Laporan

Praktikum
Bioteknologi
Pembuatan
Media Kultur
Jaringan
BAB I
PENDAULUAN
1.1 Latar Belakang
Media merupakan faktor utama
dalam perbanyakan dengan kultur
jaringan. Keberhasilan perbanyakan
dan perkembangbiakan tanaman

dengan metode kultur jaringan

secara umum sangat tergantung pada
jenis media. Media tumbuh pada
kultur jaringan sangat besar
pengaruhnya terhadap pertumbuhan
dan perkembangan eksplan serta
bibit yang dihasilkannya. Oleh karena
itu, macam-macam media kultur
jaringan telah ditemukan sehingga
jumlahnya cukup banyak. Namanama media tumbuh untuk eksplan
ini biasanya sesuai dengan nama
penemunya. Media tumbuh untuk
eksplan berisi kualitatif komponen
bahan kimia yang hampir sama,
hanya agak berbeda dalam besarnya
kadar untuk tiap-tiap persenyawaan.
Pembuatan media pada prinsipnya
dilakukan dengan melarutan semua
komponen media dalam air sesuai

dengan konsentrasi pada permulasi

yang diinginkan, penimbangan
komponen media satu persatu untuk
setiap pembuatan media kultur tidak
praktis dan hanya dapat dilakukan
jika jumlah zatnya cukup besar,
masalah tersebut dapat diatasi
dengan pembuatan larutan stok.
1.2 Tujuan
1. Untuk mengetahui jenis-jenis
media kultur
2. Untuk mengetahui sifat dan
komposisi pembuatan media
3. Untuk mengetahui teknik
aseptic pembuatan media
4. Untuk mengetahui dan
memahami rumus perhitungan
larutan stok.

1.3 Manfaat
Dari praktikum yang dilakukan
diharapkan mahasiswa dapat
mengetahui sifat media kultur
jaringan dan pemanfaatnya serta
mampu membuat media kultur
jaringan.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Jenis-jenis Media
a)
Media Knop
Dapat juga digunakan untuk
menumbuhkan kalus wortel. Kultur
kalus, biasanya ditumbuhkan pada
media dengan kosentrasi garamgaram yang rendah seperti dalam
kultur akar dengan penambahan
suplemen seperti glucosa, gelatine,
thiamine, cysteine-HCl dan IAA.

b)
Media White
Dikembangkan oleh Hildebrant
untuk keperluan kultur jaringan
tumor bunga matahari, ditemukan
bahwa unsur makro yang dibutuhkan
kultur tersebut, lebih tinggi dari pada
yang dibutuhkan oleh kultur
tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S
pada media untuk tumor bunga
matahari ini, sama dengan media
untuk jaringan normal yang
dikembangkan kemudian.
Konsentrasi NO3- dan K+ yang
digunakan Hildebrant ini lebih tinggi
dari media white, tetapi masih lebih
rendah dari pada media-media lain
yang umum digunakan sekarang.
c) Media Knudson dan media
Vacin and Went
Media ini dikembangkan khusus

untuk kultur anggrek. Tanaman yang

ditanam di kebun dapat tumbuh
dengan baik dengan pemupukan
yang hanya mengandung N dari
Nitrat. Knudson pada tahun 1922,
menemukan penambahan 7.6 mM
NH4+ disamping 8.5 mM NO3-,
sangat baik untuk perkencambahan
dan pertumbuhan biji anggrek.
Penambahan NH4+ ternyata
dibutuhkan untuk perkembangan
protocorm. Media Nitsch & Nitsch,
menggunakan NO3- dan K+ dengan
kadar yang cukup tinggi untuk
mengkulturkan jaringan tanaman
artichoke Jerussalem. Penambahan
ammonium khlorida sebanyak 0.1
mM, menghasilkan pertumbuhan
jaringan yang menurun.
Pertumbuhan sel dari jaringan suatu

organ dibandingkan dengan jaringan

tumor tanaman Venca rosea
(Catharanthus roseus), menunjukkan
bahwa penambahan ammonium ke
dalam media White yang sudah
dimodifikasi, mempunyai
pertumbuhan yang lebih baik.
Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan
H2PO4- yang diperoleh, hampir
sama dengan yang dikembangkan
oleh Miller.
d) Media Murashige & Skoog
(media MS)
Merupakan perbaikan komposisi
media Skoog, terutama kebutuhan
garam anorganik yang mendukung
pertumbuhan optimum pada kultur
jaringan tembakau. Media MS
mengandung 40 mM N dalam bentuk
NO3 dan 29 mM N dalam bentuk

