Lampiran 1.

Prosedur Analisis

a. Kadar Air (AOAC 1995)

Sampel sebanyak 2 g dimasukan ke dalam cawan almunium yang telah
diketahui bobotnya. Kemudian dikeringkan di dalam oven bersuhu 100-105oC
sampai bobot konstan. Setelah itu didinginkan di dalam desikator dan ditimbang.

(%) = 100%

b. Kadar Abu (AOAC 1995)

Sampel sebanyak 3-5 g dimasukan ke dalam cawan porselin yang telah
diketahui bobotnya, kemudian diabukan ke dalam furnace pada suhu 600oC
selama kurang lebih 4 jam atau sampai diperoleh abu berwarna putih. Setelah itu
cawan didinginkan dalam desikator sampai suhu ruang dan di timbang.
()
(%) = 100
()

c. Kadar Serat Kasar (AOAC 1995)

Sampel sebanyak 5 g dimasukan kedalam Erlenmeyer 500 ml kemudian
ditambahkan 100 ml H2SO4 0,325 N dan dididihkan selama kurang lebih 30
menit. Ditambahkan lagi 50 ml NaOH 1,25 N dan dididihkan selama 30 menit.
Dalam keadaan panas disaring kertas Whatman No. 40 setelah diketahui bobot
keringnya. Kertas saring yang di gunakan dicuci berturut-turut dengan air panas,
25 ml H2SO4 dan etanol 95%. Kemudian dikeringkan di dalam oven bersuhu 100-
110oC sampai bobotnya konstan. Kertas saring didinginkan dalam desikator dan
ditimbang.

% = 100

d. Kadar Pati (AOAC 1995)

Analisa kadar pati berdasarkan metode Luff Schrool. Larutan Luff Schrool
dengan cara CuSO4.5H2O sebanyak 25 g dilarutkan dalam 50 ml asam sitrat
dilarutkan dalam 50 ml air suling dan 388 g Na2CO3.10H2O dilarutkan dalam 400
ml air suling. Larutan asam sitrat ditambahkan sedikit demi sedikit kepada larutan
64

soda, lalu campuran ditambahi larutan terusi dan diencerkan hingga 100 ml pada
labu ukur, kemudian ke dalam erlenmeyer 500 ml di masukan 2 g sampel kering,
kemudian ditambahkan 200 ml HCl 3% dan batu didih. Erlenmeyer dipasang pada
pendingin tegak dan dihidrolisa selama 3 jam. Larutan kemudian didinginkan dan
dinetralkan dengan NaOH dengan indikator fenolfetalin. Larutan dimasukan ke
dalam labu ukur 500 ml, ditempatkan hingga tanda tera dengan air suling,
kemudian disaring. Larutan sebanyak 10 ml dipipet ke dalam erlenmeyer 250 ml
dan ditambahkan larutan Luff Schrool 25 ml serta 15 ml air suling. Blanko di buat
tanpa larutan contoh yang di analisa. Kemudian ditambahkan larutan KI 30% dan
25 ml H2SO4 25%. Setelah reaksi habis segera dititrasi dengan larutan Na2S2O3
sampai larutan berwarna muda.

0,90
(%) = 100%

Dimana :
0,90 = faktor pembanding berat molekul satu unit gula dalam molekul pati
G = glukosa setara dengan ml Na2S2O3 yang dipergunakan untuk titrasi (mg)
setelah gula diperhitungkan
P = pengenceran
g = bobot sampel (mg)

e. Kadar Protein (AOAC 1995)

Sebanyak 0,1-0,5 g sampel dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 30 ml dan
ditambahkan 1,9 g K2SO4 40 mg HgO, 2 ml H2SO4 dan beberapa butir batu didih.
Kemudian, didihkan selama 60-90 menit sampai cairan jernih. Setelah itu
didinginkan, ditambahkan sedikit H2O lewat dinding, dan didestilasi sampai
diperoleh 15 ml destilat berwarna hijau. Destilasi dilakukan dengan erlenmeyer
125 ml berisi 5 ml H3BO3, 2 tetes indikator (campuran 2 bagian metal merah 0,2%
dalam alkohol dan 1 bagian metilen blue 0,2 % dalam alkohol), dan ditambahkan
8 10 ml NaOH-Na2S2O3. Hasil destilasi diencerkan sampai 50 ml dan dititrasi
dengan HCl 0,02N
14,007 100
(%) =

