LAPORAN BIDANG PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

PENGUJIAN ENDOTOKSIN DAN MIKROBIOLOGI PADA OBAT TRADISIONAL

Oleh
Ratri Septyaning Palupi dan Wayan Chintia Yunita (ITB)

PENGUJIAN ENDOTOKSIN
Endotoksin merupakan suatu zat yang berasal dari bakteri gram negatif yang
mempunyai struktur kimia berupa kompleks lipopolisakarida (LPS) yang terdapat pada
dinding sel bakteri dan dilepaskan bila bakteri mengalami lisis. Endotoksin termasuk dalam
kelas pirogen, yaitu senyawa yang menginduksi demam bila masuk ke dalam tubuh
organisme sakit maupun sehat. Pirogen merupan senyawa yang menyebabkan kenaikan suhu
tubuh akibat penggunaan produk farmasi yang diberikan secara intravena. Semua endotoksin
bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen merupakan endotoksin.
Uji endotoksin adalah uji untuk memperkirakan kadar endotoksin bakteri yang
mungkin ada dalam atau pada bahan uji (FI V, 2014). Uji ini dilakukan untuk sediaan
parenteral maupun alat kesehatan yang dipakai sebagai perantara sediaan parenteral tersebut.
Saat ini, uji endotoksin dilakukan menggunakan metode Limulus amoebocyte lysate (LAL)
test. Uji LAL merupakan uji in vitro untuk mendeteksi dan menganalisis secara kuantitatif
endotoksin bakteri. Terdapat 3 metode analisis LAL yang sering dilakukan, yaitu teknik gel-
clot (jendal), turbidimetri kinetik, dan kromogenik (kolorimetri). Tetapi, pengujian yang telah
dilakukan adalah metode gel-clot. Prinsip dari metode ini adalah LAL akan menggumpal
dengan adanya endotoksin. Berikut ini merupakan alat, bahan, dan tahapan pengujian dari
metode gel-clot pada sampel sediaan parenteral dengan kode 437 dan 570:
Alat : tabung reaksi borosilikat yang telah dipanaskan 200C selama 2 jam, mikropipet, tip
steril, spidol, vortex, gunting
Bahan : control standard endotoxin (CSE), LAL, LAL reagent water (LRW), alumunium
foil, sampel
Tahapan Pengujian:
1. Uji konfirmasi kepekaan LAL
Uji konfirmasi kepekaan LAL merupakan uji yang dilakukan untuk mengetahui atau
mengkonfirmasi apakah LAL yang akan digunakan dalam pengujian dapat digunakan
untuk uji endotoksin atau tidak. Uji konfirmasi ini biasanya dilakukan sekali di awal
ketika LAL yang digunakan memiliki sertifikat analisis yang berbeda dengan yang
digunakan sebelumnya, sehingga untuk pengujian selanjutnya, selama masih
menggunakan LAL dengan sertifikat analisis yang sama, maka uji konfirmasi tidak perlu
dilakukan kembali.
Tahapan:
a. Untuk membuat larutan baku, CSE (5000 EU) dilarutkan dalam 5 mL LRW untuk
mendapatkan larutan 1000 EU/mL, kemudian divortex selama 5 menit untuk
dihomogenkan. Sensitivitas CSE yang digunakan adalah 0,125 EU/
5000 EU dilarutkan dalam 5 mL LRW 1 mL larutan memiliki kadar 1000 EU
1000 EU
= 8000 larutan baku
0,125 EU

b. LAL dilarutkan dalam 5,2 mL LRW, lalu dihomogenkan perlahan tanpa menggunakan
vortex agar tidak rusak
c. Dilakukan pengenceran larutan baku CSE sebagai berikut:

0,1 mL 0,1 mL 0,3 mL 2,5 mL 1 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL

Baku 0,9 mL 0,9 mL 2,7 mL 2,5 mL 1 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL

8000 LRW LRW LRW LRW LRW LRW LRW LRW
800 80 8 4 2 1

Gambar 1. Prosedur Pengenceran Larutan Baku

Tiap pengenceran dilakukan vortex selama 1 2 menit. Untuk larutan 2, , , dan
, ditambahkan dengan LAL dengan perbandingan 1:1.
2. Pembuatan kontrol sampel positif (KSP)
Perbandingan 1:1
Larutan sampel Larutan CSE 4

Divortex selama 1-2 menit

Larutan homogen LAL

Kontrol sampel positif

(KSP)

