Pendahuluan buat dibaca-baca aja

BIOKATALIS, ENZIM DAN BIOTRANSFORMASI

Theresia Umi Harwati & Bambang Sunarko
Kenapa biokatalis penting?
Biokatalisis, suatu reaksi kimiawi yang menggunakan katalis biologis (biokatalis),
merupakan metoda yang tidak asing dalam proses sintesis kimia organik di ranah
akademis maupun dalam tataran industri. Sampai saat ini, metoda tersebut banyak
berperan dalam industri kimia dan farmasi, industri pangan dan pakan, serta dalam
pengelolaan limbah dan remediasi lingkungan. Sehingga, tidaklah mengherankan,
bila biokatalisis dianggap sebagai komponen penting dan bagian yang tak
terpisahkan dari industri life-science. Di masa depan, peranan biokatalisis juga akan
semakin penting dalam industri kimia modern. Metode ini akan menjadi proses inti
untuk memproduksi senyawa yang sulit atau tidak dapat dilakukan dengan teknikteknik kimia konvensional, seperti dalam sintesa senyawa-senyawa yang bersifat
regio-, enansio- dan stereoselektif.
Seperti kita ketahui, kebanyakan farmaseutika adalah molekul-molekul khiral. Inilah
salah satu alasan mengapa saat ini industri mulai melirik biokatalisis dan
memanfaatkan biokatalis secara ekstensif untuk memproduksi precursor dan
ingradien penting untuk produksi farmaseutika. Dan tampaknya, lambat laun
biokatalisis mulai menggeser dan menjadi pesaing utama metode sintetik
konvensional, yang selama ini digunakan sebagai sarana untuk memproduksi
molekul-molekul khiral sebagai bahan baku industri farmasi. Semakin pentingnya
peran biokatalisis, dan juga biokatalis, dalam industri, dapat dibuktikan dengan
kenyataan bahwa saat ini pasar biokatalis (enzim saja) dalam bisnis global
mencapai 1 milyar dolar Amerika.
Biokatalis, yang berupa enzim, sel mikroba (hidup atau mati), yang terikat dalam
matriks atau bebas, secara tradisional telah digunakan untuk mengkonversi bahan
baku yang berasal dari bahan organik atau bahan baku yang terbarukan. Namun,

pemanfaatannya terus meluas, sehingga digunakan juga untuk mengolah material

yang berasal dari bahan bakar fosil. Pemanfaatannya juga begitu beragam, dari
biotransformasi senyawa khiral secara enzimatis untuk produksi obat sampai
desulfurisasi bahan bakar diesel menggunakan mikroba. Dalam skala industri,
misalnya, biokatalis telah digunakan untuk produksi fruktosa, aspartame, penisilin
semi sintetik dan obat kanker.
Selain itu, biokatalisis dianggap sebagai representasi dari suatu strategi yang
menjanjikan dalam menopang konsep green chemistry. Seperti kita ketahui, isu-isu
lingkungan merupakan hal yang penting bagi industri. Pemikiran untuk menekan
polusi telah meningkatkan ketertarikan mereka terhadap produk dan proses kimia,
yang ramah lingkungan, dapat menekan jumlah limbah dan konsumsi energi, serta
yang memihak pada penggunaan sumber daya terbarukan daripada bahan baku
berbasis petroleum. Dan tampaknya biokatalisis, secara ideal dapat memenuhi
tuntutan itu.
Enzim sebagai biokatalis
Sebagai biokatalis, enzim mempunyai karakteristik yang sangat menarik untuk
industri: sangat spesifik, aktif dalam kondisi normal, mudah didapat, dan ramah
lingkungan. Daya pikatnya berasal dari selektivitasnya yang tinggi, aktif dan bekerja
dalam kondisi normal, serta limbah yang dihasilkan mudah dituntaskan. Selain itu,
reaksi-reaksi yang dijembataninya seringkali mempunyai kemo-, regio- dan
stereospesifitas yang tinggi. Secara umum, enzim digunakan sebagai katalis dalam
beragam reaksi, seperti hidrolisis, transesterifikasi, resolusi kinetik dari campuran
rasemat, dan lain-lain. Industri proses kimia juga mulai menyadari bahwa enzim
bukan hanya efektif sebagai katalis dalam transformasi senyawa-senyawa alami
dalam sistem kehidupan, namun juga dapat berperan dalam reaksi serupa dengan
senyawa-senyawa

non-alami.

