Tugas Teknologi Fermentasi

Immobilization of lipases on lignocellulosic bamboo powder for

biocatalytic transformations in batch and continuous flow
Oleh :
Aidhilla Fitri – 2020412011

Dosen Pengampu :
Prof. Dr. Sumaryati Syukur
Latar Belakang dan Tujuan
LIPASE

INDUSTRI BIOKATALIS IMOBILISASI ENZIM

ADSORPSI FISIK

S
MATRIK
LIMBAH
AGROINDUSTRI
BERBASIS
LIGNISELULOSA
TUJUAN :
IMOBILISASI MENGGUNAKAN METODA ADSORPSI FISIK PADA
CANDIDA ANTARTICA LIPASE B DAN RHIZOMUCOR MIEHEI LIPASE
PADA BUBUK BAMBU SERTA PENGGUNAANYA UNTUK SINTESIS
ETIL PALMITAT, HIDROLISIS MINYAK ZAITUN DAN LARUTAN
KINETIK RASEMAT 1-FENILETANOL SECARA BATCH DAN DALAM
PROSES ALIRAN KONTINU
 DASAR TEORI
KATALIS Dapat mempercepat/memperlambat reaksi

Sifat-Sifat Katalis
- Katalis tidak mengalami perubahan yang kekal saat reaksi,
namun mungkin saja terlibat pada mekanisme reaksi
- Katalis mempercepat laju reaksi, tetapi tidak merubah jenis Jenis- Jenis Katalis
dan jumlah hasil reaksi 1. Katalis homogen
- Katalis menurunkan energy aktifasi reaksi, namun tidak 2. Katalis heterogen
merubah perubahan entalpi reaksi 3. Autokatalis
- Katalis merubah mekanisme reaksi dengan menyediakan 4. Biokatalis
tahapan reaksi yang mempunyai energi aktivasi lebih rendah 5. inhibitor
- Katalis mempunyai aksi spesifik, artinya hanya dapat
mengkatalis satu reaksi tertentu
- Katalis hanya diperlukan dalam jumlah terbatas
- Katalis dapat diracuni oleh zat tertentu, sehingga menjadi
tidak aktif sebagai katalis lagi
 merupakan biomolekul protein yang
BIOKATALIS enzim berfungsi untuk mengkatalisis reaksi-reaksi
kimia yang terjadi pada makhluk hidup,dan
senyawa yang dikatalisis disebut substrat.

Bagian-bagian enzim
Mekanisme Kerja Enzim Spesifitas Enzim

• spesifitas absolut dimana enzim hanya

mengkatalisis satu jenis reaksi saja
• Spesifik terhadap gugus fungsi dimana enzim
dapat mengkatalisis substrat dengan gugus
fungsi tertentu.
• spesifik terhadap ikatan-ikatan kimia tertentu
• spesifik terhadap stereokimia tertentu.
Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim

Suhu

pH

Konsentrasi enzim

Konsentrasi substrat

Adanya kofaktor dan inhibitor

 JENIS-JENIS REAKSI YANG DIKATALISIS LIPASE
LIPASE

Enzim mengkatalisis hidrolisis

trigliserida yang tersebar luas
banyak diorganisme

Stuktur Lipase
 CAL-B adalah enzim dari kelompok lipase, yang diisolasi
dari spesies Candidaantartika

Bentuk asli CAL-B aktif pada kisaran pH 6-10, dan titik

isoelektriknya adalah 6,8.

enzim ini adalah salah satu solusi yang paling tepat dan
efektif dalam memperoleh senyawa organik untuk aplikasi
Candida antartica
dalam kedokteran dan farmasi

Rhizomucor merupakan jamur berserabut yang ditemukan

ditanah dan buah serta sayuran yang telah membusuk

Rhizomucor miehei
 IMMOBILISASI ENZIM Modifikasi bentuk enzim terlarut menjadi tidak larut

Enzim yang secara fisik ditahan atau dikurung di dalam suatu ruang
tertentu dengan tetap mempertahankan aktivitas katalitiknya