Diinkubasi selama 37 1C selama 60 menit

Gambar 2. Prosedur Pembuatan KSP

3. Pembuatan kontrol positif dan negatif

Perbandingan 1:1
Larutan CSE 2 LAL

Kontrol Positif

Diinkubasi selama 37 1C selama 60 menit

Perbandingan 1:1
LRW LAL

Kontrol Negatif

Diinkubasi selama 37 1C selama 60 menit

Gambar 3. Prosedur Pembuatan Kontrol Positif dan Negatif

4. Pembuatan Larutan Sampel

0,3 mL sampel 0,3 mL LAL

Diaduk perlahan

Diinkubasi selama 37 1C selama 60 menit

Gambar 4. Prosedur Pembuatan Larutan Sampel

5. Pengujian Sampel
Sampel diuji dengan melihat apakah terbentuk gumpalan atau jendal di dasar tabung
reaksi. Sampel tersebut dibandingkan dengan kontrol positif, kontrol negatif, dan KSP.
Sampel tersebut dinyatakan positif apabila terbentuk gumpalan atau jendal di dasar tabung
reaksi. Sedangkan, sampel dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk gumpalan atau
jendal di dasar tabung reaksi.

Hasil Pengujian
Berikut merupakan hasil uji konfirmasi kepekaan LAL:
Tabel 1. Hasil Pengujian Endotoksin Pada Sampel 437 dan 560
2 (KSP) 437 560 (-)
+ + + - - - -
+ + + - - - -
KSP KSP
+ + + - + +
+ + + - + +
Keterangan: (+) = terbentuk gumpalan; (-) = negatif gumpalan

Berdasarkan tabel di atas, dapat disimpulkan bahwa sampel 437 dan 560 memiliki
hasil negatif. Artinya, sampel 437 dan 560 tidak memiliki kandungan endotoksin karena tidak
terdapat gumpalan di dasar tabung reaksi. Walaupun kedua sampel tersebut negatif
endotoksin, jika merujuk pada FI atau USP, kandungan endotoksin dalam kedua sampel
tersebut harus tetap dihitung dan dilihat persyaratannya berdasarkan monografinya.
Perhitungan kadar endotoksin dari kedua sampel ini adalah sebagai berikut:
Konsentrasi larutan baku(CSE) = 1000 EU/mL
Sensitivitas CSE = 0,125 EU/
1000 EUmL
larutan baku per mL = = 8000 mL
0,125 EU

Perhitungan konsentrasi larutan CSE:

0,1
800 1000 = 100
1
0,1
80 100 = 10
1
0,3
8 10 = 1
3
2,5
4 1 = 0,5
5
1
2 2 0,5 = 0,25
0,5
0,25 = 0,125
1
0,5
0,125 = 0,0625
1
0,5
0,0625 = 0,03125
1

2 Titik Akhir log

(EU/mL)
+ + + - 0,0625 -1,204
+ + + - 0,0625 -1,204
+ + + - 0,0625 -1,204
+ + + - 0,0625 -1,204
Rata-rata -1,204
Antilog 0,0625
EU/mL

Titik akhir pada tabel di atas diambil dari konsentrasi titik akhir di mana hasil uji konfirmasi
menunjukkan hasil positif, yaitu yang mana memiliki konsentrasi sebesar 0,0625 EU/mL.
Sampel 437 adalah sampel infus ringer laktat (RL) yang memiliki persyaratan endotoksin di
FI V sebesar 0,5 EU/mL. Sedangkan, sampel 560 adalah sampel infus NaCl 0,9% yang
memiliki persyaratan endotoksin di USP 38 sebesar 0,5 EU/mL. Hasil pengujian pada
sampel 437 dan 560 menunjukkan hasil negatif, sehingga dianggap bahwa kadar endotoksin
sampel adalah <0,125 EU/mL, dilihat dari sensitivitas LAL yang digunakan. Dari hasil
tersebut, maka bisa disimpulkan bahwa sampel 437 dan 560 memenuhi syarat yang telah
ditetapkan.