Atas

dasar

kelebihan-kelebihan

ini,

enzim

dimanfaatkan untuk mengkatalisis beragam reaksi-reaksi organik dan banyak

dilibatkan dalam industri pangan, deterjen, diagnostik, kimia dan farmasi. Sebagai
ilustrasi betapa beragamnya kegunaan biokatalis dalam sintesis kimia, pada Tabel 1

ditampilkan beberapa contoh senyawa-senyawa kimiawi yang diproduksi secara

enzimatis.
Bila enzim akan dimanfaatkan sebagai biokatalis, maka faktor-faktor berikut yang
perlu mendapat diperhatikan:
Spesifitas. Secara umum, enzim bersifat sangat spesifik; dapat bersifat substrat
spesifik (selektif terhadap senyawa atau kelompok senyawa tertentu),
atau regio-spesifik, atau stereospesifik (selektif hanya terhadap salah satu
stereoisomer)
Kofaktor. Untuk bisa berfungsi, beberapa enzim memerlukan keberadaan materi
lain, yang disebut sebagai kofaktor. Ada dua macam kofaktor; tipe pertama
berupa ion-ion logam sederhana, sedangkan tipe kedua terdiri atas molekul
organik yang kompleks, yang disebut sebagai ko-enzim. Semakin kompleks
kofaktor yang dibutuhkan, maka akan semakin mahal biaya yang diperlukan,
yang pada akhirnya akan membatasi penggunaannya (kecuali ada cara-cara
praktis untuk mendapatkannya kembali).
Sumber biologis. Spesifikasi sumber enzim seringkalimerupakan hal penting.
Enzim dengan nama yang sama tetapi berasal dari sumber yang berbeda
seringkali menujukkan perbedaan pula dalam struktur dan sifat-sifatnya
Stabilitas. Secara umum, ezim lebih labil dibandingkan katalis sintetik. Walaupun
beberapa dapat beroperasi diatas 60oC, secara umum hanya ada perbedaan
yang kecil diantara beragam enzim dalam nilai pH dan suhu operasinya.
Inhibitor. Aktivitas enzim seringkali peka terhadap keberadaan molekul-molekul
kecil. Sebagai contoh, enzim dapat dihambat oleh substrat, produk reaksi, atau
oleh kontaminan kimiawi yang ada dalam substrat. Dengan demikian,
pemahaman tentang mekanisme pengendalian semacam ini dapat merupakan
hal penting untuk optimasi proses

 Kondisi reaksi. Dalam praktek, ada beberapa contoh enzim yang mampu
melakukan reaksi pada suhu lebih rendah dari katalis konvensional, namun
rendeman dan kualitas produk yang dihasilkan lebih tinggi, dan sekaligus
mengurangi konsumsi enerji untuk produksinya.
Biokatalis dalam Industri Kimia
Seperti telah diuraikan, biokatalis mempunyai peranan yang semakin penting dalam
industri

kimia

sintesis.Namun,

masih

ada

beberapa

kelemahan

dalam

pemanfaatannya dalam industri, terutama karena kebanyakan indutri kimia kurang

begitu akrab dengan katalis alam ini. Oleh karena itu, Kapan dan bagaimana
menggunakan biokatalis? merupakan pertanyaan penting yang harus dijawab
sebelum industri memutuskan untuk mulai menggunakannya dalm proses
produksinya.
Kapan?
Kapan biokatalis bisa dianggap sebagai alternatif yang menjanjikan, bila
dibandingkan reaksi kimia biasa, yang sudah lama dikenal?, merupakan pertanyaan
pertama yang harus dijawab untuk memutuskan pemakaiannya dalam industri.
Aspek-aspek yang perlu mendapat perhatian dalam keputusan awal ini adalah:
ketersediaan biokatalis, kemurnian, biaya dan komponen media lain yang
diperlukan. Selain itu, jumlah reaksi yang terlibat, selektivitas dan rendeman (yield),
serta kondisi reaksi merupakan aspek lain yang perlu mendapat perhatian. Tak
kalah pentingnya, kemudahan dalam purifikasi produk, kualitas produk akhir, dan
aspek-aspek lingkungan (greenness) juga merupakan aspek penting lainnya. Dari
pengalaman dapat ditunjukkan bahwa semakin positif jawaban yang dapat diberikan
atas aspek-aspek tersebut diatas, maka semakin tinggi pula efektivitas penggunaan
biokatalis dalam industri kimia.
Peluang pemanfaatan biokatalis akan meningkat, terutama bila jumlah tahapan
reaksi dalam memproduksi suatu produk akhir dapat diturunkan secara drastis.
Aspek lain, seperti kebutuhan reagen dan senyawa-senyawa esensial lainnya yang
lebih sedikit dan lebih murah, rendeman yang lebih tinggi, laju reaksi yang lebih

