ANALISIS EKSPRESI mRNA INTERLEUKIN-8 (IL-8/

CXCL8) DAN mRNA MONOCYTES

CHEMOATTRACTANT PROTEIN-1 (MCP-1/ CCL2)
PADA PENENTUAN UMUR LUKA MEMAR

BAB I
PENDAHULUAN

1. Latar Belakang

Kelayakan

Persoalan umur luka di jelaskan eksplisit di Kitab Undang- Undang Hukum

Pidana dan Kitab Undang-undang Hukum Acara Pidana. Peraturan Pemerintah
Republik Indonesia No. 8 Tahun 1981. p.36
Tahun 2012 setiap 91 detik terjadi satu kejahatan di Indonesia (Laporan
Wakabareskrim Irjen Pol Saud Usman)
Di RS Bhayangkara Makassar
Kasus perlukaan yang disertai dengan SPV: (Dugaan kasus kriminal)
Tahun 2009-2010: 55% , Tahun 2010-2011: 60%
Luka memar urutan pertama tertinggi dari seluruh jenis perlukaan:
Tahun 2010-2011: Luka memar 44%, luka terbuka 42% , luka lecet 13%, luka
bakar 1%
7 dari 12 kasus (58%) terdapat perbedaan estimasi umur luka memar
terbanyak umur luka >24 jam didapatkan pada pasien yang berkulit gelap
(Bhayangkara RS, 2011)

Bhayangkara RS, Makassar. Perlukaan 2010-2011 di Makassar. Bagian Forensik- Medikolegal UNHAS, 2011
Kitab Undang- Undang Hukum Pidana dan Kitab Undang-undang Hukum Acara Pidana. Peraturan Pemerintah Republik Indonesia No. 8 Tahun 1981.
p.36
.

BAB I

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang

Perlu

Metode penilaian umur luka memar yang selama ini digunakan dalam bidang
forensik yaitu :
Merah 0-1 hari, biru keunguan 1-4 hari, hijau kuning 5-7 hari, kuning
kecoklatan 8-10 hari, normal 1-3 minggu (Schwartz dan Ricci, 1996), (Knight
Bernard, 1997 dan Kumar Sanil, 2011
investigasi tentang rentetan proses terjadinya trauma sampai terjadinya luka
(patobiologi terjadinya luka)
Schwartz, Ricci. How Accurately can Bruises be Aged in Abused Children?. Literature review and synthesis. Pediatrics 1996; 97: 254-257.
Knight Bernard, The Examination of Wounds. Simpsons Forensic Medicine. Edition Eleventh. 1997.p.44-5
Kumar Sanil, Mechanical Injuries. Forensic Medicine & Toxicology. Departement of Forensic Medicine and Toxicology. 2011

1.

Latar Belakang

BAB I
PENDAHULUAN

Penting

Proses inflamasi lebih dari 24 jam diketahui melalui aktivitas monosit

menggantikan neutrofil dalam sirkulasi. (Robbins dan Cotran, 2000).
Makrofag melepaskan IL-8 untuk menarik netrofil ke tempat cedera. (Charo
IF dan Ransohoff RM, 2006)
IL-8 berafinitas tinggi untuk netrofil menuju tempat jejas (Deshmane Satish
dkk, 2009. Yoshimura dkk, 1989. Ajuebor dkk, 1998).
Monosit menuju tempat jejas di perantarai Monocyte Chemoattractant
Protein-1 (MCP-1) (Yoshimura dkk, 1989. Ajuebor dkk, 1998. Deshmane
Satish dkk, 2009)
MCP-1 berafinitas tinggi untuk asosiasi infiltrasi monosit dan berperan
mendatangkan monosit/ makrofag dari sirkulasi menuju tempat jejas. (Sozzani
dkk 1993 . Ajuebor dkk, 1998)
Ajuebor MN, Flower RJ, Hannon R, Christie M, Bowers K, Verity A, Perretti M. 1998. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan
peritonitis model. J Leukoc Biol 63:108116.
Deshmane Satish, Kremlev Sergey, Amini Shohreh, Sawaya Bassel E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. Journal of Interferon and cytokine
research volume 29, Number 6, 2009;14: 313-326.
Robbins SL, Kumar V. Mitchell RN, Acute and Chronic Inflammation. Pathologic Basis of Disease.Ed. 7. 2000;p. 58-89
Sozzani S, Molino M, Locati M, Luini W, Cerletti C, Vecchi A, Mantovani A. 1993. Receptor-activated calcium infl ux in human monocytes exposed to monocyte chemotactic
protein-1 and related cytokines. J Immunol 150:15441553
Yoshimura T, Robinson EA, Tanaka S, Appella E, Leonard EJ. 1989. Purification and amino acid analysis of two human monocyte chemoattractants produced by
phytohemagglutininstimulated human blood mononuclear leukocytes. J Immunol 142:19561962.

BAB I
PENDAHULUAN

Novel

1. Latar Belakang

Telah banyak penelitian dilakukan untuk melihat ekspresi MCP-1 pada jaringan
luka menggunakan metode kohort prospective dengan berbagai jenis sitokin
sebagai salah satu marker dalam penentuan umur luka (Kondo T, dkk. 1999).

