Laporan Praktikum

Mikrobiologi

Nama
NIM
Kelas/kelompok
PJP
Asisten

: Diana Agustini Raharja

: J3L112168
: C P1/1
: M. Arif Mulya, S. Pi.
: 1. Yuriska Sekar Rani
2. Lia Suliani
3. Ramdhani

KUANTITASI MIKROBA: HITUNGAN MIKROSKOPIS

LANGSUNG

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Pendahuluan
Mikroba ialah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik untuk
bertahan hidup. Jasad renik tersebut dapat hidup hampir di semua tempat di
permukaan bumi. Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang sangat
dingin hingga lingkungan yang relatif panas, dari lingkungan yang asam hingga
lingkungan yang relatif panas, serta dari lingkungan yang asam hingga basa.
Mikroba ini tidak dapat dilihat secara kasat mata. Oleh karena itu, untuk melihat
miroorganisme diperlukan alat bantu berupa mikroskop (Afriyanto 2005).
Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk
menetapkan keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah
dikembangkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut
berupa menghitung jumlah sel, massa sel, atau isi sel yang sesuai dengan jumlah
sel. Terdapat empat macam cara umum untuk memperkirakan besar populasi
mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran langsung, perhitungan
tidak langsung, dan perkiraan tidak langsung (Harmita 2006).
Perhitungan langsung (direct count) digunakan untuk menghitung jumlah
sel atau biomassa mikroorganisme dengan cara sel dihitung langsung di bawah
mikroskop atau dengan perhitungan partikel elektronik (electronic particle
counter). Pengukuran langsung (direct measurement) digunakan untuk
menghitung biomassa mikroorganisme dengan cara massa sel dapat ditentukan
dengan menimbang atau mengukur berat seluruh sel serta biomassa dapat
dikorelasikan dengan jumlah sel dan membandingkannya pada kurva standar.
Perhitungan tidak langsung (indirect count) digunakan untuk menghitung jumlah
sel yang ada pada sampel dengan cara memperkirakan jumlah mikroorganisme
dalam sampel yang telah dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang sesuai,
contohnya pembentukan koloni dalam pelat agar. Perkiraan tidak langsung
(indirect estimate) digunakan untuk biomassa mikroorganisme. Biomassa
mikroorganisme diperkirakan dengan cara mengukur komponen biokimia sel
mikroorganisme yang relatif konstan, seperti protein, adenosin trifosfat (ATP),
lipopolisakarida (LPS), murein, dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan
secara tidak langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung
biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan
membandingkannya pada kurva standar (Harmita 2006).
Tujuan
Praktikum bertujuan menentukan jumlah sel
menggunakan teknik hitungan mikroskopis langsung.

yeast

pada

sampel

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan ialah mikroskop, pipet tetes, cover glass, counter,
dan Haemocytometer. Bahan-bahan yang digunakan adalah alkohol 70%, suspensi
yeast, serta methylene blue.
Prosedur Kerja
Suasana steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum.
Oleh karena itu, tangan dibasahi dengan alkohol 70%. Permukaan bidang
Haemocytometer dan coer glass dibersihkan juga dengan menggunakan alkohol
70%. Mikroskop dihidupkan dan diatur intensitas cahayanya, sehingga tidak