cepat dan kondisi reaksi yang lebih mild, juga akan mendorong penggunaan
biokatalis dalam proses produksi. Selain itu, sifat biokatalis yang enansio- dan/atau
stereoselektif dapat menjadi pertimbangan yang kuat untuk penggunaan biokatalis,
namun perlu juga disadari bahwa saat ini kemajuan-kemajuan dalam yang berarti
dalam bidang ini terjadi juga di bidang katalis kimiawi. Jika isu natural dan green
sangat menentukan penerimaan masyarakat terhadap suatu produk-produk tertentu,
maka kecenderungan ini juga akan mendorong penggunaan biokatalis sebagai
pilihan dalam proses produksi. Adanya kepastian bahwa proses atau reaksi akan
berlangsung melalui rute tertentu juga akan menjadi pertimbangan penting dalam
keputusan untuk menggunakan atau tidak menggunakan biokatalis dalam proses
produksi. Lebih lanjut, kompatibiliats dengan proses yang telah ada juga merupakan
hal penting lain dalam keputusan tersebut.
Bagaimana?
Bila aspek-aspek yang dikemukakan diatas dijawab secara positif, yang berarti
bahwa penggunaan biokatalis merupakan alternatif yang menarik dalam proses
produksi, maka pertanyaan Bagaimana biokatalis tersebut dimanfaatkan dalam
proses produksi? akan muncul dalam pengambilan keputusan berikutnya. Masalah
pertama menyangkut bentuk biokatalis yang akan digunakan; apakah biokatalis
tersebut diaplikasikan dalam bentuk sel utuh, sel hasil rekayasa genetis, sel
organela, enzim kompleks, ataukah dalam bentuk enzim kasar atau murni),
diimobilisasi ataupun diaplikasikan dalam bentuk bebas. Ketersediaan, biaya,
kebutuhan kofaktor adalah beberapa aspek penting yang perlu mendapat perhatian.
Sedangkan masalah kedua menyangkut media reaksi; apakah reaksi biokatalisis
dilakukan dalam media cair konvensional yang ramah lingkungan (green), ataukah
dalam media non-konvensional, seperti dalam pelarut organik atau dalam media
padat. Media padat dapat merupakan keuntungan yang meyakinkan bagi
penggunaan

biokatalis,

terutama

berkaitan

dengan

substrat/produk, keseimbangan reaksi, dan purifikasi produk.

kelarutan,

inhibitasi

Akhirnya, dalam keseluruhan pembuatan keputusan, kebutuhan dan pada tataran

mana integrasi proses dalam kaitannya dengan reaksi-reaksi (jika lebih dari satu
reaksi yang terlibat), tahapan-tahapan proses dan integrasi keseluruhan proses
perlu diperhitungkan. Kemampuan komputer yang ada saat ini memungkinkan untuk
itu.
Bila industri akan menggunakan proses yang melibatkan biokatalis dalam proses
produksinya, maka mereka memerlukan:
Identifikasi biokatalis. Kegiatan ini melibatkan pencarian dan penapisan enzim
yang tersedia secara komersial, atau bahkan melakukan pengembangan
biokatalis baru. Upaya pengembangan biokatalis baru mencakup penapisan
mikroba dan biomaterial secara ekstensif untuk mengidentifikasi aktivitas yang
diinginkan, kemudian mengisolasi enzim atau enzim-kompleks yang cocok.
Industri yang melakukan pengembangan biokatalis secara aktif biasanya
mempunyai koleksi strain-strain mikroba dan enzim-enzim dalam jumlah besar
dan menganggapnya sebagai sumber daya teknologi kunci.
Sumber biokatalis. Dalam praktek, industri dapat memperoleh atau
mengembangkan sendiri biokatalis yang diinginkan. Untuk pengembangan
biokatalis in-house, diperlukan sumber daya teknis yang memadai (beragam
keahlian bioteknologis). Untuk mengawalipenguasaan teknologi biokatalis,
biasanya industri memanfaatkan enzim yang tersedia secara komersial untuk
proses biotransformasi sederhana (satu tahap). Untuk tahap-tahap selanjutnya,
biasanya industri juga mencoba proses yang multi-tahap yang melibatkan lebih
dari satu enzim.
Pengembangan proses. Proses untuk biotransformasi yang diinginkan perlu
dikembangkan , menscale-up dan, bila perlu, mengintegrasikan ke dalam
keseluruhan proses sintesis produk yang diinginkan.Optimasi
proses downstream dari biotransformasi seringkali sama pentingnya dengan
proses biotransformasi itu sendiri.

