Metoda-metoda didalam Mikroteknik

MIKROTEKNIK
Mikroteknik merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan
untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop,
karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan
mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah
definisi dan peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan dalam pikiran
kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian atau seluruhan dari struktur
yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi
dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus
pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut (Gunarso, 1989). Sedangkan menurut Amar
(2008) Mikroteknik adalah ilmu yang akan mempelajari metode/prosedur pembuatan preparat
mikroskopik.

Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis, tentunya
pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai
Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada wilayah
aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka
memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan
prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam
pembuatan sediaan Mikroskopis.

Organ adalah susunan dari bagian organisme, yang tujuannya melakukan fungsi tertentu ataupun
kesatuan yang erat kaitannya. Dengan demikian pembuluh darah adalah organ yang fungsinya
membawa atau mengalirkan darah. Hati adalah organ yang mempunyai banyak fungsi, akan
tetapi sebagai kesatuan fungsi maka hati ini erat kaitannya dengan pencernaan dan asimilasi
makanan (Gunarso, 1989).

Jaringan adalah kumpulan sel yang mempunyai fungsi tertentu

yang khas bagi perkembangannya. Sebagai contoh jaringan
epitelia dapat terdiri dari satu atau beberapa lapisan sel yang
telah berkembang dan membantuk lapisan penutup, jenis
jaringan lainnya, jaringan otot terdiri dari sel-sel yang reka
membentuk otot (Gunarso, 1989).
Sel adalah bagian yang merupakan penyusun dasar suatu jaringan, dan pada kenyataannnya
merupakan bagian dari semua makhluk hidup. Suatu sel dapat merupakan organisme yang
lengkap, ataupun sejumlah sel dapat bergabung membentuk suatu jaringan, kombinasi
penyusunnya membentuk orga-organ. Bentu-bentuk kehidupan berderajat tinggi sekalipun
dimulai dari satu sel. Bila suatu organisme hanya teridiri dari satu sel, maka dinamakan
Organisme Uniseluler. Sedangkan yang terbentuk oleh kumpulan sel-sel yang berbeda fungsinya
dinamakan Organisme Multiseluler (Gunarso, 1989).
Metoda-metoda didalam Mikroteknik yang umum digunakan :
1. Sediaan utuh (Whole mounts)
2. Sediaan irisan (sectioning)
3. Sediaan uraian (teasing)
4. Sediaan ulasan (smearing)
Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti :
1. Sediaan rentang (spreading preparation)
2. Sediaan gosok sediaan remasan (squash)
3. Sediaan supravital

Metoda Sediaan Utuh (Whole Mounts)

Dengan metoda ini dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organisme (baik hewan
maupun tumhuhan) secara utuh. spesimen kultur, organ, maupun bagian organ, embrio, sel telur,
spermatozoa ,potongan syaraf,pembuluh darah, jenis-jenis selaput tipis dan sebagainya. Melalui
metoda ini diusahakan agar kita mendapat kesan bentuk aslinya dengan mempertahankan format-
format taga dimensinya. Yang menjadi pembatas adalah faktor ukuran, ketabalan, serta tingkat
transparansi sediaan yang kita buat tersebut yang berkaitan dengan faktor pembesaran
pengamatan melalui mikroskop nantinya. Sediaan dengan ketebalan 2 mm dan transparan akan
memungkinkan untuk diamati sampai tingkat perbasaran tidak lebih dari 30 kali. Sediaan dengan
ketebalan 0,5 mm mungkin hanya akan mencapai tingkat perbesaran 100 kali. Sediaan permanen
dengan ketebalan 0,2 mm atau lebih yang telah di dehidrasidan diberi media pelekap memerluka
adanya suatu penunjang gelas penutup agar spesimen tidak menjadi rusak dan gelas penutupnya
sendiri tidak pecah karena proses pengeringan serta pengkerutan media tersebuut. Belakangan ini
umum pula digunakan tabung plastik yang dipotong-potong secara melintang hingga dihasilkan
cincin-cincin penunjang dengan ketebalan yang sesuai dengan tinggi serta ketebalan speimen.
Tepi tempat pemotongan sebaiknya dihaluskan dengan mengunakan kerrtas amplas (Gunarso,
1989).