PENGUJIAN MIKROBIOLOGI OBAT TRADISIONAL

Menurut Peraturan Kepala BPOM No. HK.00.05.41.1384 tentang Kriteria dan Tata
Laksana Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar, dan Fitofarmaka, disebutkan
bahwa obat tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan
hewan, bahan mineral, sediaan sarian (galenik), atau campuran dari bahan tersebut, yang
secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman. Sediaan
obat tradisional yang beredar di Indonesia diawasi oleh BPOM dengan cara dilakukan
pengujian secara rutin. Sediaan obat tradisional yang diuji adalah dua jenis sediaan serbuk
dengan kode 460 dan 468. Sediaan obat tradisional selanjutnya akan dilakukan pengujian
mikrobiologi dengan parameter uji berupa angka lempeng total (ALT), angka kapang kamir
(AKK), dan adanya kontaminasi dari Pseudomonas sp, Salmonella sp, Staphylococcus
aureus, dan Eschericia coli. Alat dan bahan yang dibutuhkan serta prosedur pengujian yang
dilakukan untuk setiap parameter uji sebagai berikut.

A. PENGUJIAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) 18/MI/10

Prinsip Pengujian
Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada media agar
lempeng dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai.

Alat
Alat yang digunakan adalah cawan petri, pipet ukur, lampu spirtus, LAF, labu Erlenmeyer,
gelas ukur, hot plate, magnetic stirrer, dan autoclave.

Bahan
Bahan yang digunakan sampel, aquadest, LB, dan PDA.

Prosedur Pengujian
 10 g sampel 90 mL LB

Pengenceran 10-1 10-6

1 mL larutan 15 20 mL PDA

Keterangan: Inkubasi suhu 32,5 2,5C selama 48

LB = Lectin Broth 72 jam
PDA = Potato Dextrose
Agar

Koloni 30 300/cawan

Gambar 5. Prosedur Pengujian ALT

Hasil Pengujian
Hasil pengujian ALT setelah dilakukan inkubasi selama 3 hari menunjukkan adanya
pertumbuhan bakteri pada media yang digunakan. Koloni bakteri yang tumbuh berwarna
ungu pada media PCA dengan jumlah koloni berbeda-beda untuk setiap pengenceran yang
dilakukan.
1. Hasil Pengujian pada Sampel 460
Jumlah koloni yang tumbuh selanjutnya dihitung dengan menggunakan colony
counter. Persyaratan jumlah koloni pada setiap cawannya adalah 30-300 koloni/cawan. Hasil
perhitungan jumlah koloni pada setiap cawan untuk sampel 460 ditunjukkan pada table
berikut ini.
Tabel 2. Jumlah Koloni Bakteri per Cawan Petri pada Sampel 460
Jumlah Koloni (Koloni/Cawan)
No. Pengenceran
Cawan Petri 1 Cawan Petri 2
1. 10-1 >300 >300
-2
2. 10 169 197
3. 10-3 18 20
-4
4. 10 2 2
5. 10-5 0 0
-6
6. 10 0 0

Berdasarkan persyaratan jumlah koloni pada setiap cawan (30-300 koloni/cawan), jumlah
koloni pada pengenceran 10-2 memenuhi persyaratan yang telah disebutkan. Jumlah koloni
pada pengenceran 10-2 dilakukan perhitungan jumlah koloni/gram sampel seperti pada
perhitungan di bawah ini.
jumlah koloni cawan 1 + jumlah koloni cawan 2
Jumlah koloni = 102
2
169 + 172
Jumlah koloni = 102 = 18,3 102 18 103 koloni/gram
2
Kesimpulan: jumlah koloni bakteri pada sampel 460 memenuhi persyaratan yaitu kurang dari
1106 koloni/gram.

2. Hasil Pengujian pada Sampel 468

Jumlah koloni yang tumbuh selanjutnya dihitung dengan menggunakan colony
counter. Persyaratan jumlah koloni pada setiap cawannya adalah 30-300 koloni/cawan. Hasil
perhitungan jumlah koloni pada setiap cawan untuk sampel 468 ditunjukkan pada tabel
berikut ini.
Tabel 3. Jumlah Koloni Bakteri per Cawan Petri pada Sampel 468
Jumlah Koloni (Koloni/Cawan)
No. Pengenceran
Cawan Petri 1 Cawan Petri 2
1. 10-1 >300 >300
-2
2. 10 >300 >300
3. 10-3 226 219
-4
4. 10 25 20
5. 10-5 2 3
-6
6. 10 0 0

Berdasarkan persyaratan jumlah koloni pada setiap cawan (30-300 koloni/cawan), jumlah
koloni pada pengenceran 10-3 memenuhi persyaratan yang telah disebutkan. Jumlah koloni
pada pengenceran 10-3 dilakukan perhitungan jumlah koloni/gram sampel seperti pada
perhitungan di bawah ini.
jumlah koloni cawan 1 + jumlah koloni cawan 2
Jumlah koloni = 102
2
226 + 219
Jumlah koloni = 10 = 222,5 103 22 104 koloni/gram
3
2

Kesimpulan: jumlah koloni bakteri pada sampel 468 memenuhi persyaratan yaitu kurang dari
1106 koloni/gram.