Tahapan produksi enzim secara umum

Secara umum, enzim diperoleh dari mikroorganisme (bakteri, jamur dan kapang)
yang dipanen melalui proses fermentasi. Untuk menghasilkan biokatalis yang
memenuhi

kebutuhan

komersial,

tahap

pertama

yang

perlu

dilakukan

adalah pemurnian enzim dari media fermentasi. Prosedur purifikasi melibatkan

teknik-teknik kromatografi, misalnya dengan menggunakan HPLC (High Pressure
Liquid Chromatography), FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography), dan lain-lain.
Selain itu, teknik-teknik pengkonsentrasian juga perlu dilibatkan, misalnya metoda
penggaraman, presipitasi, sentrifugasi, ultrafiltrasi, dialisis dan/atau liofilisasi.
Setelah enzim dimurnikan, karakterisasi struktural enzim perlu dilakukan, dengan
melibatkan
spektroskopi

metoda-metoda,
(UV-VIS

seperti

dan/atau

elektroferesa,

flueresens).

ultrasentrifugasi

Demikian

analitis,

juga, karakterisasi

fungsional perlu juga dilakukan, seperti penentuan aktivitas dan stabilitas enzim
pada suhu dan pH yang berbeda, penentuan kinetika dan stoikiometri reaksi, dan
juga stabilitas dan aktivitas dalam kondisi proses sebenarnya. Data-data ini memberi
landasan untuk dapat dilakukannya site-directed mutagenesis untuk memperoleh
enzim baru yang dapat digunakan dalam bioreaktor secara industri.
Isolasi, kloning dan perunutan gena, yang menyandikan sintesis enzim, seringkali
juga dilakukan, terutama untuk mendapatkan jumlah protein yang lebih tinggi.
Biasanya, dalam tahap awal, upaya kloning dan ekspresi enzim dilakukan
pada E.coli melalui suatu vektor tertentu. Namun, bila upaya ini tidak/kurang
berhasil, baru dicoba dengan menggunakan sistem-sistem kloning dan ekspresi
yang lain.
Setelah itu, dilakukan imobilisasi enzim, yang bertujuan agar biokatalis dapat
dipanen dan digunakan kembali dalam proses. Beragam metode imobilisasi telah
dikenal dan dapat disesuaikan dengan proses-proses industrial, seperti pencerapan
dalam matriks gel (poliakrilamida, agarosa, alginat, karaginan), mikrokapsulasi
(dengan cara polimerasi interfasial atau dengan mencampurkannya dengan
surfaktan tertentu sehingga membentuk reverse micelles), pengikatan silang dengan

reaktan bifungsional (dialdehida, seperti glutaraldehida, atau diamina yang diaktivasi

dengan carbodiimida), adsorpsi dan pengikatan secara kovalen dengan pedukung
inorganik (seperti gelas berpori, silica) atau dengan pendukung organik (seperti
selulosa, dekstran, polimir akrilik).
Bila proses imobilisasi telah dilakukan dengan hasil yang baik, maka tahap
berikutnya adalah optimasi prosesyang menggunakan biokatalis amobil tersebut.
Umumnnya kajian dilakukan untuk mempelajari dan mengidentifikasi pengaruh pH,
suhu, waktu kontak dengan matriks pendukung, perbandingan enzim/dengan
matriks dan sebagainya untuk mendapatkan biokatalis yang tepat secara industrial.
Pada akhirnya, kondisi proses yang paling baik (nilai pH dan suhu optimal, stabilitas
terhadap pH dan suhu, parameter kinetika dan penggunaan ulang) dapat
diidentifikasi.
Riset dan Pengembangan Biokatalis dan Biotransformasi
Riset dalam bidang ini terutama diarahkan untuk mengembangkan dan optimasi
proses yang melibatkan biokatalis, dan juga proses untuk memproduksi biokatalis itu
sendiri.

Pengembangan

katalis

yang

stabil,

yang

menunjukkan catalytic

turnover yang tinggi, dan mampu melakukan transformasi baru merupakan hal
penting untuk memperluas area penerapan bioteknologi. Seperti kita ketahui,
dekade terakhir ini dipahami sebagai revolusi dalam pemahaman proses biokonversi
pada tataran genetik. Dengan waktu yang relatif singkat, metode-metode baru,
seperti evolusi enzim yang diarahkan (directed enzyme evolution), biokatalisis
kombinatorial, serta rekayasa metabolik (metabolic engineering), telah menghasilkan
beragam biokatalis-biokatalis baru.
Selain itu, dampak dari penggunaan biokatalis rekombinan semacam ini terhadap
keseluruhan pentahapan reaksi dan terhadap proses downstreamjuga menjadi
sasaran kajian dan riset dalam biotransformasi. Tentu saja, penyelidikan terhadap
aspek-aspek regulasi katalitis dan ekspresi enzim, demikian juga mengenai struktur,
fungsi dan aplikasi enzim masih tetap diperlukan. Selain itu, walaupun sampai saat
ini, evolusi terarah banyak diterapkan untuk mengembangkan enzim-enzim secara

individual, namun dengan meningkatnya akumulasi pengetahuan, teknik ini juga

akan dapat diaplikasikan untuk perekayasaan sistem enzim kompleks.