Menurut (Joyner, 2008 dalam zaifbio 2010) Whole mounth

merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akan
diamati dengan mikroskop tanpa didahului adanya proses
pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang diamati adalah
preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun
individu. Gambar yang dihasilkan oleh preparat whole mounth ini
terlihat dalam wujud utuhnya seperti ketika organisme tersebut
masih hidup sehingga pengamatan yang dapat dilakukan hanya
terbatas terhadap morfologi secara umum saja. Metode
pembuatan preparat yang digunakan untuk pengamatan secara
menyeluruh, artinya mempelajari struktur vegetatif dan
reproduktifnya tanpa melakukan penyayatan terhadap tanaman
tersebut karena metode ini menggunakan semua bagian tanaman
sebagai preparatnya. Tentu saja tanaman yang diamati haruslah
berukuran kecil sehingga dapat termuat pada objek glass.
Sedangkan pada tanaman yang agak besar bisa dilakukan
pemangkasan agar menjadi lebih rapi dan kecil. Metode whole
mounth mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-masing.
Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian
tanaman dengan jelas tiap bagian-bagiannya. Sedangkan
kelemahannya adalah metode ini hanya bisa dilakukan pada
tanaman dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa tanaman yang
besar sehingga metode ini perlu terus dikembangkan dengan
melakukan bebagai percobaan (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Irisan (Sectioning)
Cara pengerjaan melalui irisan atau sayatan ini dianggap sebagai teknik rutin ataupun teknik bagi
penyiapan spesimen histologi amaupun patologi. Tebal tipisnya sayatan bergantung pada
pengalaman serta tujuan penyiapan spesimen. Tebal sayatan yang umum berkisar antara 6-15
mikron (1 mikron = 0,001 mm). Ukura sayatan juga sangat bervariasi, mulai dari saytaan
pembuluh darah yang sangat kecil hingga sayatan otak. Ukuran sayatan biasanya terbatas pada
ukuran panjang lebar 2x3 cm karena ukuran yang demikian paling sesuai untuk direkapkan pada
kaca preparat yang umum digunakan. Tentu saja ukuran spesimen yang cukup kecil akan
mengjasilkan sayatan juga juga jauh lebih kecil dari ukuran sayatan tersebut.
Pengirisan atau penyayatan umumnya dilakukan dengan bantuan
mikrotom, walau seringkali dilakukan penyayatan dengan tangan
saja untuk jenis spesimen seperti tulang, gigi ataupun benda-
benda fosil seringkali diperlukan gergaji untuk memotongnya.
Mikrotom adalah jenis mesin khusus dirancang dan dipasarkan
untuk tujuan mikroteknik. Mesin tersebut dirancang sedemikian
rupa sehingga mampu untuk melakukan penyayatan sesuatu
spesimen dengan ketebalan yang sama atau paling kurang
mendekati sama (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Uraian (Teasing Preparations)
Pengertian teasing adalah menguaraikan. Untuk dapat memisahkan komponen suatu jenis
jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan menggunakan jarum penguraian.
Dengan demikian pengertian teasng ini berarti juga pembedahan dalam skala kecil. Tingkatnya
pada pembedahan biasa dan pembedahan mikro yang dilakukan dengan menggunakan jarum
pengurai. Teasing ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah difiksasi dan mengalami
pewarnaan

Secara umum jenis tisu yang bisa ditelaah melalui metode ulas ini adalah darah, limfa, cairan
sum-sum tulang belakang, semen janan, sediaan air seni, serta beberapa lainnya. Masing-masing
biasanya memerlukan teknik perlakuan tersendiri dalam melakukan pengulasa atau penyebaran
pada kaca preparat. Untuk jenis cairan yang mengandung suspensi yang tinggi densitasnya
umumnya dicairkan dengan air atau serum darah dengan perbandingan 1 : 5 atau 1 : 10
(Gunarso, 1989).