B. ANGKA KAPANG KAMIR (AKK) 48/MI/2016

Prinsip
Pertumbuhan kapang/khamir setelah cuplikan diinokulasi pada media lempeng yang sesuai
dengan cara semai dan diinkubasi pada suhu 20 25oC.

Alat
Alat yang digunakan adalah cawan petri, pipet ukur, lampu spirtus, LAF, labu Erlenmeyer,
gelas ukur, hot plate, magnetic stirrer, dan autoclave.

Bahan
Bahan yang digunakan sampel, larutan dapar fosfat pH 7,2, aquadest, dan PDA.

Prosedur Pengujian
 10 g sampel 90 mL LDF pH 7,2

Pengenceran 10-1 10-4

1 mL larutan 15 20 mL PDA

Keterangan: Inkubasi suhu 20 25C selama 3 5

LDF = Larutan Dapar Fosfat hari
PDA = Potato Dextrose
Agar

Koloni 100/cawan

Gambar 18. Prosedur Pengujian AKK

Hasil Pengujian
Hasil pengujian AKK setelah dilakukan inkubasi selama 5 hari menunjukkan adanya
pertumbuhan bakteri pada media yang digunakan. Koloni kapang-kamir yang tumbuh
selanjutnya dihitung dengan menggunakan colony counter. Persyaratan jumlah koloni pada
setiap cawannya adalah 100 koloni/cawan. Hasil perhitungan jumlah koloni pada setiap
cawan untuk sampel 460 dan 468 ditunjukkan pada tabel berikut ini.

Tabel 4. Jumlah Koloni Kapang Kamir per Cawan Petri pada Sampel 460 dan 468
Jumlah Koloni Sampel 460 Jumlah Koloni Sampel 468
No
Pengenceran (Koloni/Cawan) (Koloni/Cawan)
.
Cawan Petri 1 Cawan Petri 2 Cawan Petri 1 Cawan Petri 2
1. 10-1 15 12 25 22
-2
2. 10 3 1 3 2
-3
3. 10 0 0 0 0
4. 10-4 0 0 0 0

Jumlah koloni kapang kamir pada setiap sampel selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah
koloni dalam setiap gram sampel. Perhitungan jumlah koloni kapang kamir dilakukan dengan
rumus:
C
N=
(V (n1 + 0,1 n2 )) d
Keterangan:
Persyaratan untuk rumus tersebut adalah jumlah koloni kapang-kamir yang tumbuh 100
koloni/cawan
N = jumlah koloni kapang kamir (koloni/gram)
C = jumlah koloni kapang kamir pada semua plat sampel yang diinkubasi
V = volume sampel yang ditanam pada media
n1, n2 = jumlah pengujian yang digunakan (duplo)
d = pengenceran awal tumbuhnya koloni

Berikut ini adalah perhitungan jumlah koloni kapang-kamir pada sampel 460 dan 468.
1. Sampel 460
C
N=
(V (n1 + 0,1 n2 )) d
15 + 12 + 3 + 1
N=
(1 (2 + (0,1 2))) 101
31
N= = 14 101 koloni/gram
2,2 101

2. Sampel 468
C
N=
(V (n1 + 0,1 n2 )) d
25 + 22 + 3 + 2
N=
(1 (2 + (0,1 2))) 101
52
N= = 23 101 koloni/gram
2,2 101

Kesimpulan: jumlah koloni bakteri pada sampel 460 dan 468 memenuhi persyaratan yaitu
kurang dari 1104 koloni/gram.

C. PENGUJIAN Eschericia coli 49/MIK/15

Prinsip Pengujian
Pertumbuhan E. coli pada media selektif yang sesuai, dilanjutkan dengan konfirmasi uji
biokimia, untuk menghasilkan senyawa indol dan tidak menggunakan asam sitrat sebagai
sumber energi.

Alat
Alat yang digunakan adalah cawan petri, pipet ukur, lampu spirtus, LAF, labu Erlenmeyer,
gelas ukur, hot plate, magnetic stirrer, oose, dan autoclave.

Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel, aquadest, larutan dapar fosfat pH 7,2, lactose broth,
bakteri Eschericia coli, MCB, dan MCA.

