Maturindo (081014115)

Dosen yang Asistensi:

Sri Puji Astuti

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2012

I. TUJUAN

1. Mengisolasi protein dari organ hati (ayam, mencit, dan sapi), organ limpa dan jantung mencit
2. Mengisolasi protein dari daun muda (ujung), setengah muda (tengah), daun tua (pangkal), serta
batang tanaman
3. Mengukur konsentrasi protein hewan dan tumbuhan hasil isolasi.

II. DASAR TEORI

Protein (protos yang berarti paling utama) adalah senyawa organik kompleks yang
mempuyai bobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam
amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Peptida dan protein merupakan
polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus
karboksil. Jika bobot molekul senyawa lebih kecil dari 6.000, biasanya digolongkan sebagai
polipeptida.
Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi oleh manusia. Seperti pada
tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya. Secara umum, sumber dari protein adalah dari sumber nabati
dan hewani. Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi
untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh.

Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan
peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P
dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa
dijumpai pada protein.
Dari struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu
gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino
dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino
mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang
mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino
juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat,
atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat.
Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus
karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan
 yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan
dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik yang melibatkan gugus R-nya.
Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi
berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut : asam amino non-polar
dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Prolin, Fenilalanin,
Triptofan dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang
beranggotakan Lisin, Serin, Treonin, Sistein, Tirosin, Asparagin dan Glutamin. Golongan ketiga
yaitu asam amino yang bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino
yang bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai delapan macam
asam amino esensial yaitu valin, leusin, Isoleusin, metionin, Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan
Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus
didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya.
Protein tersusun atas asam-asam amino melalui ikatan peptide, yaitu ikatan antara gugus
karboksil (-COOH) dan gugus amina (-NH2). Oleh karena itu protein juga disebut polipeptida.
Ikatan yang terjadi pada protein selain ikatan peptide antar asam-asam amino penyusunnya, juga
terjadi ikatan-ikatan yang lain. Misalnya, ikatan hydrogen yang terjadi pada gugus N-H dan pada
gugus O-H, ikatan disulfide yaitu S S menyokong terjadinya ikatan yang kompleks pada
protein. Ikatan ion pada protein juga terjadi bila di dalamnya terdapat gugus ion logam, dan ikatan
koordinasi, misalnya ikatan koordinasi antara ion Fe3+ dengan hemoglobin pada darah.
Protein :
H2O H+
{ NHCHC NHCHC } H2NCHCO2H + H2NCHCO2H + ..
R R Kalor R R
Sifat-sifat protein :
a) Protein sukar larut dalam air Karen ukuran molekulnya yang sangat besar.
b) Dapat mengalami koagulasi oleh pemanasan, penambahan asam atau basa.
c) Bersifat amfoter karena membentuk zwitter ion, pada titik isoelektriknya protein mengalami
koagulasi sehingga dapat dipisahkan dari pelarutnya.
d) Protein dapat mengalami kerusakan (terdenaturasi) oleh pemanasan. Pada denaturasi protein dapat
mengalami kerusakan mulai dari kerusakan struktur primernya sampai pada struktur tersiernya.
Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di
luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsinya, setiap
jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milie. Protein
yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas
enzimatiknya.

Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur fraksinasi sel yaitu
:
Memisahkan sel dari jaringannya.
Menghancurkan membrane sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan organelnya.
 Memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya.

Isolasi protein yaitu memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan
protein dengan sifat tertentu dan protein dari protein lain lain yang tidak diinginkan dalam analisa.
Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi dan
kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan aktifitasnya tidak berubah.
Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki daya pemisah terendah seperti
pengendapan dengan ammonium sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi olah berbagai factor antara
lain jumlah dan posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperature larutan.

III. ALAT DAN BAHAN

Bahan:
- Hati (ayam,mencit, dan sapi),limpa dan jantung mencit
- Daun muda, daun tengah, dan daun tua, serta batang tumbuhan
- Buffer ekstrak (Tris HCL 0,1 M pH 7,2 dan mercaptoehanol
- Larutan Bradford
- Akuades
- Es
- Etanol dingin
Alat
- Mortal dan pestle
- Tabung Eppendorf
- Refrigerator
- Micro pippet
- Shaker
- Tip: blue tip, yellow tip, white tip.
- Sentrifus
- Microcuvet
- Spektrofotometer
- Kulkas