Penelitan

tentang

umur

luka

memar

menggunakan

kadar

Monocyte

Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) pada serum dengan metode ELISA

didapatkan hasil kadar bervariasi yang tidak signifikan

The Central Dogma of Molecular Biology

rangsangan

Ekspresi X

cytoplasma

Protein X

IL-8
MCP-1

Nukleus

mRNA

IL-4
IL1
Other
cytokie

DNA

Lawrence, G.S. 2015

Faktor down/up
regulation

Sehat
Obesitas
DM
Hipertensi
etc

2. Rumusan Masalah
Bagaimana kadar ekspresi (mRNA) IL-8 dan MCP-1 pada tubuh yang sehat
Bagaimana kadar, ekspresi (mRNA) IL-8 dan MCP-1 pada tubuh yang mengalami
luka dengan lamanya luka tersebut terjadi (umur luka)
Bagaimana kadar ekspresi yang memicu peningkatan secara genetik di (mRNA) IL8 dan MCP-1 pada

tubuh yang terdapat riwayat Diabetes Mellitus (DM) dan

mengalami luka memar

tersebut terjadi (umur luka)

terhadap penentuan umur luka dengan lamanya luka

BAB I
PENDAHULUAN

3. Tujuan Penelitian
3.1 Tujuan Umum
Mengetahui kadar, ekspresi (mRNA) IL-8 dan MCP-1 pada tubuh yang
mengalami luka dan pada kejadian adanya riwayat DM dalam keluarga dengan
lamanya luka tersebut terjadi (umur luka)

BAB I
PENDAHULUAN
Menentukan ekspresi mRNA IL8 dan mRNA MCP-1 pada tubuh sehat dan yang
mengalamai luka dengan lamanya luka tersebut terjadi (umur luka)
Menentukan ekspresi mRNA IL8 dan mRNA MCP-1 pada tubuh yang mengalamai
luka pada kejadian adanya riwayat DM dalam keluarga dengan lamanya luka
tersebut terjadi (umur luka)
Membandingkan ekspresi mRNA IL8 dan mRNA MCP-1 pada tubuh sehat dengan
yang mengalamai luka dengan lamanya luka tersebut terjadi (umur luka)
Membandingkan ekspresi mRNA IL8 dan mRNA MCP-1 pada tubuh yang
mengalamai luka pada kejadian adanya riwayat DM dalam keluarga dengan lamanya
luka tersebut terjadi (umur luka)

 Menganalisa ada tidak hubungan ekspresi mRNA IL8 dan mRNA MCP-1 pada
tubuh sehat dengan yang mengalamai luka dengan lamanya luka tersebut terjadi
(umur luka)
Menganalisa ada tidak hubungan ekspresi mRNA IL8 dan mRNA MCP-1 pada
tubuh yang mengalamai luka pada kejadian dengan atau tanpa adanya riwayat
DM dalam keluarga dengan lamanya luka tersebut terjadi (umur luka) Pada
kelompok:
Kontrol dan kelompok perlakuan pada waktu yang berbeda (12 jam, 24 jam,
36 jam, 48 jam, 60 jam, 72 jam, 84 jam

BAB I
PENDAHULUAN
4. Hipotesis
Terdapat perbedaan ekspresi mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1 antara masing-masing
kelompok umur luka.
Terdapat hubungan ekspresi mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1 antara masing-masing
kelompok umur luka ; ekspresi mRNA IL-8 akan menurun secara gradual setelah
umur luka lebih dari 24 jam sedangkan ekspresi mRNA MCP-1 akan meningkat
secara gradual setelah umur luka lebih dari 24
Adanya peningkatan ekspresi mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1 antara masingmasing kelompok umur luka pada kejadian yang memicu ekspresi tersebut dengan
lamanya luka tersebut terjadi (umur luka)

BAB I
PENDAHULUAN
5. Manfaat Penelitian untuk pengembangan ilmu
Hasil penelitian diharapkan dapat menambah khazanah informasi ilmiah mengenai :
Ekspresi mRNA Interleukin-8 (IL-8) mRNA Monocyte Chemoattractant Protein-1
(MCP-1) pada masing-masing kelompok umur memar.
Hasil penelitian ini memberikan rujukan rentang nilai dengan bias yang rendah
melalui gambaran ekspresi mRNA Interleukin-8 (IL-8) dan mRNA Monocyte
Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) pada masing-masing kelompok umur memar.
Dapat dijadikan sebagai data dasar untuk penelitian selanjutnya bagi pengembangan
ilmu pengetahuan untuk penentuan umur luka, misalnya: penelitian terhadap jenis
chemokine-chemokine lain yang juga berperan sama pada jenis lekosit lainnya seperti
MIP-1, RANTES.