Prosedur Pengujian
 10 g sampel 90 mL LDF pH 7,2

Inkubasi suhu 30 - 37C

selama 2 5 jam

10 mL larutan 90 mL Lactose Broth

Inkubasi suhu 30 37C selama 18 24

jam

0,1 mL larutan 100 mL MCB

Inkubasi suhu 43 45C selama 18 24

jam
Keterangan:
LDF = Larutan Dapar Fosfat
MCB = MacConkey Broth Streaking di media MCA
MCA = MacConkey Agar

Inkubasi suhu 43 45C selama 18 24

jam

Gambar 20. Prosedur Pengujian Eschericia coli

Hasil Pengujian
Hasil pengujian Eschericia coli setelah dilakukan inkubasi selama 2 hari menunjukkan tidak
ada pertumbuhan bakteri pada media yang digunakan dibandingkan dengan kontrol positif
yang telah dibuat. Warna awal media sebelum diinkubasi adalah coklat muda. Koloni
Eschericia coli yang muncul pada kontrol positif berwarna merah muda dengan ada halo
disekitar koloni bakteri. Berikut ini adalah hasil pengujian sampel 460 dan 468 yang
dibandingkan dengan kontrol positif.
 Gambar 21. Hasil Pengujian Eschericia coli Sampel 460 Dibandingkan dengan Kontrol
Positif

Gambar 22. Hasil Pengujian Eschericia coli Sampel 468 Dibandingkan dengan Kontrol
Positif

Kesimpulan: sampel 460 dan 468 tidak mengandung bakteri Eschericia coli

D. PENGUJIAN Salmonella 41/MI/11

Prinsip Pengujian
Ada empat tahap untuk mendeteksi adanya Salmonella, yaitu:
1. Pra-pengkaya dalam media cair non-selektif yang diinkubasi pada 371oC selama
182 jam
2. Pengkaya dalam media cair selektif yang diinkubasi pada 41,51oC selama 243 jam
dalam RVS cair dan 371oC selama 243 jam dalam MKKTn cair
3. Inokulasi dan identifikasi dalam dua media padat selektif, media selektif pertama
diinkubasi pada 371oC selama 243 jam dan diinkubasi media selektif kedua
disesuaikan dengan media yang digunakan
4. Konfirmasi terhadap identitas Salmonella dengan uji biokimia dan serologi
Alat
Alat yang digunakan adalah cawan petri, pipet ukur, lampu spirtus, LAF, labu Erlenmeyer,
gelas ukur, hot plate, magnetic stirrer, oose, dan autoclave.

Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel, aquadest, larutan dapar fosfat pH 7,2, lactose broth,
bakteri Salmonella sp, MKTTN, RVS, BGA dan XLD.

Prosedur Pengujian

10 g sampel 90 mL LDF pH 7,2

Inkubasi suhu 30 - 37C

selama 2 5 jam

1 mL larutan 100 mL Lactose Broth

Inkubasi suhu 37C selama 5 24 jam

1 mL larutan 10 mL MKTTN 0,1 mL larutan 10 mL RVS

Inkubasi suhu 37 1C selama 24 3 Inkubasi suhu 41,5 1C selama 24 3

jam jam

Keterangan:
Streaking di media BGA & XLD LDF = Larutan Dapar Fosfat
MKTTN = Muller-
Kauffmann Tetrathionate
Novobiocine enrichment
Inkubasi suhu 36 1C selama 24 48 broth
jam RVS = Rappaport
Vassiliadis Soya
BGA = Brilliant Green
Agar

Gambar 23. Prosedur Pengujian Salmonella

Hasil Pengujian
Hasil pengujian Salmonella setelah dilakukan inkubasi selama 2 hari menunjukkan tidak ada
pertumbuhan bakteri pada media yang digunakan dibandingkan dengan kontrol positif yang
telah dibuat. Kontrol positif yang dibuat ditunjukkan pada gambar di bawah ini.
 Gambar 24. Kontrol Positif Salmonella pada Media Pengkaya MKTTN

Gambar 25. Kontrol Positif Salmonella pada Media Pengkaya RVS

Warna awal media sebelum diinkubasi adalah coklat muda untuk BGA dan merah untuk
XLD. Koloni Salmonella yang muncul pada kontrol positif berwarna merah muda pada
media BGA dan hitam pada media XLD. Berikut ini adalah hasil pengujian sampel 460 dan
468 yang dibandingkan dengan kontrol positif.