terlalu terang dan tidak terlalu gelap. Haemocytometer diletakkan di atas meja
preparat dan kamar-kamarnya dicari serta diamati di bawah mikroskop dengan
mengghunakan perbesaran terkecil terlebih dahulu, yaitu 4x10. Jika kamarkamarnya telah ditemukan, yeast diletakkan di atas Haemocytometer dengan
bantuan pipet tetes. Kemudian yeast diamati di bawah mikrokopp dengan
perbesaran yang lebih besar agar lebih jelas terlihat yaitu 10x10 kemudian 40x10.
Jumlah yeast yang berada di kotak kecil di dalam kamar kaca dihitung setelah
ditambahkan methylene blue dengan menggunakan counter. Perhitungan
dilakukan secara representatif. Setelah dihitung, jumlah yeast dicatat dan
kepadatannya dihitung.
Data dan Hasil Pengamatan
Berikut ini hasil yang diperoleh pada perhitungan sel yeast secara langsung
setelah ditambahkan methylene blue.
Tabel 1 Hasil kuantitasi yeast
Kelompok
sel/mL
1
4,15.106
2
1,66.107
3
3,79.107
4
1,28.107
5
1,40.107
6
1,60.107
7
1,47.107
8
1,01.107
9
3,05.107
10
2,45.107
Kepadatan
1,81.107
Pembahasan
Analisis bahan pangan, air, serta susu seringkali membutuhkan
penghitungan mikroba yang terkadang teknik ini meliputi hitungan mikroskopis
langsung, memanfaatkan perhitungan sel secara elektronik, metode kimiawi untuk
mengestimasi massa sel dan pengenceran serial pada teknik pencawanan.
Pengukuran kuantitatif populasi mikroba sering kali amat diperlukan di dalam
berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Pada hakikatnya terdapat dua macam
pengukuran dasar, yaitu penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel.
Pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan bagi organisme bersel tunggal
(misalnya bakteri), sedangkan penentuan massa sel dapat dilakukan tidak hanya
baik organisme bersel tunggal tetapi juga organisme berfilamen (misalnya
kapang).
Pada percobaan dilakukan sterilisasi sebelum dan sesudah pekerjaan di
laboratorium. Alkohol 70% disemprotkan pada tangan untuk membunuh
mikroorganime yang tidak diinginkan. Haemocytometer dan cover glass juga
bersihkan dengan alkohol 70% untuk membunuh mikroorganisme yang tidak
diinginkan dan membersihkan kotoran yang menempel pada alat, karena pada
saat diamati di bawah mikroskop alat harus bersih dan steril sehingga pengamatan
terlihat jelas oleh mata dan mempermudah untuk melakukan perhitungan mikroba.

Tersedia banyak teknik di dalam laboratorium untuk mengukur

pertumbuhan mikroorganisme. Alat-alat yang ada tersebut berkisar dari peralatan
yang masih sederhana seperti sebuah kaca objek dengan olesan yang diwarnai
(Volk 1993). Pada percobaan yang dilakukan, penentuan jumlah sel yang ada
dilakukan dengan metode hitungan mikroskopis langsung (direct microscopic
count) menggunakan alat yang dinamakan Haemositometer untuk menghitung
populasi sampel.

Gambar 1 Haemocytometer yang digunakan untuk menghitung jumlah sel secara

langsung
Haemocytometer merupakan alat yang berfungsi untuk menghitung sel-sel
darah, organel dalam sel, dan sel-sel darah dalam cairan tulang punggung ke otak
setelah melakukan tusukan lumbal. Saat ini juga banyak digunakan untuk
menghitung jumlah sel serta partikel mikroskopis lainnya. Haemocytometer
ditemukan oleh Louis-Charles Malassez yang terdiri dari sebuah lapisan kaca
tebal dengan kekukan persegi panjang yang menciptakan ruang-ruang kamar.
Ruaangan tersebut diukir dengan laser grid yang menggores secara garis tegak
lurus. Perangkat tersebut dibuat dengan hati-hati sehingga daerah yang dibatasi
oleh garis diketahui kedalamannya. Oleh karena itu, alat tersebut berguna untuk
menghitung jumlah sel atau partikel dalam suatu volume cairan tertentu, sehingga
dapat menghitung konsentrasi sel dalam cairan secara keseluruhan (Lay 1994).
Ketika menggunakan mikroskop untuk mencari ruang-ruang kamar pada
Haemocytometer, intensitas cahaya jangan terlalu terang, karena garis-garis pada
Haemocytometer yang tipis sekali tidak akan terlihat dikalahkan oleh sinar yang
lebih besar dari cahaya mikroskop. Selain cahaya, faktor perbesaran mikroskop
juga berpengaruh. Ruang-ruang kamar Haemocytometer baik di bagian bawah
maupun atas akan terlihat dalam perbesaran 4x10. Pada pebesaran tersebut, akan
terlihat kotak-kotak berukuran besar sebanyak 25 kotak. Setiap satu kotak besar
berukuran 1 mm2. Pada perbesaran 40x10 akan terlihat dengan jelas satu kotak
besar yang menyusun ruang kamar memiliki 16 kotak.
Sel-sel yeast yang berhamburan pada ruang-ruang kamar Haemocytometer
tidak perlu dihitung semua. Hanya 5 kotak besar dari 25 kotak besar yang dipilih,
tetapi harus bersifat representatif. Pemilihan 5 kotak dapat secara diagonal atau
pada keempat kotak yang berada di setiap sudut dengan satu kotak berada di
tengah.

