PENDAHULUAN

PENGANTAR MIKROTEKNIK
JARINGAN HEWAN
Oleh:
Eko Prasetya, M.Sc.
PERSYARATAN MATA KULIAH
 Biologi Umum
 Biologi Sel
 Struktur Hewan
 Anatomi Tumbuhan
KUALIFIKASI MAHASISWA
 Memahami sifat structural dan fungsional sel dan jaringan
 Memahami tentang pembuatan larutan, baik larutan
tunggal maupun larutan majemuk
 Memahami sifat zat dan larutan demi keamaan
penggunaan larutan dan zat tersebut
 Memahami prinsip kerja di laboratorium
PARAFFIN METHOD
Cairan di dalam jaringan diganti denga parafin. Jaringan
tersebut kemudian dipotong menggunakan mikrotom pada
ketebalan 1 hingga 30 m. Jaringan yang telah dipotong
kemudian dipasangkan pada objek glass (slide), diberi
pewarna dan diamati menggunakan mikroskop.
 SKENARIO UMUM MIKROTEKNIK
Koleksi
Fiksasi Pencucian Dehidrasi Penjernihan
Jaringan

Hidrasi Penempelan Penyayatan Imbedding Infiltrasi

Penutupan
Pewarnaan Dehidrasi Penjernihan
(mounting)
RUANG KERJA – PEMBEDAHAN SAMPEL
PENGAMBILAN SAMPEL
FIKSASI
TUJUAN FIKSASI
 Proses ini adalah menetapkan jaringan dalam keadaan
fisik dan kimia sehingga tidak akan terjadi perubahan
pada proses selanjutnya.
 Tahapan ini dilakukan dengan menggunakan senyawa
kimia yang disebut dengan larutan fiksatif.
 Fiksasi mencegah terjadinya autolisis ataupun
dekomposisi bakteri dengan mempertahankan keadaan
jaringan dalam keadaan alami dan menetapkan semua
komponen.
FIXATIVE SOLUTION
 Buffered formalin (light microscope preparation)
 Buffered gluteraldehyde (electron microscope preparation)
 Osmium tetraoxide (electron microscope preparation, preserve and stain)
 Zenker’s formal saline
 Bowen’s fluid
SLICING
 Tidak ada larutan
fixative yang akan
menembus jaringan
dengan ketebalan lebih
dari 1 cm
MEMPERSIAPKAN BAKI SLIDE
SAMPEL DITEMPATKAN PADA BAKI SLIDE
PEMBERIAN LABEL PADA BAKI SLIDE
BAKI SLIDE YANG BERISI SAMPEL DIFIKSASI
SELESAI DIFIKSASI, SAMPEL DICUCI
TISSUE PROCESSING
TUJUAN TISSUE PROCESSING
 Agar jaringan dapat stabil ketika dipotong dengan pisau
mikrotom dengan cara mempersiapkan struktur jaringan
yang keras dan konsisten.
 Sifat stabil ini dapat diberikan dengan menggunakan lilin
parafin, berbagai jenis reagen, atau dengan pembekuan.
TISSUE PROCESSING TERDIRI DARI 2 JENIS:

Mechanical
Manual Tissue
Tissue
Processing
Processing
MECHANICAL TISSUE PROCESSING
 Pada jenis ini, jaringan dipindahkan dari larutan satu ke
larutan lainnya menggunakan perangkat mekanik.
 Pengaturan waktu disesuaikan dengan kebutuhan secara
digital.
 Suhu diatur berkisar  60oC
 Dapat berjalan sepanjang hari, memiliki 12 bak dan waktu
hingga 16 jam.
 DEHIDRASI
 Tahapan ini menghilangkan semua kandungan air di dalam
jaringan.
 Jaringan di dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat.
 Air dalam jaringan akan tergantikan keluar secara difusi dan
digantikan oleh alkohol
 Langkah selanjutnya, alcohol akan digantikan oleh lili paraffin.
 Karena paraffin tidak larut dalam alcohol, maka alcohol diganti
dengan zat yang dapat melarutlan lilin. Tahapan ini disebut
CLEARING.
ALKOHOL BERTINGKAT
 CLEARING
 Pada tahapan ini, cairan dehidrasi
diganti dengan cairan yang dapat
bercampur dengan cairan dehidrasi
(alkohol) dan media tanam (parafin).
 Beberapa reagen CLEARING
adalah:
- Xylene
- Toluene
- Chloroform
- Benzene
INFILTRATION
 Pada tahapan ini, jaringan
direndam dalam bak yang
berisi lilin paraffin cair.
 RINGKASAN TAHAPAN TISSUE PROCESSING
Fixation Clearing:
1. 10 % Formalin saline (I) for 1.5 hours 1. Xylene (I) for 1.5 hours
2. 10 % Formalin saline (II) for 1.5 hours 2. Xylene (II) for 1.5 hours

Dehydration Infiltration:
1. 80 % alcohol for 1 hour 1. Paraffin wax (I) for 1.5 hours
2. 95 % alcohol (I) for 1 hour 2. Paraffin wax (II) for 1.5 hours
3. 95 % alcohol (II) for 1 hour
4. Absolute alcohol (100%) (I) for 1 hour
5. Absolute alcohol (100%) (II) for 1 hour
6. Absolute alcohol (100%) (III) for 1 hour
 EMBEDDING (PENANAMAN)
 Embedding adalah proses dimana jaringan yang telah
diproses oleh zat selama infiltrasi dipadatkan sehingga
memberikan struktur yang stabil selama pemotongan.
 Tujuannya agar jaringan ditransfer ke cetakan (baki slide)
yang telah diisi dengan parafin cair dan dibiarkan hingga
dingin dan mengeras.
 Setelah padat, baki slide yang berisi lilin kemudian disayat
untuk mendapatkan sayatan tipis preparat.
JARINGAN DALAM BAKI SLIDE
BAKI SLIDE (CETAKAN)
LILIN PARAFIN
 Parafin adalah campuran polikristalin dari hidrokarbon
padat. Lilin parafin secara umum dipasarkan dengan titik
leleh yang berkisar dari 39 °C hingga 68 °C
 Embedding Centre
Molten wax (60°C)
(reservoir)
Used lids Heated chambers

Wax flow adjuster Mould

Hot surface Cassette

Cold plates (-5°C)

Wax dispenser
PROSEDUR UMUM EMBEDDING
Mengisi cetakan dengan lilin parafin
 PROSEDUR UMUM EMBEDDING
Gunakan forceps (sejenis pinset) untuk memilih dan
memindahkan jaringan ke dalam paraffin dengan hati-hati
PROSEDUR UMUM EMBEDDING
Rapikan posisi jaringan dalam cetakan
Penempatan jaringan pada
cetakan menjadi tahapan penting
karena sangat mempengaruhi
hasil akhir pengamatan.

Penempatan jaringan
disesuaikan dengan tujuan
pengamatan.
PROSEDUR UMUM EMBEDDING
Dinginkan cetakan agar paraffin memadat
PROSEDUR UMUM EMBEDDING
Cetakan yang telah didinginkan
PROSEDUR UMUM EMBEDDING
Lepaskan paraffin blok dari cetakan
PROSEDUR UMUM EMBEDDING
Parafin yang telah dilepaskan
 PROSEDUR UMUM EMBEDDING
Parafin yang berlebihan kemudian diiris untuk menghilangkan
kelebihan paraffin di permukaan
SECTIONING (PEMOTONGAN)
 Ini adalah prosedur di mana paraffin blok yang telah cetak
dipotong tipis dengan ketebalan beragam sesuai dengan
kebutuhan.
 Alat yang digunakan untuk pemotongan disebut dengan
Microtome
PROSEDUR PENYAYATAN
Pita hasil pemotongan
Alat
Pengendali
Pemotongan
 Bak Pengapung Jaringan

 Bak yang berisi air dengan

suhu terkontrol.
• Dipertahankan pada suhu 5-
6oC dibawah titik leleh dari
paraffin yang digunakan.
Bagian Parafin yang Diratakan
 Slide yang mengapung kemudian diambil.