NH4+. Kandungan N ini, lima kali

lebih tinggi dari N total yang terdapat
pada media Miller, 15 kali lebih tinggi
dari media tembakau Hildebrant, dan
19 kali lebih tinggi dari media White.
Kalium juga ditingkatkan sampai 20
mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur
makro lainnya konsentrasinya
dinaikkan sedikit. Pertama kali
unsur-unsur makro dalam media MS
dibuat untuk kultur kalus tembakau,
tetapi komposisi MS ini sudah umum
digunakan untuk kultur jaringan
jenis tanaman lain. Media MS paling
banyak digunakan untuk berbagai
tujuan kultur pada tahun-tahun
sesudah penemuan media MS,
sehingga dikembangkan mediamedia lain berdasarkan media MS
tersebut, antara lain media :

1. Lin & Staba, menggunakan media

dengan setengah dari komposisi
unsur makro MS,
dan memodifikasi : 9 mM
ammonium nitrat yang seharusnya
10mM, sedangkan KH2 PO4 yang
dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak
0.625 mM. Larutan senyawa makro
dari media Lin & Staba, kemudian
digunakan oleh Halperin untuk
penelitian embryogenesis kultur
jaringan wortel dan juga digunakan
oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam
Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch
(1969 dalam Gunawan 1988) dalam
penelitian kultur anther.
2. Modifikasi media MS yang lain
dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam
Gunawan 1988) untuk kultur

suspensi sel white spruce dengan cara

mengurangi konsentrasi K+ dan
NO3-, dan menambah konsentrasi
Ca2+ nya.
3. Chaturvedi et al (1978) mengubah
media MS dengan menurunkan
konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+
dan SO4-2 untuk keperluan kultur
pucuk Bougainvillea glabra.
Senyawa-senyawa di dalam media
MS dapat terjadi pengendapan
persenyawaan, ini terlihat jelas pada
media cair. Kebanyakan dari
persenyawaan yang mengendap
adalah fosfat dan besi, kemudian
dalam jumlah yang lebih sedikit
adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa
paling sedikit adalah senyawa yang
mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo,

S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari

dibiarkan, maka kira-kira 50% dari
Fe dan 13% dari PO4+, mengendap
(Dalton et al, 1983). Pengendapan
unsur-unsur tersebut mungkin tidak
penting, karena unsur-unsur tersebut
masih tersedia bagi jaringan tanaman
dan pengaruh pengendapannya
belum diketahui. Untuk mengatasi
pengendapan Fe, Dalton dan grupnya
menganjurkan supaya konsentrasi Fe
dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA
yang tetap.
5.
Media Gamborg B5 (media
B5)
Pertama kali dikembangkan untuk
kultur kalus kedelai dengan
konsentrasi nitrat dan amonium
lebih rendah dibandingkan media

MS. Untuk selanjutnya media B5

dikembangkan untuk kultur kalus
dan suspensi, serta sangat baik
sebagai media dasar untuk
meregenerasi seluruh bagian
tanaman.. Pada masa ini media B5
juga digunakan untuk kultur-kultur
lain. Media ini dikembangkan dari
komposisi PRL-4, media ini
menggunakan konsentrasi NH4+
yang rendah, karena konsentrasi
yang lebih tinggi dari 2 mM
menghambat pertumbuhan sel
kedelai. Fosfat yang diberikan setelah
1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM,
sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM
(Gamborg et al, 1968).
6. Media Schenk & Hildebrant
(media SH)

Merupakan media yang juga cukup

terkenal, untuk kultur kalus tanaman
monokotil dan dikotil. Konsentrasi
ion-ion dalam komposisi media SH
sangat mirip dengan komposisi pada
media Gamborg dengan perbedaan
kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan
PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk &
Hildebrant mempelajari
pertumbuhan jaringan dari 37 jenis
tanaman dalam media SH dan
mendapatkan bahwa: 32 % dari
spesies yang dicobakan, tumbuh
dengan sangat baik, 19% baik, 30%
sedang, 14% kurang baik, dan 5%
buruk pertumbuhannya. Tetapi
karena zat tumbuh yang diberikan
pada tiap jenis tanaman tersebut
berbeda. Media SH ini cukup luas
penggunaannya, terutama untuk