FERMENTASI
Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba untuk menghasilkan
metabolit atau enzim yang diinginkan di bawah kondisi optimal atau suatu lingkungan yang
dikendalikan (Crueger dan Crueger, 1984). Proses pertumbuhan mikroba merupakan tahap
awal proses fermentasi yang dikendalikan terutama dalam pengembangan inokulum agar
dapat diperoleh sel hidup. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan kondisi medium,
komposisi medium, suplai O2 dan agitasi. Jumlah mikroba dalam fermentor juga
dikendalikan sehingga tidak terjadi kompetisi dalam penggunaan nutrisi. Pengendalian
diperlukan karena pertumbuhan biomassa dalam suatu medium fermentasi dipengaruhi
oleh banyak faktor baik ekstraseluler maupun intraseluler. Faktor intraseluler meliputi
struktur, mekanisme dan genetika, sedangkan faktor ekstraseluler meliputi kondisi
lingkungan seperti pH, suhu dan aerasi (Crueger dan Crueger, 1984). Dalam prose
fermentasi terdapat dua komponen penting yaitu biokatalis berupa enzim atau sel mikroba
dan kondisi lingkungan. Lingkungan optimal dapat dicapai dengan menempatkan wahana
yang disebut bioreaktor (Mangunwidjaya dan Suryani, 1994). Bioreaktor menjadi wahana
penting dalam industri yang menggunakan reaksi-reaksi biokimiawi yang dikatalisis oleh sel
atau enzim.
1. Mikroba dalam produksi biokatalis

Mananase dari Bacillus licheniformis, Cellulomonas fimi dan Aspergillus sp.

Mananase adalah enzim yang digunakan untuk hidrolisis karbohidrat manan menjadi
monosakarida dan oligosakarida yang berfungsi sebagai komponen pangan
fungsional. Dalam penelitian ini akan digunakan tepung manan dari umbi Porang
(Amorphophallus muelleri blume) yang merupakan umbi lokal dengan kandungan
glukomanan tinggi. LIPI memiliki koleksi mikroba penghasil mananase, selain itu juga
terdapat mikroba Bacillus licheniformis, Cellulomonas fimi dan Aspergillus sp. Gen
penyandi mananase dari isolat manolitik tersebut dapat digunakan untuk disisipkan
ke dalam Saccharomyces cereviasiae untuk dijadikan rekombinan yeast berdisplay
enzim mananase (arming yeast). Untuk mencapai sasaran tersebut telah dilakukan
konstruksi plasmid ekspresi untuk mananase dari Bacillus licheniformis dan
Cellulomonas fimi, dan saat ini sedang proses analisa ekspresi, purifikasi dan
karakteristik rekombinan mananase. Kemudian dari transformasi plasmid PFGK426

ke dalam Sacchromyces cereviase YPH499 untuk mendapatkan yeast berdisplay

mananase, telah diperoleh 2 koloni yang akan dianalisa potensinya dalam ekspresi
mananase. Dari penelitian pendamping proyek kompetitif ini yaitu JSPS-LIPI bilateral
project (Development of Consolidated Bio-Proccesing (CBP) for Bioethanol and
Manno-oligosaccharides Production by Yeast Cell Surface Engineering), telah
diperoleh yeast berdisplay mananase dan Aspergillus acualetus. Dengan
menggunakan arming yeast mananase tersebut, dari hasil hidrolisis terhadap tepung
porang menunjukkan adanya oligosakarida yang berukuran sekitar 2 6 sakarida.
Selanjutnya akan diuji kestabilan rekombinan yeast dalam proses hidrolisis tepung
manan untuk menghasilkan oligosakarida.
Lipase dari aspergillus niger
Kapang Aspergillus niger merupakan salah satu sumber penghasil enzim lipase.
Aspergillus niger merupakan mikroba jenis kapang yang dapat tumbuh cepat dan
tidak membahayakan karena tidak menghasilkan mikotoksin. Selain itu,
penggunaannya mudah karena banyak digunakan secara komersial dalam produksi
asam sitrat, asam glukonat dan beberapa enzim seperti amilase, pektinase, amiloglukosidase dan selulase. Aspergillus niger memiliki daya amilolitik dan proteolitik
yang cukup baik, serta dapat menghasilkan enzim fitase ekstraselluler. Hasil
fermentasinya dapat digunakan sebagai sumber protein sel tunggal (PST) dan media
biakannya sebagai sumber energi potensial.Kapang merupakan mikroba yang 80%
kebutuhan substratnya dipenuhi oleh makromolekul yang memiliki rantai karbon.
Beberapa jenis kapang diketahui tumbuh pada habitat yang mengandung minyak,
misalnya tandan kelapa sawit (Rifaat, et al., 2010).Produksi lipase memerlukan
sumber karbon yang dapat berasal dari lipid atau karbohidrat. Untuk memproduksi
enzim lipase pada umumnya menggunakan induser berupa minyak zaitun untuk
memacu produksinya (Falony, et al., 2006). Pada praktikum ini memanfaatkan
minyak goreng sawit sebagai induser, karena minyak goreng sawit ini merupakan
produk lokal yang keberadaannya melimpah.
Siklodekstrin umumnya diproduksi dari pati menggunakan enzim siklodekstrin
glikosil transferase (CGTase) yang dieksresikan oleh bakteri genus bacillus. Pada
teknik itu, terlebih dahulu pati harus terlebih dahulu diluikuifikasi dengan atau tanpa
enzim penghidrolisis disertai pemanasan.