Keuntungan :
Kelemahan :
1. Dapat digunakan berulang
1. Biaya carier / penyangga dan proses
2. Pemisahan produk lebih cepat
imobilisasi cukup besar
3. Penghentian proses cepat
2. Terjadi perubahan karakteristik enzim
4. Kestabilan lebih baik
3. Aktivitas enzim hilang selama imobilisasi
5. Produk tidak terkontaminasi enzim
Metoda imobilisasi enzim
 Adsorbsi fisik

Mudah dilakukan dan ekonomis

Enzim diadsorbsi pada permukaan “carrier”

Kelebihan
1. Kondisi lunak sehingga aktivitas enzim tetap
tinggi
2. Dapat diregenasi

Kekurangan :
1. Kekuatan ikatan lemah
2. Enzim dirusak oleh mikroba/enzim proteolitik
 Lignoselulosa adalah komponen polisakarida di alam yang
berlimpah danterdiri atas tiga tipe polimer, yaitu selulosa,
hemiselulosa dan lignin.

Dendrocalamus gigantus
PRODUK REKOMBINAN MODIFIKASI BAHAN

FERMENTASI INDUSTRIAL

BIOMASSA ENZIM PRODUK METABOLIT

CARA KERJA Transformations were plated onto
chloramphenicol (35mg/L) and ampicillin
KLONING dan EKSPRESI (100mg/L) plates and incubated at 37°C
overnight.

A gene encoding Candida antarctica CalB residues A19-

P342
The gene was inserted into a modified pET23-based
expression vector using NdeI/BamHI restriction sites
The resulting plasmid was named pHIA633
Glycerol stocks were made from the
strain safter two round sofre plating
single colonies. Stocks were stored at −
70°C.

Phia633 were transformed into the E.coli K12 strain

BW25113 using calcium chloride

1μL of each plasmid was added to 50μl of competent

cells, incubated on ice for30 min and then heat-shocked at
42°C for 45s, and incubated again on ice for 2 min. 200μL
superoptimalbroth (SOB) media was added and the tubes
were placed in a shaking incubator at 37°C for 1h
The expression strain was streaked onto selective plates
and in-cubated at 37°C overnight
The following morning, a single colony was picked and a
starter culture was prepared.
For small scale expression, starter cultures comprising of
2mL of Luria-Bertani (LB) media suplemented by 2g/L
glucose and appropriate antibiotics were incubated at
30°C/250 rpm for 5h. A1:100 dilution of this pre culture
was used to inoculate the primary culture comprised of
50mL auto induction media
The supernatant was removed and the cells were
resuspended in 50 ml of 50 mM phosphate buffer
pH 7.4, supplemented with 20mg/LDNAse and
100mg/Llysozyme. The cultures were incubated at
room temperature for 10min before freezing to allow
action of the lysozyme. Cells were lysed by
repeating a freeze-thaw cycle twice.
The purification was developed using a commercial
FPLC system

With appropriate antibiotics in a 500 mL conical flask

sealed with an oxygen permeable membrane. Cultures
were grown for 17h at30 °C/250 rpm

the temperature was then dropped to 20 °C and 0.5mM of

IPTG added (BW25113 cells can not autoinduce). After
24h growth, the cells were harvested. Cells were collected
by centrifugation(3220g,20min,+4°C).
CARA KERJA
KARAKTERISASI FISIK BAMBU KARAKTERISASI FISIK BAMBU
PREPARASI BAMBU
MURNI MURNI

Bambu berumur 4 tahun Karakterisasi bambu sodium dodesil sulfat 1% (75mL)

dikumpulkan menggunakan SEM dan AFM ditambahkan pada 3 g serbuk
bambu

Serbuk bambu dicuci dengan Diaduk selama 2 jam pada suhu

aquades pada suhu 500C 900C

Serbuk bambu kemudian Disaring kemudian dicuci dengan

dikeringkan pada suhu 500C air suling

Ditambahkan 150 mL heksana ke

dalam 3 g sebuk bambu

Campuran diaduk selama 4 jam

pada suhu kamar dan disaring,
lalu dikeringkan pada suhu kamar
 Imobilisasi enzim pada pelekatan
Imobilisasi enzim pada adsorpsi fisik kimiawi