Perakat yang digunakan untuk menetapkan posisi sayatan dalam objek glass
(slide) adalah larutan albumin (Albumin Mayer)
 HIDRASI
Dilakukan perendaman kembali untuk menghilangkan paraffin pada jaringan
 HIDRASI

Hasil sayatan pada Slide

Datar, tidak ada perenggangan,

tidak ada gelembung udara, dan
tidak ada patahan
PEWARNAAN (STAINING)
PERALATAN UNTUK PEWARNAAN
SLIDE RAK
SLIDE RAK
SLIDE RAK
LARUTAN PEWARNA
PEWARNA
Jenis-jenis pewarna:

 Pewarna asam
 Pewarna basa

 Tahapan Pewarnaan:
a. Rehidrasi
b. Pewarnaan
c. dehydration
 PEWARNA ASAM
Dalam Pewarna Asam:
 Komponen basa biasanya berwarna sedangkan komponen
asam biasanya tidak berwarna
 Pewarna asam memiliki komponen yaitu Eosin yang memberi
warna pada Sitoplasma
 Warna yang ditampilkan biasanya berwarna merah-ungu
PEWARNA BASA
Dalam Pewarna Basa:
 Komponen basa biasanya berwarna sedangkan komponen
asam biasanya tidak berwarna
 Pewarna basa memiliki komponen yaitu Hematoxylin
yang memberi warna pada nucleus.
 Warna yang ditampilkan biasanya berwarna biru.
Hematoxylin dan Eosin adalah pewarna umum yang digunakan dalam analisis histologi
Hasil:
Nukleus berwarna Biru
Sitoplasma berwrna Pink
SPECIAL STAINS
 Ketika komponen jaringan tertentu misalnya jaringan
berserat, jaringan elastis, inti sel akan diwarnai, pewarna
khusus tertentu digunakan yang secara spesifik mewarnai
jaringan komponen tersebut.

Examples:
1. PAS (Periodic acid–Schiff)
2. Masson’s trichrome
3. Silver
Normal glomerulus of kidney is stained with H&E
 Normal glomerulus of kidney is stained with PAS
Detects glycogen, glycoproteins, glycolipids and mucins in tissues
Masson Trichrome Stain
 Nuclei stain black or blue-black
• Muscles stain red
• Collagen and mucus stain green or blue
• Cytoplasm of most cells stains pink

Normal glomerulus of kidney is stained with Masson trichrome

Normal glomerulus of kidney is stained with Methenamine silver
Silver stains reticular fibers (type III collagen)
BEBERAPA PEWARNA KHUSUS
 HE: pengecatan rutin, inti sel biru, sitoplasma merah
 Wright: darah dan sutul, inti biru sitoplasa merah
 Mallory Azan (M.A): sabut jar. Ikat biru, otot merah
 Verhoef van Gieson (VvG): sabut elastis hitam, lainnya kuning
pucat
 Impregnasi Perak: sabut retikuler hitam, sabut kolagen kuning
 Periodic acid Schiff (P.A.S): sabut retikuler dan elastis magenta
 Asam osmic: lemak Hitam
 Sudan IV : lemak Merah
MANUAL STAINING
MANUAL STAINING
AUTOMATIC STAINER
AUTOMATIC STAINER
AUTOMATIC STAINER
MOUNTING
 Bagian berwarna pada slide mikroskop dipasang
menggunakan medium pemasangan yang dilarutkan dalam
xilena.
 Contoh larutan yang larut dalam xylen: DPX (Distrene
Dibutyl phthalate Xylene)
 Penutup kaca ditempatkan diatas untuk melindungi
sampel.
Dengan parafin Parafin remove After Staining
elearningfmipa.unimed.ac.id