4. Proses produksi enzim upstream dan downstream

Dalam proses bioindustri, dikenal dua macam tahapan yaitu proses upstream dan downstream. Proses up-stream adalah proses di mana terjadi
transformasi dari bahan baku menjadi bahan jadi dalam bentuk yang belum
murni.
Banyak proses-proses biologi membutuhkan pemurnian untuk mengurangi
larutan fermentasi dalam produk akhir. Sebagai contoh, asam sitrat dibuat
dalam fermentor produksi yang bercampur dengan medium. Oleh karena itu
diperlukan tahapan berikutnya yaitu tahapan pemurnian atau purifikasi.
Tahapan inilah yang dimaksud dengan proses down-stream. Ada banyak tipe
pemurnian sebagai contoh adalah proses ekstraksi, filtrasi, dan koagulasi.
A. DOWNSTREAM (PEMURNIAN)

MACAM METODE PEMURNIAN PRODUK FERMENTASI

Secara umum, metode pemurnian produk fermentasi terdiri dari empat
tahapan utama yaitu penghilangan kotoran, ekstraksi, konsentrasi dan
purifikasi. Secara sistematis, tahapan tersebut dapat dilihat pada gambar
berikut:

Kultur
Fermentasi

Penghilangan
kotoran yang
tidak dapat
terlarut

fraksi
terlarut

Sel dan
pengotor
lain

Ekstraksi

produk
cair

Konsentrasi
produk
berbentuk
konsentrat

Pengotor

Purifikasi

Produk Murni

Terdapat berbagai metode purifikasi antara lain adalah:

1. Secara Gravitasional
Terdiri dari dua metode yaitu sentrifugasi dan flokulasi.
2. Secara Mekanis
Metode secara mekanis dicontohkan dengan filtrasi dan dialisis.
3. Penggunaan sifat permukaan

Metode ini terdiri dari adsorpsi, ion-exchange, dan flotasi.

4. Secara Elektrik
Metode secara elektrik ini menggunakan elektrofresis, elektrodialisis dan
elektro-osmosis.
Beberapa teknik pemurnian produk fermentasi antara lain:
Sentrifugasi

Sentrifugasi meliputi pemisahan cairan dan partikel berdasar densitas.

Sentrifugasi dapat digunakan untuk pemisahan sel dari cairan kultur, sel
pecah dari cairan, dan kelompok endapan
Ada sejumlah tipe sentrifus, beberapa diantaranya:

Tubular Bowl Centrifuge

Paling umum digunakan untuk pemisahan padat-cair, isolasi enzim.

Dapat dicapai pemisahan yang baik untuk sel mikrobia dalam larutan.
Disc Bowl Centrifuge

Secara luas digunakan untuk memisahkan sel.

Dapat untuk memisahkan sel mikrobia yang dipecah dan endapan protein
Perforate Bowl Basket Centrifuge

Pengecualian pada pemisahan adsorpbent, seperti selulosa dan agarosa.

Zonal Ultracentrifuge

Digunakan dalam industri vaksin karena dapat secara mudah memisahkan

sel yang dipecah dari virus.
Dapat untukmengendapkan protein dengan baik.
Secara eksperimental digunakan untuk pemurnian RNA polymerase dan
berbagai enzim.