Bubuk bambu 1 g ditambahkan

Larutan lipase 2mL diencerkan dalam APTES 10 mL yang dilarutkan dalam
10 mL 25mM buffer fosfat pH 7 tetrahidrofuran 100 mL

Campuran diaduk pada suhu kamar

Tambahkan ke matriks 1 g kedalam
selama 3 jam kemudian dikeringkan
laruran lipase

Bubuk kemudian ditambhkan ke larutam yang

Campuran diaduk selama 24 jam mengandung 4mL glutaraldehid dan 20 ml fosfat
pada suhu 25 C 50mM pH 7 kemudian diaduk selama 24 jam

Produk dicuci dengan air suling

Disaring kemudian dikeringkan pada
suhu kamar Hasilnya kemudian ditambahkan ke larutan lipase
bebas 2ml yang dilarutkan dalam 10 mL buffer
fosfat

Campuran diaduk selama 24 jam pda suhu 40C,

kemudian disaring dan dikeringkan pada suhu
kamar.
Karakterisasi fisik dan kimia bambu murni
Evaluasi imobilisasi
dan enzim amobil pada bambu

Analisis menggunakan FT-IR. Performa esterifikasi dengan sintesis etil palmitat

Analisis Brunauer Emmett Teller. Dengan menambahkan 30 mg biokatalis

Ditentukan dengan menentukan oenentuan terimobilisasi pada media reaksi ( 1;1 asam
luas permukaan dan diameter pori murni palmitat/etanol, dalam 100mM n-heptana)

Analisis termogravimetri dengan instrument

perkin helmer menggunakan sampel Reaksi dilakukan pada 50C dengan pengadukan
platinum yang mengandung sekitar 10 mg 200 rpm. Kuantifikasi ester yang terbentuk
dari setiap enzim yang diimobilisasi. dilakukan dengan analisis GC-FID

Setiap sampel dipanaskan dari 35 – 800 C

pada 10C/menit.

Penurunan berat dicatat

 Evaluasi imobilisasi
Uji hidrolisis aktivitas hidrolitik minyk zaitun
10 mg enzim ditambahkan ke 19 ml emulsi
yang dibuat (minyak zaitun 5% w/v) getah arab
(5%w/v) dalam buffer natrium fosfat pH 7
Reaksi dilakukan dalam pengadukan 200 rpm
pada 37 C selama 30 menit
Reaksi kemudian dihentikan lalu ditambahkan
campuran aseton-etanol (1:1v/v) dan dititrasi
hingga titik akhir dengan larutan NaOH 0.04 M
Tes kemudian dilakukan dengan enzim native
Eksperimen Batch
Rac-1-phenylethanol, vinyl acetate
ditambahkan kedalam enzim amobil dan
direaksikan pada 60 C selama 48 jam.
Kemudian dianalisis kiral GC-FID
Eksperimen aliran berkelanjutan
Proporsi yang sama dari eksperimen batch
dimasukkan kedalam kolom, kemudian
dipompa oleh pompa jarum suntik ke sistem
selama 10 menit
Analisis kromatografi
Hasil
Reaksi esterifikasi etil palmitat digunakan sebagai model reaksi untuk memverifikasi efisiensi imobilisasi CalB melalui ikatan
kovalen dan adsorpsi fisik.
Untuk meningatkan efisiensi imobilisasi dengan adsorpsi fisik dilakukan penghilngan kotoran dari permukaan bamboo
dengan cara melakukan esterfikasi asam palmitat dan hidrolisis minyak zaitun menggunakan 3 perlakuan.
kesimpulan

Adsopsi fisik dari dua lipase ( Candida antartica lipase B dan Rhizomucor miehei lipase) pada bubuk bambu
lignoselulosa alami berhasil untuk esterifikasi asam lemak, hidrolisis minyak zaitun dan resolusi kinetik 1-
fenetanol.

Aktifitas enzimatis stabil dam dapat diaplikasikan dalam industri mengingat biaya rendah dari biomassa
bambu yang melimpah dan imobilisasi yang sederhana
https://www.rcsb.org/structure/1OIL

10.1016/s0969-2126(97)00177-9