BAB I
PENDAHULUAN
6. Untuk pengembangan medik
Dapat diaplikasikan oleh dokter untuk mengkonfirmasi keterangan korban yang
diduga terdapat perbedaan yang cukup jauh antara keadaan luka dengan informasi
waktu terjadinya cedera sehingga dokter dapat sangat terbantu membantahkan alibi
didalam menentukan umur luka secara akurat termasuk dapat menunjukkan agent
trauma kekerasan yang mana lebih dulu terjadi melalui marker umur luka
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai dasar
diagnostik terhadap penentuan umur luka dengan bias sekecil mungkin.

 Dengan mengidentifikasi hal tersebut diatas maka akan sangat membantu para
pencari keadilan dan penegak hukum dalam menginvestigasi kapan, siapa dan
bagaimana terjadinya trauma. Hal ini tentunya akan mempersembit alibi para
pelaku, korban atau saksi yang ingin berbuat curang atau niat tidak jujur

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
II.Defenisi Luka dan Luka Memar
Luka adalah suatu gangguan dari kondisi normal pada kulit. (Seim HB, and Fossum TW dkk, 1997)
Luka memar adalah trauma pada suatu bagian tanpa merobek kulit dan dengan perdarahan subkutan (Dorlands Medical Dictionary, 2004)
Menganalisa patomekanisme terjadinya cedera/damage, konsep translating pendulum Hypothesis merupakan pendekatan yang komprehensif dan natural. Berbagai gangguan klinis berakar dari satu permasalahan biologik yang sama yaitu inflamasi. (Lawrence GS, 2005)

Lawrence, G.S. 2005. Can Anti Inflamantory and Anti Oxidant Status Predict Impaired Glucose Tolerance and Coronary Artery disease? Translating Pendulum
Phenomenon. Dipresentasikan pada: Semiloka Perhimpunan Atherosklerosis dan Penyakit Vaskuler Indonesia (PAPVI) ke-5. Jakarta. 1 Oktober

TINJAUAN KEPUSTAKAAN
II.2. INFLAMASI
Inflamasi adalah suatu jawaban atau respon protektif langsung yang ditujukan untuk menghilangkan
penyebab awal jejas sel serta membuang sel dan jaringan nekrotik yang diakibatkan oleh kerusakan
asal. (Robbins dkk, 2000)
Peristiwa dalam rekrutmen leukosit pada suatu tempat radang meliputi :

Aktivasi endotel.

Rolling leukosit, difasilitasi oleh ikatan selektin pada ligand

Adhesi kuat, difasilitasi oleh perubahan afinitas integrin terhadap ligand endotel yang diinduksi
kemokin.

Transmigrasi antar sel endotel

Migrasi ke jaringan interstisil menuju stimulus kemotaktik

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
II.2 INFLAMASI

Gbr:1: Proses migrasi lekosit dari pembuluh darah pada inflamasi akut. Dikutip d
Robbins and Cotran, 2000
Robbins SL, Kumar V. Mitchell RN, Acute and Chronic Inflammation. Pathologic Basis of Disease.Ed. 7. 2000;p. 58-89

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
II.2. INFLAMASI

Gambar 2. Grafik menunjukkan aktivitas netrofil dan monosit pada saat terjadi
inflamasi . Dikutip dari Robbins and Cotran, 2000
Robbins SL, Kumar V. Mitchell RN, Acute and Chronic Inflammation. Pathologic Basis of Disease.Ed. 7.
2000;p. 58-89

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN

Robbins SL, Kumar V. Mitchell RN, Acute and Chronic Inflammation. Pathologic
Basis of Disease.Ed. 7. 2000;p. 58-89

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
II.3. INFLAMASI

Gambar 3. Reaksi Inflamasi akut (Kindt G, 2006)

Kindt G, Osborne. Leukocyte Migration and Inflamation. Kuby, Imunology International edition. 6 ed: W.H Freeman;
2006.p.339-46.

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
II.3. CHEMOKINE
Disulphide bridges of Cys-Cys
30s

C
C

Antiparallel
-sheets
C
C

-Helix

N-Loop

Deshmane Satish, Kremlev Sergey, Amini Shohreh, Sawaya Bassel E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. Journal of Interferon

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
II.3.1 MONOCYTE CEMOATTRACTANT PROTEIN-1
Chemokine diklasifikasi ke dalam 4 subfamili berdasarkan pada nomor dan lokasi
dari cysteine residu pada N-terminus dari molekul dan dinamakan : CXC, CC,
CX3C, dan C
IL-8 (CXCL8) adalah family CXC terutama bekerja untuk merekrut sel netrofil
MCP-1(CCL2) adalah anggota dari family CC yang merupakan suatu kemotaktik
yang kuat untuk monosit (Deshmane dkk. 2009)
Kemotaktik sitokin adalah sitokin (mediator yang dihasilkan oleh sel radang yang
berperan sebagai hantaran signal dari satu sel ke sel lainnya) l) ke tempat infeksi
atau kerusakan jaringan. (Rollins BJ 2003. Charo IF dkk, 1994)