Kadar Protein (%) = % N x faktor konversi (6,25)
 65

f. Kadar Lemak (Metode Ekstraksi Soxhlet) (AOAC 1995)

Sebanyak 5 g sampel yang ditepungkan dibungkus dengan kertas saring,
dimasukan ke dalam soxhlet, lalu ditambahkan heksan secukupnya dan direfluks
selama 5-6 jam. Kemudian, labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dan
pelarut dipanaskan pada oven dengan suhu 105oC setelah itu didinginkan dalam
desikatot dan ditimbang

(%) = 100%

g. Analisa Kadar Neutral Detergen Fiber (NDF) (Van Soest 1963)

Sampel ditimbang sebanyak A g dan kemudian dimasukan ke dalam gelas
piala 500 ml. Larutan detergen netral (NDS) yang mengandung aquades 1 l
;natrium sulfat 30 g; EDTA 18,81g; natrium borat 10 H2O 6,81 g; Di Na-HPO4
anhidrat 4,5 g; 2-etoksi etanol murni 10 ml dimasukan ke dalam gelas piala. Filter
glass G-3 ditimbang beratnya (B g). larutan campuran kemudian dipanaskan
selama satu jam di atas penangas listrik. Sampel becampur dengan larutan NDS
kemudian disaring dengan filter glass dan dibantu dengan pompa vakum. Sisa
hasil penyaringan kemudian dibilas sebanyak tiga kali dengan air panas dan
aseton. Sisa hasil penyaringan kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu
105oC. Hasil penyaringan yang telah kering kemudian ditimbang bobotnya (C g)
setelah terlebih dahulu didinginkan di dalam desikator.

% = 100%

h. Analisa Kadar Acid Detergent Fiber (ADF) dan Hemiselulosa (Van Soest
1963)
Sampel ditimbang sebanyak A g dan kemudian dimasukan ke dalam gelas
piala. Larutan detergen asam (ADS) sebanyak 5 ml yang mengandung H2SO4;
CTAB (cethyle trymethyl ammonium bromide) dimasukan ke dalam gelas piala.
Larutan campuran kemudian dipanaskan selama satu jam di atas penangas listrik.
Filter glass G-3 ditimbang beratnya (B g). Sampel yang bercampur dengan larutan
ADS kemudian disaring dengan filter glass dan dibantu dengan pompa vakum.
Sisa hasil saringan kemudian dibilas sebanyak tiga kali dengan air panas dan
aseton. Sisa hasil penyaringan kemudian dikeringkan di dalam oven 105oC. Hasil
66

penyaringan yang telah dikeringkan kemudian ditimbang bobotnya (C g) setelah

didinginkan terlebih dahulu di dalam desikator selama satu jam.

(%) = 100%

i. Analisa Kadar Selulosa (Van Soest 1963)

Residu analisa acid detergent fiber (ADF) ditimbang bobotnya (C g)
kemudian diletakan di atas nampan yang berisi air dengan ketinggian 1 cm.
Larutan H2SO4 ditambahkan ke dalam nampan hingga ke tinggian bagian filter
glass. Biarkan sampel selama 3 jam sambil diaduk-aduk. Sampel dipisahkan dari
larutan dengan disaring menggunakan pompa vakum. Pencucian dilakukan
dengan larutan aseton dan air panas. Sisa hasil penyaringan kemudian dikeringkan
di dalam oven pada suhu 105oC. Hasil penyaringan yang telah dikeringkan
kemudian ditimbang bobotnya (D g) setelah didinginkan terlebih dahulu di dalam
desikator selama satu jam.