IV. CARA KERJA

Isolasi Protein Hewan

1. Memotong kecil- kecil organ hati, limpa, dan jantung sebanyak 1 gram. Kemudian menggerusnya
dengan mortal dan pastle dalam keadaan dingin (pemecahan secara mekanik) sambil
menambahkan dengan buffer ekstraksi sebanyak 300- 500 l (pemecahan secara kimiawi)
2. Memasukkan homogenate kedalam tabung Eppendorf, dan di vorteks selama 10 menit. Dan
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit.
3. Memisahkan antara supernatan dan peletnya.
4. Mengambil supernatannya dan menambahkan dengan etanol absolut dingin dengan perbandingan
1:1.setelah itu menginkubasi dalam refrigerator selama 1 jam pada suhu 4o C untuk pemisahan
etanol dan proteinnya
5. Mensentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 10.000 rpm
 6. Mengambil endapan dan mengeringkan hingga bau etanol hilang,serta menambahkan buffer Tris-
HCL 20 mM sebanyak 100 l untuk penyangga agar protein tetap pada kondisi tersebut. Setelah
proses tersebut akan mendapatkan ekstrak protein kasar.
7. Mengukur kadar protein hasil ekstraksi.pertama membuat larutan blanko yang terdiri dari 200 l
larutan Bradford dan ditambah 800 l akuades. Kedua membuat larutan sampel yang terdiri dari
10 l protein sampel hasil isolasidan 200 l larutan Bradford, serta ditambah 790 l akuades.
8. Mengukur nilai OD protein sampel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
9. Menghitung konsentrasi protein dengan rumus Y= 0,0465 X 0,0157 ( Y adalah nilai OD, X
adalah konsetrasi protein).
10. Supernatan disimpan dalam refrigerator -20% sampai dilakukan elektroforesis

Isolasi Protein Tumbuhan

1. Menghancurkan daun sebanyak 0,1 gram dengan mortal dan pestle.
2. Memindahkan homogenate yang dihasilkan ke tabung Eppendorf dan menambahkan sebanyak
300- 500 l buffer ekstrak dalam keadaan dingin.
3. Menginkubasikan homogenate dalam refrigerator selama 30 menit dengan dishaker sekali selama
10 menit.
4. Mensentrifugasi homogenat pada 7.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4oC. Supernatan yang
didapatkan dipindahkan ke tabung Eppendorf baru. Supernatan yang didapatkan sudah
mengandung protein kasar.
5. Mengukur konsentrasi protein hasil ekstraksi dengan cara yang sama pada pengukuran
konsentrasi protein hewan (langkah 7-9)
6. Menyimpan supernatan dalam refrigerator -20o C sampai dilakukan elektroforesis

V. HASIL PENGAMATAN
Bahan OD Konsentrasi Protein
Hati Mencit 0,396 0,8853 g/l
Hati Sapi 0,106 0,1308 g/l
Hati Ayam 0,3 0,679 g/l
Organ Limpa 0,054 0,15 g/l
Jantung 0,057 0,156 g/l
Daun Muda 0,187 0,4359 g/l
Daun Setengah Muda 0,530 1,1735 g/l
Daun Tua 0,235 0,5391 g/l
Batang 0,136 0,3262 g/l

Menghitung Konsentrasi Protein dengan Rumus :

Y = 0,0465 X 0,0157
Keterangan :
Y : nilai OD
X : konsentrasi protein

VI. PEMBAHASAN
A. Isolasi protein hewan
 Langkah pertama yang dilakukan adalah menimbang bahan-bahan sebanyak 1 gram,
kemudian digerus dan ditambahkan dengan buffer ekstraksi sebanyak 300-500 ul. Penambahan
buffer ekstraksi bertujuan untuk memecahkan sel- sel yang terdapat dalam bahan. Langkah
selanjutnya adalah menghomogenkan campuran dengan vortex kemudian disentrifugasi 6000 rpm
untuk memisahkan rendemen (pelet) dari supernatan. Supernatan diambil kemudian ditambahkan
etanol dengan tujuan mengendapkan protein, selanjutnya supernatan di sentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm. Endapan yang diambil dari proses sentrifugasi ditambahkan buffer Tris
HCL 20 mM untuk menyangga agar protein tetap pada kondisi pH yang sesuai.