Rollins BJ, 1997. Chemokines. Blood 90:909928

Charo IF, Myers SJ, Herman A, Franci C, Connolly AJ, Coughlin SR. 1994. Molecular cloning and functional expression of two monocyte chemoattractant protein 1 recepto
reveals alternative splicing of the carboxyl-terminal tails. Proc Natl Acad Sci USA 91:27522756.
Deshmane Satish, Kremlev Sergey, Amini Shohreh, Sawaya Bassel E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. Journal of Interferon and cytokine resear
volume 29, Number 6, 2009;14: 313-326

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
Interleukin-8 (IL-8/CXCL8)
IL-8/CXCL8 di produksi oleh berbagai tipe sel antara lain: makrofag dan sel
endotel sesuadah diaktifkan/diinduksi oleh TNF atau IL-1 dan produk mikroba
(Boulay, F dkk. 1991)
Pemberian makrolid menyebabkan down regulation IL-8/CXCL8 pada kasuskasus rinosinusitis kronik (RSK)
IL-8/CXCL8 berperan dalam regulasi dan infiltrasi terutama netrofil dan monosit
Fungsi IL-8/CXCL8 yang paling dominan adalah dalam rekutmen netrofil ke
jaringan yang mengalami jejas/luka. (Deshmane dkk, 2009).
IL-8/CXCL8 mengikat terutama untuk dua GPCRs, CXCR1 dan CXCR2 pada
netrofil, monosit, sel endotel, astrosit dan mikroglia.
Reshmane Satish, Kremlev Sergey, Amini Shohreh, Sawaya Bassel E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. Journal of Interferon and cytokine research volume 29, Number 6, 2009;14: 313326

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
MONOCYTE CEMOATTRACTANT PROTEIN-1 (MCP-1/CCL2)
MCP-1 di produksi oleh berbagai tipe sel antara lain: sel endotel, epitel, otot polos,
mesangial, astrosit, monosit dan mikroglia. (Cushing dkk, 1990. Standiford dkk, 1991.
Brown dkk 1992. Barna dkk, 1994
MCP-1 berperan dalam regulasi dan infiltrasi monosit, limphosit T memory dan
Natural Killer Cell.
Fungsi MCP-1 yang paling dominan adalah dalam rekutmen monosit ke jaringan
yang mengalami jejas/luka. (Deshmane dkk, 2009)
MCP-1 bekerja melalui ikatan dengan reseptornya yaitu CCR2 melalui GPCR.
(Deshmane dkk, 2009)
Produksi MCP-1 dipengaruhi oleh LPS dan Virus
Deshmane Satish, Kremlev Sergey, Amini Shohreh, Sawaya Bassel E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. Journal of Interferon and cytokine research volume 29, Number 6, 2009;14: 313326

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN

Gambar 7: Ilustrasi rekruitmen lekosit. Monosit terikat oleh integrin molekul adhesi ke endotel
setelah reseptor kemokine teraktivasi.(Charo IF dan dan Ransohoff RM, 2006)
Charo IF dan Ransohoff RM. Review Article; Mechanisms of Disease. The Many Roles of Chemokines and Chemokine Receptors in Inflammation. The New Enghland Journal,
2006.p.12: 610-621.

BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN

Penelitian yang dilakukan oleh T. Kondo dkk, 2002, terhadap beberapa jenis
sitokin telah merekomendasikan bahwa sitokin dapat menjadi salah satu marker
dalam menentukan umur luka intravital

T.Kondo TO, R.Mori, D.W.Guan,K.Ohshima,W.Eisenmenger. Immunohistochemical detection of chemokines in human skin wounds and its application to wound age
determination. Int J Legal Med. 2002;116:87-91.

Jaringan Normal

KERANGKA TEORI

UMUR LUKA MEMAR

Pelepasan Mediator

Cedera Endotel
Aktivasi molekul adhesi
( P-Selektin, ESelektin, VCAM-1,
ICAM-1)
Mast sel

Makrofag

Ektravaasi darah
Jaringan

GPCR

Epitel,fibroblas, otot
polos

Plasma

Sel

CCR2

Histamin,
Prostaglandin,
Leukotrienes

leukosit

Monosit

Netrofil

Komplemen

>24 jam
< 24 jam

Endogen
C5a,

Chemokines

Aktifasi monoit: marginasi, rolling,adhsi

transmigrasi, migrasi

C
H
E
M
O
K
I
N
E
S

CXC

Kemotaksis

Kemotaksis

IL-8

Menuju tempat jejas

CC
MCP-1
C

CX3C

Ekspresi
mRNA<24
IL-8jam

Asma, IL-1,LPS

Ekspres i mRNA MCP1

>24 jam

Obesitas,DM, HT

BAB III
KERANGKA KONSEP
Sehat

Umur luka
memar < 24
dengan atau
tanpa riwayat
DM dalam
keluarga

umur luka
memar jam
>24 jam
dengan atau
tanpa
riwayat DM
dalam
keluarga

Cedera endotel mengaktivasi molekul adhesi; ESelektin,L- selektin, P-Selektin, VCAM-1, ICAM-1.
Komponen komplemen (C5a, leukotrin B4), Ca,
makrofag,
Aktivasi lekosit (<24 jam)
netrofil (marginasi,
rolling, adhesi, diapedesis, transmigrasi, migrasi
Aktivasi lekosit (>24 jam)
monosit
(marginasi,
rolling,
adhesi,
diapedesis,
transmigrasi, migrasi
Kemotaksis IL-8, MCP-1 ke tempat cedera