Metoda Sediaan Rentang

Pada metoda ini preparat belum difiksasi, diperlakukan sedemikian rupa sehingga disamping
jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui perentangan. Jenis bahan siapan yang
umum direntang saat difiksasi adalah otot, syaraf, jenis jaringan tipis (selaput yang membungkus
jantung ,hate dan lain-lain) (Gunarso,1989).

Metoda Sediaan Gosok

Jenis jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan
beberapa lainnya mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat
sediaan sayatan (kecuali bila mengalami berbagai perlakuan
khusus sebelumnya). Untuk mengatasi hal diatas tadi, maka
umum juga dibuat sediaan dengan metoda gosok. Tulang
misalkan tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong hingga
ukuran beberapa mili hingga 1 2 cm. Potongan tersebut
kemudian digosok pada batu hingga cukup tipis untuk dapat
diamati pada mikroskop (Gunarso, 1989).

Metoda Sediaan Supravital

Selain jenis-jenis metoda yang dimanfaatkan materi yang mengalami matian dan fiksasi. Untuk
pengamatan sel-sel darah yang masih hidup umumnya digunakan zat warna vital seperti Yanus
green atau Neutral red, karena sel darah mempunyai kemampuan untuk menghisap zat warna
pada konsentrasi yang sesuai. Bila kedua zat warna tersebut dipakai secara bersama-sama maka
memungkinkan kita untuk mengamati mitokondria. Hanya saja akan terjadi perubahan yang
sangat cepat pada sel, karena sel dapat mati oleh kedua warna tadi secara bersamaan (Gunarso,
1989).

Contoh penyiapan sediaan supervital darah adalah :

1. Satu tetes darah diteteskan pada kaca preparat
2. Teteskan pula 1 tetes zat warna (missal yanus green) dengan
konsentrasi 0,25 dalam garam fisiologis3. Tutup dengan kaca penutup
4. Biarkan selama 5 menit
5. Beri lak petrolatum sekeliling tepi kaca penutup. (Lasantha, 2010)

Metoda Sediaan Remasan (Squash)

Metode remasan banyak dikakukan untuk penyaiapan pengamatan kromosom baik hewan
maupun tumbuhan. Dengan metoda ini bahan diremas atau dihancurkan sehingga masing-masing
sel akan terlepas yang memudahkan pengamatan selanjutnya. Jadi tujuan peremasan ini bukan
berarti menghancurkan sel-selnya, tapi masing-masing sel bebas terlepas satu sama lain dengan
tetap dipertahankan bentuk aslinya

Tahapan tahapan dalam mikroteknik

 1. Fiksasi (fixation)
Fiksasi bisa dengan kimiawi yaitu menggunakan senyawa formaldehide / glutardehide dan
mekanik dengan cara difreezing atau boiling.Tujuan fixation adalah untuk mempertahankan
bentuk sel atau jaringan seperti jaringan aslinya , serta untuk mencegah rusaknya sampel akibat
autolisis atau karena bakteri dekomposisi (bakteri pengurai).