tanaman legume.
7. Media WPM (Woody Plant
Medium)
Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc
Coen pada tahun 1981, merupakan
media dengan konsentrasi ion yang
lebih rendah dari media MS. Media
diperuntukkan khusus tanaman
berkayu, dan dikembangkan oleh ahli
lain, tetapi sulfat yang digunakan
lebih tinggi dari sulfat pada media
WPM. Saat ini WPM banyak
digunakan untuk perbanyakan
tanaman hias berperawakan perdu
dan pohon-pohon.
8. Media N6
Media N6 mempunyai ciri
perbandingan NH dan NO yang

jauh perbandinganya.
Amonium yang diberikan dalam
bentuk (NH)SO hanya sebanyak
363 mg/l, sedangkan KNO 2830
mg/l.
(Suryowinoto, M. 1991)
2.2 Komposisi dan Fungsi Dasar
dalam Media MS
a. Air
Air merupakan komponen yang
penting di dalam pengkulturan
eksplan karena 95% dari medium
mengandung air. Air yang digunakan
yaitu air destilasi, dimana air
tersebut telah steril dari kontaminasi
mikroorganisme atau substansi yang
dapat merusak proses perkembangan
eksplan.
b. Larutan garam anorganik
Tiap tanaman memerlukan

setidaknya 6 elemen mikronutrien N,

P, K, Mg, Ca, S, dan elemen yaitu Fe,
Mn, B, Mo, Cl. Pereduksi CU2menjadi Cu- bermanfaat pada
perkembangan dan perbaikan
vitamin adalah bahan yang perlu
ditambahkan sebab tumbuhan yang
dikulturkan belum mampu membuat
vitamin sendiri, biasanya yang
ditambahakan yaitu vitamin B, asam
nukleat, pridosin (vitamin B6).
c. Zat-zat organic
Senyawa organic yang dipakai yaitu
karbohidrat yang tersusun atas
unsur-unsur C, H, O sebagai elemen
penyusun utama karbohidrat
mempunyai fungsi utama yaitu
sebagai sumber energy untuk
keseimbangan tekanan osmotic.
(Sanawaria, 2008)

2.3 Teknik Aseptik dalam

Pembuatan Media
a. Sterilisasi peralatan
Sterilisasi peralatan (glassware
dan logum) dan aquades dilakukan
dengan sterilisasi kering (oven 1300c1700c selama 2-4 jam).
Sterilisasi peralatan dengan
autoclave dilakukan pada suhu 1210c
takanan 15 PSI selama 1 jam.
Sterilisasi peralatan logam (pinset,
gunting, jarum) yang digunakan
dengan merendam perakitan tsb
dalam alcohol 95% diikuti dengan
pembakaran dan pendinginan.
b. sterilisasi medium kultur
Metode autoclave
Medium dalam botol kultur ditutup
dengan alumunium foil pada suhu

1210 C, tekanan PSI selama 15-40

menit dari waktu medium mencapai
suhu yang diperlukan.
Metode Filtrasi
Yaitu sterilisasi menggunakan
membrane filter berukuran 0,45-0,22
mm di dalam kontiener steril.
(Sriyanti, 1994)
2.4 Rumus Perhitungan Larutan
Stok
Volume stok untuk setiap pembuatan
media q liter.
V1 X M1 = V2 x M2
Ket: V1 = Volume stok yang dicari.
V2 = Volume larutan stok
M1 = Konsentrasi larutan stok
M2 = Konsentrasi yang diinginkan.
(Hemawan dan Naem, 2006)
BAB III
METODOLOGI

3.1 Alat, Bahan dan Fungsi

Alat :
1. 14 botol kultur : berfungsi
sebagai tempat media kultur
2. 2 pak karet gelang : berfungsi
untuk penutup atau tali penutup
plastik dan alumunium
3. Plastik tahan tanas (untuk 8
botol, dengan ukuran pxl; 12 x 13
cm) : sebagai penutup botol kultur
(perlakuan a)
4. Gelas ukur : untuk mengukur
cairan yang di butuhkan
5. Mikro pipet : untuk mengambil
larutan stok dengan ukuran
terkecil mikro meter
6. Beaker glass : untuk tempat
pembuatan larutan stok