Berat
badan

Kadar,
Ekspresi
mRNA
MCP-1

Kolesterol, asam urat,

diabetes, penyakit
tulang,riwayat
penyakit

tinggi

badan

Keterangan :
Variabel bebas

Hubungan Variabel bebas

Variabel antara

Hubungan Variabel tergantung

Variabel tergantung

Hubungan Variabel kendali

Variabel kendali

Kadar,
Ekspresi
mRNA
IL-8

umur

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.1. Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan suatu penelitian
longitudinal.

kohort prospective observasi

IV.2. Tempat dan Waktu penelitian

Penelitian ini dilakukan di Rumah Sakit Bhayangkara Mappaoudang Makassar.
Waktu penelitian dilaksanakan pada Bulan April 2015

BAB IV
METODE PENELITIAN

IV.3. Populasi Penelitian

Populasi penelitian adalah laki-laki dan perempuan dewasa yang masuk dengan
luka memar pada daerah dimana saja, umur 15-45 tahun.

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.4. Sampel penelitian dan perkiraan besar sampel
Jumlah sampel penelitian adalah 25 pasien. Sampel dibagi 3 kelompok besar yaitu
kelompok I (kelompok tanpa luka, sehat) sebanyak 5 pasien. 2 kelompok berikutnya
(perkelompok jumlah sampel 10 sampel yaitu kelompok II hanya memar dengan
umur luka < 24 jam dengan atau tanpa riwayat DM dalam keluarga (yaitu umur
memar 8 jam dan kemudian diperiksa kembali dengan waktu umur 14 jam dengan
pasien yang sama), kelompok III hanya memar dengan umur luka > 24 jam dengan
atau tanpa riwayat DM dalam keluarga (yaitu umur memar 28 jam dan kemudian
diperiksa kembali dengan waktu umur 34 jam pada pasien yang sama). Diantara
kelompok diatas terdapat 5 sampel dengan riwayat DM dalam keluarga. Total 3
kelompok tersebut 25 pasien.

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.5.1. Kriteria Inklusi
Umur pasien 15-45 tahun, menyetujui dan menandatangani surat persetujuan
penelitian
Tidak sedang atau sementara mengkonsumsi obat antibiotik dan kadar gula darah
sewaktu normal dan pasien langsung tidak ada DM sebelumnya, hanya dengan atau
tanpa riwayat DM dalam keluarga.
Luka memar yang terjadi karena trauma tumpul, bukan karena penyakit perdarahan
Kelompok 1 Sehat, Berat Badan Ideal (BBI)
Kelompok 2, hanya luka memar dengan jumlah luka dan daerah dimana saja yang
tidak terbatas, umur luka memar < 24 jam dengan atau tanpa riwayat DM dalam
keluarga
Kelompok 3, luka memar dengan jumlah luka dan daerah dimana saja yang tidak
terbatas, umur luka memar >24 jam dengan atau tanpa riwayat DM dalam keluarga

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.5.2. Kriteria Eksklusi
Pada saat berlangsungnya observasi penelitian terjadi luka selain memar, terjadi
alergi, kolesterol tinggi kadar > 200 mg/dL dan kadar asam urat > 8 mg/dL
Sampel darah rusak
Jumlah darah tidak mencukupi
Terdapat stress (takut)
Selama observasi berlangusng, tidak terdapat luka lain selain luka memar diatas

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.6. CARA KERJA
IV.6.1 ALOKASI SUBYEK
Subyek pada penelitian ini adalah pasien yang memenuhi kriteria inklusi dan
eklsklusi sampai periode penelitian selesai dilakukan

IV.6.2 PROSEDUR PELAKSANAAN

Pasien yang masuk dengan luka memar daerah mana saja, dilakukan pemeriksaan;
anamnesis (mulai dari pertanyaan kronologis kejadian termasuk waktu terjadinya
trauma sampai riwayat riwayat penyakit), pemeriksaan fisik dan pemeriksaan
penunjang dan didiagnosis luka memar karena trauma tumpul sambil melakukan
riwayat tindakan rawat luka dan informed concent untuk tujuan pengambilan sampel
darah dengan menjelaskan maksud dan tujuannya untuk meminta persetujuan
pasien. Setelah ada persetujuan baru tindakan pengambilan sampel darah dari vena
cubiti sebanyak 3 cc..

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.6.2 PROSEDUR PELAKSANAAN
Darah ini diambil selain persiapan pemeriksaan kadar mRNA IL-8 dan mRNA
MCP-1 juga untuk pemeriksaan kadar kolesterol dan asam urat, setelah ada hasil
laboratorium kolesterol, asam urat yang memenuhi kriteria sesuai kelompoknya
masing-masing, maka pemeriksaan kadar mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1 dapat
diproses yaitu dengan mengambil 1 tetes darah dimasukkan kedalam tabung L6
untuk dilakukan pemeriksaan ekspresi mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1 sisanya
darah dilakukan untuk pemeriksaan kolesterol dan asam urat. Pencatatan label
pada sampel dengan menggunnakan kode penomoran.