2. Dehydration dan clearing

Menggunakan alkohol yang diberikan secara bertingkat dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi
rendah. Tujuan dari dehidrasi yaitu untuk menghilangkan sisa-sisa cairan/air yang ada pada
sampel sehingga saat proses selanjutnya tidak terbentuk es di dalam sampel. Setelah proses
dehydration di clearing dengan larutan xyline untuk membersihkan sisa-sisa alkohol.
3. Embedding
Sampel dikeraskan dengan menggunakan lilin/waxes, resin untuk membentuk blok parapin.
Dikeraskan supaya mudah untuk dilakukan pemotongan sampel.
4. Sectioning
Sampel dipotong dengan mengunakan alat pemotong misalnya microtome. Ataupun jika
sebelumnya sampel difiksasi dengan cara freezing bisa selanjutnya dipotong dengan metode
cryostat (pemotongan dengan dibekukan).
5. Staining
Selanjut sampel diwarnai, biasanya dengan pewarnaan hymatoksilin-eosin atau dari derivatnya
yang lain yang biasa digunakan. Pewarnaan tersebut untuk mewarnai inti sel dan sitoplasmanya.
6. Mouthing
Setelah diwarnai selanjutnya sampel bisa langsung diamati dibawah mikroskop atau di proses
mouthing sampel dengan tujuan untuk mempertahankan sampel jika disimpal lama,
pewarnaannya dan sampelnya tidak rusak. Biasanya menggunakan canada balsem.
I.Fiksasi

Tujuan utama fiksas adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap elemen-lemen

jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit
banyak mendekati keadaan aslinya. Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan
jaringan yang disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang terkandung
dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis. Dengan kata lain fiksasi bertujuan:

- Mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat sehingga

keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.

- Mencegah autolisis
- Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan komponen cairan
fiksatif.

Pada garis besarnya berdasarkan komposisi bahannya suatu fiksatif dapat dikelompok kan
menjadi Fiksatif tunggal. Hanya menggunakan satu bahan kimia umum dalam bentuk larutan
Contoh: formalin ,alcohol ,asam asetat dan asam pikrat. Umumnya kurang memenuhi
persyaratan sebagai fiksatif yang baik, terutama bagi tujuan mikroteknik. Masih umum
digunakan untuk tujuan anatomi maupun histopatologi terutama fiksatif formalin.

Fiksatif majemuk
Umumnya berupa campuran dari beberapa fiksatif tunggal Disusun dengan formula agar dapat
diperoleh sesuai keinginan dan tujuan.biasanya fiksatif campuran ini dituliskan sesuai dengan
nama penemu formulanya Banyak sekali fiksatif campuran yang ada,

contoh : larutan Bouin,larutan FAA, larutan glison, dan lain sebagainya

Fiksatif berfungsi untuk menghentikan metabolisme secara cepat, mengawetkan

komponen sitologis dan histologis, memperkeras tekstur yang rapuh, dan mewarnai jaringan
sehingga bagian-bagiannya dapat diketahui. Faktor-faktor yang berperan dalam fiksasi adalah
buffer (pH), suhu yang rendah, ketebalan irisan, perubahan volume,osmolalitas pada larutan
fiksatif, konsentrasi, dan waktu fiksasi.Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air dalam
jaringan. Bahan yangdigunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air.
Dehidrasi yang baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai
dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96%dan
alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali.Metode paraffin
merupakan cara dalam pembuatan sediaan denganmenggunakan paraffin sebagai
media embedding (penanaman).

II. Dehydration dan clearing (penjernihan)

Clearing atau dealkoholisasi ini dapat menggunakan aceton, benzol,toluol, dan xilol.
Clearing dapat dilakukan selama 24 jam.Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen
biologi menjadi bagianyang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa
mikrotommenggunakan pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan
atau tumbuhan dalam histologi (Wikipedia). Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai
pada mikroteknik adalah:1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya
untuk organ-organ keras seperti kayu2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya
dengan di putar yang akanmengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap.
Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin3. Sliding microtom atau
mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju dan mundur.
Mikrotom ini sering digunakan padamikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan
pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objek-
objek yang keras.4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk
penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi
jaringanyang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan denganmemakai gas
CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakailebih pendek, karena langsung
disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi
lunak sehingga sulit dipotong. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini
adalah:o Mikrotom harus seberat mungkino Meja tempat mikrotom harus stabilo Pisau harus
cocok dengan mikrotomo Posisi pisau harus stabilo Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya
harus sama dengan balok jaringanyang akan disayat.
http://catattan-aku.blogspot.co.id/2013/04/metoda-metoda-didalam-
mikroteknik.html