkan, dan media tersebut sekarang
digunakan untuk membedakan organisme usus yang memfermentasi laktosa dan organisme
yang tidak memfermentasi laktosa, khususnya selama konfirmasi uji dugaan koliform. Agen
selektif yang terkandung dalam medium, natrium deoksikolat dan natrium lauril sulfat
membantu menghambat non-coliform (seperti Salmonella thypi) untuk memetabolisme
laktosa dan memproduksi aldehida dan asam. Produksi asam dan aldehida oleh organisme
yang memfermentasi laktosa, seperti Escherichia coli, menimbulkan karakteristik warna
merah pada koloni dan media sekitarnya. Koliform yang memfermentasi laktosa (misalnya
Escherichia coli) menghasilkan koloni berwarna merah tua yang mewarnai media di
sekitarnya dan memiliki kilau logam keemasan (4,5).
Pada praktikum ini, bakteri Proteus spp diinokulasikan pada medium agar darah dan
TSIA. Pada agar darah tampak ciri khas hasil inokulasi yaitu menyebar ke seluruh medium
(swarming) dan pada agar TSI koloni tampak berwarna hitam dan mengeluarkan bau khas
seperti coklat dibakar. Karakteristik diferensial utama yang dimiliki Proteus spp adalah
Proteus spp merupakan gram negative, bersifat motil, dan memproduksi H2S pada agar TSI.
Pada agar darah proteus akan tumbuh berkerumun dan menyebar (swarming) (6). Bakteri
penghasil H2S dapat memecah natrium tiosulfat yang terdapat pada media agar TSI dan
menyebabkannya berkurang sehingga menghasilkan gas H2S. Gas H2S yang dihasilkan
selanjutnya berinteraksi dengan ion besi menghasilkan besi sulfida yang tidak larut dalam air,
berwarna hitam. Adanya H2S ditunjukkan dengan molekul berwarna hitam yang tidak larut
yang mengubah media kultur menjadi hitam (7).
Hasil inokulasi bakter Pseudomonas aeruginosa pada agar MH menunjukkan ciri khas
pigmen berwarna kehijauan (biru kehijauan). Hal ini disebabkan karena Pseudomonas
aeruginosa memproduksi pigmen dua pigmen primer, biru (pyocyanin) dan kuning
(fuorescein), yang menyebabkan warna hijau pada pelat kultur. Ekspresi faktor virulensi pada
P. aeruginosa ditingkatkan dengan sintesis pigmen ini, terutama pyoscyanin. Selain itu, strain
yang memproduksi piosianin lebih virulen dan lebih resisten terhadap banyak obat
dibandingkan strain yang tidak memproduksi pyocyanin (8).
Pada praktikum ini, hasil kultur Staphylococcus aureus menunjukkan ciri khas pada agar
darah adalah terjadi hemolosis sempurna. Hal ini disebabkan karena bakteri ini menghasilkan
toksin hemolysin yang merupakan exotoxin yang efek nya adalah merusak membrane sel
darah merah. Pada Staphylococcus aureus jenis toksin hemolysin adalah α dan β toksin (2).
Pada agar MH, hasil kultur Staphylococcus aureus menunjukkan ciri khas warna kuning
keemasan. Hal ini disebabkan karena bakteri ini memproduksi pigmen kuning yaitu
staphyloxanthin (9).
Hasil kultur bakteri Klebsiella spp pada agar MacConkey menunjukkan ciri khas
mengubah warna medium (lactose fermented). Agar MacConkey adalah agar selektif dan
pembeda yang hanya menumbuhkan spesies bakteri gram negatif; ini selanjutnya dapat
membedakan organisme gram negatif berdasarkan metabolisme laktosanya. Fermentasi
laktosa menghasilkan asam organik, khususnya asam laktat, yang menurunkan pH agar.
MAC mengandung indikator pH yang berubah warna menjadi merah muda dalam kondisi
asam. Oleh karena itu, bakteri gram negatif yang memfermentasi laktosa (lactose fermented)
akan membentuk koloni berwarna merah muda, sedangkan bakteri yang tidak memfermentasi
laktosa akan membentuk koloni buram berwarna putih. Klebsiella spp merupakan salah satu
jenis bakteri yang memfermetasi laktosa (10).
 F. DAFTAR PUSTAKA
1. Bauman RW. Microbiology With Disease by Body System. 4th ed. Pearson; 2015.
2. Cowan MK, Smith H. Microbiology A Systems Approach. 7th ed. Mc Graw Hill; 2024.
3. Riedel S, Morse SA, Mietzner T, Miller S. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical
Microbiology. 28th ed. Mc Graw Hill; 2019.
4. Thermo Scientific Fisher. Endo Agar Base [Internet]. [cited 2024 Feb 20]. Available from:
http://www.oxoid.com/uk/blue/prod_detail/prod_detail.asp?
pr=CM0479&org=64&c=uk&lang=EN
5. Basavaraju M, Gunashree BS. Escherichia coli : An Overview of Main Characteristics . In:
Escherichia coli - Old and New Insights. IntechOpen; 2023.
6. Pearson MM. Culture Methods for Proteus mirabilis. In: Methods in Molecular Biology.
Humana Press Inc.; 2019. p. 5–13.
7. Dahal P. TSIA Test: Principle, Media, Procedure, Results, Uses [Internet]. [cited 2024 Feb
20]. Available from: https://microbenotes.com/triple-sugar-iron-agar-tsia-test/
8. Abdelaziz AA, Kamer AMA, Al-Monofy KB, Al-Madboly LA. Pseudomonas aeruginosa’s
greenish-blue pigment pyocyanin: its production and biological activities. Vol. 22, Microbial
Cell Factories. BioMed Central Ltd; 2023.
9. Missiakas DM, Schneewind O. Growth and laboratory maintenance of Staphylococcus
aureus. Curr Protoc Microbiol. 2013;(SUPPL.28).
10. Jung B, Hoilat GJ. MacConkey Medium. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL):
StatPearls Publishing; 2024 [cited 2024 Feb 20]. Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK557394/