(a)
(b)
Gambar 2 Ruang-ruang kamar yang dipilih untuk perhitungan sel yeast (a) dan
ketika sel yeast diteteskan pada Heamocytometer (b)
Pada percobaan, ketika suspensi yeast diteteskan pada ruang-ruang kamar
ini, maka sel-sel yeast baik yang hidup dan yang mati tidak dapat dibedakan.
Untuk membedakan sel yang mati dengan sel yang hidup maka digunakan larutan
pewarna yaitu methylene blue. Ketika methylene blue ini ditambahkan, maka sel
yang hidup akan tetap tidak berwarna atau transparan sedangkan sel yang mati
akan berwarna biru, karena sel mati memiliki lapisan dinding sel yang rusak
sehingga pewarna dapat masuk. Konsentrasi methylene blue ini tidak boleh terlalu
tinggi, karena dapat menyebabkan zat pewarna dapat masuk menembus lapisan
dinding sel yang hidup sehingga sel hidup akan membentuk warna biru.
Konsentrasi methylene blue yang digunakan sebaiknya sebesar 0,1% b/v. Sel-sel
sebelum dan sesudah diberi methylene blue pada percobaan dapat dilihati di
lampiran. Dari hasil percobaan diperoleh rerata kepadatan sel yeast yaitu sebesar
1,81.107 sel/mL.
Sel-sel yeast berupa bulatan-bulatan kecil yang memisah satu sama lain,
tetapi ada pula yang bergabung menjadi suatu koloni yang bertumpuk dan
bergerombol sehingga dapat mempersulit perhitungan jumlah sel. Cara
mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan
menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilena diaminatetraasetat dan
Tween sebanyak 0,1% tetapi pada percobaan tidak dilakukan penambahan anti
gumpal ini.
Haemocytometer
memiliki
kelemahan
dan
kelebihan
dalam
penggunaannya pada proses penghitungan bakteri secara langsung.
Kelebihannnya antara lain ialah cepat dalam menghasilkan data sehingga tak perlu
menunggu lama, kepadatan sel, dapat mengamati morfologi sel, mengevaluasi
homogenitas, dan dapat mendeteksi kontaminan. Sedangkan kelemahannya ialah
tidak dapat membedakan antara sel yang mati dengan yang hidup apabila tidak
menggunakan suatu larutan pewarna untuk membedakannya, sulitnya menghitung
sel berukuran sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan Haemocytometer tidak
memungkinkan digunakannya lensa objektif celup minyak, dan data yang
dihasilkan tidak akurat karena setiap pengamat keterbatasan dalam melihat serta
menghitung sel yang ada dalam ruang-ruang kamar Haemocytometer. Oleh karena
itu, sebaiknya menggunakan alat yang lebih canggih lagi dalam perhitungan
jumlah sel karena setiap peralatan elektronik memilki kesensitifan yang tinggi
dibandingkan dengan mata manusia, seperti particle counter.

Simpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan pada perhitungan jumlah
sel yeast secara langsung dengan menggunakan Haemocytometer diperoleh
kepadatan sel yeast sebesar 1,81.107 sel/mL.
Daftar Pustaka
Afriyanto E. 2005. Pakan Ikan dan Perkembangannya. Jakarta: Kanisius.
Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayat. Jakarta: Kedokteran EGC. Ed. ke-3.
Lay B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo Persada.
Volk. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Erlangga.
Lampiran
Sel-sel yeast sebelum diberi methylene blue (a) dan setelah diberi methylene
blue (b) pada hasil percobaan sebagai berikut.

Contoh perhitungan jumlah sel/mL pada kelompok 1.

xx =
sel/mL = xx . 25 .
sel/mL = 16,6 . 25 .

. 103
. 103

sel/mL = 4,15.106 sel/mL

Kepadatan sel yeast dalam 1 mL suspensi.
sel/mL =

= 1,81.107