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.6.2 PROSEDUR PELAKSANAAN
Sampel pada tahap 1 ( L6 ditambah 1 tetes darah) disimpan dalam lemari pendingin
dengan suhu -200c di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Hasanuddin. Setelah
seluruh sampel tersebut terkumpul, lalu dilakukan ektraksi RNA untuk melihat
ekspresi mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1 dengan teknik Real Time PCR.dengan
memakai cara: Ekstraksi RNA

dengan metode Boom (Hatta, dkk, 2007)

(Mochammad Hatta and Henk, L, Smith, 2007. Boom, 1990)

 Darah dimasukkan kedalam 500 l larutan buffer lisis L6 pada tube yang
mempunyai penutup. Kemudian campuran ini disentrifus pada 12.000 rpm selama
10 menit. Sedimen sampel yang telah dipekatkan ini dihomogenkan selama 30
menit. Sebelum ditambahkan suspensi diatom, campuran buffer L6 yang telah
mengandung RNA hasil ekstraksi disentrifus 2-3 menit pada kecepatan 12.000
rpm, selama 15 detik.

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.6.2 PROSEDUR PELAKSANAAN
Supernatan dibuang, endapan dicuci lagi dengan 1 ml aseton, dirotasi dan
disentrifus pada 12.000 rpm selama 15 detik, kemudian supernatan kembali
dibuang. Aseton yang tersisa dalam endapan ( sedimen) diuapkan dengan membuka
penutup tabung dan dipanaskan dengan oven pada suhu 50-55 0C selama kurang
lebih 10 menit (Mochammad Hatta and Henk, L., Smiths., 2007. Boom, 1990).
Setelah sedimen mengering, TE buffer elusi ditambahkan sebanyak 60 ml kemudian
dirotasi secara merata sehingga sedimen dan suspensi tersebut dapat larut.
Kemudian tabung diinkubasi dalam oven pada suhu 56 0 selama 10 menit. Kemudian
campuran tersebut disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 detik .

BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.6.2 PROSEDUR PELAKSANAAN
Supernatan diambil secara hati-hati sebanyak 40-50

l dari supernatan dan

dimasukkan ke dalam tabung baru. Hasil ekstraksi disimpan pada suhu -80 0C
(Mochammad Hatta and Henk, L., Smits., 2007. Boom, 1990).

BAB IV
METODE PENELITIAN

Prinsip Real-time PCR (Polimerase Chain Reaction) adalah teknik yang digunakan

untuk menggandakan DNA target dari suatu sel yang diamati yaitu sel lekosit (netrofil
dan monosit) yang dilakukan untuk tujuan mengetahui kuantitas DNA target dengan
melihat ekspresi gen (kuantifikasi mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1), deteksi keberadaan
DNA target, menentukan jenis SNP (single Nukleotida Polimorphisme),

menentukan kurva Tm (Melting Curve) dan melakukan screening High Resolution

Melting (HRM).

Beberapa macam Aplikasi dari Real Time PCR yang dipilih adalah Analisa kuantifikasi
relatif atau disebut juga analisa ekspresi gen. Untuk aplikasi ini dibutuhkan target
mRNA hasil isolasi yang telah dikonversi menjadi cDNA. Analisanya dapat dilakukan
menggunakan kurva standar maupun tanpa kurva standar ( disebut juga dengan
comparative Ct).

BAB IV
METODE PENELITIAN

Interpretasi hasil
Nilai kuantifikasi relatif diperoleh dari normalisasi hasil target terhadap gen
housekeeping yang dimiliki oleh sel lekosit yang diamati

BAB IV
METODE PENELITIAN
Protokol Realtime Polymerase Chain Reaction (PCR)
Total mRNA diisolasi dari sampel darah yang diperoleh dengan protocol
menggunakan metode Boom. Kuantitatif real-time polymerase chain reaction
menggunakan BRILLIANT II SYBR dengan mengikuti instruksi produk. Primer
untuk VDR disintesis dengan menggunakan Macrogen (Korea), primer VDR; 5-3
dan R: 5-3.

Parameter siklus termal adalah 30 detik pada suhu 95 0C dan 40 siklus denaturasi pada
suhu 950C selama 10 detik kemudian annealing 600C selama 15 detik dan ekstensi pada
suhu 720C selama 40 detik. Semua pemeriksaan PCR diulang sebanyak 3 kali dan data
dianalisis dengan system deteksi instrument Mx4000 menggunakan metode perbandingan
ambang batas siklus (using the comparative threshold cycle method). Kurva standar dibuat
dan merupakan indikasi efisiensi amplikasi yang baik (90-100%).

BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
IV.7. DEFINISI OPERASIONAL DAN KRITERIA OBYEKTIF
IV.7.1. Definisi Operasional
Luka memar adalah luka yang terjadi karena trauma dari luar (trauma mekanik)
bukan karena penyakit pembuluh darah atau leukimia.
Umur luka memar adalah luka memar yang terjadi dikelompokkan berdasarkan
keterangan waktu terjadinya luka dari pasien. Masing-masing kelompok perlakuan
yaitu kelompok sehat, kelompok luka memar < 24 jam dengan atau tanpa riwayat
DM dalam keluarga, kelompok luka memar > 24 jam dengan atau tanpa riwayat
DM dalam keluarga.

BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
IV.7. DEFINISI OPERASIONAL DAN KRITERIA OBYEKTIF
IV.7.1. Definisi Operasional
Jumlah luka memar tidak terbatas adalah pasien yang masuk dengan luka memar
karena trauma dari luar (trauma tumpul) dengan jumlah luka yang tidak dibatas
Lokasi luka tidak terbatas
Ukuran luka dan warna memar adalah mengukur ukuran memar dengan
menggunakan batas warna luka sebagai batasan pengukuran, dan warna luka
yang di interpretasikan adalah mengurut warna yang paling dominan sampai yang
tidak dominan

BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
IV.7. DEFINISI OPERASIONAL DAN KRITERIA OBYEKTIF
IV.7.1. Definisi Operasional
kemudian mendokumentasikan gambar memar dan mencatatnya dan penentuan
ukuran memar berdasarkan batasan warna dari tepi luka terluar. Penentuan
ukuran luka yang diambil tidak dibatasi dan tidak membatasi dari ukuran
memaryang akan diteliti, namun akan mengelompokkan setiap pasien
berdasarkan umur dengan warna memar dan ukuran luka yang sama pada saat
analisa nanti.
Ekspresi mRNA IL-8 adalah gambaran mRNA IL-8 yang tampak pada hasil
pengujian dengan menggunakan teknik pemeriksaan real time PCR

BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
IV.7. DEFINISI OPERASIONAL DAN KRITERIA OBYEKTIF
IV.7.1. Definisi Operasional
Ekspresi mRNA MCP-1 adalah gambaran mRNA MCP-1 yang tampak pada
hasil pengujian dengan menggunakan teknik pemeriksaan real time PCR
Riwayat Diabetes Mellitus dalam keluarga adalah ada satu atau lebih keluarga
terdekat (ayah, ibu, adik atau kakak) yang di diagnosis oleh dokter dengan DM
ditegakkan berdasarkan diagnosa klinis (poliuri, polifagi, polidipsia, lemes dan
penurunan berat badan yang tidak dapat dijelaskan ditambah hasil pemeriksaan
gula darah sewaktu dengan kadar > 200c mg/dL.

BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
IV.7. DEFINISI OPERASIONAL DAN KRITERIA OBYEKTIF
IV.7.2. Kriteria Obyektif

Ekspresi mRNA IL-8 dan

mRNA MCP-1 merupakan hasil yang didapat

dengan menggunakan metode Real Time PCR kuantitatif dengan menggunakan

alat Real Time PCR skala numerik dan satuan logaritme
Kadar IL-8 dan kadar MCP-1 adalah hasil yang
didapat dari mikroplat pembaca dengan skala numerik dan satuan pg/ml
(picogram per mililiter)

BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
IV.8. Metode Analisis
Semua data yang diperoleh dari hasil penelitian, dicatat kemudian dilakukan
analisis yang sesuai yaitu :
Uji Independent sample T test membandingkan antara satu kelompok dengan
masing-masing kelompok lainnya.
Uji Korelatif Pearson, untuk menentukan hubungan antara dua kelompok
dengan skala numerik, dalam penelitian ini untuk menentukan hubungan antara
ekspresi mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1 dengan umur luka

BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
IV.9 Alur Penelitian

BAB V
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
V.A Hasil Penelitian
V.A.1. Gambaran Umum dan Karakteristik Sampel Penelitian

Pada penelitian ini dilaksanakan selama satu (1) bulan yaitu bulan April 2015 bertempat di RS.

Bhayangkara Makassar, dan sampel diperiksa di Laboratorium Mikrobiologi dan Biomolekuler Universitas

Hasanuddin Sampel darah peneltian diambil dari 25 pasien yang mengalami kekerasan karena trauma

tumpul yang memenuhi kriteria inklusi terbagi 3 (tiga) kelompok yaitu satu kelompok kontrol sebanyak 5

pasien sehat, dan sisa kelompoknya terdiri dari kelompok umur luka memar < 24 jam sebanyak 10 pasien

dengan atau tanpa riwayat DM dalam keluarga, >24 jam sebanyak 10 pasien dengan atau tanpa riwayat DM

dalam keluarga

BAB V
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
V.A.2. Deskripsi Karakteristik Subyek sampel
Karakteristik sampel penelitian ini dapat dilihat pada tabel berikut.
Tabel. 5.1. Data karakteristik sampel penelitian

Tabel. 5.2. Deskripsi luka

Tabel 5.2
memperlihatkan warna kulit memar untuk penentuan estimasi umur luka
berdasarkan parameter standar umur luka secara makroskopik yang selama ini
digunakan melalui perubahan warna memar terdapat perbedaan yang sangat besar
biasnya

dan

sangat

jauh

berbeda

hasil

interpretasi

pemeriksaan

bila

membandingkan dari hasil anamnesis langsung terhadap pasien yang diperiksa

yaitu sejak pertama terjadinya luka sampai pemeriksaan dilakukan.