Gambar 26. Hasil Pengujian Salmonella Sampel 468 pada Media Pengkaya MKTTN dan
RVS yang ditumbuhkan dalam Media XLD dan BGA
 Gambar 27. Hasil Pengujian Salmonella Sampel 460 pada Media Pengkaya MKTTN dan
RVS yang ditumbuhkan dalam Media XLD dan BGA

Kesimpulan: sampel 460 dan 468 tidak mengandung bakteri Salmonella sp

E. PENGUJIAN Staphylococcus aureus 65/MI/12

Prinsip Pengujian
Pertumbuhan S. aureus pada media lempeng yang sesuai, yang mereduksi kalium telurit,
menghidrolisa kuning telur, memfermentasi manitol dan mengkoagulasi plasma.

Alat
Alat yang digunakan adalah cawan petri, pipet ukur, lampu spirtus, LAF, labu Erlenmeyer,
gelas ukur, hot plate, magnetic stirrer, oose, dan autoclave.

Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel, aquadest, larutan dapar fosfat pH 7,2, bakteri
Staphylococcus aureus, TSB, dan BPA.

Prosedur Pengujian
 10 g sampel 90 mL LDF pH 7,2

Inkubasi suhu 36 1C selama

2 5 jam

10 mL larutan 90 mL TSB

Inkubasi suhu 36 1C selama 24 48

jam

Keterangan:
LDF = Larutan Dapar Fosfat
TSB = Tryptic Soy Broth Streaking di media BPA
BPA = Baird Parker Agar

Inkubasi suhu 36 1C selama 24 jam

Gambar 28. Prosedur Pengujian Staphylococcus aureus

Hasil Pengujian
Hasil pengujian Staphylococcus aureus setelah dilakukan inkubasi selama 1 hari
menunjukkan tidak ada pertumbuhan bakteri pada media yang digunakan dibandingkan
dengan kontrol positif yang telah dibuat. Kontrol positif yang dibuat ditunjukkan pada
gambar di bawah ini.

Gambar 29. Kontrol Positif Staphylococcus aureus

Warna awal media sebelum diinkubasi adalah kuning keruh. Koloni Staphylococcus aureus
yang muncul pada kontrol positif berwarna hitam. Berikut ini adalah hasil pengujian sampel
460 dan 468 yang dibandingkan dengan kontrol positif.
 Gambar 30. Hasil Pengujian Staphylococcus aureus pada Sampel 460 dan 468

Kesimpulan: sampel 460 dan 468 tidak mengandung Staphylococcus aureus

F. PENGUJIAN Pseudomonas 66 MI/12

Prinsip Pengujian
Pertumbuhan koloni bakteri yang dapat membentuk pigmen piosianin dan fluoresin pada
media yang sesuai serta dapat tumbuh pada suhu 41-42oC.

Alat
Alat yang digunakan adalah cawan petri, pipet ukur, lampu spirtus, LAF, labu Erlenmeyer,
gelas ukur, hot plate, magnetic stirrer, oose, dan autoclave.

Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel, aquadest, larutan dapar fosfat pH 7,2, bakteri
Pseudomonas sp, TSB, dan CETA.

Prosedur Pengujian
 10 g sampel 90 mL LDF pH 7,2

Inkubasi suhu 36 1C selama

5 jam

10 mL larutan 90 mL TSB

Inkubasi suhu 36 1C selama 24 48

jam

Keterangan:
LDF = Larutan Dapar Fosfat
TSB = Tryptic Soy Broth Streaking di media CETA
CETA = Cetrimide Agar

Inkubasi suhu 36 1C selama 24 48 jam

Gambar 31. Prosedur Pengujian Pseudomonas

Hasil Pengujian
Hasil pengujian Pseudomonas setelah dilakukan inkubasi selama 2 hari menunjukkan tidak
ada pertumbuhan bakteri pada media yang digunakan dibandingkan dengan kontrol positif
yang telah dibuat. Kontrol positif yang dibuat ditunjukkan pada gambar di bawah ini.

Gambar 32. Kontrol Positif Pseudomonas

Warna awal media sebelum diinkubasi adalah tidak berwarna. Koloni Pseudomonas yang
muncul pada kontrol positif berwarna hijau muda. Berikut ini adalah hasil pengujian sampel
460 dan 468 yang dibandingkan dengan kontrol positif.
 Gambar 32. Hasil Pengujian Pseudomonas pada Sampel 460 dan 468

Kesimpulan: sampel 460 dan 468 tidak mengandung bakteri Pseudomonas.