7. pH universal (indikator pH) :

untuk mengukur pH larutan
8. sitter : megaduk larutan
9. microwave : untuk memasak
larutan hingga larutan mengental
10. alumanium foil (unutk 6
botol, dengan ukuran pxl; 24 x 15,
kertas di lipat/rangkap) : sebagai
penutup botol kultur (perlakuan
b)
11. autoclave : sterilisasi botol
kultur sebelum di masukkan ke
ruangan pengamatan
12. Timbangan analitik : untuk
menimbang berat bahan yang
diperlukan
1. Oven : sterilisasi kering
botol kultur

bahan :
1. Aquades
: 50 ml (bahan
tambahan pada
larutan stok)
1. Makro
: 30 ml
Mikro A
: 3 ml
Mikro B
: 0,3 ml
sebagai bahan
FeEDTA
: 3 ml
pembuatan larutan stok
Vitamin
: 0,3 ml
CaCl2
: 3 ml
1. Sukrosa
:
untuk 300 ml. Larutan media
digunakan 9 gram gula. (untuk
membuat larutan menjadi
tercampur rata)
1. Agar-agar
:
unutk 300 ml. Larutan media

digunakan 2,1 gram agar-agar

(untuk mengentalkan larutan)
3.2
Cara Kerja Pembuatan
Media Kultur (Diagram Alir)
Bilas gelas dengan menggunakan aquades
Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml
Masukkan sukrosa (gula) 9 gram dan agar-agar 2,1 gram
Agar-agar
: 2,1 gram
Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna bening
Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi
Mikrowave selama 7 menit
Masukkan ke dalam botol kultur @20 ml :
8 botol dengan tutup plastik
6 botol dengan tutup alumunium
Autoclave
Tambahkan aquades hingga volume mencapai 300 ml
Stirer (aduk) dan ukur pH (pH indikator)
Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok
Makro : 30 ml, Mikro A : 3 ml, Mikro B : 0,3 ml, Fe EDTA : 3 ml, Vitamin :
0,3 ml, CaCl2 : 3 ml

3.3 Analisis perlakuan

Sebelum pembuatan media hal yang
pertama kali dilakukan adalah
mensterilkan semua peralatan yang
akan digunakan dengan alcohol 95%
serta diiuti dengan pembakaran
kemudian didinginkan, hal ini
bertujuan agar alat tidak

terkontaminasi dengan jamur atau

bakteri.
Isi breaker glas dengan larutan
aquades kurang lebih 50 ml. Setelah
itu, tambahkan unsur-unsur larutan
yang sudah di stok, yaitu : makro (30
ml), mikro A (3 ml), mikro B (0,3
ml), Fe EDTA (3 ml), Vitamin (0,3
ml) dan CaCl2 (3 ml). Setelah semua
larutan selesai ditambahkan,
tambahkan lagi aquades hingga
volume mencapai 300 ml. Stirer
(aduk) larutan dan ukut pH larutan
menggunakan indikator pH hingga
mencapai pH sekitar 5 6.
Masukkan sukrosa (9 gram) dan
agar-agar (2,1 gram) yang bertujuan
untuk melarutkan larutan dan
mengentalkan larutan. Stirer kembali
sampai larutan berwarna putih

bening. Setelah selesai, tutup breaker

glas dengan plastik wrap dan
masukkan ke dalam microwave
selama 7 menit setelah selesai,
masukkan larutan ke dalam botol
kultur dengan 8 botol di tutup
plastik, dan 6 botol ditutup
alumunium. Masukkan ke autoclave
untuk sterilisasi akhir, dan amati
selama 2 minggu, apakah terjadi
kontaminasi atau tidak, catat hasil.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
1. a.
Tabel media kultur
dengan penutup plastic
NO Hari
Botol
Pengamatan keke1. Kamis, 11 oct 1 2

Jenis
Keterangan
Kontaminan
-

Tidak ada

2012

2.

3.

4.

5.

3
4
5
6
7
8
Kamis, 18 oct 1 2
2012
3
4
5
6
7
8
Selasa, 23 oct 1 2
2012
3
4
5
6
7
8
Rabu, 31 Oct 1 2
2012
3
4
5
6
7
8
Jumat, 02
12
Nop 2012
3
4
5
6
7
8

yang
terkontaminasi

Tidak ada
yang
terkontaminasi

Tidak ada
yang
terkontaminasi

Tidak ada
yang
terkontaminasi

Tidak ada
yang
terkontaminasi

1. b.
Tabel media kultur
dengan penutup alumunium
poli
Hari
NO Pengamatan

Botol
ke-

Jenis
Keterangan
Kontaminan

1.

2.

3.

4.