Koagulasi dan Flokulasi

Koagulasi ditetapkan untuk proses-proses biologikal jika partikel kecil

secara langsung melekat satu dengan lainnya.
Flokulasi adalah agensia yang bekerja untuk menggabungkan partikel
Teknik koagulasi dan flokulasi biasanya digunakan untuk sel utuh, sel
pecah atau protein terlarut.

Sel Utuh

Banyak agensia flokulasi digunakan untuk pemisahan produk,

seperti : polielektrolit anionik dan kationik, alumina, dan
polimer sintetik.
Sedikit informasi yang dikethui tentang koagula, tetapi
beberapa koagulan anorganik aluminium, garam besidan
garamkalsium telah banyak dipelajari

Sel hancur dan protein

Koagulasi dan flokulasi banyak digunakan dengan dilakukan

agitasi
Koagulasi dan flokulasi dapat digunakan sebagai alternatif
metode presipitasi pada pemisahan enzim
Agensia yang digunakan untuk sel utuh adalah sama dengan
untuk sel hancurmaupun protein

Resin penukar ion

Filtrasi

Filter menggunakan kain saring atau beberapa bahan porusdengan

menggunakan tekananuntuk mendorong partikel melewati filter
Elemen-elemen dipisahkan berdasarkan ukuran.
Filtrasi untuk meterial biologi umumnya menggunakan batch filtration,
rotary drum filtration, atau ultrafiltration methods.

Batch Filtration

Biasanya dengan tekanan konstan dari pompa mendorong

cairan melewati filter
Filter cake akan terbentuk sebagai akibat proses filtrasi dan
menahan laju filtrasi
Filter press adalah yang umum digunakan dalam industri
Dapat digunakan untuk memisahkan sel tetapi tidakdapat
bekerja dengan baik untuk sel hewan dan tumbuhan

Rotary Drum Filtration

Solution is vacuumed upward where it crosses a filter septum

removed by a positive displacement pump
Filter cake is removed after each rotation to give a fresh
surface for filtration

Rotary vacuum filters can be used to efficiently remove

mycelia, cells, proteins, and enzymes, though a filter aid or
precoat of the septum may be necessary

Ultrafiltration

Utilizes a membrane to separate particles that are much larger

than the solvent used
Successful removal occurs in the partical size range of 10
solvent molecular diameters to 0.5

Presipitasi

Presipitasi adalah prosedur penambahan larutan ionik untuk membuat

larutan fermentasi menjadi bentuk partikel yang tidak larut.
Presipitasi biasanya untuk memisahkan enzim atau protein
Cara yang sederhana biasanya dengan mengubah pH dan suhu
Presipitasi dapat dilakukan secara batch atau kontinyu.

Variasi suhu dan pH

Umumnya kebanyakan protein dan enzim meningkat kelarutannya
dengan meningkatnya suhu
Dengan mengatur pH, polaritas enzim dapat diturunkan sehingga tidak
bermuatan, poliratas yang paling rendah menjadikan enzim sedikit larut
dan cairan.
Presipitasi oleh Solven Organik
Dengan penambahan solven organik ke cairan fermentasi, konstanta
dielektrik akan turun menyebabkan kelaturan berkurang.
Sering digunakan secara industri karena murah dan sederhana
Presipitasi oleh Ion Logam
Garam metal dengan solubilitas lebih rendah dapat dibentuk oleh enzim
dan protein.
Garam Mangan dapat digunakan untuk pengendapan asam nukleat.
Pemurnian Asam sitrat
Metode yang digunakan dalam pemurnian asam sitrat dari cairan fermentasi
terdiri dari dua teknik yaitu presipitasi dan filtrasi.

Cairan asam sitrat dari fermentor produksi sangat terkontaminasi oleh

biomass, garam, sukrosa, dan air.

Pertama, asam sitrat harus direaksikan dengan kalsium karbonat untuk

menatralisasi larutan dan membentuk presipitat tidak larut kalsium sitrat
Kalsium sitrat mengandung asam sitrat 74%.
Reaksi Kimianya adalah:
CaCO3 + Citric Acid CO2+ Calcium Citrate

Kalsium sitrat kemudian dicuci, dipanaskan dan disaring untuk

menghilangkan kontaminan
Tergantung rancangan skema pemurnian, filter dapat ditempatkan
sebelum reaksi pertama dengan kalsium karbonat.
Secara sederhana filter dapat memisahkan sebagian besar kontaminan
tergantunng ukurannya dilanjutkan untuk kontaminan yang lebih kecil
pada filter berikutnya
Kalsium sitrat kemudian ditambah asam sulfat.
Suhu reaksi ini di bawah 60C.
Reaksi akan menghasilkan asam sitrat bebas dan presipitat baru
kalsiumsulfat, yang akan dibutuhkan nantinya.
Dalam filter ini,kalsium sulfat dicuci dari asam sitrat dan meninggalkan
biomass
Kontaminan dapat dipisahkandengan filter yang lebih baik seperti
mikrofiltrasi dan ultrafiltrasi