 Data sampel pada tabel 5.3 diatas merupakan sampel berpasangan oleh karena
pasien yang diobservasi adalah pasien yang sama dan observasi pengukuran
dalam 2 waktu yaitu umur luka memar 8 jam ke 14 jam dan umur luka memar
28 jam ke 34 jam .

Hasil uji normalitas dengan shapiro-Wilk test pada tabel 5.4 memperlihatkan nilai
signifikan > 005. Hal ini menunjukkan bahwa data sampel berdistribusi normal
untuk semua kelompok baik pasien normal/ sehat (kontrol) maupun kelompok
umur luka <24 jam (8 jam dan 14 jam) dan kelompok >24 jam (28 jam dan 34
jam).

BAB V
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Prosedur pengambilan, penyimpanan dan pemeriksaan ekspresi mRNA IL-8 dan
ekspesi mRNA MCP-1 mengikuti ketentuan standar prosedur yang sudah
ditentukan yaitu pengambilan darah 3 cc dimasukkan kedalam tabung L6
sebanyak 1 cc

dan sisa

darah dimasukkan ke dalam tabung EDTA untuk

penyimpanan sampel dengan suhu penyimpanan -20 0C.

 Penelitian ini memperlihatkan ekspresi mRNA interleukin-8 (IL-8). IL-8

merupakan sitokin jenis chemokine family CXC dan ekspresi mRNA
Monocyte Chemoacctractant Protein-1 (MCP-1). MCP-1 adalah sitokin yang
sekarang lebih dikenal dengan nama chemokine. MCP-1 merupakan salah satu
jenis chemokine family CC. Sitokin adalah protein sistem pertahanan tubuh
yang dihasilkan ketika tubuh kita menemukan sebuah stimulus .

BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
VI.1 Kesimpulan
Terdapat perbedaan yang bermakna antara ekspresi mRNA IL-8 pasien sehat dan
Ekspresi mRNA IL-8 pada keadaan terjadinya luka memar 8 jam, 14 jam, 28 jam
dan 34 jam
Terdapat hubungan peningkatan yang signifikan bermakna pada ekspresi mRNA
IL-8 dari kelompok umur luka memar 14 jam ke 28 jam dan ke 34 jam.
Terdapat hubungan peningkatan yang signifikan bermakna pada ekspresi mRNA
MCP-1 dari kelompok umur luka memar 28 jam ke 34 jam.

 Tidak terdapat hubungan yang kuat antara ekspresi mRNA IL-8 dengan mRNA
MCP-1 karena diumur luka yang sama baik pada ekspresi mRNA IL-8 dengan
ekspresi mRNA IL-8 MCP-1 memperlihatkan ekspresi mRNA sama-sama
naik pada jam umur luka yang sama.
Hasil ekspresi mRNA IL-8 maupun ekspresi mRNA MCP-1 di umur luka
24 jam tetap memperlihatkan peningkatan

>

BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
VI.2. Saran
Banyaknya faktor up regulation dan down regulation

yang mempengaruhi

ekspresi mRNA IL-8 dan ekspresi mRNA MCP-1, sehingga penelitian ini penting
untuk dilanjutkan untuk mengetahui seberapa besar pengaruhnya terhadap penentuan
umur luka melalui pemeriksaan ekspresi mRNA IL-8 dan mRNA MCP-1 dengan
marker lain yang bekerja pada sel yang sama.
Sebaiknya perlu observasi intake makanan dan minuman sebelum pengukuran
ekspresi mRNA IL-8 dan ekspresi mRNA MCP-1 di jam ke dua pengukuran
berikutnya. Hal ini untuk melihat seberapa besar persentase pengaruhnya terhadap
ekspresi mRNA IL-8 dan ekspresi mRNA MCP-1 dalam rangka melihat apakah
terdapat faktor pembiaran dan penelantaran terhadap kasus-kasus kriminal

 Perlu melakukan pengukuran pada

kasus-kasus luka terbuka untuk melihat

seberapa besar pengaruh besarnya luka

terhadap ekspresi mRNA. Hal ini

bertujuan untuk membantu korban-korban mati berbicara melalui ekspresi

mRNA. Sehingga membantu hakim dalam memutuskan berat hukuman yang
harus diberikan kepada pelaku kejahatan.
Sebaiknya dilakukan pemeriksaan kadar MCP-1 pada semua mencit sebelum
penelitian dimulai ( sebagai kontrol internal).

 Keterbatasan pengukuran luka hanya sampai pada umur luka 34 jam

sehingga perlu pengukuran waktu umur luka > 34 jam. Hal ini penting
melihat di jam umur luka berapa ekspresi mRNA IL-8 dan ekspresi mRNA
MCP-1 menurun. untuk membuktikan kebenaran peran monosit >24 jam
menggantikan netrofil setelah 24 jam