Pengukuran kadar protein hasil ekstraksi dilakukan dengan cara membuat larutan blanko
yang terdiri dari 200 ul Larutan Bradford dan 800 ul aquades. Larutan Bradford merupakan
senyawaindikator adanya protein. kemudian dilakukan pembuatan larutan sampel yang terdiri atas
10 ul protein, 200 ul Bradford dan 790 ul aquades.Langkah selanjutnya dilakukan pengukuran OD
mengunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.

Kadar protein yang diketahui berupa nilai kekeruhan larutan. Nilai- nilai OD pada masing-
masing bahan dikonversikan dalam satuan M (molaritas) Menggunakan Rumus Y= 0,0465X
0,0157. Dengan demikian dihasilkan konsentrasi protein pada masing- masing bahan yakni: Organ
Limpa Mencit sebesar 0,15 g/l dan Organ jantung mencit sebesar 0,156 g/l

Isolasi protein Tumbuhan

Pada dasarnya langkah- langkah isolasi protein tumbuhan samahalnya dengan isolasi pada
tumbuhan, namun pada isolasi protein tumbuhan hanya dilakukan sentrifugasi 1 X dengan
kecepatan 7.000 rpm. Selain itu untuk mendapatkan protein kasar tumbuhan tidak mengambil
peletnya, akan tetapi mengambil supernatannya karna pada supernatan inilah yang mengandung
protein. Larutan sampel yang diambil sebanyak 10 ul diukur nilai OD nya dengan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 565 nm. Kemudian nilai OD dikonversikan dalam
satuan Molar Menggunakan Rumus Y= 0,0465X 0,0157. Dengan demikian dihasilkan
konsentrasi protein pada masing- masing bahan yakni:Batang Tumbuhan sebesar 0,3262 g/l.

VII. KESIMPULAN
1. Konsentrasi protein pada organ limpa mencit adalah 0,15 g/l
2. Konsentrasi protein pada organ jantung mencit adalah 0,156 g/l
3. Konsentrasi protein pada batang tumbuhan adalah 0,3262 g/l.
4. Urutan konsentrasi protein dari ketika pengamatan tersebut dari konsentrasi rendah ke tinggi
adalah, Organ limpa mencit, organ jantung mencit dan batang tumbuhan
5. Konsentrasi protein untuk tiap organ atau spesies jelas berbeda ,hal ini tergantung pada fungsinya.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs: xvi +
779 hlm.
Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company, Inc.,
Boston: xviii + 454 hlm.
Raven, P.H. & G.B. Johnson. 2002. Biology. 6th ed. McGraw-Hill Companies, Inc., New York: xxiv +
1238 hlm.
 Isolasi Protein Prosedur Stacy dan Aalen, dan Presipitasi (Pengendapan) dengan TCA

1. Daun sebanyak 0,1 gram digerus dengan ditambahkan 500 L ekstrak buffer dalam keadaan dingin.
2. Homogenate yang dihasilkan dipindahkan ke eppendorf yang telah diisi dengan 250 L ekstrak buffer,
3. Homogenate ditambahkan dengan 26 L PMSF 40 mM dan diinkubasi selama satu jam dalam
refrigerator dengan dishaker sekali 15 menit,
4. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C. Supernatan yang didapatkan
dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan disimpan dalam refrigerator.
5. Pellet disuspensikan dengan menambah 500L ekstrak buffer dan 26L PMSF 40 mM (6,97 mg
PMSF dalam 1 ml dMSO)
6. Inkubasi pada suhu 40C selama satu jam dan digoyang sekali 15 menit.
7. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C.
8. Supernatan yang didapatkan dicampur dengan supernatant pertama dan diendapkan dengan TCA
20% (1 ml volume supernatan berbanding dengan 200 L TCA 20%
9. Inkubasi pada suhu -200C selama satu jam.
10. Campuran kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm dengan suhu 40C selama lima menit,
11. Supernatan yang didapatkan dibuang dan peletnya dicuci dengan menambahkan 1000 ml aceton
absolute,
12. Sentrifugasi dengan 13.000 rpm 40C selama satu menit.
13. Pellet yang didapatkan dicuci kembali dengan menambahkan 1000 ml aceton absolute,
14. Sentrifugasi 13.000 rpm 40C satu menit.
15. Pellet yang didapatkan adalah protein, untuk menghilangkan aseton pellet dikering anginkan.
16. Protein yang didapatkan dilarutkan dengan 15 L aquabides dan selanjutnya dielektroforesis.

Rizki, S.Si., M.P.

Biologi-UNP, Plant Biotechnology-Brawijaya University
Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke Facebook