Pemurnian lanjut
Pemurnian lanjut:
Asam sitrat dapat dihasilkan dalam dua bentuk: - monohidrat dan anhidrat
Bentuk-bentuk ini membutuhkan tambahan tahap pemurnian untuk mencapai
kemurnian yang diinginkan
1. Monohydrate
Mengandung satu molekul air unt tiap asam sitrat
Membutuhkan kristalisasi berulang sampai kandungan air sekitar 7.58.8%
2. Anhydrous
Memisahkan semua air dari produk akhir
Dibuat dengan dehidrasi produk asam sitrat monohidrat pada suhu di
atas 36.6C

Guys yang downstream di ppt ada juga yaaa...... pokoknya pptnya jelaskok. Emang gue ngambil
tahap umumnya. Produk fermentasi disini maksudnya bisa enzim atau produk lain. Secara umum
sama semua berdasarkan referensi yang gue baca hehe

B. UPSTREAM
Basic Steps of Industrial Fermentation
Any industrial fermentation operation can be broken down into three main stages,
viz, upstream processing, the fermentation process and downstream processing.

Upstream processing includes formulation of the fermentation

medium, sterilisation of air, fermentation medium and the fermenter, inoculum
preparation and inoculation of the medium.
The fermentation medium should contain an energy source, a carbon source,
a nitrogen source and micronutrients required for the growth of the microorganism
along with water and oxygen, if necessary.
A medium which is used for a large scale fermentation, in order to ensure the
sustainability of the operation, should have the following characteristics;
1. It should be cheap and easily available
2. It should maximise the growth of the microorganism, productivity and the rate of
formation of the desired product
3. It should minimise the formation of undesired products
Usually, waste products from other industrial processes, such as molasses,
lignocellulosic wastes, cheese whey and corn steep liquor, after modifying with the
incorporation of additional nutrients, are used as the substrate for many industrial
fermentations.
Sterilisation is essential for preventing the contamination with any undesired
microorganisms. Air is sterilised by membrane filtration while the medium is

usually heat sterilised. Any nutrient component which is heat labile is filtersterilised and later added to the sterilised medium. The fermenter may be sterilised
together with the medium or separately.
Inoculum build up is the preparation of the seed culture in amounts sufficient to be
used in the large fermenter vessel. This involves growing the
microorganisms obtained from the pure stock culture inseveral consecutive
fermenters. This process cuts down the time required for the growth of
microorganisms in the fermenter, thereby increasing the rate of productivity. Then the
seed culture obtained through this process is used to inoculate the fermentation
medium.

Inoculum preparation procedure

The fermentation process involves the propagation of the
microorganism and production of the desired product. The fermentation process can
be categorised depending on various parameters.
It can be either aerobic fermentation, carried out in the presence of oxygen
or anaerobic fermentation, carried out in the absence of oxygen. Many industrial
fermentation are carried out under aerobic conditions where a few processes such as
ethanol production by yeast require strictly anaerobic environments.
The fermentation process can also be divided into three basic systems, namely batch,
continuous or fed-batch, depending on the feeding strategy of the culture and the
medium into the fermenter. Each of these processes has their own advantages and
disadvantages. In a batch operation, the medium and the culture are initially fed into

the vessel and it is then closed. After that, no components are added apart from
oxygen (in an aerobic process) and acid or alkali for the pH adjustment. The
fermentation is allowed to run for a predetermined period of time and the product is
harvested at the end. In a continuous process, fresh medium is continuously added
and the products, along with the culture is removed at the same rate, thus maintaining
constant concentrations of nutrients and cells are maintained throughout the process.
A fed-batch system is a combination of these two systems where additional nutrients
are added to the fermenter as the fermentation is in progress. This extends the time of
operation but the products are harvested at the end of the production cycle as in a
batch fermenter.

The process can also be categorised as solid state fermentation (SSF) or submerged
fermentation (SmF), depending on the amount of free water in the medium. In
a solid state fermentation, the medium contains no free flowing water. The

organisms are grown in a solid substrate which is moistened. This is used in certain
industrial process such as koji fermentation from soybeans, production of amylase
and protease by Aspergillus oryzae on roasted soybeans and wheat, bioremediation,
detoxification of agro-industrial wastes, etc. Submerged fermentation is in which
microorganisms grow submerged in a liquid medium where free water is abundant.
This is the method of choice for many industrial operations over SSF although SSF is
also rapidly gaining interest in the present.
A comparison of SSF and SmF