(%) = 100%

j. Penetapan Total Gula Metode Phenol H2SO4 (AOAC 1995)

Sebelum melakukan pengujian sampel maka perlu diketahui kurva standar
fenol yang digunakan. Pembuatan kurva standar fenol adalah sebagai berikut :
2 ml larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40, dan 60 g
glukosa masing-masing di masukan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml
larutan fenol 5% dan dikocok. Kemudian 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan
dengan cepat. Biarkan selama 10 menit, kocok lalu tempatkan dalam penanggas
air selama 15 menit. Absorbansi diukur pada 490 nm. Pengujian sampel dengan
pembuatan kurva standar fenol, hanya 2 ml larutan glukosa diganti dengan 2 ml
sampel.

k. Penetapan Gula Pereduksi Metode DNS (Miller 1959)

Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan
mereduksi 3,5-dinitrolisilat (DNS) membentuk senyawa yang dapat diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm.
 67

Persiapan Pereaksi DNS

Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 10,6 g asam 3,5 dinitrolisilat dan
19,8 NaOH ke dalam 1416 ml air. Setelah itu ditambahkan 306 g Na-K
Tatrat, 7,6 g fenol yang dicairkan pada suhu 50oC dan 8,3 g Na-metabisulfit.
Larutan ini diaduk rata, kemudian 3 ml larutan dititrasi dengan HCl 0,1 N
dengan indikator fenolftalein. Banyak titran berkisar 5 - 6 ml. Jika kurang
dari itu harus ditambahkan 2 g NaOH untuk setiap ml kekurangan HCl 0,1 N
Penentuan Kurva Standar
Kurva standar dibuat dengan mengukur untuk mengetahui nilai gula
pereduksi pada glukosa pada selang 0,2 0,5 mg/l. Kemudian nilai gula
pereduksi dicari dengan metoda DNS. Hasil yang didapatkan diplotkan dalam
grafik secara linier.
Penetapan Gula Pereduksi
Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai
berikut : 1 ml sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Larutan tersebut ditempatkan dalam air
mendidih selama 5 menit. Biarkan sampai dingin pada suhu ruang. Ukur
absorbansi pada panjang gelombang 550 nm.

l. Total Asam (Apriyantono et al. 1989)

Sampel sebanyak 10 g dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan di
tambahkan akuades dan ditempatkan sampai tanda tera, lalu dikocok dan disaring
dengan kertas saring biasa. Hasil saringan diambil sebanyak 50 ml dan diteteskan
indikator pp lalu dititrasi dengan NaOH.
100
100
= 50

m. Pengukuran Furfural, dan 5-hidroksimetil furfural (HMF) (Ameur et al. 2005)

Pengukuran furfural, 5-hidroksimetil furfural (HMF) dan asam asetat
dilakukan dengan menggunakan HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). Ada pun spesifikasi yang digunakan sebagai berikut :
68

Pengukuran Furfural dan hidroksimetil furfural (HMF) dan Furfural :

Kolom C18 5m (3.9 mm x 300 mm)
Laju alir 1 ml/menit
Panjang gelombang 284 nm
Volume sampel 20 l.
Fase mobile Sodium Acetat dan Metanol (80:20) dan di tambahkan asam
asetat hingga pH dicapai 3,6

n. Pengukuran pH
Pengukuran pH dilakukan untuk mengetahui kondisi keasaman substrat
selama proses fermentasi. Pengukuran dilakukan secara periodik sampai akhir
proses ferentasi selama 96 jam. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan
pH meter.

o. Efisiensi Penggunaan Substrat

Efisiensi penggunaan substrat diperoleh dengan membagi selisih nilai total
gula awal (A) dan total gula setelah ferementasi (B) dengan dibagi nilai total gula
awal (A). Efesiensi penggunaan substrat dihitung menggunakan rumus :

(%) = 100%

p. Kadar Etanol % (v/v)

Hasil distilasi dilakukan uji kadar etanol menggunakan density meter
dengan spesifikasi sebagai berikut :
Jenis : Density Meter DMA 4500 Merk Anton Park
Sampel : 2 ml
Metode : % v/v 01ML-ITS-90
Suhu : 20 oC

q. Efisiensi Fermentasi
Efisiensi fermentasi diperoleh dengan membagi konsentrasi etanol
sesungguhnya (yang diperoleh) (A) dengan konsentrasi etanol secara teoritis (B).
Efesiensi fermentasi dihitung menggunakan rumus :

% = 100%

 69

r. Rendemen Etanol % (w/w)

Rendemen Etanol = 100 %

70