ISOLASI DNA

DNA
• Asam deoksiribonukleat
merupakan molekul yang terdiri
atas dua rantai polinukleotida
berbentu utas ganda helix yang
dihubungkan melalui ikatan
hidrogen, yang menyimpan
informasi genetik.
• Penyusun nukleotida: gula, basa
nitrogen, fosfat.
• Fungsi DNA: menyimpan informasi
genetik, sintesis protein.
• Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh ilmuwan asal Swiss bernama
Friedrich Miescher pada tahun 1869. Ia menemukan senyawa asam
yang mengandung nitrogen dan fosfat pada inti sel dari sel darah
putih. Senyawa ini diberi nama nuklein, namun pada tahun 1889
muridnya yaitu Richard Altmann menamainya asam nukleat .
• Metode yang digunakan oleh Miescher adalah alkalyne lysis untuk
memecahkan sel dan mengisolasi DNA.
• Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau
dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni
kandungannya
Tahapan Isolasi DNA Genom

Lisis Sel Pemurnian Pemekatan

Prosedur Isolasi DNA
1. Timbang 50 g limpa, masukkan dalam 200 mL buffer fosfat salin (Phosphate buffer saline –
PBS), kemudian dihomogenisasi.
2. Suspensi dipindahkan ke tabung sentrifugasi sebanyak 15 mL menggunakan gelas ukur.
3. Sentrifugasi suspense pada 2500 rpm selama 15 menit. Endapan disuspensi kembali
dengan 15 mL PBS.
4. Buang supernatant dan sedimen ditambahkan larutan NaCl 2 M hingga volume akhir 15 mL.
5. Suspensi disimpan dalam lemari pendingin selama semalam, kemudian disentrifugasi pada
10.000 rpm selama 15 menit.
6. Ambil 1,5 mL sampel yang telah disimpan semalam, masukkan ke tabung Eppendorf
7. Simpan supernatant, dan tambahkan supernatant secara perlahan pada 2 volume etanol
100%
8. Benang putih halus akan terbentuk pada pengaduk kaca.
9. Simpan benang DNA, cuci dengan 75% etanol dan larutkan dengan buffer salin.
10. Simpan pada freezer hingga saat akan digunakan.
• Limpa: mengandung banyak DNA, aktivitas deoksiribonuklease rendah.
• Fungsi bufer salin: memberikan suasana pH darah normal, 7,35-7,4, menghambat
aktivitas Dnase dengan mengikat ion Mg dan Ca.
• Sentrifugasi ke-1: memisahkan molekul berdasarkan beratnya. DNA terdapat pada
bagian endapan.
• Sentrifugasi ke-2: resuspensi dengan bufer salin -> lisis sel, intisel mengendap (maka
yang diambil endapan).
• NaCl 2M: larutan hipertonis, lisis sel, ekstraksi DNA, sehingga DNA dan protein terpisah.
• Sentrifugasi ke-3: mengendapkan protein, ambil supernatan (DNA terkandung pada
supernatan).
• Etanol 96%: mengendapkan DNA.
ISOLASI DNA DARI
DARAH
Isolasi DNA Genom dari Darah segar menggunakan
Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)
 Preparasi Masukkan 300 µL
darah ke tabung
+ 900 µL RBC Lysis
Buffer, campurkan Inkubasi 10 menit,
Sentrifugasi 5 menit,
3000 rcf, buang
+100 µL RBC lysis
buffer, resuspend
dengan bolak-balik. suhu ruang
Sampel Eppendorf 1,5 mL
JANGAN DIVORTEX
supernatan pellet leukosit

Step 1 Lisis +200 Buffer GB,

Inkubasi 60 C,
minimal 10 menit.
selama inkubasi,
bolak-balik tiap 3
kocok kuat
Sel Pastikan lisat jernih menit

+200 µL etanol
Step 2 DNA absolut., segera
kocok kuat selama
Tempatkan GD
column pada 2 mL
transfer campuran
ke GD column,
buang tabung
pengumpul, ganti
sentrifuge 16000 rcf,
Binding 10 detik. endapan
harus larut semua
tabung pengumpul
5 menit
yang baru

buang flow-through
Step 3 +400 µL Buffer W1
ke GD column,
(yang ada di tabung
pengumpul).
+600 µL Wash Buffer
sentrifuge 16000 rcf,
60 detik. buang flow-
tempatkan kembali
GD column,
sentrifuge 16000 rcf, ke GD Column sentrifuge 3 menit
Wash 60 detik
tempatkan lagi
dengan GD column
through
16000 rcf

Step 4 Elusi transfer GD column

+100 µL Elution
buffer ke CENTER
Diamkan min. 3 sentrifuge 16000
ke tabung Eppendorf menit selama 3 menit
DNA matriks column