5.

keKamis, 11 oct 1 2
2012
3
4
5
6
Kamis, 18 oct 1 2
2012
3
4
5
6
Selasa, 23 oct 1 2
2012
3
4
5
6
Rabu, 31 Oct 1 2
2012
3
4
5
6
Jumat, 02
12
Nop 2012
3
4
5
6

Tidak ada
yang
terkontaminasi

Tidak ada
yang
terkontaminasi

Tidak ada
yang
terkontaminasi
-

Tidak ada
yang
terkontaminasi

Tidak ada
yang
terkontaminasi

4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini kita kita
mencoba membuat media kultur
jaringan dengan bahan-bahan yang
sudah dijelaskan di atas, setelah di
autoklaf kita mengamati
perkembangan media pada hari

kamis tanggal 11 oktber, disana

terlihat bahwa media yang ditutup
dengan plastic dan alumunium poli
keadaan semuanya masih baik,
dengan tanda-tanda tidak ada
perubahan warna (tetap putih) dan
juga masih kelihatan stabil dengan
kata lain tidak terlihat danya jamur
pathogen yang masuk.
Kemudian pada hari kamis tanggal 18
oktober kita mengamati lagi dan
ternyata tidak jauh berbeda dengan
yang pengamatan pertama jadi
semua media baik 8 sample yang
ditutpi plastic dan 6 sample yang
ditutupi alumunium tidak ada tandatanda terkontaminasi, tetapi disini
ada satu media yang tertutupi
alumunium yang kelihatan warnanya
agak kekuningan tetapi menurut saya

masih dalam keadaan tidak

terkontaminasi karena ketika begitu
sample didekatkan warnanya masih
putih sebenarnya cuma memang dari
jauh kelihatan agar sedikit
kekuningan, seandainya itu termasuk
dalam tanda kontaminasi tidak
mungkin sebab saya melihat sample
praktikan lain ada yang kuning tetapi
disitu ada jamur yang
menggelembung (membentuk
bundaran) yang berwarna hitam ke
abu-abuan, sedangkan pada sample
kami tidak sedemikian itu.
Begitupun pada pengamatan ke-3
pada hari selasa tanggal 23 oktober
2012 kami menyimpulkan tidak ada
yang terkontaminasi, begitu juga
pada saat pengamatan ke-4 hari rabu,
tanggal 31 oct 2012. Hingga pada

pengamatan yang terakhir pada hari

jumat tanggal 02 nop 2012, ke 8
sample media kultur jaringan yang
ditutupi plastic tidak terlihat adanya
kontainasi begitupun ke 6 sample
yang ditutupi alumunium.
Seperti apa yang dikemukakan
oleh Andria bin Muhayat bahwa
eksplan yang terkontaminasi akan
menunjukkan gejala seperti
berwarna putih sampai biru
(disebabkanjamur) atau busuk
(disebabkan bakteri)
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Media merupakan faktor utama
dalam perbanyakan dengan kultur

jaringan. Keberhasilan perbanyakan

dan perkembangbiakan tanaman
dengan metode kultur jaringan
secara umum sangat tergantung pada
jenis media. Media MS mengandung
40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29
mM N dalam bentuk NH4+. Dan
Media MS inilah yang paling banyak
digunakan untuk berbagai tujuan
kultur pada tahun-tahun sesudah
penemuan media MS.
Pada praktikum kali ini kita mencoba
membuat media tanam kultur
jaringan dengan jenis media MS
tersebut, dan akhirnya dapat ditarik
kesimpulan ketika kita sudah
melakukan beberapa kali
pengamatan, media kultur jaringan
yang ditutup dengan plastic biasa
tepatnya ada 8 sampel dan 6 sampel

yang ditutupi alumunium foil

semuanya tidak terkontaminasi,
masih putih normal
DAFTAR PUSTAKA
Herawan, T dan M. Naiem.
2006. Pengaruh Jenis Media dan
Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh
Terhadap Perakaran pada Kultur
Jaringan Cendana (Santalum album
Linn.). Jurnal Agrosains 19(2) : 103109.
Sasnawaria, 2005. Mikrobiologi
dasar. Papa sinar sinantris. Jakarta.
Sriyanti, Daisy P. 1994. Teknik
Kultur Jaringan. Kanisius.
Yogyakarta.
Suryowinoto, M. 1991. Budidaya
Jaringan dan Manfaatnya. Fakultas

Biologi. Universitas Gadjah Mada.

Yogyakart